DK168866B1 - 5-Keto-S541-macrolidforbindelse; krystallinsk produkt indeholdende over 90 % af forbindelsen; præparater indeholdende forbindelsen til anvendelse inden for human- og veterinærmedicin; skadedyrsbekæmpelsespræparat indeholdende forbindelsen; ikke-terapeutisk fremgangsmåde til bekæmpelse af skadedyr under anvendelse af forbindelsen; fremgangsmåde til fremstilling af et fermentationsmedium indeholdend - Google Patents

Description

i DK 168866 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt antibiotisk 5-keto-S541-macrolidforbindelse samt et krystallinsk produkt indeholdende over 90 vægtprocent af denne forbindelse. Opfindelsen angår desuden præparater, der indeholder 5 denne forbindelse, og som kan anvendes inden for henholdsvis humanmedicin, veterinærmedicin og skadedyrsbekæmpelse.

Endvidere angår opfindelsen en ikke-terapeutisk fremgangsmåde til bekæmpelse af skadedyr under anvendelse af titelforbindelsen, en mikrobiologisk fremgangsmåde til fremstilling 10 af et fermentationsmedium indeholdende titelforbindelsen samt en fremgangsmåde til fremstilling af selve forbindelsen.

Endelig angår opfindelsen mikroorganismen Streptomyces ther-moarchaensis NCIB 12334.

Britisk patentskrift nr. 2166436 og europæisk patentskrift 15 nr. 170006 beskriver fremstillingen af en klasse substanser, som ansøgerne har betegnet antibiotika S54l, som kan isoleres fra fermentationsprodukterne fra streptomyces-mikroorganismer. Opfinderne har nu fundet en yderligere forbindelse med antibiotisk virkning, som kan fremstilles ved isolering fra 20 fermenteringen af en kultur af en mikroorganisme af slægten streptomyces eller ved kemisk modifikation af en antibiotika S541-forbindelse som beskrevet heri.

Den her omhandlede, hidtil ukendte forbindelse har formlen (I) : 2 01 DK 168866 B1 i"3 « C#3 Vil „ lS ^CH(eH3)a \ S/° - t0

Jlfid 11 Γψ'^'Μ).

»I

Det ovenfor omtalte europæiske patentskrift nr. 170006 omhandler bl.a. den tilsvarende forbindelse med en hydroxy-gruppe i 5-stillingen. Der omtales imidlertid ikke forbindelsen med formlen (I) ifølge den foreliggende opfindelse, ej 5 heller antydes der på nogen måde, at 5-OH-gruppens omdannelse til eller udskiftning med en 5-ketogruppe vil være mulig eller hensigtsmæssig; således er der i dette patentskrift heller ikke nogen indikation eller antydning af, at forbindelsen ifølge opfindelsen ville besidde de i nærværende be-10 skrivelse angivne, nyttige biologiske eller andre egenskaber [fx formuleringsmæssige egenskaber eller anvendelighed som et syntesemellemprodukt (vide infra)].

Ingen af patentskrifteme GB 2166436 og EP 170006 omtaler fremstillingen af 5-OH-forbindelserne i krystallinsk form.

15 Et særlig fordelagtigt kendetegn ved forbindelsen ifølge opfindelsen er dens evne til at danne krystaller, og opfindelsen angår især forbindelsen med formlen (I) i krystallinsk form.

Evnen hos forbindelsen til at krystallisere kan udnyttes som 20 et oprensningstrin ved fremstilling deraf, og ved at udnytte denne egenskab er forbindelsen med formlen (I) blevet vundet som et krystallinsk produkt med en renhed på over 90%, mere specifikt på over 95%.

DK 168866 B1 3 I lyset af forbindelsens evne til at danne et krystallinsk fast stof med meget høj renhed er forbindelsen med formlen (I) særlig anvendelig som et mellemprodukt ved fremstilling af andre forbindelser med antibiotisk virkning; som eksempler 5 på sådanne forbindelser kan nævnes de i den danske patentansøgning nr. 2902/87 omhandlede "antibiotika S541"-derivater .

Forbindelsen med formlen (I) selv har også antibiotisk virkning, fx antihelminthisk virkning, fx på nematoder, og især 10 anti-endoparasitisk og anti-ectoparasitisk virkning.

Den antibiotiske virkning af forbindelsen med formlen (I) kan fx påvises ved dens virkning in vitro mod frit levende nematoder, fx caenorhabiditis elegans.

Ectoparasitter og endoparasitter inficerer mennesker og en 15 række dyr og er særlig udbredt i husdyr såsom svin, får, kvæg, geder og fjerkræ (fx kyllinger og kalkuner), heste, kaniner, fuglevildt, burfugle og kæledyr såsom hunde, katte, marsvin, springmus og hamstere. Parasitisk infektion af husdyr, hvilket fører til anæmi, underernæring og vægttab, er 20 en væsentlig årsag til økonomisk tab i hele verden.

Eksempler på slægter af endoparasitter, der inficerer sådanne dyr og/eller mennesker er ancylostoma, ascaridia, ascaris, aspicularis, brugia, bunostomum, capillaria, chabertia, cooperia, dictyocaulus, dirofilaria, dracunculus, enterobius, 25 haemonchus, heterakis, loa, necator, nematodirus, nema-tospiroider (heligomoroider), nippostrongy lus, oesophago-stomum, onchocerca, ostertagia, oxyuris, parascaris, stron-gylus, strongyloider, syphacia, toxascaris, toxocara, tri-chonema, trichostrongylus, trichinella, trichuris, trio-30 dontophorus, uncinaria og wuchereria.

Eksempler på ectoparasitter, der inficerer dyr og/eller mennesker er leddyr-ectoparasitter såsom bidende insekter, DK 168866 B1 4 spyfluer, lopper, lus, mider, sugende insekter, tæger og andre tovingede skadedyr.

Eksempler på slægter af sådanne ectoparasitter der inficerer dyr og/eller mennesker, er ambylonaaa, boophilus, chorioptes, 5 culliphore, demodex, damalinia, dermatobia, gastrophilus, haematobia, haematopinus, baemophysalis, byaloma, hypoderma, ixodes, linognathus, lucilia, melophagus, oestrus, otobius, otodectes, psorergates, psoroptes, rhipicephalus, sarcpotes, stomoxys og tabanus.

10 Ved forsøg foretaget på miden Psoroptes cuniculi (en kanin-øreparasit) er det fundet at forbindelsen udviser en udtalt pesticid effekt. Forbindelsen blev appliceret direkte på miderne på et stykke filtrerpapir, og effekten blev målt som det procentuelle antal af døde mider. Resultaterne er anført 15 i følgende tabel:

Effektivitet overfor Psoroptes cuniculi

Dosis , , 4 1 0,1 0,01 ^g/cirr Døde mider 100 54 24 26 20 %

Endvidere er forbindelsen med formlen (I) også anvendelig ved bekæmpelse af insekt-, acari- og nematodeskadedyr inden for landbrug, havebrug, skovbrug, offentlig sundhed og oplagrede produkter. Skadedyr i jord og planteafgrøder, deriblandt 25 kornarter (fx hvede, byg, majs og ris), grøntsager (fx soja), frugt (fx æbler, vin og citrus) samt rodafgrøder (fx sukker- i roer og kartofler) kan behandles på gavnlig måde. Særlige eksempler på sådanne skadedyr er frugtmider og bladlus såsom aphis fabae, aulacorthum circumflexum, rnyzus persicae, nepho-30 tettix cincticeps, nilparvata lugens, panonychus ulmi, phoro-don humuli, phyllocoptruta oleivora, tetranychus urticae og medlemmer af slægten af trialeuroides; nematoder såsom med- DK 168866 B1 5 lemmer af slægterne aphelencoides, globodera, heterodera, meloidogyne og panagrellus; lepidoptera såsom heliothis, plutella og spodoptera; kornsnudebiller såsom anthonomus grandis og sitophilus granarius; melbiller såsom tribolium 5 castaneum; fluer såsom musca domestica; stikmyrer; bladskæ-rermyrer; pear psylla; thrips tabaci; kakkelakker såsom blatella germanica og periplaneta americana og moskitoer såsom, aedes aegypti.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes derfor forbindelsen med 10 formlen (I) som defineret ovenfor, som kan anvendes som antibiotikum. Forbindelsen kan især anvendes ved behandling af dyr og mennesker med endoparasitiske, ectoparasitiske og/eller fungale infektioner og inden for landbrug, havebrug eller skovbrug som pesticid til bekæmpelse af insekt-, acari-15 og nematodeskadedyr. Forbindelsen kan også anvendes generelt som pesticid til bekæmpelse eller regulering af skadedyr under andre omstændigheder, fx i lagre, bygninger eller andre offentlige steder eller skadedyrenes opholdssted. I almindelighed kan forbindelsen påføres enten til værten (dyr 20 eller menneske eller planter eller anden vegetation) eller til skadedyrene selv eller deres opholdssted.

