AT396250B - Verfahren zur herstellung von neuen antibiotisch wirkenden verbindungen - Google Patents

Description

AT 396 250 B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung antibiotisch wirkend»’ Verbindungen, insbesondere von Antibiotika, die durch Fermentation von Streptomyces-Qrganismen erhalten werden können.

Erfindungsgemäß wird eine neue Substanzklasse bereitgestellt, die mit Antibiotika S541 bezeichnet ist Diese Substanzen können durch Züchtung eines bisher nicht beschriebenen Mikroorganismus-Stammes bei kontrollierten S Bedingungenhergestelltwerden.DieAntibiotikaS541besitzenantibiotischeundinsbesondereanti-endoparasitische, anti-ectoparasitische, insektizide und nematizide Eigenschaften. Sie wirken fern» gegen Pilze und Milben. Diese Substanzen sind für die Landwirtschaft und für den Gartenbau sowie für die Ti»- und Humanmedizin von Interesse. Die Verbindungen können auch als Zwischenverbindungen zur Herstellung weiter» wirksam» Verbindungen eingesetzt werden. Man kann die Verbindungen durch Fermentation erhalten und im wesentlichen in rein» Form 10 gewinnen, wie dies nachstehend beschrieben ist.

Die Antibiotika S541 stellen eine Gruppe von verwandten Verbindungen mit d» folgenden Teilformel (I) dar:

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Sechs Verbindungen der Teilformel (Π) sind nachstehend näher beschrieben.

Erfindungsgemäß sind sowohl die einzelnen Verbindungen der obigen Teilformeln als auch die Mischungen davon umfaßt Für bestimmte Anwendungszwecke, beispielsweise in der Landwirtschaft oder im Gartenbau bzw. in der Veterinärmedizin, kann es von Vorteil sein, die Antibiotika S541 ohne Auftrennung in die einzelnen Bestandteile einzusetzen. Für andere Anwendungszwecke hingegen, beispielsweise in der Humanmedizin, kann es von Vorteil sein, einzelne Verbindungen einzusetzen. Die Erfindung bezieht sich somit auch auf eine erfindungs-gemäße Verbindung, die in Mischung mit mindestens einer weiteren erfindungsgemäßen Verbindung vorliegt Erfindungsgemäß sind auch die einzelnen Verbindungen, beispielsweise in im wesentlichen reiner Form oder im wesentlichen in Abwesenheit anderer Makrolide umfaßt

Die ursprünglich isolierten Antibiotika S541 können ohne Schwierigkeiten durch Chromatographie an Silika Ost nachstehend beschrieben) in zwei Komponenten mit antibiotischen Eigenschaften, z. B. Antihelminthika, aufgetrennt werden. Diese Komponenten quenchen UV-Fluoreszenz bei 254 nm. Die Komponente I ist durch einen Rf-Wert von 0,70 bis 0,75 gekennzeichnet Die Komponente Π besitzt einen Rf-Wert von 039 bis 0,46. Diese Rf-Werte wurden dünnschichtchromatographisch an Merck 5735 Silika 60-Platten (Elution mit Chloroform:Ethylacetat; 3:1) bestimmt. DieKomponenten I und II, worin R2 für -CH3 bzw. -H steht, der Antibiotika S541 stellen ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal dar.

Die Komponenten I und II können wiederum weitergereinigt werden und führen zu sechs Verbindungen mit der Teilformel (I), die antibiotische Eigenschaften besitzen. Sie stellen beispielsweise Antihelminthika dar.

Gegenstand der Erfindung sind somit Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (ΙΠ):

worin

Rl eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe bedeutet und R2 ein Wasserstaffatom oder eine Methylgruppe bedeutet

Die sechs Verbindungen der allgemeinen Formel (III) sind mit Faktor A (R* = Isopropyl, Rz =Wasserstoff), ,1 2

Fadetor B (R1 = Methyl, Rz = Methyl), Faktor C (R1 = Methyl, Rz =Wasserstoff), Faktor D (R1 = Ethyl,

Rz = Wasserstoff), Faktor E (R^ = Ethyl, Rz = Methyl) und Faktor F (R1 = Isopropyl, Rz = Methyl) bezeichnet

Ui

Die Faktoren A und C sind insbesondere bevorzugt Die Faktoren B, E und F erhält man aus der Komponente I, während man die Faktoren A, C und D aus der Komponente II erhält. Dieerfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen besitzen eine antibiotische Aktivität. Sie wirken beispielsweise gegen Würmer, beispielsweise gegen Nematoden. Sie besitzen insbesondere anti-endoparasitische und anti-ektoparasitische Aktivität Die Verbindungen sind im allgemeinen zur Bekämpfung von Parasiten, wieEktoparasiten und Endoparasiten, geeignet Ektoparasiten und Endoparasiten infizieren Menschen und viele Tiere und sind -3-

AT 396 250 B insbesondere auf Tierfarmen anzutreffen. Zu diesen Tieren zählen Schweine, Schafe, Rind»:, Ziegen, Geflügel, Pferde und Haustiere, wie Hunde und Katzen. Eine parasitische Infektion des Viehbestandes, die zu Anämie, einer schlechten Ernährung und einen Gewichtsverlust führt, stellt einen der Hauptgründe für die weltweit erlittenen wirtschaftlichen Verluste dar. 5 Als Beispiele für Genera an Endoparasiten, welche Tiere und/oder Menschen infizieren, kann man nennen:

Ancylostama, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, Bunostomun, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Necator, Nematodirus, Nematospiroides, Nippostrongylus, Oesophagostomum, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris und Uncinaria. 10 Als Beispiele für Ektoparasiten, welche Tier und/oder Menschen infizieren, kann man arthropode Ektoparasiten nennen, wie beißende Insekten, Schmeißfliegen, Fliegen, Läuse, Milben, saugende Insekten, Zecken und andere zweiflügelige Schädlinge.

Als Beispiele für Genera dieser Ektoparasiten, welche Tiere und/oder Menschen infizieren, kann man nennen:

Ambylomma, Boophilus, Coroptes, Culliphore, Damodex, Damolinia, Gastrophüus, Haematobia, Haematopinus, 15 Haemophysalis, Hyalomma, Linognathus, Lucilia, Melophygus, Oestrus, Psorergates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes und Stomoxys.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen sowohl in vitro als auch in vivo gegen eine Vielzahl vonEndoparasitenundEktoparasiten wirksam sind. Insbesondere wurdegefunden,daß die erfindungs-gemäßen Verbindungen gegen parasitische Würmer, wie Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta, 20 Trichostrongyluscolubiformis,Dictyocaulusviviparis,Cooperiaoncophera,OstertagiaostertagiundNippostrongylus braziliensis und parasitische Milben, wie Sarcoptes sp. und Psoroptes sp. wirksam sind.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen können daher zur Behandlung von Menschen und Tieren mit endoparasitischen und/oder ektoparasitischen Infektionen eingesetzt werden.

Die Spezies des Parasiten hängt von dem Wirt und von der hauptsächlichen Infektionsstelle ab. So infizieren 25 beispielsweise Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta und Trichostrongylus colubiformis im allgemein»!

Schafe und sind vorwiegend im Magen und im Dünndarm zu finden, während Dictyocaulus viviparus, Cooperia oncophora und Ostertagia ostertagi im allgemeinen Rinder infizieren und vorwiegend in der Lunge, im Darm oder im Magen zu finden sind.

Ferner wurde gefunden, daß die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen gegen Pilze wirken, beispielsweise 30 gegen Stämme von Candida sp., wie Candida albicans und Candida glabrata, und gegen Hefen, wie Saccharomyces carlsbergensis.

Die erfindungsgemäß produzierbaren Verbindungen sind auch wirksam gegen den freilebenden Nematoden Caenorhabditis elegans.

Fernerwurde gefunden, daß dieneuenVerbindungenzurBekämpfungvonlnsekten-, Milben- undNematodenbefall 35 in der Landwirtschaft, im Gartenbau, in der Forstwirtschaft, im öffentlichen Gesundheitswesen und bei gelagerten Produkten eingesetzt werden können.

Schädlinge für Boden- und Pflanzenfrüchte, einschließlich Getreide (z. B. Weizen, Gerste, Mais und Reis), Gemüse (z. B. Soja), Früchte (z. B. Äpfel, Weintrauben und Zitrusfrüchte) sowie Wurzelgemüse (z. B. Zuckerrübe, Kartoffeln) können bekämpft werden. 40 Es wurde insbesondere gefunden, daß die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen wirksam sind beispiels- weisegegenFruchtmilben und Blattläuse, wie Aphis fabae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persicae.Nephotettix cincticeps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllocoptruta oleivora, Tetranychus urticae und Mitgliedern derGeneraTrialeuroides;Nematoden,wie Mitgliedern derGeneraAphelencoides,Globodera,Heterodera, MeIoidogyneundPanagrellus;Lepidopteren,wieHeliothis,PlutellaundSpodoptera; Getreidekäfer,wie Anthonomus 45 grandis und Sitophilus granarius; Schwarzkäfer, wie Tribolium castaneum; Fliegen, wieMusca domestica; beißende

Ameisen; Meniermotten; Pear psylla; Thrips tabaci; Kakerlaken, wie Blatella germanica undPeriplanetaamericana und Moskitos, wie Aedes aegypti.

Erfindungsgemäß werden Verbindungen mit der oben gezeigten Teilformel (I) hergestellt, die als Antibiotika eingesetztwerdenkönnen.Sie können insbesondere zurBehandlungvon Tieren oder Menschen mitendoparasitischen, 50 ektoparasitischen und/oder Pilz-Infektionen und in der Landwirtschaft, im Gartenbau oder in der Forstwirtschaft als

Pestizide zur Bekämpfung von Insekten, Milben der Ordnung Acarina und Nematoden eingesetzt werden. Siekönnen ferner als Pestizide zur Bekämpfung oder Regulierung von Schädlingen in anderen Umgebungen, z. B. in Läden, Gebäuden und anderen öffentlichen Orten eingesetzt werden. Im allgemeinen werden die Verbindungen entweder an den Wirt (Tier oder Mensch oder Pflanze oder andere Art der Vegetation) oder an die Schädlinge selbst oder an 55 den Ort gegeben, wo sie sich befinden.

Insbesondere bevorzugt sind die oben definierten Faktoren A, B, C, D, E und F. Die erfindungsgemäß gewinnbaren Verbindungen können für eine Verabreichung auf jede für die Veterinär- oder Humanmedizin übliche -4-

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Art formuliert werden. Gegenstand der Erfindung sind daher auch pharmazeutische Mittel, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten, welche so bearbeitet wurde, daß sie in der Veterinär- oder Humanmedizin eingesetzt werdenkann. Diese Mittel werden in üblicherweise eingesetztund können einen odermehieregeeigneteTräger oder Exzipienten enthalten: 5 Die erfindungsgemäß herstellbaren Wirkstoffe können in Mittel so formuliert sein, daß sie für eine parenterale (einschließlich intramammäre), orale, rektale oder topische Verabreichung oder für Implantate geeignet sind. Ist es erforderlich, sterile Mittel zu formulieren, beispielsweise für Injektionen (einschließlich intramammäre Präparate), Augentropfen, Salben und Implantate, dann kann man den Wirkstoff selbst aseptisch hersteilen oder nach der Herstellung durch Verfahren, wie γ-Bestrahlung oder Behandeln mit Ethylenoxid, sterilisieren. 10 Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen können als Injektion zur Verwendung in der Veterinär- oder

Humanmedizin formuliert werden. Sie können in Form einer Einzeldosis, in Ampullen oder in anderen Behältern für Einzeldosen oder in Mehrfachdosisbehältem vorliegen. Erforderlichenfalls gibt man ein Konservierungsmittel zu. Die Mittel für Injektionszwecke können als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägem vorliegen und können Formulierungshilfen enthalten, wie Suspendiermittel, Stabilisierungsmittel, 15 Solubilisierungsmittel und/oder Dispergiermittel.

Der Wirkstoff kann in alternativer Weise auch in Form eines sterilen Pulvers vorliegen, das vor der Verwendung mit einem geeigneten Träger, beispielsweise sterilem, pyrogenfreiem Wasser, rekonstituiert wird. Zu den öligen Trägem zählen mehrwertige Alkohole und deren Ester, wie Glycerinester, Fettsäuren, pflanzliche Öle, wie Erdnußöl oder Baumwollsamenöl, Mineralöle, wie flüssiges Paraffin, und Ethyloleat und andere ähnliche Verbindungen. Man 20 kann auch andere Träger, wie Propylenglykol, einsetzen.

