HU197046B - Process for producing macrolide compounds with antiparasitic effect, pharmaceuticals comprising them and plant protectives comprising the same - Google Patents

Process for producing macrolide compounds with antiparasitic effect, pharmaceuticals comprising them and plant protectives comprising the same Download PDF

Info

Publication number
HU197046B
HU197046B HU853466A HU346685A HU197046B HU 197046 B HU197046 B HU 197046B HU 853466 A HU853466 A HU 853466A HU 346685 A HU346685 A HU 346685A HU 197046 B HU197046 B HU 197046B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
priority
formula
compounds
december
factor
Prior art date
Application number
HU853466A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT39779A (en
Inventor
John B Ward
Hazel M Noble
Neil Porter
Richard A Fletton
David Noble
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB848423278A external-priority patent/GB8423278D0/en
Priority claimed from GB848432519A external-priority patent/GB8432519D0/en
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of HUT39779A publication Critical patent/HUT39779A/hu
Publication of HU197046B publication Critical patent/HU197046B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás új parazitaellenes hatású vegyületek előállítására Streptomyces organizmusok fermentációja útján.
A találmány szerinti eljárással új vegyületek állíthatók elő, melyeket S541 antibiotikumoknak neveztünk el, és amelyek egy eddig nem ismertetett mikroorganizmus törzs szabályozott körülmények között végzett tenyésztése útján állíthatók elő. AzS541 antibiotikumok paraztlaeüenes antiendoparazitikus. antiektoparazitikus, inszekticid, nematocid és akaricid hatással rendelkeznek, és a mező- és kertgazdaságban, valamint az állat- és humán gyógyászat területén alkalmazhatók. Ezek a vegyületek további hatásos vegyületek előállításához intermedierként is alkalmazhatók. A vegyületek a továbbiakban leírt módon, fermentációs úton állíthatók elő, és lényegében tisztán nyerhetők ki a megadott módszerekkel.
Az S541 antibiotikumok a (11) képletre! jellemezhetők.
A (III) képletnek megfelelő hat vegyületet részletesen ismertetjük a későbbiekben.
A találmány szerinti eljárással eiőáiiított vegyületeket bizonyos célokra, például mező- és kertgazdálkodásban vagy állatgyógyászatban elválasztás nélkül alkalmazhatjuk, más célokra azonban, például humán gyógyászati célokra célszerű a vegyületeket elválasztani és az egyedi vegyületeket alkalmazni.
Az S541 antibiotikumok szilikagélen kromatográfiásan a későbbiekben leírt módon két komponensre választhatók szét, amelyek parazitaellenes, például anti-hehnintikus aktivitással rendelkeznek, és amelyek az UV fluoreszcenciát 254 nro-nél kioítják. Az I komponens Rf értéke 0,70 és 0,75 között vám, a II komponens Rf értéke 0,39 és 0.46 között. Ezeket az értékeket vékonyréteg-kromatográfiával Merck 5735 szilikagél 60 lemezeken, kioroform és etilacetát 3:1 térfogatarányú eiegyével eluálva határoztuk meg. Az S541 antibiotikumok I és II komponensének előállítása (ahol R2 jelentése metilcsoport, illetve hidrogénatom) képezi a találmány tárgyát.
Az 1 és Π komponensek maguk is tovább finomíthatók, és így hat oiyau vegyülethez jutunk, amelyek parazitaellenes, például anti-helmintikus hatással rendelkeznek. A találmány tárgya tehát eljárás a (III) általános képletű vegyületek előállítására. A (Hí) általános képletben R1 jelentése metii-, etil- vagy izopropilcsoport, és R2 jelentése hidrogénatom vagy rnetilcsoport.
A (Ili) általános képletű hat vegyületet a következőképpen. jelöljük:
A faktor: R1 = izopropilcsoport,
R2 =· hidrogénatom,
B faktor: R1 — metilcsoport,
R2 «= metilcsoport.
C faktor: R1 -» metilcsoport,
R2 =· hidrogénatom,
D faktor: R1 — etiiesoport,
R2 = hidrogénatom.
E faktor: R* — etilcsopoi t,
R2 = metilcsoport,
E faktor: R1 — izopropilcsoport,
R2 — niclilcsoport.
Ezek közűi különösen az A és C faktor előnyös.
A Β, E és F faktor az I komponens t míg az A, Cés D faktor a II komponenst képezi.
A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek parazitaellenes, például antihelmintikus, így1 ne matocid, különösen antiendoparazitikus és antíektoparazitikus hatással rendelkeznek. A vegyületek tehát alkalmasak paraziták, így ektoparaziták és endoparaziták leküzdésére. Az ektoparaziták és entíopara ziták embereket, és különböző állatokat fertőznek meg. és különösen károsak a tenyésztett állatokra, így sertésekre, birkákra, szarvasmarhára kecskére és baromtíkra, lovakra és más háziállatokra, így kutyára és macskára nézve. A tenyészállon lányok parazitás fertőzése, amely anémiához, rosszuiíúpláltsághoz és tömegveszteséghez vezet, egyik fő tényezője a gazdasági veszteségeknek az egész világon.
Az állatokat és/vagy embereket fertőző endopamziíák nemzetségei például Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspieularis, Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Necatcr, Nematodirus, Nematospiroides, Nippostrongyíus, Oesophagostomum, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongyius, Strongyioides, Syphacía, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trinchicella, Trichuris és Uneinaria.
Állatokat és/vagy embereket fertőző ektoparaziták például az ízeltlábú ektoparaziták, így a csípő rovarok, kék és zöld dongólegyek, bolhák, tetvek, atkák, szívó rovarok, kullancsok és más kétszámyú kártevők.
Állatokat és/vagy embereket fertőző ektoparaziták nemzetségei például Amby lommá, Boophilus, Goroptes, Cülliphore Damodex, Damclinia, Gastrophilus, Haematobia, Kaematopinus, Haemophysalis, Hyalomma, Linognathns, Lucilía, Melophygtis, Oestrus, Psorergatcs, Psoroptes, Riúpicephalus, Sarcoptes és Stomoxys.
Azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti vegyületek mind in vitro, mind in vivő kísérletekben számos endoparazita és ektoparazita ellen hatásos. Ügy találtuk, hogy a találmány szerinti vegyületek különösen hatásosak parazita nematodák, például Haemonchus contortus, Ostertagia drciuncineía, Trichostrongylus colubiformis, Dictyocaulus viviparis, Cooperia oncophera, Ostertagia ostertagí és Nippostrongyíus brazilíensis, valamint atkák, például Sarcoptes sp. és Psoroptes sp. ellen.
Λ találmány szerinti vegyületek tehát aíkairoasak endoparazitás és/vagy ektoparazitás fertőzésben s renvedő állatok és emberek kezelésére.
A parazita fajtája a fertőzött szervezettől és a fertőzés helyétől függ. így például a Haemonchus contortus, Ostertagia circumcincta és a Trichostrongylus coiubiformis általában a birkákat fertőzi, és a gyomorban és a vékonybélben fordul elő, míg a Dictyocaulus viviparus, Cooperia encophore és az. Ostertagia ostertagí általában a szarvasmarhát fertőzi, és elsősorban a tüdőben, vékonybélben vagy a gyomorban fordul elő.
Ázt tapasztaltuk továbbá, hogy a találmány szerinti vegyületek fungicid hatással is rendelkeznek, hatásosak például a Cnndkla sp., pékiául Candida aibicans és Candida glabrata, valamint élesztők, például a Saccharomyces carlsbergensis ellen.
Úgy találtuk, hogy a találmány szerinti vegyüle-2197046 tek a szabadon élő nematoda, Caenorhabditis elegáns ellen is hatásos.
A találmány szerinti vegyületek rovarok, atkák és nematoda kártevők ellen is hatásosak a mező-, kert- és erdőgazdaságban, egészségügyben és a raktározott termékek esetén. A talaj és a növényi termények, így a gabonafélék (pl. búza, árpa, kukorica és rizs), zöldségfélék (pl. szója), gyümölcsök (pl. alma, szőlő, citruszfélék), valamint gyökértermények (pl. cukorrépa, burgonya) kártevői ellen hatásosan alkalmazhatók.
Úgy találtuk, hogy a találmány szerinti vegyületek különösen hatásosak például gyümölcsatkák és levéltetvek ellen. Ilyenek például az Aphis fabae, Aulacorthum cincumflexum, Myzus persicae, Nephotettix cincticeps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllocoptruta oleivora, Tetranychus urticae, valamint a Trialeuroides nemzetség tagjai; nematodák, például az Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meloidegyne és Panagrellus nemzetség tagjai; pikkelyes számyüak, például a Heliothis, Plutella és Spodoptera; gabona zsizsikek, például az Anthonomus grandis és Sitophilus granarius; lisztbogarak, például Tribolium castaneum; legyek, például a Musca domestica; hangyák; levélférgek; Pear psylla; Thrips tabaci; csótányok, például Blatella germanica és Periplaneta americana; moszkitók, például Aedes aegypti.
A találmány szerinti eljárással tehát olyan (1Π) általános képletű vegyületeket állítunk elő, amelyek parazitaellenes szerként használhatók. Ezek különösen endoparazitás, ektoparazitás és/vagy gombás fertőzésben szenvedő állatok és emberek kezelésére, továbbá a mező-, kert- és erdőgazdaságban rovar, atka és nematoda kártevők leküzdésére használhatók. Használhatók más körülmények között is, például raktárakban, épületekben vagy más közösségi helyiségekben vagy a kártevők egyéb előfordulási helyén is kártevőírtóként. A hatóanyagok kihordhatok a fertőzött szervezetre (ember, állat, növény), vagy magúra a kártevőre vagy annak előfordulási helyére. A találmány szerinti hatóanyagok a gyógyszerkészftésben szokásos módon formálhatók, és a találmány kiterjed ezeknek a gyógyszerkészítményeknek az előállítására is, amelyek a humán vagy állatgyógyászatban alkalmazhatók.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények elkészíthetők parenterális (beleértve az iníramammális), orális, rektális, topikális vagy implantátumként való alkalmazásra. Ha olyan készítmény formájában készítjük el, amelynek sterilnek kell lennie, pl. injekció (beleértve az intramammális készítményeket), szemcsepp, kenőcs vagy implantátum, maga a hatóanyag aszeptikusán készíthető el, vagy sterilizálható a gyártás után gamma-sugár kezeléssel vagy etilénoxidos kezeléssel.
A találmány szerinti, humán vagy állatgyógyászatban injekciós alkalmazásra szánt készítmények dózisegységenként ampullákban vagy több dózist tartalmazó tartályokban szerelhetők ki, kívánt esetben konzerválószer adagolása mellett. Az injekciós alkalmazásra szán készítmények lehetnek szuszpenziók, oldatok vagy emulziók, amelyek olajos vagy vizes hordozót tartalmazhatnak, és tartalmazhatnak a formáláshoz szükséges szereket, így pl. szuszpendáló-, stabilizáló-, szolubilizáló- és/vagy diszpergálószereket. A hatóanyag steril por alakban is elkészíthető valamely alkalmas hordozóval, pl. steril, pirogénmentes vízzel történő rekonstituáláshoz. Olajos hordozó lehet például polihidroxi-alkoholok és ezek észterei, például glicerinészterek, zsírsavak, növényi olajok, pl. földimogyoró-olaj, gyapotmagolaj, ásványi olajok, például folyékony paraffinok és etil-oleát és más hasonló vegyületek. Más hordozóanyag, például propilén-glikol is használható.
Az állatgyógyászati alkalmazásra szánt kompozíciók szintén elkészíthetők intramammális készítményeként vagy elnyújtott hatású vagy gyors hatóanyagleadó formában. Ezek lehetnek vizes vagy olajos hordozóval készített steril oldatok vagy szuszpenziók.. Olajos hordozóként alkalmazhatjuk az előbbiekben említetteket, és adagolhatunk töltőanyagot vagy szuszpendálószert, például lágy vagy kemény paraffinokat, méhviaszt, 12-hidroxi-sztearint, hidrogénezett ricinusolajat, alumínium-sztearátot vagy gliceril-monosztearátot. Szokásos nemíonos, kationos vagy anionos felületaktív agyagok önmagukban vagy kombinálva használhatók a készítményekben.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények elkészíthetők orális készítmények formájában is, például oldat, szirup vagy szuszpenzió formájában. Orális adagoláshoz elkészíthetjük száraz por formájában is, amelyet adagolás előtt vízzel vagy más alkalmas hordozóval és adott esetben ízesítő- és színezőanyaggal keverünk. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények más szilárd kompozíció, például tabletták, kapszulák, szögletes tabletták, pirulák, nagy pirulák, porok, paszták vagy granulátunok formájában is elkészíthetők.
Az orális adagolásra szánt szilárd és folyékony készítmények a gyógyszerkészítésben szokásos módszerekkel állíthatók elő. Ezek a készítmények egy vagy több farmakológiai hordozót is tartalmazhatnak, melyek lehetnek folyékonyak vagy szilárdak. Ilyen alkalmas farmakológiai hordozó a szilárd készítményekhez lehet például kötőanyag (pl. előzs;latinált kukoricakeményítő, polivinil-pirrolidon vagy hidroxi-propil-metil-cellulóz), töltőanyag (pl. laktóz, mikrokristályos cellulóz vagy kalcium-foszfát), síkosító anyag (pl. magnézium-sztearát, talkum vagy szilícium-dioxid), szétesést fokozó anyag (pl. burgonyakeményítő vagy nátrium-keményftőg'tkolát) vagy nedvesítőszer (pl. nátrium-íauríls/ulfát), A tablettákat a szokásos módon bevonattal lehet ellátni A folyékony készítményekhez alkalmas hordozó lehet például szuszpendálószer (pl. szóróitól szirup, metil-cellulóz vagy hidrogénezett étkezési zsiradékok), emulgálószer (pl. lecitin vagy guiniarábikum), nemvizes hordozó (pl. mandulaolaj, olajos éterek vagy etilalkohol), konzerválószerek (pl. metil- vagy propil-p-hidroxi-benzoátok vagy szorbinsav), stabilizáló- és szoíubilizálószereket szintén adagolhatunk.
Az orális alkalmazásra szánt paszták a szokásos módon készíthetők el. Ilyen készítmények alkalmas hordozói a szuszpendáló- és gélesítőszerek, pl. alunínium-disztearát vagy hidrogénezett rícinusolaj, a iiszpergálószerek, pl. poliszorbátok, nemvizes hor3
-3197046 dozők, pl. arachiszolaj vagy olajos észterek, stabilizáló- és szolubilizálószerek.