Forbindelsen ifølge opfindelsen kan formuleres til administration ad en hvilken som helst hensigtsmæssig vej til anvendelse inden for veterinær eller humanmedicin, og op-25 findelsen omfatter derfor farmaceutiske præparater tilpasset til anvendelse inden for henholdsvis human- og veterinærmedicin, idet disse præparater er ejendommelige ved, at de indeholder en effektiv mængde af forbindelsen ifølge opfindelsen sammen med én eller flere bærere og/eller excipien-30 ser. Sådanne præparater kan foreligge til anvendelse på konventionel måde ved hjælp af en eller flere egnede bærere eller excipienser. Præparaterne ifølge opfindelsen omfatter præparater, som er i en form specielt formuleret til parenteral (deriblandt intramammær administration), oral, rectal, 35 topisk, implanterings-, ophthalmisk, nasal eller genitour inær anvendelse.

DK 168866 B1 6

Forbindelsen med formlen (I) kan formuleres til anvendelse inden for veterinær- eller humanmedicinen ifølge de generelle metoder beskrevet i britisk patentskrift nr. 2166436.

De totale daglige doser af forbindelsen ifølge opfindelsen 5 anvendt inden for både veterinær- og humanmedicinen vil hensigtsmæssigt være i området 1-2000 jug/kg legemsvægt, fortrinsvis 50-1000 jag/kg, og disse kan gives i delte doser, fx 1-4 gange daglig.

Forbindelsen ifølge opfindelsen kan formuleres på en hvilken 10 som helst hensigtsmæssig måde til havebrugs- eller landbrugs-anvendelse, og opfindelsen omfatter derfor et præparat tilpasset til skadedyrsbekæmpelse, idet præparatet er ejendommeligt ved, at det indeholder en effektiv mængde af forbindelsen ifølge opfindelsen sammen med én eller flere bærere 15 og/eller excipienser. Sådanne formuleringer omfatter tørre eller flydende typer, fx puddere, deriblandt pudderbaser eller' koncentrater, pulvere, deriblandt opløselige eller befugtelige pulvere, granulater, deriblandt mikrogranuler og dispergerbare granuler, pellets, flydbare præparater ("flow-20 ables"), emulsioner såsom fortyndede emulsioner eller emul-gerbare koncentrater, dyppepræparater såsom roddyppe-præparater og frødyppepræparater, frøbejdsemidler, frøpellets, oliekoncentrater, olieopløsninger, injektioner, fx stilkinjektioner, sprays, røg og tåger.

25 Generelt vil sådanne formuleringer omfatte forbindelsen i kombination med en egnet bærer eller diluent. Sådanne bærere og diluenter er som beskrevet i britisk patentskrift 2166436.

I formuleringerne er koncentrationen af aktivt materiale i almindelighed fra 0,001 til 99 vægtprocent og fortrinsvis 30 mellem 0,01 og 40 vægtprocent.

Kommercielle produkter tilvejebringes i almindelighed som koncentrerede præparater, som skal fortyndes til en passende koncentration, fx fra 0,001 til 0,0001 vægtprocent, ved brug.

DK 168866 B1 7

Den mængde, i hvilken forbindelsen påføres, afhænger af en række faktorer, deriblandt arten af det skadedyr, der er involveret, samt angrebsgraden. Imidlertid vil en påførings-mængde på fra 10 g/h til 10 kg/h være passende; fortrinsvis 5 fra 10 g/h til 1 kg/h til bekæmpelse af mider og insekter og fra 50 g/h til 10 kg/h til bekæmpelse af nematoder.

Til anvendelse inden for veterinærmedicinen .eller til havebrugs- og landbrugsanvendelse kan det være ønskeligt at anvende hele fermentationsvæsken, i hvilken forbindelsen 10 ifølge opfindelsen er fremstillet, som kilde til den aktive forbindelse. Det kan også være hensigtsmæssigt at anvende tørret dyrkningsvæske (indeholdende mycelia) eller at anvende mycelia skilt fra væsken og pasteuriseret eller, især, tørret fx ved spray-, fryse- eller valsetørring. Hvis det ønskes, 15 kan dyrkningsvæsken eller mycelia formuleres i præparater indeholdende konventionelle inerte bærere, excipienser eller diluenter som beskrevet ovenfor.

Den antibiotiske forbindelse ifølge opfindelsen kan administreres eller anvendes i kombination med andre aktive 20 bestanddele.

Den antibiotiske forbindelse ifølge opfindelsen kan især anvendes sammen med antibiotika S541-forbindelser eller med andre antibiotiske forbindelser. Dette kan fx forekomme, hvis total fermentationsvæske anvendes uden forudgående ad-25 skillelse af forbindelsen ifølge opfindelsen eller, hvor rå fermentationsprodukter anvendes uden forudgående eller efterfølgende adskillelse; dette kan være at foretrække, fx ved landbrugsmæssig anvendelse af forbindelsen, hvor det er vigtigt at holde lave produktionsomkostninger.

30 Forbindelsen ifølge opfindelsen kan opnås ved de nedenfor diskuterede processer.

Et yderligere aspekt af opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af et fermentationsmedium eller en DK 168866 B1 8 dyrkningsvæske indeholdende forbindelsen med fomlen (I), og fra hvilket medium eller væske forbindelsen-isoleres, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en mikroorganisme af slægten streptomyces dyrkes, idet den anvendte mikroorganisme 5 er streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 eller en mutant deraf med i det væsentlige samme egenskaber, der er i stand til at danne forbindelsen med formlen (I), men som ikke danner nogen væsentlig mængde 5jS-hydroxy- eller 5jS-methoxy-S541-forbindelser.

10 Mikroorganismer, som er i stand til at danne forbindelsen ifølge opfindelsen, kan let identificeres ved at anvende en test i lille målestok, og ved at en prøve, der er vundet ved fermentation af mikroorganismen, analyseres ved HPLC.

Mutanter af stammer kan opstå spontant eller kan fremstilles 15 ved en række metoder, deriblandt dem, som er skitseret i "Techniques for the Development of Micro-organisms" af Η.I. Adler i "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings of the Symposium, Wien 1973, s. 241, International Atomic Energy Authority. Sådanne metoder om-20 fatter ioniseret stråling, kemiske metoder, fx behandling med N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), varme, genetiske teknikker såsom rekombination, transduktion, transformation, lysogenisation og lysogen omdannelse, og selektive teknikker for spontane mutanter.

25 Som omtalt ovenfor er mutanter, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, de mutanter, som ikke danner væsentlige mængder af 5jS-hydroxy- eller 5/3-methoxy-antibiotika S541-forbindelser (beskrevet i britisk patentskrift nr. 2166436). Mutanter, som er i stand til at danne forbindelsen 30 med formlen (I), men med nedsat evne til at danne antibiotika S541-forbindelserne, kan let identificeres ved anvendelse af en test i lille målestok, og ved at en test-prøve, som er vundet ved fermentation af mikroorganismen, analyseres ved HPLC.