Mittel für die Veterinärmedizin können auch als intramammäre Präparate formuliert sein, bei denen der Wirkstoff aus der Grundlage entweder langsam oder schnell freigesetzt wird. Es kann sich dabei um sterile Lösungen oder Suspensionen in wäßrigen oder öligen Trägem handeln. Die öligen Träger können beispielsweise diejenigen sein, die oben beschrieben sind. Sie können ferner ein Verdickungs- oder Suspendiermittel enthalten, wie weiche oder 25 harte Paraffine, Bienenwachs, 12-Hydroxystearin,hydriertesCastoröl, AluminiumstearateoderGlycerylmonostearate. Übliche, nicht-ionische, kationische oder anionische grenzflächenaktive Mittel können alleine oder in Kombination in den Mitteln eingesetzt werden. Für die Veterinär- oder Humanmedizin können die erfindungsgemäß erhältlichen Veibindungen auch in einer für die orale Verabreichung geeigneten Form formuliert sein. So können sie beispielsweise als Lösungen, Sirupe oder 30 Suspensionen oder als Trockenpulver vorliegen, das vor der Verwendung mit Wasser odereinem anderen geeigneten

Träger konstituiert wird. Gewünschtenfalls können Geschmacks- und Farbstoffe vorhanden sein. Man kann auch feste Mittel, wie Tabletten, Kapseln, Pastillen, Pillen, große Pillen (Bolus), Pulver, Pasten oder Granulate einsetzen.

Oral anzuwendende flüssige oder feste Mittel stellt man auf übliche Weise her. Diese Mittel können auch einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger oder Exzipienten enthalten, die fest oder flüssig sein können. 35 Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger zur Verwendung in festen Dosierungsformen sind beispielsweise Bindemittel (z. B. pregelatinierte Maisstärke, Polyinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffe (z. B. Lactose; mikrokristalline Cellulose oder Calciumphosphat); Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talk oder Silika); disintegrierende Mittel (z. B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycollat); oder Benetzungsmittel (z. B. Natriumlauiylsulfat). Die Tabletten kann man auf übliche Weise mit einem Überzug ausstatten. 40 Geeignete pharmazeutisch verträgliche Additive zur Verwendung in flüssigen Dosierungsformen sind beispiels weise Suspendiermittel (z. B. Sorbitsirup, Methylcellulose oder hydrierte eßbare Fette); Emulgatoren (z. B. Lecithin oder Acacia); nicht-wäßrige Träger (z. B. Mandelöl, ölige Ester oder Ethylalkohol); und Konservierungsmittel (z. B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure). Man kann auch Stabilisierungs- und Solubilisierungsmittel dazugeben. 45 Oral zu verabreichende Pasten kann man auf bekannte Weise formulieren. Für die Formulierung von Pasten geeignete pharmazeutisch verträgliche Additive sind beispielsweise Suspendier- oder Gelierungsmittel, z. B. Aluminiumdistearat oder hydriertes Castoröl; Dispergiermittel, z. B. Polysorbate; nicht-wäßrige Träger, z. B. Erdnußöl oder ölige Ester, und Stabilisierungs- und Solubilisierungsmittel. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in der Veterinärmedizin auch dadurch verabreicht werden, daß man sie der festen oder flüssigen Nahrung 50 für die Tiere einverleibt. So kann man sie beispielsweise der täglichen Nahrung für die Tiere oder dem Trihkwasser zugeben. Für eine bukale Verabreichung können die Mittel auf übliche Weise in Form von Tabletten, Pasten oder Pastillen famuliert werden.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen können in der Veterinärmedizin auch oral in Form eines 55 Arzneitranks verabreicht werden, der beispielsweise als Lösung, Suspension oder Dispersion des Wirkstoffs zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Exzipienten vorliegt. -5-

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Dieerfindungsgemäß herstellbarenVerbindungen können für dieVeterinär-oder Humanmedizin auch beispielsweise als Suppositorien, z. B. solche mit üblichen Suppositorienbasen, formuliert sein. Für die topische Verabreichung können die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen in der Veterinär· und Humanmedizin als Salben, Cremes, Lotionen, Pulver, Pessare, Sprays, Dips, Aerosole oder Tropfen (z. B. Augen-5 oder Nasentropfen) formuliert sein. Salben und Cremes können beispielsweise mit einer wäßrigen oder öligen Basis unter Hinzufügunggeeigneter Verdickungs-und/oder Gefienmgsmittelfarmuliertsein. In die Augen zu verabreichende Salben kann man auf sterile Weise unter Verwendung steriler Bestandteile hersteilen.

Die Lotionen können mit einer wäßrigen oder öligen Basis formuliert sein und enthalten im allgemeinen ferner ein oder mehrere Emulgiermittel, Stabilisierungsmittel, Dispergiermittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel oder 10 Färbemittel

DiePulverkann man mitHilfe jeder geeigneten Pulverbasis hersteilen. Die Tropfen kann man miteiner wäßrigen oder nicht-wäßrigen Basis formulieren, die ferner ein oder mehrere Dispergiermittel, Stabilisierungsmittel, Solubilisierungsmittel oder Suspendiermittel aufweisen. Sie können auch ein Konservierungsmittel enthalten.

Werden die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen enthaltende Mittel in der Veterinär- oder Human-15 medizin topisch durch Inhalieren verabreicht, dann können sie in Form eines Aerosolsprays vorliegen. Sie können auch mittels eines Pulverzerstäubers verabreicht werden.

Dieeifindungsgemäß erhältlichen Verbindungen können zusammen mitanderen pharmazeutischen Wirkstoffen verabreicht werden. Die tägliche Gesamtdosis der erfindungsgemäßen Verbindungen beträgt sowohl in der Veterinärmedizin als auch in der Humanmedizin etwa 1 - 2000 pg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 10 -1000 pg/kg und 20 insbesondere bevorzugt 100 - 500 pg/kg. Diese Gesamtdosis kann man auch in mehreren Dosen verabreichen, z.B. l-bis4mal/Tag.

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen können auf jede Weise formuliert sein, die für einen Einsatz in der Landwirtschaft oder im Gartenbau geeignet ist. Gegenstand der Erfindung sind daher auch Mittel, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten, welche für den Einsatz im Gartenbau oder in der Landwirtschaft angepaßt 25 wurde. Derartige Formulierungen sind beispielsweise flüssiger oder trockener Art Dazu zählen beispielsweise Stäube, einschließlich Staubbasen oder Konzentrate, Pulver, einschließlich lösliche oder benetzbare Pulver, Granulate, einschüeßüchMikrogranulateunddispergierbareGranulale, Pellets, fließbareFormulierungen, Emulsionen, wie verdünnte Emulsionen oder emulgierbare Konzentrate, Dips, wie Wurzeldips und Samendips, Samendiessings, Samenpellets, Ölkonzentrate, Öllösungen, Injektionen, z. B. Injektionen in den Stamm, Sprays, Rauch und Nebel. 30 Diese Formulierungen enthalten die neue Verbindung im allgemeinen zusammen mit einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel. Diese Träger können flüssig oder fest sein und dienen dazu, die Anwendung der Verbindung zu erleichtern, indem sie diese dort dispergieren, wo sie aufgetragen wird, oder indem sie eine Formulierung bereitstellen, die vom Verwender zu einem dispergierbaren Präparat gemacht werden kann. Derartige Formulierungen sind gut bekannt und können auf übliche Weise hergestellt werden. Dazu zählt beispielsweise das 35 Vermischen und/oder Zermahlen des (der) Werkstoffe(s) zusammen mit dem Träger oder Verdünnungsmittel, z. B. festen Träger, Lösungsmittel oder oberflächenaktivem Mittel.

Geeignete feste Träger zur Verwendung in Formulierungen, wie Stäuben, Granulaten und Pulver, sind beispielsweise natürliche Mineralfüllstoffe, wie Diatomit, Talk, Kaolinit, Montmorillonit, Pyrophyllit oder Attapulgit. Hochdispergierte Kieselsäure oder hochdispergierte absorbierende Polymere können gewünschtenfalls den Mitteln 40 einvarleibt werden. Als granulierte Adsorptionsträger kann man poröse (z. B. Bimsstein, Erdstein, Meerschaum oder

Bentonit) oder nicht-poröse (wie Calcit oder Sand) einsetzen. Geeignete, pregranulierte, ersetzbare Materialien können organischen oder anorganischen Ursprungs sein. Dazu zählen Dolomit und Reste von Erdpflanzen.

Geeignete Lösungsmittel zur Verwendung als Träger oder Verdünnungsmittel sind aromatische Kohlenwasserstoffe, aliphatische Kohlenwasserstoffe, Alkohole und Glykole oder Ether davon, Ester, Ketone, Säureamide, stark 45 polare Lösungsmittel, gewünschtenfalls epoxidierte pflanzliche Öle und Wasser. Übliche, nicht-ionische, kationische oder anionische grenzflächenaktive Mittel, z. B. ethoxylierte Alkylphenole und Alkohole, Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze von Alkylbenzolsulfonsäuren, Lignosulfonsäuren oder Sulfobemsteinsäuren oder Sulfonate von polymeren Phenolen mit guten emulgierenden, dispergierend«! und/oder benetzenden Eigenschaften können entweder alleine oder in Kombination in den erfindungsgemäßen Mitteln 50 eingesetzt werden.

Stabilisierungsmittel, Mittel, welcheeinZusammenbackenverhindern, Antischaummittel,Viskositätsregulatoren, Bindemittel und Klebemittel, Photostabilisatoren sowie Düngemittel, die Futteraufnahme stimulierende Agenden sowie andere Wirkstoffe können den erfindungsgemäßen Mitteln gewünschtenfalls einverleibt sein. Die erfindungsgemäßen Ve^indungenkönnenauchin Mischung mitanderen Insektiziden,milbentötendenMitteln und wurmtötenden 55 Mitteln formuliert sein.

In diesen Formulierungen beträgt die Konzentration an aktivem Material im allgemeinen von 0,01 - 99 % und vorzugsweise von 0,01 - 40 Gew.-%. -6-

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Handelsprodukte werden im allgemeinen als konzentrierte Mittel bereitgestellt, die vor der Verwendung auf eine geeignete Konzentration des Wirkstoffs, beispielsweise von 0,001 · 0,0001 Gew.-%, verdünnt werden.

Zum Einsatz im Gartenbau und in der Landwirtschaft sowie in der Veterinärmedizin kann es wünschenswertsein, die gesamte Fermentationsbrühe einzusetzen, ohne eine Auftrennung in die Komponente oder Faktoren vorzunehmen. Die Brühe dient dann als Quelle für die Wirkstoffe. Man kann auch die getrocknete Brühe (enthält Myzele) einsetzen. Es ist ferner möglich, lysierte Myzele oder lebende oder tote Myzele einzusetzen, die aus der Brühe durch Fest/Flüssig-Trennung oder Verdampfungstechniken abgetrennt wurden. Man kann auch die nach der Abtrennung der Myzele verbleibende Fermentationsbrühe verwenden. Die Myzele kann man gewünschtenfalls pasteurisieren oder vorzugsweise trocknen, z. B. durch Sprühtrocknung oder Walzentrocknung. Gewünschtenfalls kann man die Brühe oder die Myzele zu Mitteln formulieren, welche übliche inerte Träer, Exzipienten oder Verdünnungsmittel, wie oben beschrieben, enthalten.

Aus dem oben Gesagten geht hervor, daß die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen im allgemeinen zur Bekämpfung von Infektionen oder von Parasitenbefall eingesetzt werden können. Dazu trägt man eine wirksame Menge ein«’ oder mehrerer der genannten Verbindungen auf den für die Infektion oder den Befall verantwortlichen Organismus oder oder auf die befallene Stelle auf.

Gegenstand der Erfindung ist, wie schon eingangs erwähnt, ein Verfahren zur Herstellung der zuvor definierten Antibiotika S541 oder einer Komponente oder eines Faktors davon. Dazu kultiviert man einen Organismus des Genus Streptomyces, der in der Lage ist, mindestens eine der neuen Verbindungen zu produzieren. Dadurch erhält man mindestens eine der Verbindungen. Diese kann man gewünschtenfalls davon abtrennen und isolieren. Bei dem Organismus handelt es sich vorzugsweise um einen solchen, der im wesentlichen eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen produziert

Taxonomische Untersuchungen haben gezeigt, daß es sich bei dem bestimmten Mikroorganismus, der obige Substanzen produzieren kann, um eine neue Spezies des Genus Streptomyces handelt. Dies« Mikroorganismus wurde mit Streptomyces thermoarchaensis bezeichnet. Eine Probe dieses Mikroorganismus, der aus dem Boden isoliert wurde, ist bei der Hinterlegungsstelle „National Collections of Industrial and Marine Bacteria“, Tony Research Station, Aberdeen, United Kingdom, hinterlegt worden. Diesem Mikroorganismus wurde die Nr. NCIB 12015 zugeteilt. Die morphologischen Charakteristika und die Kulturcharakteristika von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 sind nachstehend beschrieben. Dieser Organismus sowie weitere Antibiotika S541 produzierende Streptomyces-Stämme sind erfindungsgemäß umfaßt. Die Erfindung ist insbesondere auf die neue Spezies von Streptomyces gerichtet, deren Mitglieder die gleichen wesentlichen morphologischen und kulturell«! Charakteristika wie Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 besitzen.