A találmány szerinti hatóanyagok állatgyógyászati készítmények formájában is elkészíthetők, szi lárd vagy folyékony készítmény formájában. Például az állatok napi takarmányához vagy ivóvizéhez keverhetők.
Bukkális adagoláshoz a találmány szerinti készítmények tabletta, paszta vagy szögletes tabletta formájában a szokásos módon állíthatók elő.
A találmány szerinti hatóanyagok az állatgyógyászatban folyékony készítmények, például oldatok, szuszpenziók vagy diszperziók formájában is adagolhatok. Ilyenkor alkalmas hordozóanyaggal keverhetők.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények kúpok formájában is elkészíthetők, ilyenkor a humán vagy állatgyógyászatban szokásos segédanyagokkal keverhetők.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények elkészíthetők továbbá helyi alkalmazásra szánt készítmények formájában is, így például kenőcs, krém, öblítőszer, por, pakolószer, spray, borogatószer, aeroszol vagy csepp (szemcsepp vagy orrcsepp) formájában. A kenőcsök és krémek vizes vagy olajos alappal készíthetők, a szokásos alkalmas töltő-, gélesítő adalékok alkalmazása mellett, A szemkenőcsöket steril körülmények között, sterilizált komponensek felhasználásával készítjük.
Öblítőszerek készíthetők vizes vagy olajos alappal, ezek tartalmazhatnak egy vagy több emulgálószert, stabílizálószert, diszpergálószert, szuszpendálószert, töltő- és színezőanyagot.
A porok készíthetők bármely alkalmas poralap segítségével. A cseppek készíthetők vizes vagy nemvizes alappal, és tartalmazhatnak egy vagy több diszpergálószert, stabilizálószert, szolubilízálószert és/vagy szuszpendálószert. Tartalmazhatnak konzerválószert is.
Inhalálás útján történő helyi alkalmazásra a találmány szerinti készítmények aeroszol vagy inszufflátor formájában készíthetők el.
A találmány szerinti vegyületek más farmakológiailag aktív vegyületekkel is kombinálhatok. A találmány szerinti vegyületek teljes napi adagja mind humán mind állatgyógyászatban 1 és 2000 pg/ testtömegkg, célszerűen 10 és 1000 pg/testtömegkg, előnyösen 100 és 500 pg/testtömegkg között van, amelyet 1—4 alkalommal adagolhatunk.
A találmány szerinti vegyületek mező- és kertgazdaságban alkalmazható készítmények formájában is formulázhatók. Az ilyen kompozíciók lehetnek szilárd vagy folyékony készítmények, például porok, beleértve a poralapokat és -koncentrátumokat is, oldható vagy nedvesíthető porok, granulátumok, beleértve a mikrogranulátumokat és diszpergálható granulátumokat is, szemcsék, öntözőszerek, emulziók, mint például hígított emulziók vagy emulgálható koncentrátumok, csávázószerek, mint pl. gyökér vagy terméscsávázó szerek, termésbevonó szerek, terménypellettáló szerek, olajkoncentrátumok, olajos oldatok, injektálószerek, pl. törzs-injektálószerek, permetek, füstök és ködök.
A fenti készítmények alkalmas hordezószert is tartalmaznak. Ilyen hordozószerek lehetnek folyé4 kony vagy szilárd hordozószerek, amelyek alkalmasak a hatóanyag eloszlatására vagy az alkalmazás helyén történő diszpergálás útján, vagy oly módon, hogy a felhasználó diszpergálható készítményt állít són elő belőle. Az ilyen készítmények ismertek, és a szokásos módszerekkel előállíthatók, például úgy, hogy a hatóanyagot a hordozó- és hígítóanyagokkal, például szilárd hordozóval vagy oldószerrel és felületaktív anyaggal együtt alaposan elkeverjük vagy megőröljük.
Porok és granulátumok előállításához alkalmas hordozóanyagok például a természetes kőzetőrlemények, pl. dintomnföld, talkum, kaolin, montmorrilonit, pirofiliit vagy attapulgit. Nagy diszperzitású kovasav vagy nagy diszperzitású abszorbeáló polimerek kívánt esetben szintén alkalmazhatók. A granulált adszorbeáló hordozók lehetnek porózusak (pl. horzsakő, őrölt tégla, szepiolit, bentonit) vagy nemporózusak (pi. kalcit, homok). Alkalmas előgranulált anyagok lehetnek szerves vagy szervetlen eredetűek, ilyen például a dolomit vagy őrölt növényi anyagok.
A folyékony készítmények előállításához alkalmas hordozó- vagy hígítószerek például az aromás szénhidrogének, alifás szénhidrogének, alkoholok és glikolok vagy ezek éterei, észterek, ketonok, savamidok, erősen poláros oldószerek, adott esetben epoxidált növényi olajok és víz.
Az alkalmazott szokásos nemíonos, kationos vagy anionos felületaktív anyagok lehetnek például etoxilezett alktl-fenolok és alkoholok, alkálifémvagy alkáiiföldfém-alkil-benzolszulfonsavakj -lignoszulfonsavak vagy szulfoszukcinátok, továbbá polimer fenolok szulfonátjai, amelyek jó emulgálő. diszpergáló és/vagy nedvesítő képességekkel rendelkeznek, és amelyek, önmagukban vagy kombinálva használhatók a kompozíciókban.
A találmány szerinti kompozíciók tartalmazhatnak stabilizálószeleket, csomósodásgátió szerekei, habzásgátió szereket, viszkozitásszabályozó szereket, kötőanyagokat tapadásjavító szereket, fotostabilizáló szereket, valamint műtrágyákat, vagy tápanyagfelvétel-szabályozó szereket vagy más aktív anyagot is. A találmány szerinti vegyületek más inszckticiddel, .akariciddel vagy ncmatociddal együtt is formulázhatók.
A találmány szerinti kompozíciók a hatóanyagot általában 0,01—99 tömeg%, előnyösen 0,01—40 tömeg% mennyiségben tartalmazzák.
A kereskedelmi forgalomba kerülő készítményeket általában koncentrált kompozíció formájában állítjuk elő, amelyek felhasználáskor a kívánt mértékig, például 0,001—0,0001 tömeg% mértékig hígíthatok.
Kert- és mezőgazdasági, valamint állatgyógyászati felhasználás esetén előnyös, ha a teljes fermentlevet használjuk fel, a komponensek és faktorok elválasztása nőikül. írehet szárított tápközeget használni (amely a micéliumokat is tartalmazza), vagy elroncsolt micéliumokat, élő vagy elölt micé liumokat, amelyeket a tápközegtől szilárd és folyékony fázis elválasztása útján vagy bepárlással választunk el, yagy használható a tápközeg a micéliumok elválasztása után. Kívánt esetben a micéliumok paszrőrözhetők, vagy előnyösebben szárítha-4197046 tók, permeteztető szárítóban vagy forgó szántóban. Kívánt esetben a tápközeg a szokásos hordozó-, hígító- és egyéb segédanyagokat tartalmazó kompozícióvá alakítható.
A fentiekből látható, hogy a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek fertőzések és rovarfertőzések leküzdésére alkalmasak a fertőzést okozó szervezetekre vagy azok élőhelyére történő juttatás útján.
A találmány tárgya tehát eljárás (III) általános képletű, S541 antibiotikumok, azok komponensei és faktorai előállítására. A találmány értelmében egy, a későbbiekben meghatározott, Streptomyces nemzetségbe tartozó olyan szervezetet tenyésztünk asszimilálható szén-, nitrogén- és ásványisóforrást tartalmazó tápközegen, amely legalább egy fenti vegyületet képes termelni, és kívánt esetben a vegyületet elválasztjuk a tápközegtől és kinyerjük. Az alkalmazott szervezet olyan, amely főleg a találmány szerinti vegyületeket, illetve legalább azok egyikét termeli.
Taxonómiai ismereteink alapján megállapítottuk, hogy a fenti anyagok termelésére képes szervezetek a Streptomyces nemzetség egy új faját jelentik, és ezeket Streptomyces thermoarchaensis-nek neveztük el. Ezeket a mikroorganizmusokat talajból izoláltuk, és a nagy-britanniai National Collection of Industrial and Maríné Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Nagy-Britania állandó törzsgyűjteményben helyeztük letétbe az NCIB 12015 számon. Az NCIB 12015 jelű Streptomyces thermoarchaensis morfológiai és tenyésztési jellemzőit a továbbiakban leírjuk.
A találmány szerinti eljárásban tehát előnyösen Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 jelű mikroorganizmust vagy ennek mutánsait alkalmazzuk.
Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 mutánsai képződhetnek spontán, vagy különböző eljárásokkal állíthatók elő, fgy például azokkal, amelyeket a Techniques fór the Development of Mícro-organisms by Η. I. Adler „Radiation and Radioisotopes fór Industrial Microorganisms”, Proceedings of the Symposium, Vienna 1973, 241. oldalon, az International Atomié Energy Authority által kiadott közlemény ismertet. Ilyen módszerek például ionizáló sugárzás, kémiai módszerek, pl. N - metil - Ν’ - nitro - N - nitrozo - guanidinnel (NTG) végzett kezelés, hőkezelés és más spontán mutációt célzó szelektív módszerek. így például az
S. thermoarchaensis NCIB 12015 négy mutánsát állítottuk elő, és ezeket szintén letétbe helyeztük a National Collection of Industrial and Maríné Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Nagy-Britannia törzsgyűjteményben NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 és NCIB 12114 számon, és ezen mutánsokkal végzett fermentációs eljárás szintén a találmány tárgyát képezi.
Az NCIB 12111, 12112 és 12113 mutánsokat a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 spóráiból hoztuk létre NTG-vei végzett kezelés útján, és a Ilolliday-féle egylépéses módszerrel jellemeztük [R. Holliday, Natúré /75,987 (1956)].
Az NCIB 12114 mutáns a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 spontán mutációja útján jött létre, és streptomicinnel szemben rezlsztensnek mutatkozott, miután életképes maradt 100 pg/ml streptomicin-szulfáttal 28 °C-on 5 napig végzett kezelés után.
Tixonómiai vizsgálataink azt mutatták, hogy a Strepromyces thermoarchaensis NCIB 12015 egy előzőleg le nem írt fajba tartozó mikroorganizmus, amelynek tulajdonságait a következőkben ismertetjük, és amely tulajdonságok az egész fajra jellemzők. A fentiek értelmében a találmány kiterjed minden e fajba tartozó mikroorganizmussal végzett fementációs eljárásra, amely mikroorganizmusok lényegében hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek.
A szokásos spóráztató közegeken, zabliszt-agaron, maláta-élesztő-agaron, szervetlen só-keményítő-agaron [Sh tri ing E. B. és Gottlieb D. Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313—340 (1966)1 a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 bőségesen növekszik, stabil szubsztrát-micéliumot és lég-micéliumot képez, ez utóbbiak tartalmazzák a spórákat nyitott spirális láncokban a fő hifák oldalágaiként. Ezeken a tápközegeken a pigmentáció sárga/bama és a spóratartók szürkék. 10-szeres nagyításnál látható, 'rogy a spóratartók lánconként 2—5 spirálmenetet tartalmaznak, és minden menetben 5—10 spóra található. Egy spóratartó általában 20—50 spórát tartalmaz. Letapogató elektronmikroszkóppal, 12000-szeres nagyításnál megállapítható, hogy a spórák sima felületűek, elipszoid alakúak, 0,7x1,4 pm méretűek. A Streptomyces thermoarchaensis NQB 12015 Gram-pozitív, 20 és 50 °C közötti hőmérsékleten növekszik és spórát képez.
Az előbbi adatokat összehasonlítva a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (nyolcadik kiadás) leírásával, megállapítottuk, hogy a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 a Streptomyces nemzetségbe tartozik.
A Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 törzsszintű azonosítását Williams és munkatársai által közölt [J. Gén. Mícrobiol 129, 1815—1830 (1983)] számítógépes azonosítási mátrix segítségével végeztük. A szerzők által leírt 41 taxonómiai teszteredmény a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015-re nézve a következő:
Tulajdonság: Eredmény:
Spóralánc, örvös —
Spóralánc, rostos —
Spóralánc, hosszirányban változó —
Spóralánc, spirális +
Micéliumok fragmentációja —
Spóra felülete sima +
Spóra felülete érdes —
Spóra színe szürke +
Spóra színe vörös —
Spóra színe zöld —
Reverz pigmentáció sárga/bama +
Reverz pigmentáció vörös/narancs —
Melanintermelés —
Adonitfelhasználás —
Cellobióz-felhasználás +
D-Fruktóz-felhasználás +
-5197046
Mezo-inozit-felhasználás —
Inulin-felhasználás +
Mannit-felhasználás —
Raffinóz-felhasználás +
Ramnóz-felhasználás +
D-Xüóz-felhasználás +
D,L-a-arníno-vajsav-felbasználás —
L-hisztidin-felhasználás +
LrlI idrox i- prol in-fe [használás —
Ailantoin-Iebontás +
Arbutin-Iebontás +
Xantin-lebontás +
Pektin-lebontás +
Lecitin-lebontás —
Nitrát-redukció +
Hidrogén-szulfit-termelés
Nátrium-azid-toierancia (0,01 töm/térf%) —
Nátrium-klorid-tolerancia (7 töm/térf%) —
Fenol-tolerancia (0,1 töm/térf%) +
Növekedés 45 °C-nál +
Neomicin-rezisztencia (50 pg/ml) —
Rifampicin-rezisztencia (50 pg/ml) +
Antibiózis Aspergilus nigcr L1V 131-vel +
Antibiózis Bacillus subtilis NC1B 3610-vel —
Antibiózis Streptomyces murinus
1SP 5091-vel -ΙΑ mikroorganizmust nem lehetett a 23 nagyobb fajcsoporthoz [Williams S. T. és munkatársai J. Ge. Microbiol 129, 1815—1830 (1983)] vagy a kisebb fajcsoportokhoz vagy a Williams és munkatársai által leírt egyedi csoportokhoz [J. Gén. Microbiol 129, 1743—1813 (1983)] tartozónak tekinteni. A Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 tulajdonságait a Bergey’s Manual of Dete ríni nat ive Bacterjology (nyolcadik kiadás), Shirling és Gottlieb által közölt 1SP közlemények [Int. J. Syst. Bacteriol. 18, 69—189 (1968); Int. J. Syst. Bacteriol. 18, 279—392 (1968); Int. J. Syst. Bacteriol. 19, 391-512 (1969); Int. J. Syst. Bacteriol. 22, 165394 (1972)] lefrásásaival, továbbá az. International Journal of Systematic Bacteriology 1980 óta új fajokról megjelentetett leírásaival is összevetettük.