DK 168866 B1 9

En særlig foretrukken stamme, som er i stand til at danne forbindelsen med formlen (I), med nedsat evne til at danne antibiotika S541-forbindelser er streptomyces thermo-archaensis NCIB 12334 (deponeret 15. september 1986 i den 5 permanente kultursamling hos National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, Storbritannien i overensstemmelse med Budapest-traktaten) og mutanter deraf med i det væsentlige samme egenskaber. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 udgør et 10 yderligere aspekt af opfindelsen. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 har på mange punkter de samme essentielle kendetegn som dem, der er beskrevet for streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 i britisk patentskrift nr. 2166436.

NCIB 12334 kan imidlertid skelnes fra NCIB 12015 ved, at den 15 under de i britisk patentskrift nr. 2166436 beskrevne fermentationsbetingelser danner lidt eller ingen af de antibiotika S54l-forbindelser, som er beskrevet deri. Mutanter af Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 med i det væsentlige samme egenskaber som denne kan opstå spontant eller kan 20 fremstilles ved de ovenfor beskrevne metoder.

Fremstilling af et fermentationsmedium eller en dyrkningsvæske indeholdende forbindelsen ifølge opfindelsen ved fermentation af en egnet streptomyces-organisme kan udføres på konventionel måde, dvs. ved dyrkning af streptomyces-organis-25 men i nærværelse af assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og mineralsalte.

Assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og mineraler kan tilvejebringes af enten simple eller komplekse næringsmidler. Kilder til carbon vil i almindelighed omfatte glucose, malto-30 se, stivelse, glycerol, melasse, dextrin, lactose, saccarose, fructose, carboxylsyrer, aminosyrer, glycerider, alkoholer, alkaner og vegetabilske olier. Kilder til carbon vil i almindelighed omfatte fra 0,5 til 10 vægtprocent af fermentationsmediet .

DK 168866 B1 10

Kilder til nitrogen vil i almindelighed omfatte sojabønnemel, majsstøbevand, opløselige destillationsrester, gærekstrakter, bomuldsfrømel, peptoner, jordnøddemel, maltekstrakt, melasse, kasein, aminosyreblandinger, ammoniak (gas eller opløsning), 5 ammoniumssalte eller nitrater. Ureaer og andre amider kan også anvendes. Kilder til nitrogen vil i almindelighed omfatte fra 0,1 til 10 vægtprocent af fermentationsmediet.

Næringsmineralsalte, som kan inkorporeres i dyrkningsmediet, omfatter de almindeligt anvendte salte, som er i stand til at 10 give natrium-, kalium-, ammonium-, jern-, magnesium-, zink-, nikkel-, cobalt-, mangan-, vanadium-, chrom-, calcium-, kobber-, molybdæn-, bor-, phosphat-, sulphat-, chlorid- og carbonationer.

Et antiskummiddel kan være til stede til styring af over-15 dreven skumning og kan tilsættes med mellemrum efter behov.

Dyrkning af streptomyces-organismen vil i almindelighed blive udført ved en temperatur fra 20°C til 50°C, fortrinsvis fra 25°C til 40°C, specielt omkring 34°C, og vil fortrinsvis finde sted under beluftning og agitation, fx ved rystning 20 eller omrøring. Mediet kan indledningsvis inokuleres med en lille mængde af en suspension af den sporulerede mikroorganisme, men med henblik på at undgå en vækstforsinkelse kan et vegetativt inokulum af organismen fremstilles ved at inokulere en lille mængde af dyrkningsmediet med sporeformen 25 af organismen, og det vundne vegetative inokulum kan overføres til fermentationsmediet eller, især, til ét eller flere podetrin, hvor yderligere vækst finder sted inden overføring til hovedfermentationsmediet. Fermentationen vil i almindelighed udføres i pH-intervallet 5,5-8,5, fortrinsvis 5,5-7,5. 30 Det kan være nødvendigt at sætte syre til fermentationsmediet for at holde pH inden for det ønskede område. Egnede syrer, som kan tilsættes, omfatter vandige syrer såsom svovlsyre eller fedtsyrer såsom valerianesyre eller isosmørsyre eller blandinger deraf.

DK 168866 B1 11

Fermentationen kan udføres i et tidsrum på 2-10 dage, fx ca.

5 dage.

Hvis det ønskes at skille forbindelsen ifølge opfindelsen fra det samlede fermentationsmedium, kan dette udføres ved kon-5 ventionelle isolerings- og separationsteknikker. Forbindelsen ifølge opfindelsen er hovedsageligt indeholdt i cellernes mycelia, men kan også findes i fermentationsvæsken, og isoleringsteknikkerne kan også anvendes på fermentationsvæsken enten før eller efter klaring. Det vil være klart, at valget 10 af isolationsteknikker kan variere inden for vide grænser.

Forbindelsen ifølge opfindelsen kan isoleres og separeres ved en lang række fraktioneringsteknikker, fx adsorptions-elu-ering, udfældning, fraktioneret krystallisation, solvent-ekstraktion og væske/væske-fordeling, som kan kombineres på 15 forskellige måder.

Solventekstraktion, fordeling mellem to opløsningsmidler, som er ikke-blandbare eller kun delvist blandbare med hinanden, og chromatografi har vist sig at være særlig egnet til isolering og separation af forbindelsen ifølge opfindelsen.

20 Efter fermentationen kan myceliet høstes (eventuelt efter behandling med et flocculeringsmiddel eller med en syre, indtil fermentationsmediets pH-værdi er under pH 6 eller efter opvarmning eller, fortrinsvis, opvarmning og syretilsætning) under anvendelse af konventionelle teknikker, fx 25 filtrering eller centrifugering. Derefter kan forbindelsen ifølge opfindelsen fx ekstraheres fra myceliet ved hjælp af et passende organisk opløsningsmiddel såsom en keton, fx acetone, methylethylketon eller methylisobutylketon; et car-bonhydrid, fx hexan; et halogeneret carbonhydrid, fx chloro-30 form, carbontetrachlorid eller methylenchlorid; en alkohol, fx methanol eller propan-2-ol; en diol, fx propan-1,2-diol eller butan-1,3-diol; en ester, fx methylacetat eller ethyl-acetat, eller blandinger deraf. Det vil være klart, at hvis myceliet indeholder signifikante mængder vand, vil det fore- DK 168866 B1 12 trækkes at anvende et med vand blandbart opløsningsmiddel såsom methanol eller acetone.

Der vil i almindelighed kræves mere end én ekstraktion af myceliet for at opnå optimal udvinding. Forbindelsen ifølge 5 opfindelsen kan udvindes fra opløsningsmiddelekstrakterne som et råpræparat ved fjernelse af opløsningsmidlet, fx ved inddampning eller ved udfældning, fx ved at hælde opløsnings-middelekstraktet ud i vand. Alternativt kan den indledende opløsningsmiddelekstrakt efter reduktion af opløsningsmiddel -10 volumet, fx ved inddampning, selv ekstraheres med et andet opløsningsmiddel, som er ikke-blandbart eller kun delvist blandbart med det første. Hvis den indledende ekstraktion af myceliet er med et med vand blandbart opløsningsmiddel såsom methanol eller propan-1,2-diol, kan det andet opløsnings-15 middel hensigtsmæssigt være et med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel såsom hexan, chloroform, dichloromethan, ethylacetat eller petroleumsether eller blandinger deraf, idet der sættes tilstrækkeligt vand til den indledende ekstrakt for at sikre ikke-blandbarhed med det andet opløsnings-20 middel og for at styre fordelingen af den antibiotiske forbindelse mellem faserne. Ved passende valg af med vand blandbare og med vand ikke-blandbare opløsningsmidler og ved at manipulere med vandindholdet af det med vand blandbare opløsningsmiddel er en række overføringer af den antibiotiske 25 forbindelse fra vand-blandbare til vand-ikke-blandbare opløsningsmidler og omvendt mulige. Alternativt kan den indledende opløsningsmiddelekstrakt passeres hen over et leje af en ionbytterharpiks såsom Amberlite® IRA 68 eller en ikke-funktionel harpiks såsom Amberlite® XAD-1180 (Rohm og Haas) 30 for yderligere at oprense ekstrakten.

s Den antibiotiske forbindelse kan udvindes fra den endelige opløsningsmiddel-opløsning ved afdampning af opløsningsmidlet, ved udfældning eller ved adsorption på en egnet fast bærer, alt efter arten af det endelige opløsningsmiddel.