Zur Erfindung gehört auch die Herstellung aller Verbindungen, die durch Fermentation von S. thermoarchaensis NCIB 12015 gewonnen werden können und welche optische Isomere der Verbindungen der Formel (I) darstellen.

Bei dem Organismus vom Genus Streptomyces handelt es sich vorzugsweise um Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 odereinen Mutanten davon.

Mutanten von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 können spontan entstehen oder können durch eine Vielzahl von Verfahren produziert werden. Dazu gehören diejenigen, die beschrieben sind in „Techniques for the Development of Microorganisms by Η. I. Adler in Radiation and Radioisotopes for Industrial MicroorganismS“, Proceedings of the Symposium, Wien 1973, S. 241, International Atomic Energy Authority. Zu diesem Verfahren gehören die Bestrahlung mit ionisierenden Strahlen, chemische Verfahren, z. B. Behandlung mitN-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG); Hitze; genetische Techniken, wie Rekombination, Transduktion, Transformation, Lysogenisation und lysogene Umwandlung, und selektive Techniken für spontane Mutanten. So wurden beispielsweise vier Mutantenstämme von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 erhalten. Jeder dies« Stämme wurde bei der Hinterlegungsstelle „National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Ab«deen, United Kingdom“ hinterlegt Diesen Stämmen wurden die folgenden Hinterlegungsnumm«n zugeteilt: NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 und NCIB 12114. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111,12112, 12113 und 12114 und die Mutanten davon stellen somit einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar. D« Stamm NCIB 12015 wurde am 10. September 1984 hinterlegt, die Stämme NCIB 12111 -12114 am 26. Juni 1985.

Die Mutantenstämme NCIB 12111,12112 und 12113 wurden durch Behandlung der Sporen von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 mit NTG behandelt. Sie wurden dann nach dem Einstufenverfahren (one-step method) von Holliday (R. Holliday (1956) Nature 12£ 987) charakterisi«L

Der Mutantenstamm NCIB 12114 entstand durch spontane Mutation von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015. Von diesem Stamm wurde festgestellt, daß « gegenüber Streptomycin resistent ist, da «, nachdem « 100 pg/ml Streptomycinsulfat 5 Tage bei 28 °C ausgesetzt gewesen war, lebensfähig blieb.

Taxonomische Untersuchungen deuten darauf hin, daß Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 ein zuvor nicht offenbarter Mikroorganismus einer neuen Spezies darstellt. Die Eigenschaften davon sind nachstehend beschrieben und stellen im wesentlichen diejenigen der Spezies als Ganzes dar. Erfindungsgemäß sind alle -7-

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Mitglieder dieserSpezies umfaßt. Dazu zählen auch alle Organismen,welche in der Hauptsache ähnlichewesentliche Charakteristika besitzen.

Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12015 wächst auf den bevorzugten Sporulationsmedien, Weizenmehl, Malz/Hefe-Agar und anorganische Salze/Stärke-Agar (Shirling, E. B. und Gottlieb, D. (1966) Int. J. Syst. Bacteriol, 16.313-340) üppig und produziert ein stabiles Substratmyzel und ein Luftmyzel, das Sporen in offenen Spiralenketten trägt, die Seitenzweige der Hauthyphen darstellen. Auf diesen Medien ist die rückwärtige Pigmentation gelb/braun. Die Sporophoren sind grau. Bei einer 100-fachen Vergrößerung zeigen die Sporophoren 2 - 5 Windungen pro Kette mit 5 -10 Sporen innerhalb jeder Windung der Spirale. Die Sporophoren enthalten durchschnittlich 20-50 Sporen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen bei einer Vergrößerung von 12.000 zeigen, daß die Sporen glattwandig sind und Ellipsenform besitzen, mit Maßen von 0,7 pm x 1,4 pm zwischen den am weitesten entfernten Punkten. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 ist gram-positiv und kann bei Temperaturen zwischen 20 °C und 50 °C wachsen und Sporen bilden.

Ein Vergleich der zuvor genannten Daten mit den in Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Eighth Edition) veröffentlichten Beschreibungen zeigt, daß der Organismus Streptomyces thermoarchaensis NQB12015 zum Genus Streptomyces gehört.

Die Zuordnung von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 zu ein»- Spezies-Untergruppe wurde mit Hilfe einer computerisierten Identifikationsmatrix durchgeführt, die von Williams et al stammt (J. Gen. Microbiol (1983) 129.1815-1830). Für Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 wurden in den von den oben genannten Autoren beschriebenen 41 taxonomischen Tests folgende Ergebnisse erhalten:

Merkmal Ergebnis

Sporenkette verticillati Sporenkette retinaculiaperti Sporenkette rectiflexibiles

Sporenkette spirales +

Myzelfragmentation

Sporenoberfläche glatt +

Sporenoberfläche faltig

Sporenfarbe grau +

Sporenfarbe rot Sporenfarbe grün Rückseite gelb/braun + Rückseite rot/orange Melaninproduktion Verwertung von Adonit

Verwertung von Cellobiose +

Verwertung von D-Fructose +

Verwertung von meso-Inosit

Verwertung von Inulin +

Verwertung von Mannit

Verwertung von Raffinose +

Verwertung von Rhamnose +

Verwertung von D-Xylose +

Verwertung von DL-a-Aminobuttersäure

Verwertung von L-Histidin +

Verwertung von L-Hydroxyprolin

Abbau von Allantoin +

Abbau von Arbutin +

Abbau von Xanthin +

Abbau von Pectin +

Abbau von Lecithin

Nitratreduktion +

Schwefelwasserstoffproduktion +

Verträglichkeit von Natriumazid (0,01 % G/V) Verträglichkeit von Natriumchlorid (7 % G/V) Verträglichkeit von Phenol (0,1 % G/V) + -8-

AT 396 250 B (Fortsetzung)

Merkmal Ergebnis 5 Wachstum bei 45 °C +

Resistenz gegenüber Neomycin (50 pg.ml’*)

Resistenz gegenüber Refampicin (50 pg.mr1) +

Antibiose auf Aspergillus niger LIV 131 +

Antibiose auf Bacillus subtilis NCIB 3610 10 Antibiose auf Streptomyces murinus ISP 5091 +

Der Organismus konnte keiner der 23 Hauptspeziesgruppen (Williams, S. I. et al (1983) J. Gen. Microbiol 129. 1815-1830) zugeordnet werden. Der Organismus konnte auch keiner der Nebenspeziesgruppen und einzelnen 15 Mitgliedergruppen (wie von Williams et al definiert; J. Gen. Microbiol (1983) 129,1743-1813) zugeordnet werden.

Die Charakteristika von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 wurden auch verglichen mit Beschreibungen bekannter Streptomyces Spezies in Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Eigth Edition), in ISP Berichten von Shirling und Gottlieb (Int. J. Syst. Bacteriol. (1968) 1&, 69-189; Int. J. Syst. Bacteriol. (1968) IS» 279-392; Int J. Syst. Bacteriol. (1969) 1£, 391-512; Int. J. Syst. Bacteriol. (1972) 22» 265-394). Ein weiterer 20 Vergleich wurde mit neuen Spezies durchgeführt, die im International Journal of Systematic Bacteriology seit 1980 in ausreichendem Maße beschrieben sind.

Es konnte keine Übereinstimmung zwischen Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 und einer beschriebenen Spezies festgestellt werden. Es wird daher angenommen, daß Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 das erste bekannte Mitglied einer neuen Spezies darstellt, die zum Genus Streptomyces gehört 25 Alle Mutantenstämme NCIB 12111, 12112, 12113 und 12114 haben im wesentlichen ähnliche essentielle

Charakteristia wie Streptomyces thermoarchaensis. Jedoch benötigt NCIB 12111 zum Wachstum Adenin, NCIB 12112 benötigt zum Wachstum Serin, NCIB 12113 benötigt zum Wachstum Histidin undNCIB-12114 ist gegenüber Streptomycin resistent.

Die Herstellung von S541 durch Fermentation eines geeigneten Streptomyces-Organismuskann man auf übliche 30 Weise durchführen, beispielsweise durch Kultivieren des Streptomyces-Organismus in Gegenwart assimilierbarer

Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und in Anwesenheit von anorganischen Salzen.

Die assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und die Mineralien können als einfache oder komplexe Nährstoffe vorliegen. Als Kohlenstoffquellen kann man im allgemeinen Glucose, Maltose, Stärke, Glycerin, Melassen, Dextrin, Lactose, Sucrose, Fructose, Carbonsäuren, Aminosäuren, Glyceride, Alkohole, Alkane und 35 pflanzliche Öleeinsetzen. DieKoldenstoffquellen machen im allgemeinen 0,5 - 10Gew.-% desFermentationsmediums aus.

Stickstoffquellen sind im allgemeinen Sojäbohnenmehl, Maisquellwasser, Maisschlämpe, Hefeextrakte, Baumwollsamenmehl, Peptone, gemahlenes Nußmehl, Malzextrakt, Melassen, Casein, Aminosäuremischungen, Ammoniak (Gas oder Lösung), Ammoniumsalze oder Nitrate. Man kann auch Harnstoff oder andere Amide 40 einsetzen. Die Stickstoffquellen machen im allgemeinen 0,1 -10 Gew.-% des Fermentationsmediums aus.

Man kann auch mineralische Nährsalze zum Kulturmedium geben. Im allgemeinen setzt man Salze ein, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Eisen-, Magnesium, Zink-, Nickel-, Kobalt-, Mangan-, Vanadium-, Chrom-, Calcium-, Kupfer-, Molybdän-, Bor-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen liefern können.

Auch ein Antischaummittel kann zugegen sein, um ein exzessives Schäumen zu vermeiden. Dies wird in den 45 erforderlichen Abständen zugegeben.

Die Kultivierung des Streptomyces-Organismus führt man im allgemeinen bei einer Temperatur von20 - 50 °C, vorzugsweise bei 25 - 40 °C, und insbesondere bei etwa 34 °C durch. Es ist von Vorteil dabei zu belüften und das Medium in Bewegung zu halten, beispielsweise durch Schütteln oder Rühren. Das Medium kann man am Anfang mit einer kleinen Menge einer Suspension des Mikroorganismus animpfen, der Sporen gebildet hat. Um jedoch eine 50 Wachstumsverzögerung zu vermeiden, kann man ein vegetatives Inokulum des Organismus herstellen, indem man eine geringe Menge des Kulturmediums mit der Sporenform des Organismus animpft und das erhaltene vegetative Inokulum in das Famentationsmedium transferiert. Man kann das vegetative Inokulum jedoch auch, was bevorzugt ist, auf ein oder mehrere Samengebiete, wo weiteres Wachstum stattfindet, transferieren, bevor man es in das hauptsächliche Famentationsmedium überführt Die Fermentation führt man im allgemeinen bei einem pH von 55 5,5 - 8,5, vorzugsweise 5,5 - 7,5, durch.

DieFermentation kann man während eines Zeitraums von 2-10 Tagen, z. B. während etwa 5 Tagen, durchführen. -9-

AT 396 250 B Wünscht man, ein Material von der gesamten Fermentation abzutrennen, das die Antibiotika S541 oder irgendeine Komponente oder irgendeinen Faktor davon enthält, oder möchte man irgendeinen der Komponenten oder Faktoren isolieren, dann kann man dies nach üblichen Isolierungs- und Auftrennverfahren durchführen. Die erfindungsgemäßen Antibiotika S541 sind vorwiegend in den Myzelen der Zellen enthalten. Sie werden jedoch auch 5 in der Fermentationsbrühe gefunden. Die Fermentationsbrühe kann entweder vor oder nach dem Klarwerden diesen

Isolierungsverfahren unterzogen werden. Eine Vielzahl derartiger Isolierungsverfahren stehen zur Verfügung.

Die Antibiotika S541 können nach einer Vielzahl von Fraktionierungsverfahren isoliert und abgetrennt werden; beispielsweise durch Adsorption-Eluierung, Präzipitation, fraktionierte Kristallisation und Lösungsmittelextraktion. Man kann diese Verfahren auch auf verschiedene Weise miteinander kombinieren. 10 Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen am besten durch Lösungsmittelextrakt ion, Chromatographie und fraktionierte Kristallisation isoliert und abgetrennt werden können.

Nach der Fermentation gewinnt man die Myzele auf übliche Weise, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Danach kann man das Material beispielsweise aus den Myzelen mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel extrahieren. Zu diesen Lösungsmitteln zählen Ketone, z. B. Aceton, Methylethylketon oder IS Methylisobutylketon; Kohlenwasserstoffe, z. B. Hexan; halogenierte Kohlenwasserstoffe, z. B. Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff oder Methylenchlorid; Alkohole, z. B. Methanol oder Ethanol; Diole, z. B. Propan-1,2-diol; oder Ester, z. B. Methylacetat oder Ethylacetat. Enthalten die Myzele signifikante Wassermengen, dann setzt man vorzugsweise ein wasserlösliches Lösungsmittel ein.