Semmi kapcsolatot nem fedeztünk fel a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 és a leírt fajok között, így megállapítható, hogy a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 a Streptomyces nemzetségbe tartozó új faj első ismert tagja.
Az NCIB 12111, 12112, 12113 és 12114 mutánsok alapvető tulajdonságaikban hasonlóak a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015-tel, de az NCIB 12111 növekedéséhez adenin szükséges, az NCIB 12112 növekedéséhez szerint, és az NCIB 12113 növekedéséhez hisztidin szükséges, míg az NCIB 12114 streptomicinnel szemben rezisztens.
Az S541 antibiotikum fermentációs előállítása alkalmas Streptomyces thermoarchaensis mikroorganizmus tenyésztésével a szokásos módon történhet, azaz a Streptomyces mikroorganizmust asszimilálható szén- és nitrogénforrás, valamint szervetlen só jelenlétében tenyésztjük.
Asszimilálható szén- és nitrogénforrások és szervetlen sók vagy egyszerű; vagy komplex tápközegek formájában alkalmazhatók.
Szénforrás lehet például glükóz, rnaltóz, kémé n-Tő, glicerin, melasz, dextrin, laktóz, szacharóz, fruVóz, karbonsavak, aminosavak, gliceridek, a! koholok, alkánok és növényi olajok. A szénforrást általában 0,5—10 tömeg'/o mennyiségben alkalmazzuk a fermentációs tápközegben.
Nitrogénforrás lehet például szójaliszt, élesztőkivonat, gyapotmagliszt, peptonok, őrölt csonthéjas liszt, ma’átakivonnt, melasz, kazein, aminosav-keverék, ammónia (gáz vagy oklat), ammóniumsók vagy nitrátok. Karbamid és más amidok szintén alkalmazhatók. A nitrogénforrást általában 0,1—10 tömeg% mennyiségben használjuk.
A tápközegben alkalmazott szervetlen sóként olyan sókat alkalmazunk, amelyek nátrium-, kálium-, ammónium-, vas-, magnézium-, cink-, nikkel-, kobalt-, mangán-, vanádium-, króm-, kalcium-, réz-, molibdén-, bór-, foszfát-, szulfát-, klorid- és karbonátionokat képeznek.
A tápközeghez habzásgátlót adagolhatunk a fölös habzás meggátlására, az adagolást a szükségletnek megfelelő időközökben végezhetjük.
A Streptomyces thermoarchaensis mikroorganizmus tenyésztését általában 20 és 50 ’C közötti, célszerűen 25 és 40 °C közötti, előnyösen 34 ’C körüli hőmérsékleten, kívánt esetben levegőztetés és keverés vagy rázatás közben végezzük. A tápközeget az eljárás elején beolthatjuk egy kis mennyiségű spórázoft mikroorganizmus-szuszpenzióval, de eljárhatunk úgy is, a „lag-szakasz” kiküszöbölése érdekében, hogy a mikroorganizmus vegetatív inokulumát állítjuk elő kis mennyiségű tápközeg beoltásával, és az így kapott vegetatív inokulumot visszük át a fermentációs íápközegbe, vagy előnyösebben •:gy vagy több növesztési fázis után visszük át a végső fermentációs tápközegbe. A fermentációt általában 5,5 és 8,5, előnyösen 5,5 és 7,5 közötti pH-nál végezzük.
A fermentáció 2—10 napig, pl. kb. 5 napig tart.
Kívánt esetben az S541 antibiotikumot tartalmazó anyagot vagy annak valamely komponensét vagy faktorát elválaszthatjuk a fermentlétől, vagy a komponenseket, illetve faktorokat izolálhatjuk. Ez az izolálás a szokásos elválasztási és izolálást módszerekkel végezhető. A találmány szerinti S541 antibiotikum elsősorban a sejt-micéiiumokban for dul elő, de előfordulhat a fermentlében is, ilyenkor az izolálást a fermentléből végezzük, szűrés előtt vagy után. Az izolálást módszert szakember kiválaszthatja.
Az S541 antibiotikumok bármely frakcionáló módszerrel, például adszorpciós-elúciós, kicsapásos, frakcionált kristályosításos, extrakciés módszerrel vagy ezek kombinálásával izolálhatok és választhatók szét.
Úgy találtuk, hogy a találmány szerinti vegyületeket legcélszerűbb extrakcióval, kromatográfiával és frakcionált kristályosítással izolálni és szétválasztani.
A fermentálás után a micéliumok szokásos módszerekkel, például szűréssel vagy centrifugálássaí gyűjthetők össze. Ezután nz anyag például extrahálható a micéliuniokból valamilyen alkalmas oldószerrel, például acetonnal, metil-etil-ketonnal vagy nietil-izobutil-ketonnal; szénhidrogénnel, például
-6ii
137046 hexánnal; halogénezett szénhidrogénnel, például kloroformmal, szén-tetrakloriddal vagy metilénkloriddal: alkohollal, például metanollal vagy etanoílal; diollal, például propán-í,2-diollal; észterrel, például metil-acetáttal vagy etil-acetáttal. Ha a micéliumok jelentős mennyiségű vizet tartalmaznak, célszerű vízoldható oldószert használni.
Az optimális kitermelés érdekében célszerű többszöri extrakciót végezni. Az első extrakciót előnyösen vízzel elegyedő oldószejrel, például metanollal vagy acetonnal végezzük. Az antiobiotikumok nyers extrakíumként nyerhetők az oldószer eltávolítása után. Kívánt esetben, az oldószer térfogatának csökkentése után, az oldószeres extraktumok maguk is extrahálhatók. Ilyenkor célszerű vízzel nem elegyedő oldószert, például hexánt, kloroformot, metilén-kloridot vagy etil-acetátot vagy ezek elegyét alkalmazni, és bizonyos mennyiségű vizet adagolni ahhoz, hogy biztosítva legyen az antibiotikum vegyületek megoszlása. A vízzel nem elegyedő fázissal olyan anyaghoz jutunk, amely az S541 antibiotikumokat tartalmazza. Λ B faktor kívánt esetben alkalmas oldószerből, például izopropanolből kristályosítva izolálható.
Az aktív komponensek és/vagy faktorok tisztítása és/vagy elválasztása (teljesen vagy más jelenlevő makrolid vegyietektől) szokásos módszerekkel történhet, például kromatográfiásan (beleértve a nagynyomású folyadékkromatográfiát is) alkalmas hordozón, például szilikagélen, nemfunkcionáüs makroretikuiáris adszorpciós gyantán, például térhálós polisztirol gyantán, így Amberlite XAD-2, XAD-4 vagy XAD-1180 gyantán (Rohm and Haas Ltd. gyártmány) vagy SÍ 12 gyantán (Kastel! Ltd. gyártmány) vagy szerves oldószerrel szemben ellenálló térhálós dextránon, így pl. Sephadex LH20-on (Pharmacia UK Ltd. gyártmány) vagy nagynyomású folyadékkromatográfia esetén reverzibilis fázishordozón, pl. szénhidrogénnel kapcsolt szilikagélen, például C,e-kapcsolt szilikagélen. A hordozót töltet formájában, előnyösen oszlopba töltve alkalmazzuk. Nemfunkcionális makroretikuiáris gyanta, pl. XAD-1180 vagy SÍ 12 esetén szerves oldószer elegyek, például acetonitril és víz elegye használható eluálásra.
Általában úgy járunk el, hogy a vegyületek alkalmas oldószerrel készült oldatát visszük fel a Sephadex oszlopra, kívánt esetben az oldószer térfogatának csökkentése után. Az oszlopot adott esetben alkalmas poláros oldószerrel moshatjuk és eluálhatjuk. Sephadex és szilikagél oszlopok esetén alkoholok, pl. metanol, szénhidrogének, pl. hexán, acetonitril, halogénezett szénhidrogének, pl. kloroform vagy metilén-klorid vagy észterek, pl. etil-acetát használhatók oldószerként. Az említett oldószerek elegyét önmagukban vagy vízzel együtt is használhatjuk.
A találmány szerinti vegyületek eluálását és elválasztását/tisztítását a szokásos módszerekkel ellenőrizhetjük, például kromatográfiával, így vékonyréteg-kromatográfiásan vagy nagynyomású folyadékkromatográfiával, vagy a vegyületek előbb leírt tulajdonságainak kihasználásával.
Szilikagélen végzett kromatográfiával, amikor eluensként előnyösen kloroform és etil-acetát elegyét használjuk, az S541 antibiotikumok I és II komponensekre bonthatók, először az I komponens eluálódik. Ezután az I komponensből a Β, E és F faktorok például nagynyomású folyadékkromatográfiával kaphatók, Hasonlóképpen, az A, C és D faktorok a II komponensből izolálhatok. A B faktor másképpen úgy választható el az E és F faktoroktól, hogy alkoholból, például metanolból vagy izopropanolból kristályosítjuk. Az anyalúgot, amely az E és F faktorokat tartalmazza, kívánt esetben tovább tisztíthatjuk, például szilikagélen kromatografálva, és az E és F faktorok nagynyomású folyadékkromatográfiásán izolálhatok. Ha az egyes faktorokat elválasztottuk, tovább tisztíthatjuk, például kristályosítással, pl. metanolból, izopropanolbóí vagy metanol és víz elegyéből.
Az előbbi eljárások alkalmas kombinációjának megválasztásával a találmány szerinti vegyületek szilárd formában izolálhatok. Nyilvánvaló, hogy a tisztítási lépések végrehajtási sorrendje és megválasztása bármilyen módon variálható.
így kísérleteink során, a B faktort kristályos szilárd formában, 90%-ot meghaladó tisztasággal állítottuk elő. Hasonlóképpen, az A, C, D, E és F faktorokat 90%-ot meghaladó tisztasággal állítottuk elő. Az egyes faktorok azonban felhasználási területüknek megfelelő tisztaságban alkalmazhatók, így pékiául humán gyógyászatban legalább 90%-os, előnyösen 95%-osnál nagyobb tisztaság szükséges. Állatgyógyászati, kert- és mezőgazdasági felhasználás esetén alacsonyabb tisztasági fok, például 50%os vagy ennél alacsonyabb tisztaság is megfelelő,
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük. A példákban a következő rövidítéseket használjuk:
tíc vékony réteg-kromatográfia (Merck 5735 silica 60 lemezek, kloroform—etil-acetát 3:1 térfogatarányú eleggyel kifejlesztve, hacsak másképp nem jelöljük),
CCM oszlopkromatográfia (Merck 7734 szilica 60 töltet, 200X4 cm méretű oszlop, kloroform—etil-acetát 3:1 térfogatarányu elegygyel töltve és eluálva, hacsak másképpen nem jelöljük), hplc nagynyomású folyadékkromatográfia,
PE petroléter (fp.: 60—80 °C, hacsak másképpen nem jelöljük),
EA etil-acetát.
Az A, B és C tápközeg összetétele a következő:
A tápközeg
D-glükóz g/i 15,0
Glicerin _ 15,0
Szója-pepton 15,0
NaCI 3,0
CaCO3 1,0
Desztillált vízben 1 literre oldva, pH nátriumhidroxiddal 7,0-ra állítva az autoklávozás előtt.
-713 <4
B tdpközeg
g/i
D-glükóz Maláta-dextrin MD 30E 2,5
(Roquette Ltd. gyártmány) Arkasoy 50 (brit Arkady Co. 25,0
Ltd. gyártmánya) 12,5
Melasz 1,5
K;HPO4 0,125
CaCO3 MOPS [3-(N-morfolino)- 1,25
propán-szulfo nsav j 21,0
Desztillált vízben 1 literre oldva, pH nátrium
hidroxiddal (5n) autoklávozás előtt 6,5-re állítva.
C tdpközeg g/i
D-glükóz Maláta-dextrin MD 30E 2,5
(Roquette Ltd. gyártmánya) 25,0
Arkasoy 50 12,5
Cukorrépa melasz 1,5
K2HPO4 0,125
CaCO3 1,25
Silicone 1520 (Dow Corning) 0,625
Desztillált vízben 1 literre oldva, pH sterilizálás előtt 6,5-re állítva.
1. példa
Streptomyces thermoarcbaensis NCIB 12015 spórákat a következő összetételű ferde agarra oltottunk:
g/1
Élesztőkivonat (Oxoid L21) 0,5
Malátakivonat (Oxoid L39) 30,0
Mikológiái pepton (Oxoid L40) 5,0
Agar No. 3 (Oxoid L13) 15,0
Desztillált víz 1 literig, pH körülbelül 5,4.
A tenyészeteket 28 ’C-on 10 napig ínkubáltuk. Az érett tenyészeteket ezután 10%-os glicerinoldattal fedtük be (6 ml), és egy steril eszközzel ledörzsöltük a spórákat és a micéliumokat a felületről. A kapott spóraszuszpenzióból 0,4 ml alikvotokat vettünk ki, és polipropilén csövecskékbe töltöttük, majd leoívasztottuk, és felhasználásig folyékony nitrogénben tároltuk.
Egyetlen csövecske tartalmát hnsználtuk fel azután 10 ml A tápközeg beoltásához, amelyet 3 napig 28 ’C-on inkubáltunk egy 250 fordulat/perc, 50 mm átmérőjű mozgást biztosító rázógépen. Ezt az inkubált tápközeget használtuk fel 15 cső és két 250 ml-es Erlenmeyer-lombik, amelyek 10, illetve 50 ml B tápközeget tartalmaztak, 2%-os beoltására.
A csöveket és lombikokat 28 ’C-on 5 napig tenyésztettük, és a tenyészeteket vákuumban leszűrtük, és a sejteket azonos térfogatú metanollal 30 percig kiráztuk,
A Caenorhabditis elegans-szal szembeni aktiviíást mértük mind a csövekben, mind a lombikokban tenyésztett sejtek extraktumában, az extraktumokat összesítettük, szárazra pároltuk, és újraextraháltuk 6 ml metanollal, a kapott oldatot Sephadex LH20 oszlopra (110X2,5 cm) vittük fel, amelyet metanollal töltöttünk fel, és metanollal eluáltunk 10 ml es frakciókat gyűjtöttünk.
A 21—28. frakciókat összesítettük, bepótoltuk, és így 156 mg olajos maradékot kaptunk, amelyet CHC13-EA 3:1 térfogatarányú eleggyel extraháltunk, a kapott 3 ml extraktumot CCM oszlopra (55X2,5 cm) vittük fel. 10 ml frakciókat gyűjtöttünk, és tlc-vel, fluoreszcencia-indikátor használatával analizáltunk. A 20—23. és a 36—44. frakciók két nagyobb területet mutattak, ahol a fluoreszcencia kioltódott, és amelyeket 1 és II komponensként azonosítottunk (Rf értékek 0,70, IH. 0,43). A 20—23. frakciók bepárlásával az I komponenst kaptuk 9 mg szilárd termék formájában.