DK 168866 B1 13

Oprensning og/eller separation af forbindelsen ifølge opfindelsen kan endvidere udføres ved konventionelle teknikker såsom fx chromatografi (deriblandt HPLC (High Performance Liquid chromatography)) på en egnet bærer såsom silicagel; en 5 ikke-funktionel makroretikulær adsorptionsharpiks, fx tvær-bundne styren/divinylbenzenpolymerharpikser såsom Amberiite® XAD-2, XAD-4, XAD-16 eller XAD-1180 harpikser (Rohm og Haas Ltd.)_ eller Kastell™ S112 (Montedison); en substitueret sty-ren/divinylbenzen-polymer, fx en halogeneret (fx bromeret) 10 styren/divinylbenzen-polymer såsom Diaion™ SP207 (Mitsubishi) ; en organisk opløsningsmiddel-kompatibel tværbundet dextran såsom Sephadex® LH20 (Pharmacia UK Ltd.) eller på omvendt-fasebærere såsom carbonhydridbundet silicagel, fx C18-bundet silicagel. Bæreren kan være i fom af et leje 15 eller fortrinsvis pakket i en søjle.

En opløsning af forbindelsen med formlen (I) i et egnet opløsningsmiddel, fx dichlormethan, tetrahydrofuran, pe-troleumsether, acetonitril, chloroform, ethylacetat eller blandinger deraf vil i almindelighed fyldes på chromatografi-20 søjlen, fx en silicagel- eller sephadex-søjle, om ønsket efter først at reducere opløsningsmiddelvolumet. Søjlen kan eventuelt vaskes og derefter elueres med et opløsningsmiddel med hensigtsmæssig polaritet, fx alkoholer såsom methanol; carbonhydrider, fx hexan eller petroleumsethere; estere såsom 25 ethylacetat; ketoner såsom acetone; ethere såsom diethyl-ether; acetonitril; eller halogenerede carbonhydrider såsom dichlormethan eller chloroform. Kombinationer af sådanne opløsningsmidler eller kombinationer med et polært opløsningsmiddel, fx vand, kan også anvendes.

30 Tilstedeværelsen af forbindelsen ifølge opfindelsen under ekstraktions/isolations-procedurerne kan overvåges ved konventionelle teknikker såsom HPLC eller UV-spektroskop! eller ved at udnytte de nedenfor beskrevne egenskaber hos forbindelsen.

DK 168866 B1 14

Hvis forbindelsen ifølge opfindelsen fås i form af en opløsning i et organisk opløsningsmiddel, fx efter oprensning ved chromatografi, kan opløsningsmidlet fjernes ved konventionelle procedurer, fx ved inddampning, hvilket giver for-5 bindeisen i fast eller krystallinsk form.

Ved en hensigtsmæssig kombination af de ovennævnte procedurer er forbindelsen ifølge opfindelsen blevet isoleret som et fast stof. Det vil være klart, at den rækkefølge, i hvilken de ovennævnte oprensnings trin udføres, samt valget af dem, 10 som anvendes, kan variere inden for vide grænser.

Ved en yderligere fremgangsmåde ifølge opfindelsen kan forbindelsen med formlen (I) fremstilles ved oxidation af en forbindelse med formlen (II)

OH

CHj (ll) S N/0 «PUi ° “3

Reaktionen udføres ved hjælp af et oxidationsmiddel, som 15 tjener til at omdanne en allylisk sekundær hydroxygruppe til en oxogruppe, hvorved forbindelsen med formlen (I) dannes.

Egnede oxidationsmidler omfatter fx overgangsmetaloxider såsom mangandioxid og atmosfærisk oxygen i nærværelse af en egnet katalysator såsom et findelt metal, fx platin.

20 Oxidationsmidlet vil i almindelighed blive anvendt i overskud i forhold til den støkiometriske mængde.

DK 168866 B1 15

Reaktionen kan hensigtsmæssigt udføres i et egnet opløsningsmiddel, som kan være valgt fra en keton, fx acetone, en ether, fx diethylether, dioxan eller tetrahydrofuran; et carbonhydrid, fx hexan; et halogeneret carbonhydrid, fx 5 chloroform eller methylenchlorid; eller en ester, fx ethyl-acetat. Kombinationer af sådanne opløsningsmidler enten alene eller med vand kan også anvendes.

Reaktionen kan udføres ved en temperatur på fra -50°C til +50°C, fortrinsvis fra 0°C til 30°C.

10 Mellemproduktforbindelsen med formlen (II) kan fremstilles som beskrevet i britisk patentskrift nr. 2166436.

Forbindelsen med formlen (I), fremstillet ved fermentation eller ud fra en forbindelse med formlen (II) ifølge de ovennævnte procedurer enten som en opløsning eller som et råt 15 fast stof, kan opnås i krystallinsk form under anvendelse af konventionelle metoder. For eksempel kan krystallisation opnås ud fra en opløsning af forbindelsen, fx ved henstand i et egnet opløsningsmiddel (fx en alkohol såsom methanol eller propan-2-ol; acetonitril; et carbonhydrid såsom hexan; en 20 ether såsom diethylether eller isopropylether; eller petro-leumsether) eventuelt kombineret med vand.

Opfindelsen illustreres ved nedenstående eksempler.

Faktor A er forbindelsen med formlen (II). Faktor A kan fremstilles som beskrevet i britisk patentskrift nr. 2166436.

25 EKSEMPEL 1 250 mg faktor A i 30 ml ether blev omrørt sammen med 1,0 g aktivt mangandioxid i 2,75 time. Blandingen blev filtreret gennem en kieselguhrkage, og filtratet blev inddampet, hvilket gav 240 mg af forbindelsen ifølge opfindelsen som et 30 skum. En portion blev krystalliseret fra petroleumsether, hvilket gav mikrokrystaller, (EtOH) 240,5 nm (Έ·^ 495); DK 168866 B1 16 δ (CDC13) værdier 6,58 (s; IH), 2,60 (m; IH) 1,89 (s; 3H), 1,62 (s; 3H) , 1,53 (θ; 3H) , 1,05 (d 6; 3H),-1,00 (d 6; 3H) , 0,96 (d 6; 3H) og 0,80 (d 6; 3H); m/z omfatter 610, 592, 574, 441, 265, 247, 237, 219 og 151.

5 EKSEMPEL 2

Sporer af streptomyces thermoarchaensis NCIB_12015 blev inokuleret på skrå-agar fremstillet ud fra følgende bestanddele: sr/i 10 Gærekstrakt (Oxoid® L21) 0,5

Maltekstrakt (Oxoid® L39) 30,0

Mykologisk pepton (Oxoid® L40) 5,0

Agar nr. 3 (Oxoid® L13) 15,0

Destilleret vand op til 1 1 15 pH ~ 5,4 og inkuberet ved 28°C i 10 dage.

Den modne skrå-agar blev derefter dækket med 6 ml af en 10% glycerolopløsning og skrabet med et sterilt værktøj for at løsne sporerne og myceliet. Portioner på 0,4 ml af den resul-20 terende sporesuspension blev overført til sterile polypropylenrør, som derefter blev varmeforseglet og opbevaret i dampen oven over flydende nitrogen, indtil de skulle bruges.