Im allgemeinen ist mehr als eine Extraktion wünschenswert, um eine optimale Ausbeute zu erzielen. Vorzugs-20 weise führt man die erste Extraktion unter Verwendung eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wie Methanol oder Aceton, durch. Die Antibiotika kann man als Rohextrakt durch Entfernen des Lösungsmittels gewinnen. Die Lösungsmittelextrakte kann man dann selbst, gewünschtenfalls nach Reduktion des Lösungsmittelvolumens, beispielsweise durch Emengen, extrahieren. In dieser Stufe ist es bevorzugt, ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie Hexan, Chloroform, Methylenchlorid oder Ethylacetat oder Mischungen davon einzusetzen, 25 wobei man ausreichend Wasser zugibt, um eine ausreichende Trennung der antibiotischen Verbindungen zu erzielen.

Nach Entfernen der mit Wasser nicht mischbaren Phase erhält man ein Material, das die Antibiotika S541 enthält. Gewünschtenfalls kann man den Faktor B durch Kristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Isopropanol, abtrennen.

Die Reinigung und/oder Trennung der wirksamen Bestandteile und/oder der Faktoren (vollständig oder von 30 anderen vorhandenen Makroliden) kann man auf übliche Weise durchführen, beispielsweise chromatographisch (einschließlich high performance liquid chromatography) an einem geeigneten Träger, wie Silika, einem nichtfunktionellen makronetzförmigen Adsorptionsharz, wie beispielsweise vernetzte Polystyrolharze, wie Amberlite XAD-2-, XAD-4- oder XAD-1180-Harze (Rohm & Haas Ltd.) oder S112-Harz (Kastell Ltd.) oder an einem organischen lösungsmittelkompatiblen vernetzten Dextran, wie SephadexLH20 (Pharmacia UK Ltd.), oder im Falle 35 von hplc an Umkehrphasenträgem, wie durch Kohlenwasserstoffe verbundenes Silika, z. B. Cjg-verbundenes Silika, durchführen. Der Träger kann in Form eines Bettes vorliegen. Vorzugsweise ist er in einer Säule gepackt Setzt man nicht-funktionelle makrovemetzte Harze, wie XAD-1180 oder S112 ein, dann kann man Mischungen organisch« Lösungsmittel, wie Acetonitril/Wasser, für die Elution einsetzen.

Im allgemeinen gibt man eine Lösung der Verbindungen in einem geeigneten Lösungsmittel auf die Silika- oder 40 Sephadex-Säule, nachdem man gewünschtenfalls das Lösungsmittelvolumen reduziert hat Die Säule kann man gewünschtenfalls waschen. Dann eluiert man mit einem Lösungsmittel geeigneterPolarität Setzt man Sephadex und Silika ein, dann kann man Alkohole, wie Methanol; Kohlenwasserstoffe, wie Hexan; Acetonitril; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform oder Methylenchlorid; oder Ester, wie Ethylacetat, als Lösungsmittel verwenden. Man kann auch Kombinationen dieser Lösungsmittel untereinander oder mit Wasser einsetzen. 45 Die Elution und Trennung/Reinigung der erfindungsgemäß erhaltenen Verbindungen kann man auf übliche

Weise überwachen, beispielsweise chromatographisch, z. B. dünnschichtchromatographisch, und durch high performance liquid chromatography, oder indem man sich die zuvor beschriebenen Eigenschaften der Verbindungen zunutze macht.

Bei der Chromatographie an Silika, vorzugsweise unter Verwendung eines Eluierungsmittels, wie 50 ChloroformrEthylacetat, trennen sich die Antibiotika S541 ohne Schwierigkeiten in die Komponenten I und Π auf, wobei dieKomponentel zuersteluiert wird. Die Faktoren B, E und F können dann ohne weiteres chromatographisch aus der Komponentel erhalten werden, beispielsweise durch hplc. In ähnlicher Weise können die Faktoren A, C und D ohne weiteres aus der Komponente Π isoliert werden. In alternativer Weise kann man den Faktor B von den Faktoren E und F durch Kristallisierung aus einem Alkohol, wie Methanol oder Isopropanol, abtrennen. Die 55 Mutterflüssigkeiten, welche die Faktoren E und F enthalten, kann man gewünschtenfalls weiter reinigen, beispiels weise chromatographisch an Silika. Die Faktoren E und F isoliert man mittels hplc. Hat man die Faktoren einmal erhalten, dann kann man sie weiter durch Kristallisierung aus beispielsweise Methanol, Isopropanol oder einer Methanol/Wasser-Mischung reinigen. Die Erfindung umfaßt somit auch die Verbindungen in kristalliner Form. -10-

AT 396 250 B

Durch eine geeignete Kombination der zuvor beschriebenen Arbeitsweisen kann man die erfindungsgemäßen Verbindungen als Feststoffe isolieren. Dabei kann man die Reihenfolge, in welcher man die oben beschriebenen Reinigungsstufen durchführt, und auch die Art der Reinigung in einem großen Bereich variieren.

So wurde der Faktor B als kristalliner Feststoff mit einer Reinheit größer als 90 % erhalten. In ähnlicher Weise wurden die Faktoren A, C, D, E und F in einer Reinheit größer als 90 % erhalten. Die Faktoren können jedoch, wie dies oben ausgeführt ist, je nach dem beabsichtigten Einsatzgebiet in unterschiedlichen Reinheitsgraden eingesetzt werden. Zum Einsatz in der Humanmedizin ist eine Reinheit von mindestens 90 % und vorzugsweise von größer als 95 % wünschenswert Für die Verwendung in der Veterinärmedizin oder in der Landwirtschaft oder im Gartenbau sind niedrigere Reinheitsgrade ausreichend, beispielsweise 50 % oder niedriger.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Dabei werden folgende Abkürzungen benutzt: de = Dünnschichtchromatographie (unter Verwendung von Merck 5735 Silika 60 Platten: entwickelt mit CHCl3:Ethylacetat (3:1), soweit nichts anderes angegeben ist); CCM = Säulenchromatographie, gepackt mit Merck 7734 Silika 60 (200 x 4 cm Säule, sofern nichts anderes angegeben ist) und eluiert mit CHCl3:Ethylacetat (3:1), sofern nichts anderes angegeben ist; hplc = high performance liquid chromatography; PE = Petrolether (Siedepunkt 60 - 80 °C, sofern nichts anderes angegeben ist); 1 = Liter;

EA = EthylacetaL

Bei den in den Beispielen genannten Medien A, B und C handelt es sich um folgende: Medium A gl*1 D-Glucose 15,0 Glycerin 15,0 Sojapepton 15,0 NaCl 3,0 CaC03 1,0 Man füllt mit destilliertem Wasser auf 11 auf und stellt den pH mit einer wäßrigen NaOH-Lösung auf pH 7,0 ein, bevor man sterilisiert. Medium B gl'1 D-Glucose 2,5 Malzdextrin MD 30E (Roquette (UK) Ltd.) 25,0 Arkasoy 50 (British Arkady Co. Ltd.) (Sojabohnenmehl) 12,5 Melassen U k2hpo4 0,125 Calciumcarbonat 1,25 MOPS (3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure) 21,0 Man füllt mit destilliertem Wasser auf 11 auf und stellt den pH mit 5N NaOH auf 6,5 ein, bevor man sterilisiert. Medium C gi'1 D-Glucose 2,5 Malzdextrin MD 30E (Roquette (UK) Ltd.) 25,0 Arkasoy 50 (Sojabohnenmehl) 12,5 Zuckerrübenmelassen U k2hpo4 0,125 CaC03 1,25 Silikon 1520 (Dow Coming) (Antischaummittel) 0,625

Man füllt mit destilliertem Wasser bis 11 auf und stellt den pH auf 6,5 ein, bevor man sterilisiert. -11 -

AT 396 250 B

PtiSBlgLl

Sporen von Streptomyces thermoarchaensis NCIB12015 wurden durch Impfung auf Schrägagar übertragen, der aus folgenden Bestandteilen aufgebaut war: 5 gl'1

Hefeextrakt (OxoidL21) 0,5

Maisextrakt (Oxoid L39) 30,0 mykologisches Pepton (Oxoid 40) 5,0 10 Agar Nr. 3 (Oxoid L13) 15,0

Mit destilliertem Wasser wurde auf 11 aufgefüllt, der pH auf etwa 5,4 eingestellt und 10 Tage bei 28 °C inkubiert. Der entwickelte Schrägagar wurde dann mit einer 10%igen Glycerinlösung (6 ml) bedeckt und mit einem sterilen Werkzeug gekratzt, um die Sporen und das Myzel zu lockern. 0,4 ml Aliquots der erhaltenen Sporensuspension 15 wurden in dünne sterilePolypropylenröhrchen überführt, die dann mit Hitze verschlossen wurden und im Dampf vom flüssigen Stickstoff bis zur Verwendung gelagert wurden.

Der Inhalt eines einzelnen dünnen Röhrchens wurde verwendet, um 10 ml des Mediums A zu beimpfen, das dann 3 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 250 UpM (Durchmesser der Umlaufbahn: 50 mm) bei 28 °C inkubiert wurde. Dieses inkubierte Medium wurde eingesetzt, um 15 Röhrchen und zwei 250 ml Erlenmeyer-Kolben, die lOmlbzw. 20 50 ml Medium B enthielten, anzuimpfen (Gehalt 2 %).

Die Röhrchen und Kolben wurden 5 Tage bei 28 °C gehalten. Die Kulturen wurden dann getrennt im Vakuum filtriert. Die Zellen wurden 30 min mit Methanol geschüttelt, wobei das Methanolvolumen demjenigen des Kulturfiltrats entbrach.

Von den Extrakten der Zellen, die sowohl in den Röhrchen als auch in den Kolben gewachsen waren, wurde 25 festgestellt, daß sie gegen Caenorhabditis elegans wirksam sind. Diese Myzelextrakte wurden zusammengegeben, zur TrockeneeingeengtundmitMethanolzueinemKonzentrat(6ml)reextrahiert, das auf eine Säulegegeben wurde, die mit Sephadex LH20 (110 x 2,5 cm) gepackt war. Es wurde mit Methanol eluiert. Es wurden 10 ml Fraktionen gesammelt

Die Fraktionen 21-28 wurden vereinigt und eingeengt, wobei ein öliger Rückstand (156 mg) erhalten wurde, der 30 mit CHCl^EA (3:1) extrahiert wurde. Es wurde ein Extrakt (3 ml) erhalten, der einer CCM (55 x 2,5 cm Säule) unterworfen wurde. Es wurden 10 ml Fraktionen gesammelt und mittels tlc unter Verwendung von Platten, die einen Fluoreszenzindikator enthielten, analysiert. Die Fraktionen 20 bis 23 und 36 bis 44 führten zu zwei Hauptflächen, welche die Fluoreszenz unterdrückten. Diese wurden als Komponente I (Rf 0,70) und als Komponente II (Rf 0,43) identifiziert. Durch Abziehen der Fraktionen 20-23 wurde die Komponente I als Feststoff (9 mg) erhalten; 35 238 nm, E^ 340; \aaK 245 nm, E^ 350; und Xmax 254 nm, E* 200.

Durch Einengen der Fraktionen 36 bis 44 wurde die Komponente Π als Feststoff (11 mg) erhalten; 40 238 nm, E^ 440; λιη3χ 245 nm, E^ 460; und 254 nm, E* 280.

Beispiel 2

Zwei250ml Erlenmeyer-Kolben, die 50 ml Medium A enthielten, wurden jeweils mit 0,2 ml einer Sporensuspension von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 angeimpft, die aus dem dünnen Röhrchen stammte, das gemäß 45 Beispiel 1 hergestellt worden war. Die Kolben wurden 3 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 250 UpM (Durchmesser der Umlaufbahn: 50 mm) bei 28 °C inkubiert. Der Inhalt der beiden Kolben wurde zum Animpfen eines 201 Fermentergefäßes verwendet, das 121 Medium B enthielt Die Kultur wurde nach 5-tägigem Wachstum geerntet und wie in Beispiel 3 beschrieben bearbeitet.