238 nm, Ej 340; 245 nm, Ej 350;
254 nm E1, 200.
A 36—44. frakciók bepárlásával a II komponenst kaptunk 11 mg szilárd termék formájában.
238 nm, Ej 440; 245 nm, Ej 460;
254 nm, Ej 280.
2. példa
Két 250 ml-es Erlenmeyer-lombikot, amelyek 50 ml A tápközeget tartalmaztak, beoltottunk 0,2 ml Streptomyces thermoaichaensis NCIB 12015 spóra-szuszpenzióval, amelyet az 1. példa szerint állítottunk elő, és csövecskékben tároltunk. A lombikokat 28 ’C-on 3 napig inkubáltuk egy 250 fordulat/perc, 50 mm átmérőjű mozgást biztosító rázógépen. A kapott tenyészetet használtuk fel egy 20 1-es, 12 1 B tápközeget tartalmazó fermentor beoltására. A tenyésztést 5 nap múlva befejeztük, és a
3. példa szerinti módon dolgoztuk fel.
3. példa
A 2. példában leírt módon, 28 ’C-on 5 napig végzett tenyésztés után kapott 12 1 tenyészetet lecentrifugáltuk (4200 ford/perc, 10 ’C-on, 15 percig). A sejttömeget 5 1 metanollal kevertük, és 20 óra hosszat 4 ’C-on állni hagytuk. A micélium-extraktumot leszűrtük, 40 ’C-on bepároltuk, és 100 ml bután-l-ol hozzáadásával azeotrópos desztillációnak vetettük alá. Az extraktumot ezután 5-ször 200 ntl metanollal kezeltük, és a kombinált extraktumokat 100 ml-re bepároltuk, és egy Sephadex LH20 oszlopra (112X5 cm) vittük fel. Az eluálást metanollal végeztük, 200 ml előeluátum után 50 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A 40—90. frakciókat összesítettük, és bepároltuk, így 3,85 g olajos maradékot kaptunk, amelyet 77 ml CHC13-EA 3:1 térfogatarányú eleggyel extraháltunk. Az extraktu-815 mot leszűrtük, CCM nek vetettük alá, és egy 200 ml-es előeluátum után 15 ml-es frakciókat gyűjtöttünk.
Az 1 komponenst tartalmazó 124—142. frakciókat összegyűjtöttük és bepároltuk, így 253 mg szilárd terméket kaptunk, amelyből 216 mg-ot hplcvel tisztítottunk (Zorbax ODS, 25x2,1 cm, 80% CHjCN/HjO). AII komponenst tartalmazó 250— 320. frakciókat is összegyűjtöttük, bepároltuk, és fgy 602 mg szilárd terméket kaptunk, amelyből 540 mg-ot hplc-vel tisztítottunk (ahogyan a 124—142. frakciókat).
A hplc oszlopról eluált anyagot UV spektroszkópiával vizsgáltuk 243 nm-nél. Az ezen a hullámhosszon abszorbeáló csúcsoknak megfelelő anyagot megszárítottuk, és egyrészt Caenorhabditis elegansszal szembeni aktivitásra vizsgáltuk, másrészt tlcvel analizáltuk. A Caenorhabditis elegans-szal szemben aktív négy csúcs Rf értéke 0,39 és 0,46, illetve 0,70 és 0,75 közé esett.
Az I komponens egy csúcsot adott 0,70 és 0,75 Rf érték között, ez a csúcs a B faktornak felelt meg. A II komponens három csúcsot adott 0,39 és 0,46 Rf érték között, ezek az A, C és D faktoroknak feleltek meg.
Az A faktor 260 és 340 ml között eluálódott a hplc oszlopról a minta injektálása után, és a tlc-ben az Rf értéke 0,44 volt. A B faktor 270 és 310 ml között eluálódott a hplc oszlopról a minta injektálása után, és a tlc-ben az Rf értéke 0,72 volt. A C faktor 160 és 180 ml között eluálódott a hplc oszlopról a minta injektálása után, és a tlc-ben az Rf értéke 0,4 volt. A D faktor 220 és 250 ml között eluálódott a hplc oszlopról a minta injektálása után, és a tlc-ben az Rf értéke 0,42 volt. Az A, B, C és D faktor további jellemzőit a következőkben ismertetjük.
4. példa
Az 1. példa szerinti módon előállított, és csövecskében tárolt 0,4 ml Streptomyces thermoarchacnsis NCIB 12015 spóra-szuszpenzióval beoltottunk egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50 ml A tápközeget, és 28 °C-on, 4 napig inkubáltuk egy 250 ford./perc, 50 mm átmérőjű mozgást biztosító rázógépen. Ebből kivett, 8 ml-es részletekkel oltottunk be két 2 1-es lapos fenekű lombikban levő 400 ml A tápközeget, majd ugyanolyan körülmények között 3 napig ínkubáltuk.
A két lombik tartalmát egy 70 1-es fermentor beoltására használtuk, amely 40 1, Silicone 525-tel (Dow Corning; 0,0625 térf.%) kiegészített B tápközeget tartalmazott. A fermentációt keverés és olyan levegőztetés közben végeztük, amely a telítettség 20%-ánál magasabb oxigén koncentrációt biztosított, Silicone habzásgátlót szükség szerint adagoltunk. A fermentációt 10 nap múlva állítottuk le, a 40 1 tenyészközeget lecentrifugálíuk (15000 ford./perc). A maradék felülúszót 5 1 vízzel eltávolítottuk, és a kinyert 1,4 kg sejtet —20 ’Con megfagyasztottuk.
Egy hét múlva a fagyasztott sejteket felengedtük, 15 1 metanolban szuszpendáltuk, és óvatosan kevertük 15 óra hosszat. Ezután a szuszpenziót leszűrtük, és a szilárd maradékot 10 1 metanollal újraextraháltuk. A 25 1 egyesített szűrletet 12 1 vízzel hígítottuk, és 25 1 PE-vel extraháltuk. 30 perc múlva a fázisokat centrifugálással szétválasztottuk.
Az alsó, metanolos fázist háromszor újraextraháítuk PE-vel (25 1, 15 1 és 15 I). Az egyesített PE fázisokat (80 1) koncentráltuk három fázisban egy Pfaudler 8,8—12V—27 lengőlapátos filmbepárlóban (gőznyomás 0,1 bar, gőzhőmérséklet 20 ’C, fűtőgőz hőmérséklete 127 ’C), a koncentrátumot (8 1) l kg nátrium-szulfáttal megszárítottuk, és tovább koncentráltuk csökkentett nyomáson 40 ’C-on egy merevlapátos filmbepárlóban. A 15 ml olajos maradékot 70 ml CHC13-EA 3:1 térfogatarányú elegyben oldottuk, és CCM-nek vetettük alá, 1400 ml elő-eluátum után 40 ml-es frakciókat gyűjtöttünk.
A 45—65. frakciókat egyesítettük és bepároltuk, így 940 mg B faktort kaptunk (jellemzőit 1. a 3. példában), amelyet metanolból kétszer és nitrometánból átkristályosítottunk. A kristályokat röntgen-diffrakciós kristályanalízissel vizsgáltunk, és megállapítottuk, hogy ortorombos tiszta prizmák, a következő jellemzőkkel: a = 10,171 (3), b - 13,317 (5), c- 25,032 (7) A, 3391 A\ Z ·» 4, tércsoport P2,2,2j, Dc = 1,18 g/cm3, R = 0,C53 2169-nél, független megfigyelt reflexiók (Óíá58°) diffraktométerben Cu-Κα sugárzással mérve (λ = 1,54178 A). A röntgen-krisztalográfíás szerkezetet az 5. ábra mutatja.
5. példa
Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 inokulumot készítettünk a 4. példában ismertetett módon, 2 nap tenyészidővel, és egy 70 1-es fermentorban levő 40 1 1 B tápközeget oltottunk be vele, amely Silicone 525 helyett polipropilén 2000-t tartalmazott (0,06 térf.%). A polipropilén 2000-t a fermentáció során szükség szerint adagoltuk a habzás megakadályozására. A fermentációt 28 ’C-on végeztük, keverés és olyan levegőztetés mellett, amely a telítettség 30%-ánál magasabb oldott oxigénszintet biztosított. 24 óra hosszat végzett fermentáció után 9 1 tenyészközeget átvittünk egy 700 1-es fermentorban levő 450 1 tápközegbe, amelynek az összetétele a következő:
D-glükóz g/i 2,8
Maláta-dextrin (MD 30E) 27,8
Arkasoy 50 13,9
Melasz 1,7
KJ1PO, 0,14
CaCO3 1,39
Silicone 525 (Dow Corning) 0,06 térf.%
A pH a sterilizálás előtt 6,5-re állítva.
A fermentációt 28 ’C-on végeztük keverés és olyan levegőztetés közben, amely a telítettség 20%-ánál magasabb oxigénszintet biztosított. Polipropilén 2000 habzásgátlót szükség szerint adagol9
-917.
tünk. 2 nap múlva a pH-t 7,2-re állítottuk kénsavval, majd 5 nap múlva learattuk.
A 450 1 tenyészközeget lecentrifugáltuk, és a maradék felülúszót 20 1 vízzel eltávolftottuk. A kinyert sejteket (25,5 kg) 1 óra hosszat kevertük annyi metanolban, amennyi a 75 1 teljes térfogathoz kellett. A szuszpenziót leszűrtük, és a szilárd maradékot 35 1 metanollal újraextraháltuk, és leszűrtük. Az egyesített szírieteket (87 I) 40 1 vízzel hígítottuk, és PE-vel extraháltuk. 30 perc múlva a fázisokat centrifugálással elválasztottuk, és az alsó, metanolos fázist 40 1 vfe hozzáadása után 30 1 PEvel újraextraháltuk. Elválasztás után az alsó fázist újra 30 1 PE-vel extraháltuk. Az egyesített PE fázisokat (85 1) koncentráltuk három fázisban egy Pfandler 8.8—12V—-27 lengőlapátos filmbepárlóban (gőznyomás 0,1 bar, gőzhőmérséklet 20°, fűtőgőz hőmérséklete 127 ’C). A kapott 9 1 koncentrátumot 2 kg nátrium-szulfáton megszárítottuk, és tovább koncentráltuk csökkentett nyomáson, 40 °C-on egy merevlapátos filmbepárlóban. A 130 g olajos maradékot kloroformban oldottuk 190 mire, és ezt CCM-re vittük [oszlop kloroformmal töltve és mosva (500 ml)], 1400 ml előeluátum után kb. 40 ml-es frakciókat gyűjtöttünk.
A 32—46. frakciókat egyesítettük és bepároltuk, így 21,2 g olajat kaptunk. A 47—93. frakciókat, egyesítettük és bepároltuk, és így 20,1 g olajat kaptunk, amelyet CHC13-EA 3:1 térfogatarányú elegyben oldottunk 50 ml-re, és CCM-re vittük, 1400 ml előeluátum után mintegy 40 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A 22—36. frakciókat egyesítettük, és bepároltuk, így 3,1 g olajat kaptunk, amelyet a 32—46. frakciókból nyert olajhoz adtunk. Az egyesített olajokat 4 ml forrásban levő metanollal oldottuk, amelyet azután 20 ml forró propán-2-οίhoz adtunk, amelyből állás közben 2,57 g B faktor kristályosodott ki.
A B faktor kikristályosodása után visszamaradt anyalúgot bepároltuk, a kapott olajat azonos térfogatú diklór-metánban oldottuk, és egy Merck Kieselgel 60 (70-230 mesh ASTM, Art. No. 7734) oszlopra (30X2,2 cm) vittük, amelyet diklór-metánnal töltöttünk. Az oszlopot kétszeres töltettérfogatnyi diklór-metánnal mostuk, és CHC13~EA 3:1 térfogatarányú, 2 töltettérfogatnyi mennyiségű eleggyel eluáltuk. Az eluátum bepárlásával olajat kaptunk, amelyet metanolban oldottunk, és preparatív hplc-nek vetettünk alá Spherisorb S5 ODS-2 oszlopon (250 mmX20 mm, Phase Sep. Ltd.). 5 ml mintát 1 perc alatt töltöttünk az oszlopra, és acetonitril és víz 7:3 térfogatarányú elegyével eluáltuk a következő körülmények között:
Idő (perc) Átfolyás (ml/perc)
0,00 0,00 Injektálás
1,00 0,00 ideje
1,10 30,00
39,90 30,00
40,00 35,00
75,00 35,00
A hplc oszlopról eluálódott anyagot UV spektroszkópiával vizsgáltuk 238 nm-nél. A 26,3. perc10 nél eluálódott, csúcsot mutató frakciót bepárolva az E faktort kaptuk szilárd termék formájában. A 36,4. percnél eluálódott, csúcsot mutató egyesített frakciókat bepárolva az F faktort kaptuk szilárd termék formájában. Az E és F faktorok további jellemzőit a későbbiekben ismertetjük.
ő. példa
A 2. példában leírt módon, 117 óra hosszat tenyésztett fermentumot 121 ’C-on 1 óra hosszat sterileztük, lehűtöttük szobahőmérsékletre, és mágneses keverővei homogén sejtszuszpenzióvá kevertük. Két 2 ml-es részletet lecentrifugáltunk (12000 g, 2 perc, szobahőmérsékleten), a felülúszót dekantáltuk. és a maradék sejteket 2 ml vízben szuszpendáltuk, elkevertük, és újra lecentrifugáltuk (12000 g, 2 perc, szobahőmérsékleten). A felülúszó dekantálása után a sejteket kétszer 2 ml desztillált vízzel mostuk. A mosott sejteket jól elkevertük 2 ml vízben, illetve 2 ml metanolban, szobahőmérsékleten állni hagytuk, egyszeregyszer felrázva, 1,5 óra hosszat. A szuszpenziót újra lecentrífugáltuk (12000 g, 2 perc, szobahőmérsékleten), és a felülúszóból vízzel hígítás! sort készítettünk. A vizes szuszpenzióból származó sejteket újra szuszpendáltuk vízben, és ebből is hígftási sort készítettünk. Minden hígításból 10 μί részletet vettünk ki, és Caenorhabditis elegáns nematóda 200 μΐ szuszpenziójához adtuk. A nematodaszuszpenzió 6 g/1 Na2HPO4, 3 g/1 K2HPO4, 5 g/1 NaCl és 0,25 g/1 MgSO4.7H2O tartalmú, 7,0 pH-jú pufferrel készült. 4 óra múlva a nematodaszuszpenziókat megvizsgáltuk arra nézve, hogy a tesztoldatok melyike okozott a nematodák 98%-ánál nagyobb tömegben teljes mozgékonysági gátlást. Úgy találtuk, hogy a metanolos extraktumok 5-szörös, 25-szőrös, 250szeres és 500-szoros hígítása, a sejtszuszpenzió
5-szörös, 25-szörös, 250-szeres, 500-szoros és 1000-szeres hígítása, míg a vizes extraktum 2-szeres, 4-szeres és 8-szoros hígítása okozott ilyen gátlást a nematodáknál, amikor a nematodaszuszpenzió 200 μΙ-éhez 10 μΐ mintát adtunk.