To 250 ml Erlenmeyer-kolber indeholdende 50 ml podemedium blev fremstillet som følger: 25 gr/2 D-glucose 15,0

Glycerol 15,0

Sojapepton 15,0

NaCl 3,0 30 CaC03 1,0

Destilleret vand op til 1 1 DK 168866 Bl 17 (Mediets ujusterede pH-værdi var 6,7, som blev justeret til pH 7,0 ved hjælp af vandigt natriumhydroxid- inden autoklavering. Mediets pH-værdi efter autoklavering var 7,3) blev hver podet med 0,2 ml af sporesuspensionen taget fra et 5 rør.

Kolberne blev inkuberet ved 28°C i 2 dage på-et rysteapparat, der roterede med 250 omdrejninger pr. minut med en orbital bevægelse med diameter på 50 mm.

Indholdet af begge kolber blev anvendt til at inokulere en 10 70-liters fermentationsbeholder indeholdende 40 1 af det samme podemedium, suppleret med polypropylenglycol 2000 (0,06% volumen/volumen) . Polypropylenglycol 2000 blev tilsat efter behov under hele fermentationen for at styre skumning. Fermentationen blev udført ved 28°C med agitation og beluft-15 ning i tilstrækkelig grad til at opretholde et niveau af opløst oxygen på over 30% af mætning. Efter 24 timers fermentation blev en 9-liters portion væske overført til en 700-liters fermentor indeholdende 450 1 medium fremstillet som følger:

20 g/I

D-glucose 2,8

Maltdextrin (MD30E) 27,8

Arkasoy™ 50 13,9

Melasse 1,7 25 K2HP04 0,14

CaC03 1,39

Silicone™ 525 (Dow Corning) 0,06% (volumen/volumen)

Justeret til pH 6,5 inden sterilisation.

Fermentationen blev udført ved 28°C med agitation og beluft-30 ning. Polypropylenglycol 2000 antiskum blev tilsat efter behov, og pH blev holdt nede ved 7,2 ved tilsætning af H2S04 indtil høstning. Fermentationen blev høstet efter 5 dage.

DK 168866 B1 18

Dyrkningsvæsken (450 1) blev klaret på en Westfalia™ KA 25 centrifuge, og den tilbageværende supernatant blev fortrængt ved hjælp af 20 1 vand. De 25,5 kg udvundne celler blev omrørt i 1 time på en Silverson™ mixer model BX i tilstrække-5 lig methanol til at give et samlet volumen på 75 1. Suspensionen blev filtreret, og den faste remanens blev gen-ekstraheret med 35 1 methanol og filtreret. Det forenede filtrat _(87 1) blev fortyndet med 40 1 vand og .ekstraheret med 30 1 60-80° petroleumsether. Efter 30 minutter blev faserne 10 adskilt på en Westfalia™ MEM 1256 centrifuge og den nedre methanolfase blev genekstraheret med 30 1 60-80° petroleumsether efter tilsætning af 40 1 vand. Efter adskillelse blev den nedre fase igen ekstraheret med 30 1 60-80° petroleumsether. De forenede petroleumsetherfaser (85 1) blev koncen-15 treret ved tre passager gennem en Pfaudler® 8,8-12v-27 film-afstrygningsinddamper (damptryk 0,1 bar, damptemperatur 20°C, vanddamptemperatur 127°C). Koncentratet (9 1) blev tørret med 2 kg natriumsulfat og yderligere koncentreret under reduceret tryk ved 40°C i en rotationsfilminddamper.' 20 Den olieagtige remanens (130 g) blev opløst i chloroform, hvilket gav 190 ml, og denne opløsning blev sat på en søjle af Merck® 7734 silica 60 (200 x 4 cm) pakket i chloroform. Søjlen blev vasket med 500 ml chloroform og elueret med . chloroform/ethylacetat (3:1), og fraktioner på ca. 40 ml blev 25 opsamlet efter et forløb på 1400 ml.

Fraktionerne 32-46 blev forenet og inddampet, hvilket gav 21,2 g af en olie. Fraktionerne 47-93 blev forenet og inddampet, hvilket gav 20,1 g af en olie, som blev opløst i-chloroform/ethylacetat (3:1) op til 50 ml og sat på en søjle 30 af Merck® 7734 silica 60 (200 x 4 cm) pakket i chloroform/ethylacetat (3:1), og fraktioner på ca. 40 ml blev opsamlet efter et forløb på 1400 ml. Fraktionerne 22-36 blev forenet og inddampet, hvilket gav 3,1 g af en olie, som blev sat til olien vundet fra fraktionerne 32-46 fra den første 35 søjle. De forenede olier blev opløst i 4 ml kogende methanol, DK 168866 Bl 19 som derefter blev sat til 20 ml varm propan-2-ol og fik lov at krystallisere.

Moderluden efter krystallisation blev inddampet, hvilket gav en olie, som blev opløst i et ligeså stort volumen di-5 chlormethan og sat på en søjle (30 x 2,2 cm) af Merck® Kieselgel 60 (0,21-0,063 mm ASTM, art. nr. 7734) pakket i dichlormethan. Lejet blev vasket med dichlormethan (2 leje-volumener) og elueret med chloroform/ethylacetat (3:1) (2 lejevolumener). Inddampning af eluatet gav en olie, som blev 10 opløst i methanol og underkastet en præparativ HPLC på Spherisorb™ S5 ODS-2 (250 mm x 20 mm, Phase Sep. Ltd.). Portioner på 5 ml af prøven blev pumpet over på søjlen i løbet af et tidsrum på ét minut, og søjlen blev elueret med acetonitril/vand (7:3) under følgende betingelser: 15 Tid (minutter) Flow (ml/min) 0,00 0,00 ) Injektions- 1.00 0,00 ) tid 1,10 30,00 39,90 30,00 20 40,00 35,00 75.00 35,00

Materialet elueret fra HPLC-søjlen blev overvåget ved UV-spektroskopi ved 238 nm.

Inddampning af de forenede fraktioner med toppe, der eluerede 25 ved 33,4 minutter, gav 34 mg af forbindelsen ifølge opfindelsen.

E.I.-massespektroskopi gav en molekylion ved 610 og gav karakteristiske fragmenter ved: 592 574 30 556 422 259 241 DK 168866 B1 20 EKSEMPEL 3

Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 blev i fom af sporesuspensioner i 20% glycerol lagret ved -70°C på en måde i lighed med det i eksempel 2 for streptomyces thermo-5 archaensis NCIB 12015 beskrevne. 1 ml sporer blev optøet og benyttet til at inokulere en 250 ml Erlenmyer-kolbe indeholdende 50 ml medium A:

Medium A g/1 D-glucose 2,5 10 Maltodextrin MD30E 25,0

Arkasoy™ 50 12,5

Roemelasse 1,5 K2HP04 0,125

CaC03 1,25 15 MOPS [3- (N-morpholino)propansulfonsyre] 21,0

Destilleret vand op til 1 1, pH justeret til 6,5 før autoklavering (15 minutter ved 121°C).

Podekolben blev inkuberet ved 28°C i 2 dage, hvorefter 1 ml blev aseptisk overført til hver af fire lignende kolber (hver 20 indeholdende 50 ml Medium A) . Hver kolbe blev inkuberet ved 28°C i en 2-dages periode med agitation på en rotationsryster (250 omdr./min.) med en bevægelse med en diameter på 50 mm.

To 7-liters podefermentorer blev derefter inokuleret med'ca.

80 ml [2% (volumen/volumen) ] af det samlede rystekolbe-in-25 okulum. Hver 7-liters fementor indeholdt 4 1 medium B:

Medium B g/1

Meritose 45,0

Arkasoy™ 50 18,0

Roemelasse 2,2 30 K2HP04 0,18

CaC03 (Analar) 1,8

Silicone™ 1520 (Dow Corning) 2,5 ml i 4 1 DK 168866 B1 21

Destilleret vand op til 4 1 med pH justeret til 6,5 før autoklavering (45 minutter ved 124°C). Fermentationen blev udført ved 28°C med agitation og beluftning.