Nach einem 5-tägigen Wachstum bei 28 °C wurde die gemäß Beispiel 2 erhaltene Famentationsbrühe (121) 50 geerntet und zentrifugiert (4.200 UpM bei 10 °C und 15 min). Das Zellpellet wurde mit 51 Methanol vermischt und 20 h bei 4 °C stehengelassen. Der Myzelextrakt wurde filtriert, bei 40 °C eingeengt und nach Zugabe von 100 ml Butan-l-ol einer azeotropen Destillation unterworfen. Der Extrakt wurde dann mit 5 x 200 ml Methanol behandelt Die vereinigten Extrakte wurden auf 100 ml eingeengt und auf eine Sephadex LH20-Säule (112 x 5 cm) gegeben. Die Säule wurde mit Methanol eluiert. Nach einem Vorlauf von 200 ml wurden 50 ml Fraktionen gesammelt Die 55 Fraktionen40-90 wurden vereinigt und zu einem öligen Rückstand (3,85 g) eingeengt. Dieser Rückstand wurde mit 77 ml CHC^EA (3:1) extrahiert, filtriert und dann einer CCM unterworfen. Nach einem Vorlauf von200ml wurden etwa 15 ml Fraktionen gesammelt. -12-

AT 396 250 B

Die Fraktionen 124 bis 142, welche die Komponente I enthielten, wurden vereinigt und zu einem Feststoff (253 mg) eingeengt. Davon wurden 216 mg mittels hplc (Zorbax ODS, 25 x 2,1 cm, 80 % CH3CN/H2O) gereinigt. Die Fraktionen 250bis 320, welche die Komponente II enthielten, wurden vereinigt und zu einem Feststoff (602 mg) eingeengt, von dem 540 mg mittels hplc (wie bei den Fraktionen 124-142) gereinigt wurden. Es wurden Fraktionen von verschiedenen Läufen gesammelt.

Das von der hplc-Säule eluierte Material wurde UV-spektroskopisch bei 243 nm überwacht Bei dieser Wellenlänge absorbierende Peaks (Fraktionen) wurden getrocknet und i) auf Aktivität gegen Caenorhabditis elegans getestet und ii) dünnschichtchromatographisch analysiert.

Vier Peaks, die gegen Caenorhabditis elegans aktiv waren, besaßen auch einenRf-Wert in einem Bereich von 0,39 bis 0,46 oder 0,70 bis 0,75.

Die Komponente I führte zu einem Peak mit einem Rf-Wert von 0,70 bis 0,75. Dieser Peak wurde mit Faktor B bezeichnet Die Komponente II ergab drei Peaks mit Rf-Werten von 0,39 bis 0,46. Diese Peaks wurden als Faktoren A, C und D bezeichnet

Der Faktor A wurde von der hplc-Säule von 260 bis 340 ml nach Injektion der Probe eluiert und besaß einen Rf-Wert von 0,44 (dünnschichtchromatographisch). Der Faktor B wurde von der hplc-Säule zwischen 270 bis 310 ml nach der Injektion der Probe eluiert und besaß einen Rf-Wert von 0,72 (dünnschichtchromatographisch). Der Faktor C wurde von der hplc-Säule zwischen 160 bis 180 ml nach der Injektion der Probe eluiert und besaß einen Rf-Wert von 0,4 (dünnschichtchromatographisch). Der Faktor D wurde von der hplc-Säule zwischen 220bis250 ml nach Injektion der Probe eluiert und besaß einen Rf-Wert von 0,42 (dünnschichtchromatographisch). Die weiteren Charakteristika der Faktoren A, B, C und D sind nachfolgend beschrieben.

Beispiel 4 0,4 ml einer Sporensuspension des Organismus Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, die von einem gemäß Beispiel 1 hergestellten dünnen Röhrchen genommen wurde, wurde zum Animpfen eines250ml Erlenmeyer-Kolbens verwendet, der 50 ml Medium A enthielt. Der Kolben wurde 4 Tage bei 28 °C auf einem Rotationsschüttler bei 250 UpM inkubiert (Durchmesser der Kreisbewegung: 50 mm). 8 ml Portionen wurden dann verwendet, um jeweils zwei 21 Kolben mit flachem Boden anzuimpfen, die jeweils 400 ml desselben Mediums enthielten. Danach wurde 3 Tage bei denselben Bedingungen inkubiert.

Der Inhalt der beiden Kolben wurde dann zum Impfen eines 70 1 Fermentergefäßes verwendet, das 40 1 Medium B enthielt, dem das Antischaummittel auf Silikonbasis Silicone 525 (Dow-Corning; 0,0625 % (v/v)) zugesetzt war. Die Fermentation wurde unter Rühren durchgeführt. Dabei wurde so stark belüftet, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer als 20 % der Sättigung war. Silikon-Antischaummittel wurde zugegeben, wenn es erforderlich war. Nach 10 Tagen wurde die Fermentation geerntet Die Brühe (401) wurde mittels Zentrifugieren (15.000 UpM) geklärt Der überstehende Rest wurde mit Wasser (51) verdrängt Die gewonnenen Zellen (1,4 kg) wurden bei -20 °C gefroren.

Nach 1 Woche wurden die gefrorenen Zellen aufgetaut, in 151 Methanol suspendiert und vorsichtig 15 h gerührt. Die Suspension wurde dann filtriert und der feste Rückstand wurde mit 101 Methanol reextrahiert Das vereinigte Filtrat (251) wurde mit 121 Wasser verdünnt und mit 251PE extrahiert Nach 30 min wurden die Phasen durch Zentrifugieren getrennt.

Die untere, Methanolphase wurde dreimal mit PE (251,151 und 151) reextrahiert Die vereinigten PE-Phasen (801) wurden konzentriert, indem sie dreimal durch einen Pfaudler 8.8-12V-27 wiped-film-Verdampfer (Dampfdruck 0,1 bar, Dampftemperatur 20 °C, Wasserdampf temperatur 127 °C) gegeben wurde. Das Konzentrat (81) wurde über Natriumsulfat (1 kg) getrocknet und bei vermindertem Druck bei 40 °C in einem Rotationsfilmverdampfer weiter konzentriert Der ölige Rückstand (15 ml) wurde in einer Mischung von CHCI3 und EA (70 ml, 3:1 Volu-men/Volumen) gelöst und einer CCM unterworfen. Es wurden Fraktionen von etwa 40 ml nach einem Vorlauf von 1.400 ml gesammelt

Die Fraktionen 45-65 wurden vereinigt und eingeengt, wobei der Faktor B (940 mg; wie in Beispiel 3 definiert) erhalten wurde, der zweimal aus Methanol und schließlich aus Nitromethan kristallisiert wurde. Die Kristalle wurden einer Einzelkristall-Röntgenstrukturanalyse unterworfen. Es zeigte sich, daß sie orthorhombische, klare Prismen waren mit a = 10.171(3), b = 13.317(5), c = 25.032(7) Ä, V = 3391 Ä3, Z = 4, Raumgruppe P212121, D^.=l,18 gern*3, R=0,053 für 2169 beobachtete unabhängige Reflexe (Θ < 58°), gemessen miteinem Diffraktometer mit Kupfer-Ka-Strahlung (λ = 1.54178Ä). Die röntgenographisch bestimmte Kristallstruktur ist in Fig. 5 gezeigt -13-

AT 396 250 B

Beispiel 5

Ein Inokulum von Streptomyces thermoarchaensis NCIB12015 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt,' wobei die Wachstumsperiode 2 Tage betrug. Dieses Inokulum wurde zum Animpfen eines Fermentergefäßes (701) verwendet, das 401 Medium B enthielt, das anstelle von Silicone525 mitdem Antischaummittel aufPolypropylenbasis Polypropylen2000 (0,06% Volumen/Volumen) versetzt war. Polypropylen2000wurde erforderlichenfalls während der Fermentation zugegeben, um die Schaumbildung unter Kontrolle zu halten. Die Fermentation wurde bei 28 °C unter Rühren durchgeführt. Dabei wurde derart belüftet, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer war als 30 % der Sättigung. Nach 24-stündiger Fermentation wurde ein Teil der Brühe (91) in einen Fermenter (7001) überführt, der 4501 eines Mediums enthielt, das sich wie folgt zusammensetzte: gl'1 D-Glucose 2,8

Malzdextrin (MD 30E) 27,8

Arkasoy 50 (Sojabohnenmehl) 13,9

Melassen 1,7 K2HP04 0,14

CaC03 1,39

Silikon 525 (Dow Coming) (Silikon-Antischaummittel) 0,06 % (v/v)

Vor der Sterilisierung auf pH 6,5 eingestellt.

Die Fermentation wurde bei 28 °C unter Schütteln durchgeführt. Dabei wurde so stark belüftet, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer war als bei 20 % Sättigung. Polypropylen 2000-Antischaum wurde erforderlichenfalls hinzugegeben. Nach 2 Tagen wurde der pH durch Zugabe von HjSC^ auf 7,2 eingestellt. Die Fermentation wurde nach 5 Tagen geerntet.

Die Brühe (4501) wurde durch Zentrifugieren geklärt. Der überstehende Rest wurde mit 201 Wasser verdrängt Die gewonnenen Zellen (25,5 kg) wurden 1 h in einem so großen Volumen Methanol gerührt, daß ein Gesamtvolumen von 751 erhalten wurde. Die Suspension wurde filtriert und der feste Rückstand wurde mit 351 Methanol reextrahiert und filtriert Das vereinigte Filtrat (871) wurde mit 401 Wasser verdünnt und mit PE extrahiert Nach 30 min wurden durch Zentrifugieren die Phasen getrennt. Die untere Methanolphase wurde mit 301 PE nach der Zugabe von 401 Wasser reextrahiert. Nach Abtrennen wurde die untere Phase wiederum mit 301 PE extrahiert Die vereinigten E-Phasen (851) wurden konzentriert, indem sie dreimal durch einen Pfandler 8.8-12V-27 wiped-film-Verdampfer (Dampfdruck 0,1 bar, Dampftemperatur 20 °C, Wasserdampftemperatur 127 °C) gegeben wurden. Das Konzentrat (91) wurde mit Natriumsulfat (2 lg) getrocknet und bei vermindertem Druck bei 40 °C in einem Rota-Film Verdampfer eingeengt. Derölige Rückstand (130 g) wurde in CHCI3 gelöst so daß 190 ml erhalten wurden. Dies wurde einer CCM unterworfen (gepackte Säule und gewaschen (500 ml) in CHCI3). Fraktionen von etwa 40 ml wurden nach einem Vorlauf von 1.400 ml gesammelt.

Die Fraktionen 32-46 wurden vereinigt und zu einem Öl (21,2 g) eingeengt Die Fraktionen 47-93 wurden vereinigt und zu einem Öl (20,1 g) eingeengt, das in CHCtyEA (3:1) gelöst wurde (50 ml). Dann wurde eine CCM durchgeführt wobei Fraktionen von etwa40 ml nach einem Vorlauf von 1.400ml gesammelt wurden. DieFraktionen 22-36 wurden vereinigt und zu einem Öl (3,1 g) eingeengt, das zu dem aus denFraktionen32-46von der ersten Säule erhaltenen Öl gegeben wurde. Die vereinigten Öle wurden in siedendem Methanol (4 ml) gelöst das dann zu heißem Propan-2-ol (20 ml) gegeben wurde, wobei nach Stehen kristalliner Faktor B (2,57 g) erhalten wurde.