7. példa
250 ml-es Erlenmeyer-lombikokban levő 50 ml A tápközeget, ill. 50 ml B tápközeget beoltottunk 0,4 ml, az 1. példa szerint előállított és csövecskében tárolt Streptomycines thermoarchaensis NCIB 12015 spóraszuszpenzióval. A lombikokat 2 napig 28 ’C-on inkubáltuk egy 250 fordulat/perc, 50 mm átmérőjű mozgást biztosító rázógépen. 8 ml-es részleteket vettünk ki, és 2 1-es lapos fenekű lombikban levő 400 ml A, illetve B tápközeget oltottunk be vele. A lombikokat ugyanolyan körülmények között inkubáltuk 2 napig.
Két 70 1-es fermentort beoltottunk 2-2 lombik A tenyészközeggel, és két másik 70 1-es fermentort 2-2 lombik B tenyészközeggel. A 70 1-cs fermentorok mindegyike 40 1 C tápközeget tartalmazott.
A fermentálást 34 ’C-on végeztük, keverés és olyan levegőztetés mellett, amely a telítettség 30%-1019 ánál magasabb oldott oxigénszintet biztosított, mintegy 24 órai fermentálás után a pH-t vizes kénsavoldattal 7,2-re állítottuk. Polipropilén-glikol 200 habzásgátlót szükség szerint adagoltunk 5 nap múlva a tenyésztést leállítottuk és a tenyészközeget félretettük.
Egy másik 70 1-es fermentort, amely Silicone 1520 (0,06%) habzásgátlóval kiegészített B tápközeget tartalmazott, beoltottunk 2 lombik fenti B tenyészközeggel. A fermentációt 28 ’C-on végeztük, keverés és olyan levegőztetés mellett, amely a telítettség 30%-ánál magasabb oldott oxigénszintet biztosított. Polipropilén-glikol 2000 habzásgátlót szükség szerint adagoltunk. 24 óra múlva 9 litert átvittünk egy 700 1-es fermentorba, amely 450 1 C tápközeget tartalmazott.
Itt a fermentálást 34 ’C-on végeztük, keverés és olyan levegőztetés mellett, amely a telítettség 30%ánál magasabb oldott oxigénszintet biztosított. A habzást polipropilén-glikol 2000 adagolásával akadályoztuk meg. Mintegy 24 órai fermentálás után a pH-t vizes kénsavoldattal 7,2-re állítottuk. 4 nap múlva a tenyésztést leállítottuk és a tenyészközeget a három fenti 40 1-es tenyészközeggel egyesítettük.
Az egyesített tenyészközegeket Sharples AS16PY centrifugán 120 1/óra sebességgel centrifugáltuk, a felülúszót vízzel helyettesítettük a centrifugában.
A 11,65 kg kinyert sejtet 33 1 metanolban emulgeáltuk Silverson keverő segítségével. 60 perc múlva a szuszpenziót vásznon átszűrtük, és a maradékot újra emulgeáltuk 34 1 metanolban. 40 perc múlva a szuszpenziót újra leszűrtük. A két metanolos extraktumot egyesítettük.
Az egyesített 53,5 I extraktumokat 27 I vízzel és 27 1 PE-vel elegyítettük, 20 percig kevertük, és a két fázist Westfalia MÉM 1256 centrifugán elválasztottuk. Az alsó, 70 1 metanolos fázist 37 1 vízzel és 27 1 PE-vel elegyítettük, és a fenti módon kevertük és elválasztottuk. A két fázis között képződött emulziót 4 1 acetonnal megtörtük. Az alsó, 108 1 metanolos fázist harmadszor is elegyítettük 40 1 vízzel és 27 1 PE-vel, és a fenti módon kevertük és elválasztottuk, az emulzió megtörésére 4 1 acetont használtunk. A három extraktumot ezután egyesítettük.
Az egyesített, 85 1 PE-extraktumokat lengőlapátos filmbepárlóban bepároltuk (gőznyomás 0,15 · 10’ Pa, gőzhőmérséklet 26 ’C). A kapott 3 1 koncentrátumot 2 kg nátrium-szulfáton megszárítottuk, és csökkentett nyomáson, 40 ’C-on tovább koncentráltuk. A kapott 639 g olajat 300 ml kloroform-EA 3:1 térfogatarányú elegyben feloldottuk, leszűrtük és mostuk üvegszál szűrőpapíron. A szűrletet és a mosófolyadékot (1060 ml) CCM-re (1500 mmX 100 mm) vittük, és 6 1/óra sebességgel eluáltuk.
A 8,8 és 13,1 liter közötti frakciókat egyesítettük, és alacsony nyomáson bepároltuk, így 56,3 g olajat kaptunk, míg a 13,1 és 24,6 liter közötti frakciókat hasonlóan feldolgozva 153,4 g halványsárga szilárd terméket kaptunk. A korábbi frakciók főleg B faktort, míg a későbbi frakciók az A, B, C és D faktorok elegyét tartalmazták. A későbbi frakciókból a B faktort a CCM kétszeri ismétlésével fokozatosan eltávolítottuk, másodszorra friss szilikagélt használva és 3 1/óra sebességgel eluálva.
A második oszlopról az A, C és D faktorokat tartalmazó csúcsok a 8,8 és 17,6 1 között eluálódtak, az itt jelenlevő B faktort a harmadik oszlopon távolítottak el, ahol az A, C és D faktorok a 14 és 28 1 között eluálódtak. Ez utóbbi egyesített eluátumokat csökkentett nyomáson bepároltuk, és így 114 g szilárd terméket kaptunk. A két oszlopról származó, B faktort tartalmazó csúcsokat (7,5-8,8 1, illetve 10,3—13,4 1) bepároltuk, és így 10,7 g, illetve 10 g olajat kaptunk, amelyeket egyesítettünk a bárom oszlop közül az elsőről származó olajjal.
A B faktort tartalmazó olajat 25 ml forró metanolban oldottuk, és elegyítettük 100 ml forró propan-2-olIaI, majd 4 ’C-ra lehűtve a B faktort kikristályosftotíuk, leszűrtük, 200 ml metanollal mostuk, —20 ’C-ra lehűtöttük, vákuumban megszárftottuk, és így 25,3 g B faktort kaptunk.
A harmadik oszlopról származó, A, C és D faktort tartalmazó szilárd anyagot vákuumban súlyállandóságig szárítottuk. Ebből a szilárd anyagból 320 mg-os mintákat 190 ml metanolból oldottunk, és acetonitril—víz 7:3 térfogatarányú eleggyel 230 ml-re egészítettünk ki. Az oldatból 5 ml-es részleteket Spherisorb ODS-2 (5 pm szemcseméretű) oszlopon (250 mmx21,2 mm) kromatografáltunk, eluálószerként acetonitril és víz 7:3 térfogatarányú elegyét használva. Az átfolyási sebességet 10 másodpercig 20 ml/perc értéken tartottuk, majd 22 perc alatt folyamatosan emeltük 34 ml/perc értékig, és ezt az értéket tartottuk további 3 percig. Az eluálódott faktorokat 238 nm-nél detektáltuk. A C faktor 11,0 és 13,4 perc között, a D faktor 13,4 és
17,4 perc között, inig az A faktor 17,4 és 23,0 perc között eluálódott.
Az összes kromatográfiás elválasztásból származó, C faktort tartalmazó frakciót egyesítettük, és csökkentett nyomáson szárazra pároltuk. Az A faktort tartalmazó frakciókat hasonlóképpen szárazra pároltuk. A D faktort tartalmazó frakciókat szintén egyesítettük és bepároltuk, így 7 g szennyezett szilárd terméket kaptunk. Ezt 65 ml metanolban feloldottuk, 7:3 térfogatarányú acetonitril—víz eleggyel kevertük, és Spherisorb ODS2 oszlopon a fenti módon kromatografáltuk, azzal a különbséggel, hogy az átfolyási arányt állandó 20 ml/perc értéken tartottuk. Most a D faktor a 16. és 20. perc között eluálódott, ezeket a frakciókat minden kromatográfiás futtatásból egyesítettük, és szárazra pároltuk. Az A, C és D faktorokat tartalmazó szilárd termékeket vákuumban P2O5 fölött súlyállandóságig szárítottuk, így 55 g, 7,0 g, illetve 1,21 g terméket kaptunk.
Ezzel az eljárással kapott négy szilárd termék azonosnak mutatkozott az A, B, C és D faktorok autentikus mintáival.
8. példa ml B tápközeget tartalmazó 250 ml-cs Erlenmeyer-lombikokat beoltottunk az 1. példa szerint előállított, és csövecskében tárolt 0,5 ml Strep11
-1121
197 046 tomyces thermoarchaensis NC1B 121J1, 12112,
12113 és 12114 spóraszuszpenzióval.
A Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12.111,
12112 és 12113 törzseket tartalmazó lombikokat 31 °C-on rázógépen inkubáltuk. A Streptomyces g thermoarchaensis NC1B 12114 törzseket tartalmazó lombikot 28 °C-on 2 napig inkubáltuk, majd a tenyészközegből 1 ml-t átvittünk egy másik 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba, amely 50 ml B tápközeget tartalmazott. Ezt a lombikot 31 ’C-on rázógépen inkubáltuk. A rázatást minden esetben 250 ford./perc sebességgel, 50 mm átmérőjű mozgással végeztük.
napig tartó inkubálás után minden tenyészközegből 10 ml-t lecentrifugáltunk (1250 g, perc), és a következőképpen dolgoztunk fel. A felülúszót eldobtuk, és a sejtmasszát metanollal 10 ml-re felöntöttük, és szuszpendáltuk. A szuszpenziót erősen összeráztuk, majd állni hagytuk 1 óra hosszat, közben egyszeregyszer felráztuk. A szusz- 20 penziót ezután 10000 g-vel 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszót hplc-vel elemeztük (S5 Ol)S-2, 10 cmX4,6 mm, 70% CH3CN/0,l mol/1 NH4H2PO4).
A csúcsokat 246 nm-nél azonosítottuk.
A hplc-elemzés kimutatta az A, B, C és D fakto- 25 rok jelenlétét minden esetben.
példa
Az A, B, C, D, E és F faktorok jellemzői a következők:
i) Csak szenet, hidrogént és oxigént tartalmaznak.
ii) Az A, B, C, D, E és F faktorok elektronütközéses (Ε. 1.) tömegspekíroszkópiás elemzése a következő eredményeket mutatta:
Faktor Molekula-ion Megfelelő képlet
A 612,37 C^HjjOg
B 598,35 C35H50O8
C 584,34 C34H48O8
D 598,35 CjsHjoOg
E 612,3638 CjöHj2Ojj
F 626,3807 C37HJ4Os
Gyors atomokkal végzett bombázás (FAB) a következő eredményt mutatta:
Faktor +ve FAB -ve FAB moltömeg
A M/Z 635 M+Na+ M/Z 613 M+H1 M/Z 611 M-1I- 612
B M/Z 691 M+H+glicerin M/Z 599 M+H’M/Z 581 MH-íljO1 M/Z 563 MH-Í+O+ 598
C M/Z 607 M+Na' MZZ 583 M-l Μ 584
D M/Z 621 M+Na' M/Z 597 M-ll- 598
Az E faktor tér-deszorpciós tömegspektroszkópiás vizsgálata a következő eredményt adta: M/Z 612 M', az F faktorra: M/Z 626 ME
Az A faktor Ε. I. spektruma pontos tömegméréssel a következő ionokat adta: 612,37-nél C,6H52O8j 466,31-nél C,0H42O4) 448,30-nál
C30H4()O3, 425,23-ná! 354,22-nél
C23H30O3, 297,22-nél C21HJ9O, 278,11-nél
C15H18O,, 247,17-né! C16H23O2, 219,18-nál
C15H2jO, 95,05-nél C6H7O.
A B faktor Ε. I. spektruma pontos tömegméréssel a következő ionokat adta: 598,35-nél C35Hj0O8, 438,28-ná! C,8H38O4, 420,26-nál
QgH^Oj, 314,19-néi C20H26O3, 248,14-nél
C15H2()O3, 151,08-nál C91IUO2.
A C faktor Ε. 1. spektruma pontos tömegméréssel a következő ionokat adta: 584,34-néI C34H48O8, 566,33-nál C,4H46O7, 438,28-nál £ζ8Η38Ο4.
A D faktor Ε. I. spektruma pontos tömegmérésig sel a következő ionokat adta: 598,35-nél QjHjoOg, 452,29-nél C29H40O4, 434,28 C29H38O3.
Az E faktor pontos tömegmérése az Ε. I. ionizációs módban a következő iont adta: 452,2908-nál C+H^O,, és az F faktorra 466,3067-nél Cj(,H24O4.
5Q iii) Az A, B, C, D, E és F faktorok bromoformban a következő csúcsokat tartalmazó jellemző IR spektrumot mutatták (az értékek cm-1-ben vannak megadva):
A faktor: kb. 3510 (OH), 1712 (észter), 998 (C-O);
B faktor: kb. 3510 (OH), 1710 (észter), 996 (C-O);
C faktor: kb. 3510 (OH), 1712 (észter), 996 , (C-O);
gr) D faktor: kb. 3508 (OH), 1711 (észter), 996 (C-O);
E faktor: kb. 3500 (OH), 1708 (észter), 994 (C-O);
F faktor: kb. 3500 (OH), 1708 (észter), 997 (C—O).
-1223
Az A, B, C, D, E és F faktorok teljes spektrumát a mellékelt 1., 2., 3,, 4., 6. és 7. ábrán mutatjuk be.
iv) Az A, B, C, É>, E és F fak torok metanolban (c = 0,002%) felveti UV spektruma a következő (I = inflexió, M = maximum):
Faktor (rn n) E] Faktor (m ”) El,
A 252 (1) 318 D 252 G) 263
244,5 (M) 468 244,5 (M) 393
239 (I) 430 239 (I) 362
B 252 (0 302 ♦E 252 (!) 266
244,5 (M) 426 244,5 (M) 402
239 Ο) 394 238 (M) 373
C 252 (I) 316 *F 252 (0 285
244,5 (M) 470 244,5 (M) 421
239 (D 432 239 (M) 389
Megjegyzés: *c = 0,001%, metanolban.