En 700-liters fermentor blev inokuleret med 5,4 1 overført 5 aseptisk fra podebeholderne efter 24 timer. Fermentoren indeholdt 450 1 Medium B, hvor CaC03 (analysereagenskvalitet) var erstattet med Sturcal™ kridt, og 250 ml Silicone™ 1520 blev tilsat. pH blev justeret til 6,5 under anvendelse af koncentreret H2S04 inden sterilisering in situ i 30 minutter 10 ved 121°C. Endvidere blev tre 70-liters fermentorer inokuleret med 800 ml (2% volumen/volumen) overført aseptisk fra podebeholderen efter 24 timer. Hver beholder indeholdt 35 1 Medium B som vist ovenfor med 25 ml Silicone™ 1520 tilsat inden sterilisation in situ (30 minutter 121°C).

15 De efterfølgende fermentationer blev udført ved 34°C med agitation og beluftning. Polypropylenglycol 2000 antiskummid-del blev tilsat efter behov under fermentationerne, og pH-værdien blev holdt nede ved pH 7,4 ved tilsætning af en 75:25 blanding af valeriane/isosmørsyre indtil høstning.

20 Efter 120 timer blev fermentorernes indhold forenet (600 1), blandet med 3 kg dicalit og filtreret gennem 24 kg cellulose (Rettenmaier™ ΒΕ00) på et rotationsvakuumfilter. Den vundne cellepasta (45 kg) blev opbevaret ved -20°C.

Den frosne cellepasta blev suspenderet i 55 1 methanol og fik 25 lov at tø. Efter 30 minutter ved 5°C blev suspensionen filtreret gennem et celluloseleje. Remanensen blev resuspenderet i 50 1 methanol, filtreret gennem celluloselejet og vasket med 10 1 methanol.

De forenede filtrater og vaskefaser (116 1) blev fortyndet 30 med 22 1 vand og ekstraheret med 100 1 60-80°C petroleums-ether. Petroleumsetherekstrakten blev koncentreret ved lavt tryk (ca. 0,15 bar) i en afstrygningsfilminddamper.

DK 168866 B1 22

Koncentratet (8,4 1) blev ekstraheret 3 gange med 3 x 4,2 1 propan-l,2-diol. De forenede ekstrakter (13-,.5 1) blev omrørt sammen med 22 1 ethylacetat og 12 1 vand og fik derefter lov at henstå til adskillelse af faserne. Den øvre fase (17,5 1) 5 blev vasket 2 gange med vand (12 1 og 10 1), og den tilbageværende øvre organiske fase blev tørret til 112 g af en olie.

Olien. blev opløst i 500 ml dichlormethan og chromatograferet på en søjle (425 mm x 45 mm 0) af Merck® Kieselgel 60 (type 7734) pakket i samme opløsningsmiddel. Søjlen blev vasket med 10 500 ml dichlormethan og blev derefter elueret med 400 ml af en 9:1 volumen/volumen blanding af dichlormethan og diethyl-ether. Eluatet blev tørret til 54 g af en svagt gul tjære.

(a) En portion på 1,2 g af tjæren blev opløst i 5 ml aceto-nitril og chromatograferet på en søjle (340 mm x 25 mm 0) af 15 Sephadex® LH20, som var pakket og blev elueret med aceto-nitril. Fraktionen elueret mellem 110 ml og 130 ml blev tørret og genopløst i et 2,5 ml acetonitril. 2 ml af denne opløsning blev fortyndet med 70% vandigt acetonitril (2 ml indeholdende 1,4 ml acetonitril). Denne opløsning blev der-20 efter i to lige store dele chromatograferet på en søjle (250 mm x 25 mm 0) af Spherisorb™ S5 0DS2 med 70% vandigt acetonitril som elueringsopløsningsmiddel. Det materiale, der eluerede mellem 0,8 1 og 0,95 ml blev opsamlet fra de to kørsler og blev fortyndet med ca. 0,9 1 vand. Denne opløsning 25 blev pumpet tilbage på samme søjle af Spherisorb™ S5 ODS2, og søjlen blev elueret med acetonitril. Acetonitrilet blev fjernet ved inddampning, og prøven blev tørret azeotropt ud fra en blanding af acetone og cyclohexan, hvilket gav 33 mg af forbindelsen ifølge opfindelsen som et fast stof. NMR, UV 30 og massespektrene af det faste stof var forligelige med spektrene af produktet fra eksempel 1.

(b) 4,32 g af tjæren opløst i diethylether blev tørret til et fast stof og genopløst i acetonitril i en koncentration af 300 mg/ml. Denne opløsning (8,5 ml) blev blandet med et 35 ligeså stort volumen 75% volumen/volumen acetonitril i vand DK 168866 B1 23 og blev i 9 portioner chromatograferet på en søjle af Spherisorb™ ODS-2 (250 mm x 20 mm) . De forskellige komponenter blev elueret med 75% acetonitril ved 25 ml/minut. Toppen, der eluerede mellem 0,51 1 og 0,61 1, blev opsamlet 5 fra hver kørsel og samlet sammen. Totalmængden blev blandet med et ligeså stort volumen vand og blev genadsorberet på samme Spherisorb™-søjle. Søjlen blev elueret med acetonitril. Eluatet blev opvarmet til 45°C, og der blev tilsat vand indtil eluatet lige netop blev tåget. Eluatet blev afkølet 10 til 4°C og blev henstillet til krystallisation. Krystallerne blev filtreret fra og tørret, hvilket gav 0,26 g af forbindelsen ifølge opfindelsen. Analyse af det faste stof ved omvendt-fase analytisk HPLC viste tilstedeværelse af 4% urenheder regnet ud fra den samlede absorption ved 238 nm.

15 1H-NMR - SPEKTRUM

Et 200 MHz 1H-NMR-spektrum af en opløsning i deutero-chloroform omfatter signaler ved omtrent følgende positioner: δ 6,55 (udbredt s; IH) 1,88 (udbredt s; 3H) 5,86 (dl5; IH) 1,60 (s; 3H) 20 5,72 (ddl5,11; IH) 1,52 (s; 3H) 1,03 (d7; 3H) 1,00 (d7; 3H) 0,95 (d7; 3H) 0,79 (d6; 3H)

25 13 c-mm-SPEKTRUM

13

Et 25,05 MHz C-NMR-spektrum af en opløsning i deutero- chlorofrom har signaler ved ca. følgende positioner: δ 192,2 (s) 69,6 (t) 171,9 (s) 63,3 (d) 30 143,9 (d) 68,6 (d) 138,4 (d) 48,4 (t) 137,7 (S) 46,6 (d) DK 168866 B1 24 137,4 (s) 41,1 (t) 137.3 (d) 40,8 (t) 136.7 (s) 36,1 (?) 130.7 (s) 34,8 (t) 5 123,4 (d) 26,9 (d) 121,9 (d) 22,9 (q) 120.4 (d) 22,2 (q) 99.8 (s) 15,6 (q) 82,0 (s) 14,0 (q) 10 81,0 (d) 11,0 (q) 76.8 (d)

Toppen ved δ 36,1 fremkommer ud fra adskillige overlagte signaler og dens multiplicitet er derfor uklar.

UV-SPEKTRUM

15 Et UV-spektrum i methanol (c = 0,001%) har en X__ på ca.

max 240,4 nm (E-l1 509) .

IR-SPEKTRUM

Et IR-spektrum af en bromoformopløsning (c = 1%) omfatter bånd ved ca. 3500 (OH), 1710 (ester), 1678 (konjugeret keton) 20 og 996 cm"1 (C-0).

MASSESPEKTRUM

Et lavopløsnings E.I. massespektrum gav en molekylion ved m/z 610 og fragmentioner ved m/z 592, 574, 480, 441, 440, 423, 422, 265, 259, 247, 241, 237, 219 og 151.

25 MIKROANALYSE

Mikroanalyse gav C 70,95%, H 8,33%. (Beregnet C 70,82%, H

8,20%).

EKSEMPEL 4 DK 168866 B1 25 1 ml af en sporesuspension af streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 (fremstillet ifølge eksempel 3) blev brugt til at inokulere en 250 ml rystekolbe indeholdende medium A (50 ml, 5 pH justeret til 6,5 inden autoklavering). Kolben blev inkuberet ved 28°C i 2 dage med agitation på en rotationsryster (250 jomdr./min.) med en bevægelse med en diameter på 50 mm. Portioner på 1 ml fra det efter 2 dage udviklede inokulum blev overført til hver af seks lignende kolber indeholdende 10 50 ml medium A og fermenteret på samme måde i to dage. En 20-liters fermentor indeholdende medium B (12 1, pH justeret til 6,5 inden sterilisation ved 121°C i 30 minutter) blev derefter inokuleret med ca. 300 ml (2% volumen/volumen) af det samlede rystekolbe inokulum. Fermentationen blev udført ved 15 28°C med agitation og beluftning i 24 timer.

En 700-liters fermentor indeholdende Medium B (450 1, pH justeret til 6,5 inden sterilisation ved 121°C i 30 minutter) blev inokuleret med 12 1 af det efter 24 timer udviklede inokulum. Fermentationen blev udført ved 34°C med agitation 20 og beluftning, og pH blev styret ned til pH 7,4 ved hjælp af et 10% H2S04.

Efter 90 timer blev de 400 1 høstet dyrkningsvæske filtreret gennem cellulose (Rettenmaier™ BEOO) med en blanding af 2 kg Dicalite® og 2 kg cellulose som filterhjælp. Den udvundne 25 cellepasta blev suspenderet i ca. 100 1 methanol og filtreret efter ca. 45 minutter. Cellerne blev genekstraheret med ca.

50 1 methanol. De forenede ekstrakter (145 1) blev fortyndet med 35 1 vand og ekstraheret med hexan på en Rotabel™ LX204, idet der blev tilsat vand ved tredie ekstraktionstrin. Hexan-30 ekstrakten (145 1) blev koncentreret.

Koncentratet (2 1) blev ekstraheret med 3x11 propan-1,2-diol. Ekstrakterne blev forenet (3,16 1) og blandet med 3,34 1 ethylacetat og 3,0 1 vand. Den øverste fase af ethylacetat blev udvundet og vasket med vand. Ethylacetaten blev fjernet DK 168866 B1 26 og den tilbageværende olie blev azeotropiseret med acetone til 71 g af et tørt skum.

Det faste stof blev opløst i 300 ml methanol og 32 ml vand og sat på en søjle (4,6 1, 12,8 x 36 cm) af Whatman® ODS3 Prep 5 40 omvendt-faset silicagel. Søjlen blev elueret med methanol/vand (9:1), og fraktioner elueret mellem 8,6 1 og 10,2 2 blev forenet og koncentreret, indtil der begyndte at dannes et bundfald. Efter henstand natten over ved 4°C blev det faste stof filtreret fra og tørret i vakuum.

10 En portion på 8,5 g af det faste stof blev opløst i en blanding af 140 ml acetonitril, 17 ml tetrahydrofuran og 13 ml vand. Portioner på 5,0 ml af denne opløsning blev derefter chromatograferet på en søjle (25 x 2,1 cm) af Spherisorb™ ODS2 (5 μ) under anvendelse af acetonitril/vand (4:1) som 15 elueringsopløsningsmiddel tilsat med en hastighed på 25 ml /min. De toppe, der kom ud mellem 9,8 min. og 13,6 min. blev forenet (2,75 1) og fortyndet med 1,5 1 vand, og opløsningen blev delt i tre protioner. Hver portion blev pumpet tilbage på søjlen og elueret med acetonitril. De tre prøver 20 blev derefter forenet, inddampet til et fast stof og omkrystalliseret af acetonitril, hvilket gav 4,8 g krystaller af forbindelsen ifølge opfindelsen. Analyse af det faste stof ved normal og omvendt-faset analytisk HPLC viste tilstedé-værelse af <2% urenheder.

25 EKSEMPEL 5 25 1 høstet dyrkningsvæske fremstillet ifølge eksempel 3 blev gjort sur til pH 3 ved hjælp af 15% volumen/volumen svovlsyre og derefter opvarmet ved 90°C i 15 minutter inden filtrering gennem et Hyflo®-leje. Cellepastaen (1556 g) blev omrørt med 30 3,9 1 methanol i 30 minutter, opslæmningen blev filtreret, og den faste remanens blev gensuspenderet i 3,9 1 methanol og genfiltreret. Det forenede filtrat blev justeret til pH 4 ved hjælp af 15% volumen/volumen svovlsyre og passeret hen over et leje af Amberlite® IRA 68 harpiks (acetatcyclus, 750 ml) DK 168866 B1 27 ved 3750 ml/time. Søjlen blev vasket med methanol og de forenede methanolperkolater blev koncentreret bil 3,5 1 og samtidig med 10,5 1 0,1% volumen/volumen svovlsyre sat til 50 ml kold (ca. 5°C) omrørt 0,1% svovlsyre. Opslæmningen blev 5 omrørt i 10 minutter og filtreret, og den faste opslæmning blev vasket med koldt vand inden tørring. Det tørre faste stof indeholdt 12,9 g af forbindelsen ifølge opfindelsen ved sammenligning med en autentisk prøve ved hjælp af HPLC.

EKSEMPEL 6 10 25 1 høstet dyrkningsvæske fremstillet ifølge eksempel 3 blev gjort sur til pH 3 ved hjælp af 15% volumen/volumen svovlsyre og derefter opvarmet til 90°C i 15 minutter inden filtrering gennem et Hyflo®-leje. En portion på 500 g af cellepastaen blev omrørt med 750 ml methanol i 30 minutter, opslæmningen 15 blev filtreret, og den faste remanens blev gensuspenderet i 750 ml methanol og filtreret. Det forenede filtrat (1,5 1) blev fortyndet med 617 ml vand og ekstraheret med tre portioner hexan (706 ml). Hexanekstrakterne blev forenet (2790 ml), og en portion på 1390 ml blev koncentreret til 20 250 ml og blev ved 50 ml/time passeret hen over et leje af 10 ml Amberlite® XAD 1180 harpiks præpareret i hexan. Harpiksen blev vasket med 10 ml hexan, og den totale hexan-opløsning blev koncentreret til 20 ml. En portion på 10,2 ml af den koncentrerede hexan blev sat på en søjle (100 ml) af 25 Crossfield™ SD 210 silicagel præpareret i hexan. Lejet blev vasket med 700 ml 5% volumen/volumen acetone/hexan ved 100 ml/time og elueret med 10% volumen/volumen acetone/hexan ved 100 ml/time. Eluatet blev overvåget ved hjælp af HPLC, og de fraktioner, der indeholdt forbindelsen ifølge opfindelsen, 30 blev forenet og inddampet til en olie.

Olien blev opløst i 150 ml methanol og 70 ml vand efterfulgt af afdampning af methanolen i vakuum, hvilket efterlod et fast stof, som blev filtreret og tørret. Det tørre faste stof indeholdt 0,21 g af forbindelsen ifølge opfindelsen sammen-35 lignet med en autentisk prøve ved hjælp af HPLC.

DK 168866 B1 28

Det følgende er eksempler på formuleringer ifølge opfindelsen. Udtrykket "aktiv bestanddel", som anvendt i det følgende, betegner forbindelsen ifølge opfindelsen.

Parenteralt multidosis-ini ektionspræparat 5 % vægt /volumen Område

Aktiv bestanddel 4,0 0,1-7,5% vægt/volumen

Benzylalkohol 2,0

Glyceryltriacetat 30,0

Propylenglycol op til 100,0 10 Den aktive bestanddel opløses i benzylalkohol og glyceryl triacetat. Der tilsættes propyl englycol op til volumen. Produktet steriliseres ved konventionelle farmaceutiske metoder, fx sterilfiltrering eller ved opvarmning i en autoklave og aseptisk pakning.

15 Aeorosolsnray % vægt/vægt Område

Aktiv bestanddel 0,1 0,01-2,0% vægt/vægt

Trichlorethan 29,9

Trichlorf luormethan 35,0 20 Dichlordif luormethan 35,0

Den aktive bestanddel blandes med trichlorethan og fyldes i aerosolbeholderen. Headspace skylles med det gasformige drivemiddel, og ventilen krympes på plads. Den nødvendige vægt af flydende drivmiddel påfyldes under tryk gennem ven-25 tilen. Aerosolbeholderen forsynes med aktivator og støvhætte.

DK 168866 B1 29

Tablet

Fremstillingsmetode - våd granulering mg

Aktiv bestanddel 250,0 5 Magnesiumstearat 4,5

Majsstivelse 22,5

Natrijumstivelsesglycolat 9,0

Natriumlaurylsulphat 4,5

Mikrokrystallinsk cellulose 10 op til tabletkernevægt på 450 mg

Der tilsættes tilstrækkelig mængde af en 10% stivelsespasta til den aktive bestanddel til at danne en til granulering passende våd masse. Granulerne fremstilles og tørres under anvendelse af en bakke- eller fluid-bedtørrer. Granulerne 15 sigtes gennem en si, de øvrige bestanddele tilsættes, og blandingen presses til tabletter.

Hvis det ønskes, kan tabletkernerne filmovertrækkes under anvendelse af hydroxypropylmethyl cellulose eller et lignende filmdannende materiale under anvendelse af enten et vandigt 20 eller et ikke-vandigt opløsningsmiddelsystem. Et blødgørings-middel og hensigtsmæssig farve kan inkluderes i filmovertræk-ningsopløsningen.

Veterinær tablet til anvendelse i små husdyr Fremstillingsmetode - tør granulering 25 mg

Aktiv bestanddel 50,0

Magnesiumstearat 7,5

Mikrokrystallinsk cellulose op til tabletkernevægt på 75,0 30 Den aktive bestanddel blandes med magnesiumstearatet og den mikrokrystallinske cellulose. Blandingen kompakteres til kugler. Kuglerne nedbrydes ved passage gennem en rotations- DK 168866 B1 30 granulator til dannelse af frit flydende granuler. Granulerne presses til tabletter.

Tabletkemerne kan derefter, om ønsket, filmovertrækkes som beskrevet ovenfor.

5 Veterinært intramammært iniektionspræparat mg/dosis Område

Aktiv bestanddel 150 mg 0,05 - 1,0 g

Polysorbate™ 60 3,0% (vægt/vægt)

Hvid bivoks 6,0% (vægt/vægt) til 3 g til 3 eller 10 15 g

Arachisolie 91,0% (vægt/vægt)

Arachisolie, hvid bivoks og Polysorbate™ 60 opvarmes til 160°C under omrøring. Blandingen holdes ved 160°C i to timer og afkøles derefter til stuetemperatur under omrøring. Den 15 aktive bestanddel sættes aseptisk til bæreren og dispergeres under anvendelse af en high speedmixer. Blandingen raffineres ved passage gennem en kolloidmølle. Produktet fyldes aseptisk i sterile plastsprøjter.

Veterinært oralt "drench” 20 % vægt/volumen Område

Aktiv bestanddel 0,35 0,01 - 2% vægt/volumen

Polysorbate™ 85 5,0

Benzylalkohol 3,0

Propylenglycol 30,0 25 Phosphatpuffer som pH 6,0-6,5

Vand op til 100,0

Den aktive bestanddel opløses i Polysorbate™ 85, benzylalkohol og propylenglycol. En del af vandet tilsættes, og pH justeres om nødvendigt til 6,0-6,5 ved hjælp af phosphat-30 puffer. Der fyldes op til slutvolumen med vandet. Produktet fyldes i "drench"-beholderen.

DK 168866 B1 31

Veterinær oral pasta % vægt/vægt Område

Aktiv bestanddel 7,5 1 - 30% vægt/vægt

Saccharin 25,0 5 Polysorbate™ 85 3,0

Aluminiumdi s tearat 5,0

Fraktioneret kokos-nøddeolie op til 100,0

Aluminiumdistearatet dispergeres i den fraktionerede kokos-10 nøddeolie og Polysorbate™ 85 ved opvarmning. Blandingen afkøles til stuetemperatur, og saccharinen dispergeres i. den olieagtige bærer. Den aktive bestanddel dispenseres ned i basisen. Blandingen fyldes i plasticsprøjter.

Granuler til veterinær administration i foder 15 % vægt/vægt Område

Aktiv bestanddel 2,5 0,05-5% vægt/vægt

Calciumsulphathemihydrat op til 100,0

Den aktive bestanddel blandes med calciumsulfatet. Granulerne fremstilles under anvendelse af en vådgranuleringsproces.

20 Granulerne tørres under anvendelse af en bakke- eller fluid-bedtørrer. Granulerne fyldes i en passende beholder.

Emulcrerbart koncentrat

Aktiv bestanddel 50 g

Anionisk emulgator 40 g 25 (fx phenylsulphonat CALX)

Ikke-ionisk emulgator 60 g (fx Syperonic™ NP13)

Aromatisk opløsningsmiddel (fx Solvesso® 100) op til 1 liter. Alle ingredienserne blandes og omrøres, indtil de er opløst.

DK 168866 B1 32

Granuler (a) Aktiv bestanddel 50 g

Træharpiks 40 g

Gips-granuler (0,84-0,25 mm) op til 1 kg 5 (fx Agsorb™ 10OA) (b) . Aktiv bestanddel 50 g _

Syperonic™ NP13 40 g

Gips-granuler (0,84-0,25 mm) op til 1 kg

De opløselige bestanddele (dvs. alle bestanddelene midtagen 10 gips-granulerne) opløses i et letflygtigt opløsningsmiddel, fx methylenchlorid, og sættes til granuleme, mens granulerne roterer i en tromleblander. De resulterende granuler tørres derefter for at fjerne opløsningsmidlet.

Claims (10)

1. 2. Forbindelsen ifølge krav 1 i krystallinsk form.
2. 3. Krystallinsk produkt indeholdende over 90% af forbindelsen 5 ifølge krav 1.
3. 4. Præparat til anvendelse inden for humanmedicin, kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde af forbindelsen ifølge krav 1 sammen med én eller flere bærere og/eller excipienser.
4. 5. Præparat til anvendelse inden for veterinærmedicin, kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde af forbindelsen ifølge krav 1 sammen med en eller flere bærere og/eller excipienser.
5. 6. Skadedyrsbekæmpelsespræparat, 15 kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde af forbindelsen ifølge krav 1 sammen med én eller flere bærere og/eller excipienser.
6. 7. Ikke-terapeutisk fremgangsmåde til bekæmpelse af skadedyr inden for landbrug, havebrug eller skovbrug eller i lagre, 20 bygninger eller andre offentlige steder eller skadedyrenes opholdssteder, DK 168866 81 kendetegnet ved, at der til planter eller anden vegetation eller til skadedyrene selv eller-disses opholdssted påføres en effektiv mængde af forbindelsen ifølge krav 1.
7. 8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at skadedyrene er insektskadedyr, acariskadedyr, eller nematodeskadedyr.
8. 9. Fremgangsmåde til fremstilling af et fermentationsmedium indeholdende forbindelsen ifølge krav 1, fra hvilket fermen - 10 tationsmedium forbindelsen ifølge krav 1 isoleres, kendetegnet ved, at en mikroorganisme af slægten streptomyces dyrkes, idet den anvendte mikroorganisme er streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 eller en mutant deraf med i det væsentlige samme egenskaber, der er i stand 15 til at danne forbindelsen med formlen (I), men som ikke danner nogen væsentlig mængde 5)3-hydroxy- eller 5/3-methoxy-S541-forbindelser.
9. 10. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen ifølge krav 1, 20 kendetegnet ved, at den tilsvarende 5j3-hydroxy-forbindelse oxideres.
10. 11. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 9.