Nach der Kristallisation des Faktors B wurde die Mutterflüssigkeit zu einem Öl eingeengt, das in einem gleichen Volumen (¾¾ gelöst und auf eine Säule (30 x 2,2 cm) von Merck Kieselgel 60 (0,212 - 0,063 mm Korngröße, ArtNr. 7734; gepackt in CH2CI2) gegeben wurde. Das Bett wurde mit 0¾¾ (2-Bettvolumen) gewaschen und mit CHCfyEA (3:1) (2-Bettvolumen) eluiert. Nach Abziehen des Eluats wurde ein Öl erhalten, das in Methanol gelöst wurde und mit dem eine präparative HPLC an Spherisorb S5 ODS-2 (HPLC-Träger auf Kieselsäurebasis) (250 mm x 20 mm, Phase Sep.Ltd.) durchgeführt wurde. Die Probe (5 ml) wurde während eines Zeitraums von 1 min auf die Säule gepumpt. Die Säule wurde mit Acetonitril:Wasser (7:3) bei den folgenden Bedingungen eluiert:

Zeit (mini Fluß fml/minl 0,00 0,00 )Injektions- 1,00 0,00 ) zeit 1,10 30,00 -14-

AT 396 250 B (Fortsetzung)

Zeit (mini Fluß fml/minl 39,90 30,00 40.00 35,00 75.00 35,00

Das von der hplc-Säule eluierte Material wurde UV-spektroskopisch bei 238 nm überwacht Einengen der vereinigten Fraktionen mit Peaks, die bei 26,3 min eluierten, ergab den Faktor E als Feststoff. Einengen der vereinigten Fraktionen mit Peaks, die bei 36,4 min eluierten, ergab den Faktor F als Feststoff. Die weiteren Charakteristika der Faktoren E und F sind nachfolgend beschrieben. E.siaüsl.6

Eine nach 117 h geerntete Fermentationsbrühe (ähnlich der in Beispiel 2 hergestellten) wurde in einem Autoklaven (121 °C, 1 h) behandelt, auf Raumtemperatur gekühlt und mit einem Magnetrührer gerührt, so daß eine homogene Zellsuspension erhalten wurde. Zwei Portionen (2 ml) wurden zentrifugiert (12.000 g; 2 min; Raumtemperatur). Die überstehenden Flüssigkeiten wurden dekantiert und die zurückbleibenden Zellen wurden in 2 ml Wasser suspendiert, gründlich gemischt und wiederum zentrifugiert (12.000 g; 2 min; Raumtemperatur). Nach Abdekantieren der überstehenden Flüssigkeiten wurden die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser (2 ml Portionen) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden dann gründlich entweder mit 2 ml Wasser oder mit 2 ml Methanol vermischt und bei Raumtemperatur 1,5 h stehengelassen, wobei gelegentlich geschüttelt wurde. Die Suspensionen wurden wiederum zentrifugiert (12.000 g; 2 min; Raumtemperatur) und die überstehenden Flüssigkeiten wurden sequentiell in Wasser verdünnt. Die Zellen von der wäßrigen Suspension wurden in Wasser resuspendiert und unmittelbar sequentiell in Wasser verdünnt. Portionen (10 μΐ) jeder dieser Verdünnungen wurden zu einer Suspension (200 μΐ) des Nematoden Caenorhabditis elegans in einer Pufferlösung gegeben, die NajHPC^ (6 g/1), K2HPO4 (3 g/1), NaCl (5 g/1) und MgSC^J^O (0,25 g/1) enthielt und auf pH 7,0 eingestellt war. Nach 4 h wurden die Nematodensuspensionen begutachtet, um festzustellen, welche Verdünnungen der Testmischung eine völlige Inhibierung der Motalität (größer als 98 %) der Nematoden in der Assay-Suspension bewirkt hatten. Es wurde gefunden, daß 1 zu 5,1 zu 25,1 zu 250 und 1 zu 500 Verdünnungen des Methanolextrakts, 1 zu 5,1 zu 25, 1 zu 250,1 zu 500 und 1 zu 1000 Verdünnungen der Zellsuspension und 1 zu 2,1 zu 4 und 1 zu 8 Verdünnungen des wäßrigen Extrakts eine derartige Inhibierung der Nematoden bewirkten, wenn 10 μΐ zu 200 μΐ der Nematodensuspensionen gegeben wurden.

Beispiel 7 250 ml Erlenmeyer-Kolben, die entweder 50 ml Medium A oder 50 ml Medium B enthielten, wurden mit 0,4 ml einer Sporensuspension von Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 geimpft, die aus einem gemäß Beispiel 1 hergestellten dünnen Röhrchen stammte. Die das Medium A oder Medium B enthaltenden Kolben wurden 2 Tage bei 28 °C auf einem Rotationsschüttler bei 250 UpM (Durchmesser der Kreisbewegung: 50 mm) inkubiert. 8 ml Portionen aus jedem Medium wurden dann zum Animpfen von 2 1 Kolben mit flachem Boden eingesetzt, die 400 ml desselben Mediums (A bzw. B) enthielten. Diese Kolben wurden 2 Tage bei denselben Bedingungen inkubiert.

Zwei 70 mlFermenter wurden jeweils mitzwei Kolben des Mediums Aangeimpftund ein weiterer 701 Fermenter wurde mit zwei Kolben des Mediums B angeimpft. Jeder Fermenter enthielt 401 des Mediums C.

Die Fermentationen wurden bei 34 °C unter Schütteln durchgeführt, wobei so starkbelüftet wurde, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer war als 30 % des Sättigungsgehalts. Nach einer etwa 24-stündigen Fermentation wurde der pH durch Zugabe wäßriger H2SO4 auf 7,2 eingestellt. Erforderlichenfalls wurde Polypropylenglykol 2000-Anti-schaummittel zugegeben. Nach 5 Tagen wurden diese Fermentationen geerntet und vereinigt

Ein weiterer 701 Fermenter, der Medium B enthielt, dem Silicone 1520 (0,06 %) zugegeben worden war, wurde ebenfalls mit zwei Medium B enthaltenden Kolben angeimpft. Die Fermentation wurde bei 28 °C unter Schütteln durchgeführt. Dabei wurde so starkbelüftet daß der gelöste Sauerstoffgehaltgrößer war als 30 % des Sättigungsgehalts. Erforderlichenfalls wurde Polypropylenglykol 2000 zugegeben, um die Schaumbildung unter Kontrolle zu halten. Nach 24 h wurde ein 91-Teil in einen 7001-Fermenter überführt der 4501 Medium C enthielt

Die Fermentation wurde bei 34 °C unter Schütteln durchgeführt, wobei so stark gelüftet wurde, daß der gelöste Sauerstoffgehalt größer war als 30 % des Sättigungsgehalts. Die Schaumbildung wurde durch Zugabe von Polypropylenglykol 2000 unter Kontrolle gehalten. Nach etwa 24 h wurde der pH durch Zugabe wäßriger H2SO4 auf 7,2 eingestellt. Die Fermentation wurde nach 4 Tagen geerntet und mit den drei oben beschriebenen 40 1 Fermentationen vereinigt -15-

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Die vereinigten geernteten Brühen wurden zentrifugiert, kontinuierliche Durchflußzentrifuge, Typ Sharples AS16PY bei etwa 1201/h. Die im Zentrifugengefäß zurückbleibende überstehende Flüssigkeit wurde mit Wasser verdrängt.

Die gewonnenen Zellen (11,65 kg) wurden in Methanol (331) mit einem Silverson-Mischer emulgiert. Nach 5 60min wurde die Suspension durch ein Twilltuch filtriert Der Rückstand wurde erneut in Methanol (341) emulgiert.

Nach 40 min wurde die Suspension erneut filtriert Die Filtrate der beiden Methanolextraktionen wurden vereinigt

Die vereinigten Extrakte (53,51) wurden mit Wasser (271) und PE (271) vermischt Nach 20-minütigem Rühren wurden die beiden Phasen in einer Westfalia MEM 1256-Zentrifuge getrennt Die untere wäßrige Methanolphase (701) wurde mit Wasser (371) undPE (271) vermischt und gerührt und wie zuvor getrennt Die Grenzflächenemulsion 10 inderPE-Phase wurdemit Aceton (41) gebrochen. Die untere wäßrige Methanolphase (1081) wurde dann mit Wasser (40 Q und PE (271) ein drittes Mal vermischt und gerührt und wie zuvor getrennt, wobei Aceton (41) zum Klären der Grenzflächenemulsion eingesetzt wurde. Die drei Hexanextrakte wurden dann vereinigt

Der vereinigte PE-Exfrakt (851) wurde mit einem wiped-fUm-Verdampfer (Dampfdruck 0,15 bar, Dampftempe* ratur 26 °Q konzentriert. Das Konzentrat (31) wurde mit Natriumsulfat (2kg) getrocknet und dann weiterbei vermin-15 dertem Druck bei 40 °C eingeengt Das erhaltene Öl (639 g) wurde in 300 ml einer Mischung aus Chloroform und EA (3:1 Volumen/Volumen) gelöst und filtriert und durch ein Glasfaserpapier gewaschen. Das Filtrat und die zum Waschen eingesetzten Lösungsmittel (1060ml) wurden einer CCM unterworfen (Durchmesser 1500 mm x 100 mm), wobei bei einer Flußrate von 61/h eluiert wurde.

Die zwischen 8,8 und 13,11 eluierte Fraktion wurde vereinigt und bei niedrigem Druck zu einem Öl (56,3 g) 20 eingeengt während diezwischen 13,11 und 24,61 eluierte Fraktion in ähnlicher Weise bei niedrigem Druckzu einem hellgelben Feststoff (153,4 g) eingeengt wurde. Die erstere Fraktion enthielt im wesentlichen Faktor B, während letztere Fraktion eine Mischung der Faktoren A, B, C und D enthielt Der Faktor B in dieser letzteren Fraktion wurde nach und nach entfernt indem die zuvor beschriebene CCM-Chromatographie zweimal - das letzte Mal an frischem Silika - bei ähnlichen Bedingungen wiederholt wurde, wobei jedoch die Durchflußrate auf 31/h reduzint wurde. 25 Die die Faktoren A, C und D enthaltenden Peaks von der zweiten dieser Säulen wurden zwischen 8,8 und 17,61 eluiert während der übrige Faktor B, der darin enthalten war, in der dritten Säule äbgetrennt wurde, von der die Faktoren A, C und D zwischen 14 und 281 eluiert wurden. Dieses letzte Bulk-Eluat wurde bei vermindertem Druck zu einem Feststoff (114 g) eingeengt. Die den Faktor B von den beiden Säulen (7,5 · 8,8 1 bzw. 103 -13,41) wurden zu Ölen eingeengt (10,7 g bzw. 10 g) und mit dem von der ersten der drei Säulen erhaltenen 30 Öl vereinigt

Die den Faktor B enthaltenden Öle wurden in siedendem Methanol (25 ml) gelöst und mit siedendem Propan-2-ol (100 ml) vermischt. Nach Kühlen auf 4 °C kristallisierte der Faktor B. Er wurde abfiltriert, mit200ml Methanol gewaschen, auf -20 °C gekühlt und im Vakuum getrocknet. Es wurden 253 g des Faktors B erhalten.

Der Feststoff von der dritten Silikasäule, der die Faktoren A, C und D enthielt wurde im Vakuum bis zur 35 Gewichtskonstante (87 g) getrocknet. Proben (20 g) dieses Feststoffs wurden in 190 ml Methanol gelöst und mit 7:3 (v/v) AcetonitrikWasser auf 230 ml aufgefüllt. 5 ml Portionen dieser Lösung wurden dann chromatogra-phiert an einer Säule (Durchmesser 250 mm x 21,2 mm) mit dem HPLC-Trägermaterial auf Kieselsäurebasis: Spherisorb ODS-2 (Partikeldurchmesser 5 |im), wobei 7:3 Acetonitril: Wasser als Eluierungsmittel verwendet wurde. Die Durchflußrate wurde für etwa 10 s bei 20 ml/min gehalten. Dann wurde sie gleichmäßig während eines Zeitraums 40 von 22 min auf 34 ml/min erhöht und 3 min bei letzterem Wert gehalten. Die eluierten Faktoren wurden bei 238 nm detektiert. Der FaktorC wurde zwischen ll.Ound 13,4 min, der FaktorD zwischen 13,4 und 17,4 min und der Faktor A zwischen 17,4 und 23,0 min eluiert.

Die den Faktor C enthaltenden Fraktionen von jeder chromatographischen Trennung wurden vereinigt und bei vermindertem Druck zu einem Feststoff eingeengt. Die den Faktor A enthaltenden Fraktionen wurden in ähnlicher 45 Weise zu einem Feststoff eingeengt. Die den Faktor D enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zu einem unreinen Feststoff (7 g) vereinigt. Dieser wurde in 65 ml Methanol wiederum gelöst, mit 7:3 AcetonitrikWasser vermischt und wiederum an der zuvor beschriebenen Spherisorb ODS2-Säule (Kieselsäure-Träger) chromatographiert, wobei jedoch dieDurchflußrate bei 20 ml/min konstant gehalten wurde. Der Faktor D wurde nun zwischen 16 und 20 min eluiert Diese Fraktion von jedem chromatographischen Lauf wurde vereinigt Das vereinigte Eluat wurde 50 zu einem Feststoff eingeengt. Die drei die Faktoren A, C und D enthaltenden Feststoffe wurden über P2O5 im Vakuum bis zur Gewichtskonstante getrocknet (55 g, 7,0 g bzw. 1,21 g).

Von den vier nach diesem Verfahren isolierten Feststoffen konnte gezeigt werden, daß sie mit den authentischen Proben der Faktoren A, B, C und D übereinstimmen. 55 Beispiel 8 250 ml Erlenmeyer-Kolben, die 50 ml Medium B enthielten, wurden mit 0,5 ml einer Sporensuspension von jeweils Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111,12112,12113 und 12114 beimpft, welche von den gemäß Beispiel 1 hergestellten dünnen Röhrchen genommen wurden. -16-

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Die Streptomyces thennoarchaensis NCIB12111, NCIB12112 und NCIB12113 enthaltend»! Kolben wurden auf einem Drehschüttler bei 31 °C inkubiert. Der Streptomyces thennoarchaensis NCIB 12114 enthaltende Kolben wurde 2 Tage bei 28 °C inkubiert. Dann wurde 1 ml der Brühe zu einem weiteren 250 ml Erlenmeyer-Kolben transferiert, der 50 ml Medium B enthielt. Dieser Kolben wurde auf einem Drehschüttler bei 31 °C inkubiert Alle Kolb»! wurden bei 250 UpM geschüttelt (Kreisdurchmesser 50 mm).