Megjegyzendő, hogy a fenti ox értékek az összes faktorra jellemzők, az Ej értékek a kapott anyag tisztaságára utalnak. Az Ejértékek aránya azonban magára a vegyületre jellemző.
v) Az egyes faktorok deutero-kloroformmal készült oldatának 200 MHz-nél felvett proton NMR spektruma a következő helyeknél ad jelet [τ értékek sokszorozódással, csatolási álladók (Hz) és integrálási értékek zárójelben]:
A faktor: 4,1-4,4 (m, 2H); 4,61 (széles, s IH);
4,6-4,75 (m, 2H); 4,81 (d, 9,1 H); 5,05 (m, IH);
5.34 (s, 2H); 5,69 (d, 5,1 H); 6,06 (d, 5,1 H); 6,17 (m, IH); 6,26 (d, 11,1 H); 6,37 (m, IH); 6,46 (d, 10, IH); 6,74 (q, 2,1 H); 7,42 (m, 1H); 7,7-7,9 (m, 5H); 8,14 (s, 3H); 8,40 (s, 3H); 8,47 (s, 3H); 8,61 (t, 11,1 H); 8,96 (d, 7,3 H); 9,06 (d, 7,3 H); 9,02 (d, 7,3 II); 9,13 (q, 11,1 II); 9,21 (d, 7,3 II).
B faktor: 4,2-4,4 (m. 2H); 4,55 (q, 7,1 H);
4,65 (széles, s, IH); 4,6 4,8 (m, 2H); 5,06 (m, IH); 5,3-5,5 (m, 2H); 6,01 (d, 5,1 H); 6,07 (d,
5,1 H); 6,12 (s, IH); 6,24 (d, 11,1 H); 6,24 (m, IH); 6,3-6,5 (m, 2H); 6,53 (s, 311); 6,73 (q, 2,1 H); 7,62 (m, IH); 7,6-8,0 (m, 411); 8,22 (s, 311);
8.35 (d, 7,3 H); 8,41 (s, 3H); 8,49 (s, 3 H); 8,62 (t, 11,1 H); 9,03 (d, 6,3 H); 9,12 (q, 11,1 FI); 9,22 (d, 7,3 H).
C faktor: 4,29 (d, 11, t, 2,1 H); 4,4-4,6 (m, 3H); 4,56 (széles, s, 1H); 5,14 (dd, 15, 10, 1 H); 5,23 (m, IH); 5,65 (széles, s, 2H); 5,72 (d, 6,1 H); 5,95 (d, 10,1 H); 5,99 (d, 6,1 H); 6.08 (széles, s, IH); 6,1-6,4 (m, 3H); 6,62 (q, 3,1 H); 7,7-8,1 (m, ca 7 H); 8,18 (s, 3H); 8,33 (s, 3H); 8,48 (d,
7,3 H); 8,64 (s, 3H); 8,68 (t, 11,1 H); 9,00 (d, 7,3 H); 9,08 (d, 7,3 H); 9,12 (q, 12,1 H).
D faktor: 4,18-4,4 (m, 2H); 4,47—4,81 (m, 4H); 5,04 (in, IH); 5,35 (s, 2H); 5,72 (d, 7,1 II); 6,07 (d, 7,1 H); 6,15-6,45 (in, 4H); 6,74 (q, 4,1 H); 7,45-8,1 (m, 8 H); 8,16 (s, 3 H); 8,41 (s, 3 H); 8,49 (s, 3H); 8,62 (t, 11,1 H); 8,92-9,05 (m, 6 H); 9,21 (d, 7,3 H).
E faktor: 4,1-4,3 (m, 2 FI); 4,5-4,8 (m, 4Η teljes); 5,04 (m, 1H); 5,2-5,5 (m, 2H); 6,01 (d,
5,1 TI); 6,05 (d, 5,1 H); 6,11 (s, IH); 6,1-6,4 (m,
3H); 6,45 (d, 10,1 H); 6,51 (s, 3H); 6,70 (q, 2,1 II); 7,60 (m, IH); 8,20 (s, 3H); 8,41 (s, 3H); 8,47 2ς (s, 3H); 8,60 (t, 11,1 H); 9,00 (t, 7,3 H); 9,02 (d,
6.3 11); 9,11 (q, 11,1 FI); 9,20 (d, 7,3 H).
F faktor: 4,2—4,4 (in, 2 H); 4,62 (s, IFI); ca 4,70 (m, 2 H); 4,80 (d, 9,1 H); 5,04 (m, IH); 5,2-5,5 (m, 2 H); 5,99 (d, 5,1 H); 6,05 (d, 5,1
H); 6,11 (s, 1 H); 6,1-6,3 (m, 2H); ca 6,36 (m,
IH); 6,45 (d, 10,1 H); 6,51 (s, 3H); 6,70 (q, 2,1 H); 7,42 (m, IH); 7,58 (rn, IH): 8,19 (s, 3H); 8,40 (s, 3 H); 8,47 (s, 3H); 8,60 (t, 11,1 H); 8,95 (d, 7,3 H); 9,05 (d, 7,3 H): 9,01 (d, 7,3 H); 9,10 35 (q, 11,1 H); 9,21 (d, 6,3 H).
vi) Az egyes faktorok deutero-kloroformmal készült oldatának 25,05 MHz-nél felvett zajkioltott szén-13 NMR spektruma a következő helyeknél ad jelet (δ értékek a jelek sokszorozod ás ával a spekt40 rumban zárójelben):
A faktor: 173,2 (s); 142,6 (d); 139,2 (s): 137,6 (s); 137,1 (s); 137,0 (d); 130,4 (s); 123,1 (d);
120.1 (d); 117,8 (d); 99,5 (s); 80,0 (s); 79,0 (d);
76.5 (d); 69,0 (d); 68,3*; 67,4 (d); 48,2 (t); 45,5 45 (d); 40,9 (t); 40,5 (t); 35,8*; 34,5 (t); 22,1 (q);
34.5 (t); 26,6 (d); 22,6 (q); 22,0 (q); 19,7 (q);
15.3 (q); 13,7 (q); 10,8 (q).
B faktor: 173,4 (s); 142,1 (d); 139,5 (s); 137,1 (s); 135,7 (s); 133,7 (s); 123,6 (d); 123,3 (d);
50 120,0 (d); 119,3 (d); 118,2 (d); 99,5 (s); 80,1 (s);
77.3 (d); 76,6 (d); 76,4 (d); 69,0 (d); 68,3 (d); 67,9*; 67,6*; 57,5 (q); 48,2 (t); 45,4 (d); 40,7 (t);
40.5 (t); 35,8*; 34,5 (t); 22,1 (q); 19,6 (q); 15,3 (q); 13,6 (q); 12,9 (q); 10,5 (q).
C faktor: Y13,3 (s); 142,2 (d); 140,3 (s); 138,5 (s); 137,0 (s); 134,9 (s); 123,9 (d); 121,1 (d);
120,6 (d); 118,1 (d); 100,2 (s); 80,6 (s); 80,1 (d);
77.4 (d); 69,2 (d); 69,0 (d); 68,3*; 68,0 (d); 67,9 (d); 48,6.(t); 46,3 (d); 41,4 (t); 36,5*; 36,3*; 36,1 (d); 35,0 (t); 22,6 (q); 20,0 (q); 15,4 (q); 14,3 (q);
13.1 (q); 10,8 (q).
D faktor: 173,2 (s); 142,5 (d); 139,1 (s); 137,5 (s); 137,1 (s); 132,1 (s); 131,4 (d); 123,1 (d); 120,1 (d); 117,8 (d); 99,5 (s>; 79,9 (s); 79,2 (d); 76,5 (d); 69,0 (d); 68,3*; 68,1*; 67,6*; 67,4*; 48,2 (t);
-1325
2ö
45,5 (d); 40,8 (t); 40,5 (t); 35,7 ♦; 34,5 (t); 22,0 (q); 20,6 (t); 19,6 (q); 15,3 (q); 13,7 (q); 13,6 (q);
10,7 (q).
*A sokszorozódás bizonytalan.
vii) Az A, B, C és D faktor (kb, 0,1 %-os metanolos oldata) cirkulációs dikroizmusának jellemző görbéjét a 8. ábra mutatja. A görbék a 230—260 nm-es tartományban, amely a dién-kromofőr ab szorpciójának felel meg, szorosan megegyeznek. Ez arra utal, hogy a C2, C,, C,7 és C19 abszolút konfigurációja mind a négy faktorban azonos.
A következő példákban a találmány szerinti gyógyszerkészítmények előállítását mutatjuk be. A „hatóanyag” kifejezés a találmány szerinti vegyületet jelenti, amely az A, B, C, D, E vagy F faktorok bármelyike lehet.
Többszörös dózistí parenterális injekció
töm./ térf.% határ- értékek
Hatóanyag 4,0 1—5 töm/térf.%
Benzilalkohol 2,0
Glicerin-triacetát 30,0
Propilén-glikol 100,0-ig
A hatóanyagot feloldjuk benzilalkoholban és gliceril-triacetátban, és hozzáadjuk a propilén-glikolt, a térfogatot kiegészítve. Az oldatot leszűrjük a szemcsés maradványok eltávolítására. A terméket aszeptikus körülmények között injekciós flakonokba töltjük, gumidugóval lezárjuk, amelyet alumíniumkupakkal rögzítünk. Végül a terméket autoklávban sterilezzük.
Állatgyógyászati intramammdlis injekció
Aeroszol spray töm/ mg/ határ-
40 Hatóanyag Poliszorbát 60 töm% dózis értékek
töm% határ- értékek 3,0 150 150—500 mg 3 vagy 5 g-ig
Hatóanyag 0,1 0,01-0,50 Fehér 3 vagy 5 g-ig
töm.% méhviasz 6,0 3 g-íg
Triklór-etán 29,9 45 Aracliiszolaj 91,0 3 vagy 5 g-ig
Triklór-fluor-metán 35,0
Diklór-difluor-metán 35,0
A hatóanyagot triklór-etánnal keverjük, és aeroszol tartályba töltjük. A fejrészt megtisztítjuk a gáz hajtóanyaggal, és a szelepet a helyére nyomjuk. A szükséges tömegű folyékony hajtóanyagot a szelepen keresztül nyomás alatt betöltjük, és felszereljük a működtető szerkezetet és a porsapkát.
Kukoricakeményítő
Keményítő-nátriumglikolát
Nátrium-lauril-szulfát
22,5
9,0
4,5
Mikrokristályos cellulóz 450 mg tabletta magsúlyig.
A hatóanyagot összekeverjük annyi 10%-os ke ményítőmasszával, amennyi a nedves granulálási lehetővé teszi. A keveréket granuláljuk, fluidágyon megszántjuk, átszitáljuk, hozzáadjuk a többi komponenst, és tablettává sajtoljuk.
Kívánt esetben a tablettákat filmbcvonattal lát juk el, amely hidroxi-propil-mclil-cellulózból vagy más hasonló fílmképzŐ anyagból készült, vizes vagy nemvizes oldószerrendszerben. A filmbevonó oldószerbe lágyítószert és színezőanyagot is adagolhatunk.
Állatgyógyászati tabletta kis/hdzi állatok számára
Előállítás módja — száraz granulálás mg
Hatóanyag 50,0
Magnézium-sztearát 7,5
Mikrokristályos cellulóz 75 mg tabletta magsúlyig.
A hatóanyagokat elkeverjük a magnézium-sztearáttal és a mikrokristályos cellulózzal. A keveréket szemcsékké sajtoljuk, amelyeket rotációs granulátorban szabadon folyó tablettákká alakítunk. A tablettákat filmbevonattal láthatjuk el.
Keverés közben felmelegítjük az arachiszolajat, a fehér méhviaszt és a poüszorbát 60-t 160 ’C-ra. Az elegyet 2 óra hosszat 160 ’C-on tartjuk, majd lehűtjük szobahőmérsékletre, keverés közben. Aszeptikus körülmények között hozzáadjuk a hatóanyagot, és nagy sebességű keverővei díszpergáljuk. A keveréket kolloidmalmon finomítjuk, és aszeptikus körülmények között steril fecskendőkbe
Tabletta
Előállítás módja — nedves granulálás töm./ töm.%
Hatóanyag
Magnézium-sztearát 1 mg
250,0
4,5
Állatgyógyászati folyékony gyógyszer
töm/térf% határértékek
Hatóanyag 0,35 0,05-0,50 töin/térf%
Poliszorbát 85 5,0
Benzilalkohol 3,0
-142?
197 04G
Propilén-glikol 30,0
Foszfát-puffer pH 6,0-6,5 érték beállításához Víz 100,0-ig
A hatóanyagot feloldjuk poliszorbát 85, benzilaikohol és propilén-glikol elegyében. Hozzáadjuk a víz egy részét, a pH-t beállítjuk 6,0 és 6,5 közötti értékre, és a térfogatot kiegészítjük vízzel. A kész terméket töltjük.
Állatgyógyászati orális paszta
töm/töm% határértékek
Hatóanyag 7,5 T—10 töm/töm%
Szacharin 25,0
Poliszorbát 85 3,0
Alumínium-
disztearát 5,0
Frakcionált
kókuszolaj 100,0-ig
A frakcionált kókuszolajban diszpergáljuk az alumínium-disztearátot és a poliszorbát 85-t, melegítés közben. Az elegyet lehűtjük szobahőmérsékletre, és diszpergáljuk az olajos hordozóanyagban a szacharint, majd a hatóanyagot, és műanyag fecskendőkbe töltjük.
b) Hatóanyag 50 g
Syperonic NP13 40 g
Gipsz granulátum 1 kg-ig (20—60 mesh)
A komponenseket illékony oldószerben, pl. metilén-kloridban feloldjuk, és a granulátumhoz adjuk iiányváltós keverőben, majd megszárítjuk.
Az A, B, C, D, E és F faktorok aktivitását meghatároztuk különböző kártevők és gazdaszervezeteik esetén: Tetranychus urticae (francia bab és Myrobalan B szilva), Myzus persicae (kínai káposzta és retek), Heliothis virescens (gyapot), Chilo portellus (repce), Meíoidogyne incognita, Panonchus ulmi (Myrobalan B szilva), Phorodon humuli (komló), Aulacorthum circumflexum (ciklámen).
Λ terméket folyékony készítmény formájában alkalnituluk, acetonban oldva. Az oldatot azután hígítottuk vízzel, amely 0,1—0,01% nedvesftőszert tartalmazott, a kívánt koncentrációra.