Nach 4-tägiger Inkubation wurde ein 10 ml-Probe jeder Brühe bei 1250 g 45 min zentrifugiert und wie folgt weiterverarbeitet Das Pell» wurde in 10 ml Methanol resuspendiert Die Suspension wurde heftig geschüttelt und 1 h stehengelassen, wobei gelegentlich gemischt wurde. Die Suspension wurde dann bei 10.000g 5 min z»itrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde mittels HPLC (S5 ODS-2, Spherisorb, HPLC-Kieselsäureträger) 10 cm x 4,6 mm, 70 % CH3CN/Ö,1M NH4H2PO4) analysiert Die Peaks wurden bei 246 nm überwacht

Die hplc-Analyse zeigte, daß die Faktoren A, B, C und D in jedem Fall vorhanden waren.

Beispiel 9

Es wurde festgestellt, daß die Faktoren A, B, C, D, E und F die folgenden Charakteristika besitzen: i) Sie enthalten lediglich Kohlenstoff, Wasserstoff und Sau»stoff. ii) Die Elektronenstoß (E.I.)-Massenspektroskopie der Faktoren A, B, C, D, E und F führte zu folgenden Ergebnissen:

Faktor Molekülion entspricht der Bruttoformel A 612.37 ^36%2°8 B 598.35 C35H50°8 C 584.34 ^34H48®8 D 598.35 ^35H50?8 E 612.3638 C36H52°8 F 626.3807 C37H54°8

Die Fast Atom Bombardment (FAB)-Massenspektroskopie führte zu folgenden Ergebnissen:

Faktor +ve FAB -ve FAB Molekulargewicht A M/Z 635 [M+Na]+ M/Z 613 |M+H]+ M/Z 611 [M-Η]- 612 B M/Z 691 [M+H+qlycerol]+ M/Z599[M+H]+ M/Z581[MH-H20]+ M/Z 563 [ΜΗ^ΗλΟ]4-M/Z 607 [M+Nar 598 C M/Z 583 [M-H]" 584 D M/Z 621 [M+Na]+ M/Z 597 [M-Η]- 598

Die Felddesoiptionsmassenspektroskopie des Faktors E führte zu: M/Z 612 M+ und die des Faktors F zu: M/Z 626 M+. Ein E.I.-Spektrum des Faktors A, wobei die Masse genau gemessen wurde, ergab Ionen bei: 612.37 C36H5208; 466.31 C30H42O4; 448.30 C30H40O3; 425.23 C26H3305; 354.22 C23H30O3; 297.22 C21H290; 278.11 C15H1805;247.17 C16H2302; 219.18 C15H230; 95.05 C6H?0.

Ein E.I.-Spektrum des Faktors B, wobei die Masse genau gemessen wurde, ergab Ionen bei: 598.35 C^HjQOg; 438.28 C2gH3g04j 420.26 C2gH3g03: 314.19 U2QH2g03: 248.14 Cj^H2q03j 151.08 C9Hu02.

Ein E.I.-Spektrum des Faktors C, wobei die Masse genau gemessen wurde, ergab Ionen bei: 584.34 C-^I^gOg; 566.33 C^H^gO-yj 438.28 C2gH3g04· -17-

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Ein E J.-Spektrum des Faktors D, wobei die Masse genau gemessen wurde, ergab Ionen bei: 598.35 C35H50O8; 452.29 434.28 0^3303. 5 · Ein genaue Messung der Masse des Faktors E bei der E.I.-Ionisation ergab ein Ion bei: 452.2908 C29H4QO4; für den Faktor F ergab sich ein Ion bei: 466.3067 C3QH24O4. iii) DieFaktoren A, B, C, D, E und F besitzen in Bromoform charakteristische IR-Spektren, wozu folgende Peaks gehören: 10 Für Faktor Abei etwa 3510 (OH), 1712 (Ester) und 998 cm'* (C-O); für Faktor B bei etwa 3510 (OH), 1710 (Ester) und 996 cm"* (C-O);

Faktor C zeigt Peaks bei etwa 3510 (OH), 1712 (Ester) und 996 cm'* (C-O); j ^ Faktor D zeigt Peaks bei etwa 3508 (OH), 1711 (Ester) und 996 cm'1 (C-O);

Faktor E zeigt Peaks bei etwa 3500 (OH), 1708 (Ester) und 994 cm'1 (C-O); und Faktor F zeigt Peaks bei etwa 3500 (OH), 1708 (Ester) und 997 cm'1 (C-O).

Die vollständigen Spektren für die Faktoren A, B, C, D und F sind in den Figuren 1, 2, 3,4,6 und 7 der 20 nachfolgenden Zeichnungen gezeigt iv) Die Faktoren A, B, C, D, E und F besitzen in Methanol (c = 0,002 %) folgende UV-Spektren (I = Beugung und M = Maximum): 25 30 35

Faktor λ(ηηι) e1i A 252 (I) 318 244.5 (M) 468 239 (D 430 B 252 (I) 302 244.5 (M) 426 239 (I) 394 C 252 ö) 316 244.5 (M) 470 239 (I) 432 * Methanol c = 0,001%

Faktor X(nm) eIi D 252 (D 263 244.5 (M) 393 239 362 * E 252 (D 266 244 (M) 402 238 (M) 373 * F 252 (D 285 24,5 (M) 421 239 (M) 389 40

Es ist festzuhalten, daß die E1 j-Werte die Reinheit des erhaltenen Materials wiederspiegelt, während die oben aufgeführten Xmax-Werte für jeden Faktor charakteristisch sind. Jedoch sind die Verhältnisse der E^ charakteristisch für die Verbindung per se. 45 v) Ein 200 MHz-Protonen-NMR-Spektrum einer Lösung jedes Faktors in Deuterochloroform ergibt unter anderen folgende Signale [die τ-Werte sind zusammen mit den Multiplizitäten, den Koppelungskonstanten (Hz) und den Werten für die Integrale in Klammem angegeben]:

Faktor A: 50 4.1 to 4.4 (m,2H); 4.61 (breit,s,lH); 4.6 to 4.75 (m,2H); 4.81 (d,9,lH); 5.05 (m,lH); 5.34 (s,2H); 5.69 (d,5,lH); 6.06 (d,5,lH); 6.17 (m,lH); 6.26 (d,ll,lH); 6.37 (m.lH); 6.46 (d,10,lH); 6.74 (q,2,lH); 7.42 (m,lH); 7.7-7.9 (m,5H); 8.14 (s,3H); 8.40 (s,3H); 8.47 (s,3H); 8.61 (t,l 1,1H); 8.96 (d,7,3H); 9.06 (d,7,3H); 9.02 (d,7,3H); 9.13 (q,ll,lH); 9.21 (d,7,3H). -18- 55

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Faktor B: 42-4.4 (m,2H); 4.55 (q,7,lH); 4.65 (breit,s,lH); 4.6-4.8 (m2H); 5.06 (m,lH); 5.3-5.5 (m,2H); 6.01 (d5,lH); 6.07 (d,5,lH); 6.12 (s,lH); 6.24 (d,ll,lH); 6.24 (m,lH); 6.3 to 6.5 (m2H); 6.53 (s3H); 6.73 (q2.1H); 7.62 (m,lH); 7.6-8.0 (m,4H); 8.22 (s,3H); 8.35 (d,7,3H); 8.41 (s,3H); 8.49 (s,3H); 8.62 (t,ll,lH); 9.03 (d,6,3H); 9.12 (q,ll,lH); 9.22 (d,73H).

Faktor C: 429 (d,ll,t2,lH); 4.4-4.6 (m,3H); 4.56 (breit,s,lH); 5.14 (dd,15,10.1H); 5.23 (m,lH); 5.65 (breit^2H); 5.72 (d,6,lH); 5.95 (d.IO.lH); 5.99 (d,6,lH); 6.08 (breit.s.lH); 6.1-6.4 (m,3H); 6.62 (q,3.1H); 7.7-8.1 (m,ca7H); 8.18 (s3H); 8.33 (s3H); 8.48 (d,73H); 8.64 (s3H); 8.68 (t,l 1.1H); 9.00 (d,73H); 9.08 (d,7,3H); 9.12 (q,12,lH).

Faktor D: 4.18-4.4 (m2H); 4.47-4.81 (m,2H); 5.04 (m,lH); 5.35 (s2H); 5.72 (d,7.1H); 6.07 (d,7,lH); 6.15-6.45 (m,4H); 6.74 (q,4,lH); 7.45-8.1 (m,8H); 8.16 (s3H); 8.41 (s3H); 8.49 (s3H); 8.62 (t,ll,lH); 8.92-9.05 (m,6H); 921 (d,7,3H).

Faktor E: 4.1- 4.3 (m,2H); 4.5-4.8 (m,4H gesamt); 5.04 (m,lH); 52-5.5 (m2H);6.01 (d,5.1H); 6.05 (d,5,lH);6.U (s,lH); 6.1- 6.4 (m3H); 6.45 (d,10,lH); 6.51 (s3H); 6.70 (q,2.1H); 7.60 (m,lH); 8.20 (s3H); 8.41 (s3H); 8.47 (s3H); 8.60 (U1.1H); 9.00 (t,73H); 9.02 (d,6,3H); 9.11 (q,ll,lH); 9.20 (d,73H).

EaktorF: 42-4.4 (m2H); 4.62 (s,lH); ca 4.70 (m2H); 4.80 (d,9.1H); 5.04 (m,lH); 52-5.5 (m2H); 5.99 (d,5,lH); 6.05 (d,5,lH); 6.11 (s,lH); 6.1-6.3 (m2H); ca 6.36 (m,lH); 6.45 (d,10.1H); 6.51 (s3H); 6.70 (q2,lH); 7.42 (m,lH); 7.58 (m,lH); 8.19 (s3H); 8.40 (s3H); 8.47 (s3H); 8.60 (t,ll,lH); 8.95 (d,73H); 9.05 (d,73H); 9.01 (d,73H); 9.10 (q,ll,lH); 9.21 (d.63H). vi) Ein rausch-entkuppeltes25,05 MHz1^ C-NMR-Spektrum einer Lösung jedes Faktors in Deuterochloroform ergibt unter anderem folgende Peaks [die δ-Werte sind mit den Multiplizitäten der Signale im Off-Resonanzspektrum in Klammem angegeben]:

Faktor A: 173.2 (s); 142.6 (d); 139.2 (s); 137.6 (s); 137.1 (s); 137.0 (d); 130.4 (s); 123.1 (d); 120.1 (d); 117.8 (d); 99.5 (s); 80.0 (s); 79.0 (d); 76.5 (d); 69.0 (d); 68.3*; 67.4 (d); 482 (t); 45.5 (d); 40.9 (t); 40.5 (t); 35.8*; 343 (t); 22.1 (q); 34.5 (t); 26.6 (d); 22.6 (q); 22.0 (q); 19.7 (q); 15.3 (q), 13.7 (q);10.8 (q). * Multiplizität unsicher

Faktor P; 173.4 (s); 142.1 (d); 139.5 (s); 137.1 (s); 135.7 (s); 133,7 (s); 123.6 (d); 123.3 (d); 120.0 (d); 119.3 (d); 118.2 (d); 99.5 (s); 80.1 (s); 773 (d); 76.6 (d); 76.4 (d); 69.0 (d); 68.3 (d); 67.9*; 67.6*; 57.5 (q);482(t); 45.4 (d); 40.7 (t); 40.5 (t); 35.8*; 34.5 (t); 22.1 (q); 19.6 (q); 15.3 (q); 13.6 (q); 12.9 (q); 10.5 (q).

Faktor C: 173.3 (s); 1422 (d); 140.3 (s); 138.5 (s); 137.0 (s); 134.9 (s); 123.9 (d); 121.1 (d); 120.6 (d); 118.1 (d); 100.2 (s); 80.6 (s); 80.1 (d); 77.4 (d); 69.2 (d); 69.0 (d); 68.3*; 68.0 (d); 67.9 (d); 48.6 (t); 46.3 (d); 41.4 (t); 36.5*; 36.3*; 36.1 (d); 35.0 (t); 22.6 (q); 20.0 (q); 15.4 (q); 14.3 (q); 13.1 (q); 10.8 (q).