A teszteket az egyes kártevőkhöz alkalmazva végeztük, számos kártevőt vizsgáltunk egy közegen, amely rendszerint egy gazdanövény volt, és a közeget kezeltük a termékkel (reziduális teszt). Tetranichus urticae esetén mind a kártevőt, mind a közeget kezeltük a termékkel (kontakt teszt).
Az A, B, C, D, E és F faktorok 500 ppm-néi kisebb koncentrációban hatásosnak bizonyultak.
Állatgyógyászati granulátum táphoz kevert adagoláshoz töm/töm% határértékek
Hatóanyag 2,5 0,05—5 töm/töm%
Mészkőliszt 100-lg
A hatóanyagot elkeveijük a mészkőliszttel, granuláljuk nedves granuláló módszerrel, fluidágyon megszárítjuk, és alkalmas csomagolóanyagba töltjük.
Növénykártevők elleni aktivitás
Az előzőekben ismertetett módszerrel az A és a C faktort vizsgáltuk, és 80—100%-osan hatásosnak találtuk Tetranichus urticae (francia babon), Myzus persicae (kínai kelen), ! íeliotís virescens (gyapoton) és Chilo portellus (repcén) ellen három napon át, 80—100%-osan hatásosnak találtuk Meliodigyne incognita ellen (Mung babon) hét napon át. A B faktort szintén 80—100%-osan hatásosnak találtuk Tetranichus urticae, Heliothis virescens és Chilo portellus ellen három napon át.
Emulgálható koncentrátum
Hatóanyag 50 g
Anionos emulgálószer 40 g
(pl. fenil-szulfonát CALX) Nemionos emulgálószer 60 g
(pl. Syperonic NP13) Aromás oldószer (pl. Solvesso 100) 1 literig
A komponenseket összekeveri ük, és oldódásig
keverjük.
Granulátum
a) Hatóanyag 50 g
Fagyanta 40 g
Gipsz granulátum 1 kg-ig
(pl. Agsorb 100A, 20—60 mesh)
Emberben és állatokban jelentkező aktivitásra utaló adagok (1) Caenorhabditis elegáns elleni aktivitás
A találmány szerinti eljárással előállított vegyületeket a szabadon élő Caenorhabditis elegáns elleni aktivitásra vizsgáltuk. A vegyületek oldatát, illetve szuszpenzióját metanollal készítettük el, és 20%-os prcpilén-glikolla! sorozathígítást készítettünk 400 mg/ml-tőí lefelé. 10 pl kapott oldatokat kevertünk 200 μ], 100—200 Caenorhabditis elegáns férget tartalmazó vizes oldattal, és 20 óra hosszat szobahőmérsékleten tartottuk.
A következő eredményeket kaptuk, és a minimális letális koncentráció formájában fejeztük ki (m. 1, c.), ahol a férgeknek több, mint 98%-a elpusztult vagy megbénult.
-1529
Faktor m. 1. c. mg/ml (20 óra)
A 0.08
B 0,08
C 0,08
D 0,08
E 0,15
F 0,01
Bár ez a teszt egy szabadon élő féregre irányult, következtetni lehet arra, hogy az emberben és állatban előforduló parazita férgek ellen a vegyületek ugyanígy hatnak.
2. Dictyocaulus viviparus elleni aktivitás
A találmány szerinti vegyületek aktivitását Dictyocaulus viviparus parazita nematodával fertőzött borjakon vizsgáltuk. A borjakat megfertőztük, és a fertőzés után 23 nappal a találmány szerinti eljárással előállított vegyület egyetlen dózisával (200 pg/ kg) kezeltük. Az állatokat a fertőzés után 29 nappal leöltük, és megszámoltuk a bennük található férgeket. Úgy találtuk, hogy az A, B, C és D faktorral történt kezelés után eltűntek a Dictyocaulus viviparus férgek.
Különböző ekto- és endoparaziták elleni aktivitás különbözőállatmodellekhen
Szarvasmarha
Ostertagia ostertagi lárvákkal fertőzött borjakat a fertőzés után 23 nappal egyetlen dózis (200 pg/ kg) találmány szerinti eljárással előállított vegyülettel kezeltünk orálisan. Az állatokat a fertőzés után 29 nappal leöltünk, és a bennük található férgeket megszámoltuk. Az A, C és D vegyületekkel végzett kezeléssel az Ostertagia ostertagi férgek teljesen eltűntek. A B faktor ő3%~os eredményt adott.
Hasonló módszerrel, egyetlen dózis (800 pg/kg) A faktor orális adagolása teljesen eltüntette a Cooperia oncophora férgeket.
Birka
Ostertagia ostertagi lárvákkal fertőzött birkákat 21 nappal a fertőzés után egyetlen dózis (200 pg/ kg) találmány szerinti eljárással előállított vegyülettel kezeltünk. Az állatokat a fertőzés után 27 nappal leöltük, és a bennük található férgeket megszámoltuk. Ügy találtuk, hogy az A és D faktor teljesen eltüntette az Ostertagia ostertagi férgeket. A C faktorral 74%-os eredményt kaptunk.
Hasonló módon, egyetlen dózis (200 pg/kg) A faktor orális adagolása teljesen eltüntette a Haemonchus contortus, Ostertagia circumcinta Trichostrongylus colubriformis és Nematodirus spathiger férgeket.
Sertés
1200 pg/kg A faktor szubkután adagolva teljesen meggyógyította a Sarcoptes acabei atkákkal fertőzött sertéseket.
In vitro aktivitás kullancs ellen
Kontakt tesztben a B faktor teljesen hatásosnak bizonyult Rhipicephalus appendiculatus kifejlett kullancs ellen 24—28 óra alatt.
Toxiátdsi vizsgálatok egereken
Akut toxicitást vizsgáltuk egereken intraperitoneális (I.P.) és orális (BO.) adagolás útján. Az állatokat 21 napig Figyeltük meg, és az LD50 értéket mértük.
Nőstény egereknek 0,1 ml, meghatározott töménységű, propilén-glikolban oldott tcsztvegyületet adtunk intraperitoneálisan. Az orális adagoláshoz a vegyületek 0,2 ml propilén-glikolos oldalit adagoltuk.
A következő eredményeket kaptuk LD50 értékben kifejezve, amely annyi mg tesztvegyüíet a kezelt állat testtömegének 1 kg-jára számítva, ameny-
nyi szükséges ahhoz, hogy az állatok 50%-át elpusztítsa.
Faktor adagolás módja LD50 (mg/kg)
A I.P. 12,5-50
B I.P 400
C I.P 25—50
D I.P 25-50
’vermectin I.P. 12,5-50
Faktor adagolás módja LDJ0 (mg/kg)
A PO. 100—200
B PO. >200
C P.O. >200
D PO. 100-200
’vermectin S.C. >50
S.C. — szubkután adagolás.
Az A, C és D faktor toxicitása hasonló, mint az ivermectiné, a B faktor viszont lényegesen kevésbé toxikus.
Szabadalmi igénypontok

Claims (15)

1. Eljárás (III) általános képletű vegyületek előállítására — ahol
R1 jelentése metil-, etil- vagy izopropilcsoport,
R2 jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport —, azzal jellemezve, hogy valamelyik Streptomyces ‘thermoarchaensis fajhoz tartozó mikroorganizmust asszimilálható szén-, nitrogén- és ásványisóforrást tartalmazó táptalajon tenyésztünk, és it tenyészközegből kívánt esetben a termelt (III) általános képletű vegyületek közül legalább egyet elválasztunk és kinyerünk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 21.)
-16197046
2. Eljárás (111) általános képletű vegyűletek előállítására — ahol
R1 és R2 jelentése metilcsoport, vagy
R2 jelentése hidrogénatom és R1 jelentése metil-, etil- vagy izopropilcsoport — azzal jellemezve, hogy valamely, a Streptomyces thermoarchaensis fajhoz tartozó mikroorganizmust asszimilálható szén-, nitrogén- és ásványisóforrást tartalmazó táptalajon tenyésztünk, és kívánt esetben a tenyészközegból a termelt (Hl) általános képletű vegyűletek közül legalább egyet elválasztunk és kinyerünk. (Elsőbbsége: 1984. 09. 14.)
3. A 2. igénypont szerinti eljárás az olyan (111) általános képletű vegyület előállítására, ahol R’ jelentése izopropilcsoport és R2 jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy a kapott olyan (111) általános képletű vegyületet, ahol R1 és R2 a tárgyi kör szerinti, a tenyészközegból elválasztjuk és kinyerjük. (Elsőbbsége: 1984. 09. 14.)
4. A 2. igénypont szerinti eljárás olyan (III) általános képletű vegyület előállítására, ahol R1 jelentése metilcsoport és R2 jelentése hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy a kapott olyan (III) általános képletű vegyületet, ahol R1 és R2 jelentése a tárgyi kör szerinti, a tenyészközegból elválasztjuk és kinyetjük. (Elsőbbsége: 1984. 09. 14.)
5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 törzset vagy ennek egy mutánsát tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1984. 12. 21.)
6. Az 1—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 vagy NCIB 12114 törzset vagy ezek mutánsát tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1985. 12. 21.)
7. Áz 1—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 25—40 ’Con végezzük. (Elsőbbsége: 1984. 12. 21.)
8. Az 1—7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 5,5 és 8,5 közötti pH-nál végezzük. (Elsőbbsége: 1984. 12.
21.)
9. Az 1—8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 2—10 napig végezzük. (Elsőbbsége: 1984. 12. 21.)
10. Az 1—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus micéli .imából vízzel elegyedő oldószerrel egy vagy több (IH) általános képletű vegyületet extrahálunk.
5 (Elsőbbsége: 1984. 12. 21.)
11. Az 1—10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (III) általános képletű vegyületeket elválasztjuk és kinyerjük a tenyészközegbő! (Elsőbbsége: 1984.
12. 21.) 10 12. Az 1—2. vagy 5—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyrészt az olyan (III) általános képletű vegyületeket, ahol R* jelentése az 1. igénypont szerinti és R2 jelentése hidrogénatom, és másrészt az olyan (IH) általános 15 képletű vegyületeket, ahol R1 jelentése az 1. igénypont szerinti és R2 jelentése metilcsoport, elválasztjuk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 21.)
13. Az 1—2. vagy 5—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a terméket a
20 teljes, legalább egy (Hl) képletű vegyületet tartalmazó tenyészközeg formájában, a teljes tenyészközeg szilárd terméke formájában, a tenyészközegből elválasztott teljes vagy elroncsolt micélium formájában, a tenyészközegnek a micéli25 ura elválasztása után visszamaradó része formájában vagy a tenyészközegnek a micélium elválasztása után visszamaradó részéből nyert szilárd termék formájában állítjuk elő. (Elsőbbsége: 1984. 12. 21.)
14. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására,
30 azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. vagy 2.
igénypont szerinti eljárással előállított (III) általános képletű vegyületet a gyógyszerkészítésben szokásos hígító-, hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakí35 tünk. (Elsőbbsége: 1984. 12. 21.)
15. Inszekticid, akaricid és neraatocid szer, azzal jellemezve, hogy hatóanyagént 0,01—15 tömeg% (III) általános képletű vegyületet — ahol R1 és R2 jelentése az 1. igénypont szerinti — tartamaz, a
40 növényvédőszcr-gyártásban szokásos folyékony és/ vagy szilárd hordozóanyagok — előnyösen aromás oldószerek, kőzeíőrlemények — és kívánt esetben felületaktív anyagok — előnyösen anionos és nemionos emulgálószerek — mellett. (Elsőbbsége:
45 1984. 12. 21.)
HU853466A 1984-09-14 1985-09-13 Process for producing macrolide compounds with antiparasitic effect, pharmaceuticals comprising them and plant protectives comprising the same HU197046B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB848423278A GB8423278D0 (en) 1984-09-14 1984-09-14 Antibiotic compounds
GB848432519A GB8432519D0 (en) 1984-12-21 1984-12-21 Antibiotic compounds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT39779A HUT39779A (en) 1986-10-29
HU197046B true HU197046B (en) 1989-02-28

Family

ID=26288220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU853466A HU197046B (en) 1984-09-14 1985-09-13 Process for producing macrolide compounds with antiparasitic effect, pharmaceuticals comprising them and plant protectives comprising the same

Country Status (33)

Country Link
US (2) US4898821A (hu)
JP (2) JPH07116199B2 (hu)
KR (1) KR940004098B1 (hu)
AT (1) AT396250B (hu)
AU (1) AU596565B2 (hu)
BE (1) BE903232A (hu)
BG (1) BG44205A3 (hu)
BR (1) BR8504457A (hu)
CA (1) CA1313155C (hu)
CH (1) CH666690A5 (hu)
CS (1) CS268803B2 (hu)
DE (1) DE3532794A1 (hu)
DK (1) DK162099C (hu)
ES (2) ES8704545A1 (hu)
FI (1) FI87366C (hu)
FR (1) FR2570390B1 (hu)
GB (1) GB2166436B (hu)
GR (1) GR852232B (hu)
HU (1) HU197046B (hu)
IE (1) IE59394B1 (hu)
IL (1) IL76385A (hu)
IT (1) IT1182857B (hu)
LU (1) LU86074A1 (hu)
NL (1) NL8502511A (hu)
NZ (1) NZ213463A (hu)
PH (2) PH21995A (hu)
PL (1) PL152148B1 (hu)
PT (1) PT81125B (hu)
RO (1) RO92478A (hu)
SE (2) SE502748C2 (hu)
SU (1) SU1738090A3 (hu)
UA (1) UA19162A (hu)
ZW (1) ZW15585A1 (hu)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LV5536A3 (lv) * 1984-09-14 1994-03-10 American Cyanamid Co Panemiens antibiotikas s-541 iegusanai streptomicetu celmi-antibiotikas s-541 producenti
US4696922A (en) * 1984-11-26 1987-09-29 Ciba-Geigy Corporation 5-azolylacetoxymilbemycins as ecto- and endoparasites
ES8802229A1 (es) * 1985-04-30 1988-04-16 Glaxo Group Ltd Un procedimiento para preparar nuevos derivados lactonicos macrociclicos.