Faktor P: 1732 (s); 142.5 (d); 139.1 (s); 137.5 (s); 137.1 (s); 132.1 (s); 131.4 (d); 123.1 (d); 120.1 (d); 117.8 (d); 99.5 (s); 79.9 (s); 79.2 (d); 76.5 (d); 69.0 (d); 68.3*; 68.1*; 67.6*; 67.4*; 48.2 (t); 45.5 (d); 40.8 (t); 40.5 (t); 35.7*; 34.5 (t); 22.0 (q); 20.6 (t); 19.6 (q); 15.3 (q); 13.7 (q); 13.6 (q); 10.7 (q). * Multiplizität unsicher vii) Zirkulardichroismuoskurven für die Faktoren A, B, C und D (ca. 0,1%-ige Lösungen in Methanol) sind in Fig. 8 gezeigt Die Kurven sind im Bereich von 230 bis 260 nm, sehr ähnlich. In diesem Bereich absorbiert der -19-

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Dienchromophor. Dies zeigt an, daß die absoluten Konfigurationen an C2, C7, Cyj und für alle Faktoren die gleichen sind

Nachstehend sind Beispiele für erfindungsgemäß erhaltene Wirkstoffe enthaltende Formulierungen aufgeführt Der verwendete Ausdruck „Wirkstoff“ bezeichnet eine erfindungsgemäße Verbindung und kann beispielsweise für 5 einen der Faktoren A,B,C,D,E oder F stehen.

Parenterale Multidosisiniektion % G/V Bereich Wirkstoff 4,0 1 - 5 % G/V Benzylalkohol 2,0 Glyceryltriacetat 30,0 Propylenglykol auf 100 Man löst den Wirkstoff in Benzylalkohol und Glyceryltriacetat. Man gibt Propylenglykol bis zum gewünschten

Volumen zu. Man filtriert die Lösung, um partikelförmige Verunreinigungen zu entfernen. Das Produkt füllt man aseptisch in Injektionsampullen und verschließt mit Gummiverschlüssen oder Gummistopfen, die mit Aluminiumdeckelverschlüssen in Lage gehalten weiden. Zum Schluß wird das Produkt durch Erhitzen in einem Autoklaven 20 sterilisiert. Aetosolsprav % G/G Bereich 25 Wirkstoff 0,1 0,1 - 0,50 % G/G Trichlorethan 29,9 Trichlorfluormethan 35,0 Dichlordifluormethan 35,0 3°

Man mischt den Wirkstoff mit Trichlorethan und füllt in einen Aerosolbehälter. Den Luftraum im Flüssigkeitsbehält» spült man mit dem gasartigen Treibmittel. Dann befestigt man das Ventil. Man füllt das erforderliche Gewicht des flüssigen Treibmittels unter Druck durch das Ventil ein. Man stattet mit einer Betätigungsvorrichtung und mit Staubkappen aus. 35 MÜs

Herstellungsverfahren - Naßgranulierung mg

Wirkstoff 250,0 Magnesiumstearat 1 % G/G 4,5 Maisstärke 5% G/G 22,5 Natriumstärkeglykolat 2 % G/G 9,0 Natriumlaurylsulfat 1 %G/G 4,5 Mikrokristalline Cellulose bis zu einem Kerngewicht der Tablette von 450 mg

Zu dem Wirkstoff gibt man eine so große Menge einer 10%-igen Stärkepaste, daß man eine für die Granulierung 50 geeignete nasse Masse erhält. Man stellt die Kügelchen her und trocknet unter Verwendung eines Boden· oder Flüssigbetttrockners. Man siebt durch ein Sieb, gibt die übrigen Bestandteile zu und komprimiert zu Tabletten.

Erforderlichenfallskann man dieTablettenkememiteinemFilmüberziehen,wöbeiHydroxypropylmethylcellulose oder ein anderes ähnlich filmbildendes Material einsetzt, wobei man entweder ein wäßriges oder nicht-wäßriges Lösungsmittelsystem zur Anwendung bringt. 55 Der Lösung für den Filmüberzug kann ein Weichmacher oder ein geeigneter Farbstoff einverleibt sein. -20-

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Veterinärtablette für kleine Tiere oder Haustiere Herstellungsverfahren - Trockengranulierung mg

Wirkstoff 50,0

Magnesiumstearat 7,5

Mikrokristalline Cellulose bis zu einem Gewicht des Tablettenkems von 75,0

Man vermischt den Wirkstoff mit Magnesiumstearat und mikrokristalliner Cellulose. Die Mischung kompaktie.it man za Rohlingen. Man zerbricht die Rohlinge, indem man sie durch einen Rotationsgranulator gibt, um freifließende Tabletten zu produzieren. Man komprimiert zu Tabletten. Die Tablettenkeme kann man gewünschten-falls wie zuvor beschrieben mit einem Filmfibeizug ausstatten.

Veterinäre intrammäre Injektion mg/Dosis Bereich

Wirkstoff 150 mg 150 - 500 mg Polysorbat 60, Polyoxyethylensoibit-Monostearat 3,0% G/G bis3oder5g weißes Bienenwachs 6,0 % G/G bis 3 g bis 3 oder 5 g Erdnußöl 91,0 % G/G bis 3 oder 5 g

Man erhitzt das Erdnußöl, das Bienenwachs und Polysorbat 60 auf 160 °C, wobei man rührt. Man hält 2 Stunden bei 160 °C und kühlt dann unter Rühren auf Raumtemperatur ab. Den Wirkstoff gibt man aseptisch zu dem Träger und dispergiert unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsmischers. Man macht das Produkt fein«’, indem man es durch eine Kolloidmühle gibt. Man füllt das Produkt aseptisch in sterile Plastikspritzen.

Veterinärer oraler Arzneitrank %G/V Bereich Wirkstoff 0,35 0,05 - 0,50 %G/V Polysorbat 85, Polyoxyethylensorbit-trioleat 5,0 Benzylalkohol 3,0 Propylenglykol 30,0 Phosphatpuffer bis pH 6,0 - 6,5 Wasser auf 100,0

Man löst den Wirkstoff in Polysorbat 85, Benzylalkohol und Propylenglykol. Man gibt einen Teil des Wassers zu und stellt erforderlichenfalls mitdemPhosphatpuffer auf pH 6,0 bis 6,5 ein. Man gibt das restliche Wasser bis zum gewünschten Volumen zu. Man füllt das Produkt in Arzneitrankbehälter.

Veterinäre orale Paste %G/G Bereich Wirkstoff 7,5 1 -10 % G/G Saccharin 25,0 Polysorbat 85, Polyoxyethylensorbit-trioleat 3,0 Aluminiumdistearat 5,0 fraktioniertes Kokusnußöl bis 100,0 -21-

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Man dispergiert das Aluminiumstearatin dem fraktionierten Kokusnußöl undPolysorbat 85, (Polyoxyethylensorbit-trioleat), wobei man erhitzt. Man kühlt auf Raumtemperatur ab und dispergiert das Saccharin in dem möglichen Träger. Man dispensiert den Wirkstoff in der Basis. Man füllt in Plastikspritzen. 5 Kügelchen zur Verabreichung an Tiere im Futter % G/G Bereich

Wirkstoff 2,5 0,05-5%G/G 10 Kalksteinmehl bis 100,0

Man vermischt den Wirkstoff mit dem-Kalksteinmehl. Man stellt Kügelchen nach einem Naßgranulierungs-Verfahren her. Man trocknet unter Verwendung eines Boden- oder Flüssigbetttrockners. Man füllt in die geeigneten Behälter. 15

Emulgierbares Konzentrat

Wirkstoff 50 g

Anionischer Emulgator (z. B. Phenylsulfonat CALX) 40 g 20 nicht-ionischer Emulgator auf Nonylphenolethoxylat-Basis (z. B. Syperonic NP13) 60 g aromatisches Lösungsmittel mit hoher Reinheit (z. B. Solvesso 100) bis 11 25 Man mischt alle Bestandteile und rührt, bis sich alles gelöst hat.

Granulat (Kügelchen) a) Wirkstoff 50 g 30 Baumharz 40 g Gipskügelchen (0,85 - 0,25 mm Durchmesser) (z. B. Agsorb 100A) bis 1kg b) Wirkstoff 50 g 35 Syperonic NP 13 (nichtionischer Emulgator auf Nonylphenolethoxylat-Basis) 40 g Gipskügelchen (0,85 - 0,25 mm Durchmesser) bis 1kg

Man löst alle Bestandteile in einem flüchtigen Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid, und gibt zu den Kügelchen 40 im Trommelmischer. Man trocknet, um das Lösungsmittel zu entfernen.

Die Aktivität der Faktoren A, B, C, D und F wurde mit Hilfe einer Vielzahl von Schädlingen und deren Wirten bestimmt Dazu zählen die folgenden:

Tetranychus urticae (Feuerbohne und Myrobalan B Pflaume), Myzus persicae (Chinakohl und Rettich), Heliothis virescens (Baumwolle), Chilo portellus (Rapsbohne), Meloidogyne incognita (Mungobohne), Panonchus ulmi 45 (Myrobalan B Pflaume), Phorodon humuli (Hopfen), Aulacorthum circiumflexum (Alpenveilchen).

Das Produkt wurde als Flüssigpräparat eingesetzt Die Präparate wurden durch Lösen der Produkte in Aceton hergestellt. Die Lösungen wurden dann mit Wasser verdünnt, das 0,1 % oder 0,01 Gew.-% einesNetzmittels enthielt, bis die Flüssigpräparate die erforderliche Produktkonzentration enthielt

Die Testverfahren wurden dem jeweiligen Schädling angepaßt Dazu wurden eine Anzahl von Schädlingen auf 50 ein Medium gegeben, das gewöhnlich eine Wirtspflanze darstellt Dann wurde das Medium mit dem Präparat behandelt (Residualtest). Im Fall von Tetranychus urticae wurden sowohl die Schädlinge als auch das Medium mit dem Präparat behandelt (Kontakttest).

Bei diesen Tests wurde gefunden, daß die Faktoren A, B, C, D und Fin Konzentrationen (bezogen auf das Gewicht des Produktes) von 500 Teilen pro Million oder weniger wirksam waren. -22- 55

Claims (11)

1. AT 396 250 B PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen mit der Teilformel OH

   (i),

   -23- AT 396 250 B und insbesondere von Verbindungen der allgemeinen Formel OH

   1 r\ worin R eine Methyl-, Ethyl- oder Isopropylgruppe und R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus des Stammes Streptomyces thermoarchaensis NCIB12015odereinenMutanten davonkultiviert,sodaß die Verbindungproduziert wird,unddaßmangewünschten-falls anschließend mindestens eine der genannten Verbindungen aus der Fermentationsbriihe abtrennt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Verbindungen der (Teil-)For-meln I, Π oder m durch Kultur eines Stammes aus der Gruppe Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112,NCIB 12113 undNCIB 12114 und von deren Mutanten produziert wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der (Teil-)Formeln I, Π oder m produziert worden, worin R1 eine Isopropylgruppe und R2 ein Wasserstoffatom bedeuten.
4. 4. Vorfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Verbindungen der (Teil-)Formeln I, Π oder ΠΙ produziert werden, worin R* eine Methylgruppe und R2 ein Wasserstoffatom bedeuten.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die dort genannten Verbindungen im wesentlichen frei von anderen Makroliden produziert und bevorzugt in im wesentlichen reiner Form gewonnen weiden.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Mischungen von mindestens zwei Verbindungen mit den (Teil-)Formeln I, II oder III oder eine Mischung der Verbindungen der Formel m gemäß Anspruch 3, worin R2 ein Wasserstoffatom bedeutet; oder eine Mischung der Verbindungen nach Anspruch 3, worin R2 eine Methylgruppe bedeutet, produziert werden.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Verbindung der (Teil-)Fonneln I, Π oder ΙΠ, die in Form der gesamten Fermentationsbriihe, die mindestens eine solche Verbindung enthält; in Form der Feststoffe der gesamten Fermentationsbriihe, die mindestens eine solche Verbindung; in Form der aus ein«* derartigen Brühe abgetrennten und zerstörten oder lysierien Myzele oder in Form der Feststoffe einer solchen Brühe nach Abtrennung der unzerstörten oder lysierien Myzele oder in Form dieser Brühe nach Abtrennung der Myzele vorliegt, gewonnen wird. -24- AT 396 250 B
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man dieMyzeledesMikioorganismus der in diesen Ansprüchen genannten Stämme mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in Kontakt bringt, um mindestens eine der Verbindungen der (Teil-)Formeln I, Π oder ΙΠ daraus zu extrahieren.
9. 9. Mikroorganismus des Stammes Streptomyces thermoarchaensis NCIB12015 und dessen Mutanten.
10. 10. Mikroorganismen der Stämme Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 und/oder NCIB 12114 und Mutanten davon.
11. 11. Verfahren zur Bekämpfung von Infektionen oder von Schädlingsbefall, beispielsweise in der Landwirtschaft, im Gartenbau oder in der Forstwirtschaft, wobei man auf den Parasiten oder einen anderen Schädling oder auf den Pilz oder einen anderen für diese Infektionen oder den Befall verantwortlichen Organismus oder auf eine befallene Stelle eine wirksame Menge mindestens einer der in den Ansprüchen 1 bis 6 genannten Verbindungen der (Teil-JFor-meln I, Π oder ΠΙ oder eines mindestens eine der genannten Verbindungen enthaltenden Mittels aufträgt. Hiezu 5 Blatt Zeichnungen -25-