AT399441B (de) * 1985-04-30 1995-05-26 American Cyanamid Co Schädlingsbekämpfungsmittel und verfahren zur bekämpfung von schädlingen
ES8800986A1 (es) * 1985-07-27 1987-12-01 Pfizer Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina
IE67373B1 (en) * 1985-09-13 1996-03-20 American Cyanamid Co Macrolide antibiotics and their preparation
GB8606120D0 (en) * 1986-03-12 1986-04-16 Glaxo Group Ltd Process
GB8606105D0 (en) * 1986-03-12 1986-04-16 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
NZ219575A (en) * 1986-03-12 1990-04-26 Glaxo Group Ltd Phosphate, substituted alkoxy, or amino-carbonyloxy derivatives of milbemycin, and pesticidal compositions
AT398312B (de) * 1986-03-12 1994-11-25 American Cyanamid Co Verfahren zur herstellung einer neuen makroliden verbindung
GB8606116D0 (en) * 1986-03-12 1986-04-16 Glaxo Group Ltd Process
ES2004384A6 (es) * 1986-03-12 1989-01-01 Glaxo Group Ltd Procedimiento para preparar compuestos antibioticos macrolidos y metodo para combatir plagas con ellos.
GB8613790D0 (en) * 1986-06-06 1986-07-09 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
CA1296329C (en) * 1986-06-06 1992-02-25 Derek R. Sutherland Macrolide compounds
US5840704A (en) * 1986-07-16 1998-11-24 Pfizer Inc. Antiparasitic agents and process for their preparation
EP0253378A3 (de) * 1986-07-18 1988-03-23 Ciba-Geigy Ag 13Beta-Alkyl-derivate von S541-Antibiotika zur Bekämpfung von Parasiten an Nutztieren und Pflanzen
JP2587241B2 (ja) * 1986-07-24 1997-03-05 ビ−チヤム・グル−プ・ピ−エルシ− 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物
US4916154A (en) * 1986-09-12 1990-04-10 American Cyanamid Company 23-Imino derivatives of LL-F28249 compounds
ES2058082T3 (es) * 1986-09-12 1994-11-01 American Cyanamid Co Derivados 23-oxo (ceto) y 23-imino de compuestos ll-f28249.
US5149832A (en) * 1986-09-12 1992-09-22 American Cyanamid Company Mono and diacyl derivatives of ll-f28249 compounds
US5019589A (en) * 1986-09-12 1991-05-28 American Cyanamid Company Δ23 -LL-F28249 compounds
ES2055695T3 (es) * 1986-09-12 1994-09-01 American Cyanamid Co Derivados 23-desoxi de compuestos ll-f28249.
US4886828A (en) * 1986-09-12 1989-12-12 American Cyanamid Company Δ22 -derivatives of LL-F28249 compounds
US5238848A (en) * 1987-01-23 1993-08-24 Pfizer Inc Cultures for production of avermectins
US5525506A (en) * 1987-01-23 1996-06-11 Pfizer Inc. Process for production of avermectins and cultures therefor
US5234831A (en) * 1987-01-23 1993-08-10 Pfizer Inc Cultures for production of B avermectins
US5183749A (en) * 1987-02-04 1993-02-02 Sankyo Company, Ltd. Microbial process for the preparation of milbemycin derivatives
US4897416A (en) * 1987-02-18 1990-01-30 Ciba-Geigy Corporation Insecticides and parasiticides
US4886829A (en) * 1987-03-06 1989-12-12 American Cyanamid Company 23-Oxo (keto) and 23-imino derivatives of mono- and diepoxy LL-F28249 compounds
US4956479A (en) * 1987-03-06 1990-09-11 American Cyanamid Company 23-deoxy-27-chloro derivatives of LL-F28249 compounds
US4855317A (en) * 1987-03-06 1989-08-08 Ciba-Geigy Corporation Insecticides and parasiticides
US4851428A (en) * 1987-03-06 1989-07-25 American Cyanamid Company Mono- and diepoxide derivatives of Δ22-LL-F28249 compounds
US4886830A (en) * 1987-03-06 1989-12-12 American Cyanamid Company Mono- and diepoxide derivatives of 23-deoxyl-LL-F28249 compounds
US4876272A (en) * 1987-03-06 1989-10-24 American Cyanamid Company Mono- and diepoxide derivatives of LL-F28249 compounds
US4806527A (en) * 1987-03-16 1989-02-21 Merck & Co., Inc. Avermectin derivatives
US4871719A (en) * 1987-03-24 1989-10-03 Ciba-Geigy Corporation Composition for controlling parasites in productive livestock
EP0285561A3 (de) * 1987-03-27 1989-10-25 Ciba-Geigy Ag Parasitizide und insektizide Milbemycin-Derivate
GB8721378D0 (en) * 1987-09-11 1987-10-21 Glaxo Group Ltd Chemical process
GB8721377D0 (en) * 1987-09-11 1987-10-21 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB8721375D0 (en) * 1987-09-11 1987-10-21 Glaxo Group Ltd Chemical process
GB8721647D0 (en) * 1987-09-15 1987-10-21 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
US5240850A (en) * 1987-10-23 1993-08-31 Pfizer Inc. Cultures for production of avermectin aglycones
EP0316124B1 (en) * 1987-11-09 1993-04-07 Pfizer Inc. Ethylated avermectins
GB8726730D0 (en) * 1987-11-14 1987-12-16 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
GB8803836D0 (en) * 1988-02-18 1988-03-16 Glaxo Group Ltd Compositions
GB8804440D0 (en) * 1988-02-25 1988-03-23 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
GB8805978D0 (en) * 1988-03-14 1988-04-13 Glaxo Group Ltd Process
GB8813760D0 (en) * 1988-06-10 1988-07-13 American Cyanamid Co Chemical process
NZ232422A (en) * 1989-02-16 1992-11-25 Merck & Co Inc 13-ketal milbemycin derivatives and parasiticides
US5322692A (en) * 1989-02-28 1994-06-21 American Cyanamid Company Sustained release bolus effective for the prolonged prevention, treatment or control of nematode, acarid and endo- and ectoparasitic infestations of ruminants
US6001822A (en) * 1989-04-11 1999-12-14 Pfizer Inc. Antiparasitic formulations
EP0393890B1 (en) * 1989-04-11 1992-08-12 Pfizer Limited Injectable compositions containing 25-cyclohexyl-avermectin b1
ES2087099T3 (es) 1989-08-11 1996-07-16 American Cyanamid Co Agentes arilpirrolicos insecticidas, acaricidas y nematicidas y procedimientos.
NZ234802A (en) * 1989-08-14 1992-11-25 Merck & Co Inc Long acting injectable formulations comprising an avermectin compound and triacetin. treatment for internal and external parasites of animals
US5830875A (en) * 1989-10-30 1998-11-03 Merck & Co., Inc. 24-and 25-substituted avermectin and milbemycin derivatives
US5055454A (en) * 1989-10-30 1991-10-08 Merck & Co., Inc. 13-epi-avermectin derivatives useful as antiparasitic agents
US5208222A (en) * 1991-03-28 1993-05-04 Merck & Co., Inc. 4"-and 4'-alkylthio avermectin derivatives
US5262400A (en) * 1991-06-20 1993-11-16 Merck & Co., Inc. 4α-substituted avermectin derivatives
MD24C2 (ro) * 1991-07-09 1994-05-31 Fabrica De Parfumerii Si Cosmetica "Viorica" Compoziţie de substanţe odorante
GB9205007D0 (en) * 1992-03-07 1992-04-22 Pfizer Ltd Antiparasitic agents
US5229415A (en) * 1992-03-24 1993-07-20 Merck & Co., Inc. Alkylthio alkyl avermectins are active antiparasitic agents
US6103504A (en) * 1992-03-25 2000-08-15 Pfizer Inc. Process for production of avermectins and cultures therefor
US6486195B1 (en) * 1993-08-19 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Thermodynamically stable crystal form of 4″-deoxy-4″-epi-methylamino avermectin B1a/B1b benzoic acid salt and processes for its preparation
JP2855181B2 (ja) 1993-12-10 1999-02-10 敏雄 鈴木 松類の枯損防止用組成物及び防止方法
US6495591B1 (en) 1997-10-02 2002-12-17 Essential Therapeutics, Inc. Fungal efflux pump inhibitors
EP1197215B1 (en) 2000-10-10 2006-03-22 Wyeth Anthelmintic compositions
GB0205253D0 (en) * 2002-03-06 2002-04-17 Univ Gent Immediate release pharmaceutical granule compositions and a continuous process for making them
KR100617648B1 (ko) * 2005-02-25 2006-09-05 김응권 혈장 또는 혈청을 함유하는 아벨리노 각막 이영양증 치료용약학 조성물
CN100394983C (zh) * 2006-01-09 2008-06-18 浙江海正药业股份有限公司 含有大豆油的多拉菌素注射液

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4914624A (hu) * 1972-06-08 1974-02-08
SE434277B (sv) * 1976-04-19 1984-07-16 Merck & Co Inc Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis
US4171314A (en) * 1977-12-19 1979-10-16 Merck & Co., Inc. 13-Halo and 13-deoxy C-076 compounds
US4173571A (en) * 1977-12-19 1979-11-06 Merck & Co., Inc. 13-Halo and 13-deoxy derivatives of C-076 compounds
PH16612A (en) * 1977-12-19 1983-11-28 Merck & Co Inc 13-halo and 13-deoxy derivatives of c-076 compounds
US4200581A (en) * 1978-08-04 1980-04-29 Merck & Co., Inc. Alkyl derivatives of C-076 compounds
NZ201681A (en) * 1981-09-03 1985-11-08 Merck & Co Inc Avermectin derivatives and parasiticidal compositions
DK165119C (da) * 1984-06-05 1993-03-01 American Cyanamid Co Antibiotiske forbindelser betegnet ll-f28249alfa, beta, gamma, delta, epsilon, zeta, eta, theta, iota, kappa, my og ny og pharmaceutisk or pharmakologisk acceptable salte deraf samt fremgangsmaade til deres fremstilling
ES8802229A1 (es) * 1985-04-30 1988-04-16 Glaxo Group Ltd Un procedimiento para preparar nuevos derivados lactonicos macrociclicos.
ES8800986A1 (es) * 1985-07-27 1987-12-01 Pfizer Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina

Also Published As

Publication number Publication date
CS654685A2 (en) 1989-08-14
LU86074A1 (fr) 1986-04-03
HUT39779A (en) 1986-10-29
US4898821A (en) 1990-02-06
CA1313155C (en) 1993-01-26
ATA268485A (de) 1992-11-15
DK162099B (da) 1991-09-16
PL152148B1 (en) 1990-11-30
SE8802985D0 (sv) 1988-08-25
PT81125A (en) 1985-10-01
IT8548551A0 (it) 1985-09-13
KR860002576A (ko) 1986-04-26
ES8802555A1 (es) 1988-08-01
KR940004098B1 (ko) 1994-05-13
FI87366C (fi) 1992-12-28
JPS61118387A (ja) 1986-06-05
DE3532794A1 (de) 1986-04-17
AT396250B (de) 1993-07-26
JPH07213278A (ja) 1995-08-15
BR8504457A (pt) 1986-07-15
IE852263L (en) 1986-03-14
DK418085A (da) 1986-03-15
NZ213463A (en) 1993-04-28
GB2166436B (en) 1989-05-24
PT81125B (pt) 1987-10-20
GB2166436A (en) 1986-05-08
PH24247A (en) 1990-05-04
SE8802985L (sv) 1988-08-25
SU1738090A3 (ru) 1992-05-30
IE59394B1 (en) 1994-02-23
ZW15585A1 (en) 1986-04-23
SE8504254L (sv) 1986-03-15
IT1182857B (it) 1987-10-05
CS268803B2 (en) 1990-04-11
ES8704545A1 (es) 1987-04-01
US4935531A (en) 1990-06-19
SE469173B (sv) 1993-05-24
SE8504254D0 (sv) 1985-09-13
AU4742685A (en) 1986-03-20
DK162099C (da) 1992-02-24
AU596565B2 (en) 1990-05-10
IL76385A (en) 1990-09-17
GR852232B (hu) 1986-01-14
CH666690A5 (de) 1988-08-15
ES546962A0 (es) 1987-04-01
FI853520L (fi) 1986-03-15
FI87366B (fi) 1992-09-15
GB8522699D0 (en) 1985-10-16
DK418085D0 (da) 1985-09-13
ES557237A0 (es) 1988-08-01
FI853520A0 (fi) 1985-09-13
SE502748C2 (sv) 1995-12-18
BG44205A3 (en) 1988-10-14
BE903232A (fr) 1986-03-13
PH21995A (en) 1988-05-02
NL8502511A (nl) 1986-04-01
JP2566385B2 (ja) 1996-12-25
FR2570390B1 (fr) 1987-11-27
RO92478A (ro) 1987-09-30
PL255360A1 (en) 1988-02-18
FR2570390A1 (fr) 1986-03-21
UA19162A (uk) 1997-12-25
IL76385A0 (en) 1986-01-31
JPH07116199B2 (ja) 1995-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU197046B (en) Process for producing macrolide compounds with antiparasitic effect, pharmaceuticals comprising them and plant protectives comprising the same
DK169036B1 (da) Avermectinderivater, fremgangsmåde til fremstilling af avermectinderivater med en ikke-naturlig substituentgruppe i 25-stillingen, præparater til behandling eller forhindring af parasitinfektioner hos mennesker og dyr og fremgangsmåde til bekæmpelse af insekt- eller parasitangreb
DE3614549C2 (de) Makrolid-Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Mittel, die diese Verbindungen enthalten
EP0284176B1 (en) Process for production of avermectins and cultures therefor
EP0194125A2 (en) Avermectin bioconversion products
HU199847B (en) Process for producing macrolide compounds and pharmaceutical compositions comprising same, as well as insecticides, acaricides and nematocides
US5182207A (en) Strains of streptomyces thermoarchaensis
DK168159B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af med avermectiner og milbemyciner beslægtede forbindelser
EP0204421B1 (en) Antihelmintic macrocyclic lactones and their production by fermentation
EP0298423A2 (en) Antibiotic KSB-1939 compounds and production process thereof as well as pesticidal agents containing same
EP0205251B1 (en) Antihelmintic macrocyclic lactones and their production by fermentation
DK168866B1 (da) 5-Keto-S541-macrolidforbindelse; krystallinsk produkt indeholdende over 90 % af forbindelsen; præparater indeholdende forbindelsen til anvendelse inden for human- og veterinærmedicin; skadedyrsbekæmpelsespræparat indeholdende forbindelsen; ikke-terapeutisk fremgangsmåde til bekæmpelse af skadedyr under anvendelse af forbindelsen; fremgangsmåde til fremstilling af et fermentationsmedium indeholdend
EP0242052B1 (en) Macrolide compounds
RU2100354C1 (ru) Макроциклический лактон, фармацевтическая композиция, обладающая антибиотической активностью, и инсектоакарицидная композиция
RU2029783C1 (ru) Способ получения антибиотика
PH26844A (en) Antibiotic compounds

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: AMERICAN CYANAMID COMPANY,US

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee