PT84447B - Processo para a preparacao de um composto macrolido e de composicoes que os contem - Google Patents

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Derek R Sutherland
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Hazel M Noble
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American Cyanamid Co
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/01—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
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Description

Pedido de Publicação de Patente Britânica 2166436 e o Pedido de Patente Europeia N9 170006 descrevem a produção de uma classe de substâncias, que designamos por Antibióticos S541, que podem ser isolados dos produtos de fer mentação dos microorganismos Streptomyces. Encontrámos agora mais um composto com actividade antibiótica que pode ser preparado por * isolamento a partir duma cultura de um microorganismo do gênero
N.
Streptomyces ou por modificação química de um composto Antibiõti co S541 como descrito incluso.
Assim a presente invenção refere-se a um processo para a preparação do composto de fórmula (I)
Uma caracteristica particularmente vantajosa do composto da fórmula (I) ê a sua capacidade de formar sólidos cristalinos e a presente invenção abrange o processo para a preparação do composto da fórmula (I) na forma cristalina.
A capacidade do composto de cristalizar pode ser usada como uma fase de purificação na sua prepara ção, e utilizando esta propriedade o composto da fórmula (I) foi obtido como um sólido cristalino tendo uma pureza superior a 90%, mais particularmente superior a 95%.
Tendo em vista esta capacidade para formar um sólido cristalino possuindo uma pureza muito alta, o composto da fórmula (I) ê especialmente útil como intermediário na preparação de outros compostos com actividade antibiótica.
O próprio composto da fórmula (I) tem também actividade antibiótica p. ex., actividade antihelmíntica, por exemplo contra nemãtodos, e em particular actividade anti-endoparasítica e anti-ectoparasítica.
A actividade antibiótica do composto da fórmula (I) pode, por exemplo, ser demonstrada pela sua ac tividade in vitro contra nemãtodos livres vivos p. ex., Caenorha biditis elegans.
Ectoparasitas e endoparasitas infec
tam humanos e uma variedade de animais e são particularmente pre dominantes em animais de quintas tais como porcos, carneiros, ga do vacum, cabras e criação (p. ex. galinhas e perus), cavalos coelhos, aves de caça, aves de gaiola, e animais domésticos tais como cães, gatos, cobaias, gerbos e hamsters. A infestação por parasitas dos animais domésticos, conduzindo a anemia, malnutrição e perda de peso, ê a maior causa de prejuízo económico através do mundo.
Exemplos de gêneros de endoparasitas que afectam tais animais e/ou humanos são Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, Brugia, Bunostomum, Capillaria, Cha bertia, Cooperia, Dictyocaulus, Dirofilaria, Dracunculus, Entero bius, Haemonchus, Heterakis, Loa, Necator, Nematoridus, Nemastopiroides (Heligomoroides), Nippostrongylus, Oesophagostomum, Onchocerca, Ostertagia, Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Toxocara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris, Triodontophorus, Uncinaria e Wuchereria.
Exemplos de ectoparasitas que infes tam animais e/ou humanos são artrópodes ectoparasitas tais como insectos picadores, moscas varejeiras, pulgas, piolhos, traças, insectos sugadores, carrapatos e outras pragas de dlpteros.
Exemplos dos géneros de tais ectopa rasitas que infectam animais e/ou humanos são Ambyloma, Boophilus, Chorioptes, Culliphore, Demodex, Damalinia, Dermatobia, Gas trophilus, Haematobia, Haematopinus, Haemophysalis, Hyaloma, Hypoderma, Ixodes, Linognathus, Lucilla, Melophagus, Oestrus, Otobius, Otodectes, Psorergates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes, Stomoxys e Tabanus.
Além disso, o composto da fórmula (I) usa-se também no combate a pragas de insectos, de acarldeos e de nemãtodos na agricultura, horticultura, silvicultura, saúde pública e produtos armazenados. Pragas de solos e de plantas de cultivo, incluindo cereais (p. ex. aveia, cevada, milho e arroz) vegetais (p. ex. soja), frutos (p. ex. maçãs, vinhas e citrinos) bem como raízes de cultivo (p. ex. beterraba açucareira, batatas) podem ser tratadas vantajosamente. Exemplos particulares de tais
pragas são a traça da fruta e afídios tais como Aphis fabae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persicae, Nephotettix cincticeps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllocoptruta oleivora, Tetranychus urticae e membros do gênero Trialeuroides; nemãtodos tais como membros dos gêneros Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meloidogyne e Panagrellus; lepidópteros tais como Heliothis, Plutella e Spodoptera; gorgulhos de grãos tais como Anthonomus grandis e Sitophilus granarius; escaravelhos da farinha tal como Tribolium castaneum; moscas tal como Musca domestica; formigas vermelhas; mineiros das folhas; Pear psylla; Thrips tabaci; baratas tais como Blatella germanica e Periplaneta americana e mosquitos tal como Aedes aegypti.
objecto da presente invenção compreende portanto um processo para a preparação do composto da formula (I) como definido acima, composto este que pode ser usado como um antibiótico. Em particular, pode ser usado no tratamento de animais e humanos com infestações endoparasíticas, ecto parasíticas e/ou fúngicas e em agricultura, horticultura ou silvicultura como pesticida para combater pragas de insectos, acarí deos e nemãtodos. Pode ser usado também usado no geral como pesticida para combater ou controlar pragas em outras circunstâncias, p. ex. em armazéns, edifícios ou outros lugares públicos ou outras situações de pragas. No geral o composto pode ser apli cado quer no hospedeiro (animal ou humano ou plantas ou outra vegetação) ou nas próprias pragas ou num local delas.
composto obtido pelo processo da presente invenção pode ser integrado numa formulação para administração de qualquer maneira conveniente para uso em veterinária ou medicina humana e a invenção por conseguinte inclui no seu âmbito o processo para a preparação de composições farmacêuticas compreendendo o composto da fórmula (I) quando obtido pelo processo da presente invenção adequadas ao uso em veterinária ou me dicina humana. Tais composições podem ser apresentadas para uso de modo convencional com a ajuda de um ou mais veículos ou excipientes adequados. As composições obtidas de acordo com a presen te invenção incluem as composições sob uma forma especialmente formulada para utilização parenteral (incluindo administração in tramamâria), oral, rectal, tópica, implantação, oftálmica, nasal ou genito-urinária.
composto da fórmula (I) pode ser formulado para uso em veterinária ou medicina humana de acordo com os métodos gerais descritos na Publicação de Patente Britâni ca 2166436.
As dosagens diárias totais do composto da fórmula (I) empregues em medicina veterinária e humana estarão de preferência na gama de 1-200 ug/kg de peso corpóreo, em especial de 50-1000 ug/kg e estas podem ser dadas em doses parciais, p. ex. 1-4 vezes por dia.
composto da fórmula (I) obtido de acordo com o processo da presente invenção pode ser formulado de qualquer meio conveniente para uso na horticultura ou agricultura e a presente invenção incluí portanto no seu âmbito um proces so para a preparação de composições contendo o composto quando obtido de acordo com o processo da presente invenção adaptadas para uso na horticultura ou agricultura. Tais formulações incluem tipos secos ou líquidos, por exemplo põs finos, incluindo põs bases ou concentrados, põs, incluindo põs solúveis ou molháveis, granulados, incluindo microgrânulos e grânulos dispersáveis, pílulas, formas fluidificáveis, emulsões tais como emulsões diluídas ou concentrados emulsificantes, banhos, tais como banhos de imersão para raízes e para sementes, revestimentos para sementes aglomerados para sementes, concentrados oleosos, soluções oleosas, injecções p. ex. injecções para os caules, pulverizações, fumigações e nebulizações.
Geralmente tais formulações incluem o composto em associação com um veículo ou diluente apropriado. Tais veículos e diluentes são como está descrito na Publicação de Patente Britânica 2166436.
Nas formulações, a concentração do material activo é geralmente de 0,01 a 99% e de preferência entre 0,01% e 40% em peso.
Os produtos comerciais são geralmen te fornecidos como composições concentradas para serem diluídas a uma concentração apropriada para uso, por exemplo de 0,001 a
0,0001% em peso.
ritmo ao qual o composto ê aplica do depende de um numero de factores incluindo o tipo de praga presente e o grau de infestação. Contudo, no geral, um ritmo de aplicação de lOg/ha ate lOkg/ha ê adequado; de preferência de lOg/ha a lkg/ha para o controle de traças e de insectos e de 50g/ha a lOkg/ha para o controle de nemãtodos.
Para o uso em medicina veterinária ou para uso em horticultura e agricultura pode ser conveniente utilizar o caldo de fermentação inteiro, como fonte de composto activo. Pode também ser conveniente usar caldo seco (contudo micêlio) ou usar micêlio separado do caldo e pasteurisado ou de pre ferência, seco p. ex. por secagem por pulverização, por liofilização ou em secador rotativo. Se se desejar o caldo ou micêlio podem ser formulados em composições incluindo veículos inertes convencionais, excipientes ou diluentes como descrito acima.
composto antibiótico preparado de acordo com o processo da presente invenção pode ser administrado ou usado em combinação com outros ingredientes activos.
Em particular o composto antibiótico preparado de acordo com o processo da presente invenção pode ser usado em conjunto com os compostos antibióticos S541 ou com outros compostos antibióticos. Isto pode acontecer, por exemplo, quando se usa o caldo de fermentação inteiro sem prévia separação do composto preparado de acordo com a presente invenção ou quando os produtos brutos da fermentação reagem de acordo com o processo da invenção sem prévia ou subsequente separação; isto pode ser conveniente, por exemplo, no uso do composto em agricul tura, onde ê importante manter baixos os custos de produção.
processo da presente invenção para a preparação do composto da fórmula (I) compreende as variantes discutidas abaixo.
Assim uma variante processual refere-se a um procedimento para a produção do composto da fórmula (I) que compreende a fase de cultivar o microorganismo do gênerc Streptomyces capaz de produzir o composto da fórmula (I), e se se desejar isolar daí o dito composto.
Os microorganismos capazes de serem usados no processo da presente invenção podem ser rapidamente identificados usando um ensaio em pequena escala e analisando ume. amostra do ensaio obtido por fermentação do microorganismo por cromatografia liquida de alta pressão.
Em geral o microorganismo para uso no processo de acordo com a invenção ê uma estirpe do género Streptomyces capaz de produzir o composto da fórmula (I) e pode ser por exemplo um microorganismo das espécies Streptomyces ther·· moarchaensis ou Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus. Exemplos particulares de estirpes adequadas incluem Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 /depositada no dia 10 de Setembro de 1984_7 Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 e NCIB 12114 /todas depositadas a 26 de Junho de 1985/ Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL 15773 /depositada a 3 de Maio de 19847 e mutantes de todas estas estirpes.
Mutantes das estirpes acima podem aparecer espontaneamente ou podem ser produzidas por uma varieda de de métodos incluindo os descritos em Techniques for the Development of Micro-organisms por Η. I. Adler em ’Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms', Procedings of the Symposium, Vienna 1973, p241, International Atomic Energy Authority. Tais métodos incluem radiação ionizante, métodos químicos p. ex. tratamento com N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), calor, técnicos genéticas, tais como recombinação, transcrição, transformação, lisogenisação e conversão lisogénica, e técnicas selectivas para mutantes expontâneos.
Os mutantes que são particularmente adequados para usar no processo de acordo com a invenção são aque les mutantes que não produzem quaisquer quantidades substanciais de compostos Antibióticos S541 5^-idroxi ou 5^-metoxi descritos na Publicação de Patente Britânica N9 2166436. Os mutantes com capacidade diminuída de formar compostos Antibióticos S541 constituem um aspecto adicional da presente invenção.
Os mutantes capazes de produzir o composto de fórmula (I) mas com possibilidades diminuídas de for mar os compostos Antibióticos S541 descritos na Publicação da Pa tente Britânica n9 2166436 podem rapidamente ser identificado utilizando um ensaio em escala pequena e analizando uma amostra do ensaio obtido por fermentação do microorganismo por cromatografia líquida de alta pressão.
De acordo com outra variante proces suai incluida no âmbito da presente invenção podem ser usados ma teriais genéticos de mutantes com capacidade diminuída de formar compostos Antibióticos S541 que participam na síntese do composto da fórmula (I). Este material pode ser obtido usando técnicas de engenharia genética convencionais como descrito imediatamente abaixo.
Uma estirpe particularmente preferi da capaz de produzir compostos da fórmula (I) com capacidade diminuída de formar compostos Antibióticos S541 é a Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 (depositado a 15 de Setembro de 1986 na colecção permanente de culturas da National Collection of Industrial and Marine Bactéria, Torry Research Station, Aberdeen, United Kingdom) e seus mutantes. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 e seus mutantes constituem um aspecto adicional de in venção. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 tem características essenciais substancialmente similares às descritas para o Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 na Publicação de Patente Britânica 2166436. Contudo, NCIB 12334 pode ser distinguida de NCIB 12015 porque ele produz pouco ou nada de compostos Antibióticos S541 descritos na Publicação de Patente Britânica 2166435 sob condições de fermentação aí descritas. Mutantes de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 podem aparecer espontaneamente oi podem ser preparados pelos métodos descritos imediatamente acima.
O âmbito da presente invenção inclui ainda a variante processual na qual o material genético do Strep tomyces thermoarchaensis NCIB 12334 e os seus mutantes participam na síntese do composto da fórmula (I).
Tal material pode ser obtido usando técnicas convencionais de engenharia genética incluindo as referidas por D.A. Hopwood em Cloning genes for Antibiotic Biosynthesis in Streptomyces Spp.: Productíon of an hybrid antibiotic p 409-413 em Microbiology 1985, Ed. L. Lieve, American Society
of Microbiology, Washington D.C 1985. Tais técnicos podem ser usados de modo semelhante ao descrito préviamente para clonar ge nes antibióticos biosintêticos, incluindo os genes biosintéticos para actinorhodin(Malpartida, F. and Hopwood, D.A. 1984, Nature 309, p 462-464), eritromicina (Stanzak, R. et al, 1986, Biotechnology, 4, p 229-232) e uma enzima importante que entra na produ ção de penicilina e cefalosporina em Acremonium chrysogenum (San son, S.M. et al, 1985, Nature, 318, p 191-194). 0 material genético de Streptomyces thermoarchaensis assim obtido pode ser usado, por exemplo, para melhoramento de estirpe, para produção de enzimas biosintéticas para aplicações in vitro ou para produzir antibióticos novos pela introdução de tal material em organismos que não o Streptomyces thermoarchaensis.
processo objecto da presente invenção para a preparação do composto da fórmula (I) por fermenta ção de um organismo Streptomyces adequado pode ser concretizado pelos meios convencionais, i.e. cultivando o organismo Streptomyces na presença de fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais minerais.
Fontes assimiláveis de carbono, azo to e sais minerais podem ser fornecidas por nutrientes simples ou complexos. As fontes de carbono incluem geralmente glucose, maltose, amido, glicerol, melaços, dextrina, lactose, sucrose, frutose, ácidos carboxílicos, aminoácidos, glicerldeos, álcoois, alcanos e óleos vegetais. As fontes de carbono constituem geralmente de 0,5 a 10% em peso do meio de fermentação.
Fontes de azoto incluem geralmente farinha de soja, licor de maceração de milho, solúveis de destilaria, extracto de levedura, farinha de linhaça, peptonas, farinha de amendoim, extracto de malte, melaços, caseína, misturas de aminoácidos, amoníaco (gás ou solução), sais de amónio ou nitratos. Também podem ser usados ureia e outras amidas. As fontes de azoto constituem geralmente de 0,1 a 10% em peso do meio de fermentação. Os sais minerais nutrientes que podem ser incorpora dos no meio de cultura incluem os sais geralmente usados capazes de fornecerem sódio, potássio, amónio, ferro, magnésio, zinco, níquel, cobalto, manganês, vanádio, crómio, cálcio, cobre, moli9
bdênio, boro e iões fosfato, sulfato, cloreto e carboneto.
Pode estar presente um antiespuma para controlar a espuma excessiva e ser adicionado a intervalos como requerido.
A cultura do organismo Streptomyces ê geralmente efectuada a uma temperatura de 20 a 259 C de preferência de 259 a 409 C, especialmente à volta de 349 C, e ê conve niente que tenha lugar com arejamento e agitação, p. ex., agitan do ou misturando. O meio pode inicialmente ser inoculado com uma pequena quantidade de uma suspensão do microorganismo esporulado mas no sentido de evitar o período de latência pode ser preparado um inoculo vegetativo do organismo inoculando uma pequena quar tidade do meio de cultura com o organismo sob a forma de esporos e o inoculo vegetativo obtido pode ser transferido para o meio de fermentação, ou, de preferência para um ou mais estágios de sementeira onde um crescimento adicional tem lugar antes de se transferir para o meio de fermentação principal. A fermentação ê geralmente levada a efeito na gama de pH de 5,5 a 8,5, de preferência 5,5 a 7,5. Pode ser necessário adicionar ácido ao meio de fermentação para manter o pH dentro da gama desejada. Os ácidos adequados que podem ser adicionados incluem ácidos aquosos tal como ácido sulfúrico ou ácidos gordos tais como ácido valêrico ou isobutírico ou misturas deles.
A fermentação podem ser realizada du rante um período de 2-10 dias, p. ex., 5 dias.
Quando ê necessário separar o composto de fórmula (I) do total da fermentação isto pode ser reali zado pelas técnicas convencionais de isolamento e separação. O composto de fórmula (I) obtido pelo processo da presente invenção está predominantemente contido no micêlio das células mas pode também encontrar-se no caldo de fermentação e as técnicas de iso lamento podem ser também aplicadas ao caldo de fermentação quer antes quer depois da clarificação. Ê desejável que a escolha das técnicas de isolamento possa variar muitíssimo.
composto da fórmula (I) pode ser isolado e separado de acordo com o processo da presente invenção por uma variedade de técnicas de fraccionamento, por exemplo ad10 -
sorção-eluição, precipitação, cristalização fraccionada, extracção por solvente, partição líquido-líquido, que podem ser combinadas de várias maneiras.
A extracção por solvente, partição entre dois solventes que são imisclveis ou parcialmente miscíveis um com o outro, e cromatografia tem-se considerado ser particularmente adequadas para isolamento e separação do composto de fôr mula (I) de acordo com o processo da presente invenção.
Seguindo a fermentação, o micêlio pode ser colhido (opcionalmente depois do tratamento com um floculante ou com um ácido até o pH do meio de fermentação estar abaixo de pH 6 ou depois de aquecimento ou de preferência aquecimento e adição de ácido) usando técnicas convencionais, por exem pio, filtração ou centrifugação. A seguir, por exemplo, o compojs to da fórmula (I) pode ser extraído do micêlio de acordo com o processo da presente invenção com um solvente orgânico apropriado tal como uma cetona p. ex., acetona, metiletilcetona ou metil isobutilcetona; um hidrocarboneto, p. ex., hexano; um hidrocarbo neto halogenado, p. ex., clorofórmio, tetracloreto de carbono ou cloreto de metileno; um álcool, p. ex., metanol ou 2-propanol; um diol, p. ex., 1,2-propanodiol ou 3-butano-diol; um éster, p. ex., acetato de metilo ou acetato de etilo ou suas misturas. Ê conveniente que se o micêlio contêm quantidades significativas de água ê preferível usar um solvente miscível com água tal como metanol ou acetona.
Geralmente ê necessário mais do que uma extracção do micêlio para conseguir uma óptima recuperação. 0 composto da fórmula (I) pode ser recuperado dos extractos dos solventes na forma duma preparação bruta por remoção do solvente p. ex., por evaporação ou precipitação, por exemplo, deitando o extracto do solvente na água. Em alternativa o extracto do solve» te inicial depois de redução do volume de solvente, por exemplo por evaporação, pode ser ele próprio extraído com um segundo sol vente que ê imiscível ou sõ parcialmente miscível com o primeiro. Se a extracção inicial do micêlio ê com um solvente miscível com a água tal como metanol ou 1,2-propanodiol, então o segundo solvente pode de preferência ser um solvente imiscível com a água
tal como hexano, clorofórmio, diclorometano, acetato de etilo ou éter do petróleo ou suas misturas, sendo adicionada agua suficien te ao extracto inicial para assegurar a imiscibilidade com o segundo solvente e para controlar a partição do composto antibióti co entre as fases. Pela escolha adequada de solventes misciveis e imiscíveis com a agua, e por manipulação do conteúdo em água do solvente miscivel com a água e possível um número de transferências do composto antibiótico do solvente miscível para o solvente imiscivel com a água e vice-versa. Em alternativa o extrac to do solvente inicial pode passar através de um leito de resina permutadora de iões tal como IRA 68 ou uma resina não funcional tal como XAD-1180 (Rohm and Haas) para posterior purificação do extracto.
composto antibiótico pode ser recuperado da solução do solvente final por evaporação do solvente, por precipitação ou por adsorção num suporte adequado, dependendo de natureza do solvente final.
Purificação e/ou separação do composto de fórmula (I) da presente invenção podem além disso ser efectuadas por técnicas convencionais tais como, por exemplo, crc matografia (incluindo cromatografia líquida de alta pressão) num suporte adequado tal como sílica; uma resina de adsorção macrore ticular não funcional, por exemplo, resinas de polímero de estireno divinil-benzeno reticuladas tal como resinas Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-16 ou XAD-1180 (Rohm & Haas Ltd) ou Kastell S112 (Montedison); um polímero de estireno/divinil-benzeno substituído, por exemplo por um polímero de estireno/divinil-benzeno halo genado (p. ex. brominado) tal como Diaison SP207 (Mitsubishi); um dextrano compatível com o solvente orgânico reticulado tal co mo Sephadex LH20 (Pharmacia UK Ltd), ou em suportes de fase invertida tal como hidrocarboneto ligado a sílica, p. ex., C^g-ligado a sílica. 0 suporte pode ser em forma de leito ou de preferência enchendo uma coluna.
A solução do composto de fórmula (I) num solvente adequado, p. ex., diclorometano, tetrahidrofura no, éter do petróleo, acetonitrilo, clorofórmio acetato de etilo ou suas misturas são geralmente carregadas numa coluna de croma12
tografia, p. ex., uma coluna de sílica ou de Sephadex, se se qui zer depois de primeira redução de volume do solvente. A coluna pode opcionalmente ser lavada e depois eluída com um solvente de polaridade apropriada por exemplo álcoois, tal como metanol; hidrocarbonetos p. ex. hexano ou éter do petróleo; esteres tal como acetato de etilo, cetonas tal como acetona; éteres tal como éter dietílico; acetonitrilo; ou hidrocarbonetos halogenados tais; como diclorometano ou clorofórmio. Também se podem usar combinações de tais solventes ou combinações com um solvente polar, p. ex., água.
A presença do composto de fórmula (I) durante os procedimentos para a extracção/isolamento pode sei detectada por técnicas convencionais tais como cromatografia lí quida de alta pressão ou espectroscopia de UV ou utilizando as propriedades do composto descritas a seguir.
Quando o composto de fórmula (I) é obtido na forma de uma solução num solvente orgânico, por exemplo depois de purificação por cromatografia, pode-se remover o solvente pelos processos convencionais, p. ex., evaporação, para obter o composto numa forma sólida ou cristalina.
Por uma adequada combinação de procedimentos precedentes, o composto da fórmula (I) pode ser isola do como um sólido. Ê conveniente que a ordem pelo qual as fases de purificação acima mencionadas são lavadas a efeito e a escolha das que são usadas possa variar amplamente.
De acordo com outra variante proce£ suai o composto da fórmula (I) pode ser preparado por oxidação de um composto da fórmula (II)
ch3 ch(ch3)2 (II)
A reacção pode ser efectuada com um agente oxidante que serve para converter um grupo hidroxilo alílico secundário num grupo oxo, pelo que o composto de fórmula (I) ê produzido.
Agentes oxidantes adequados incluem, por exemplo, óxidos de metais de transição tal como dióxido de manganês, e oxigénio atmosférico na presença dum catalisador apropriado tal como metal finamente dividido p. ex. platina.
agente oxidante ê geralmente usado em excesso sobre a quantidade estequiométrica.
A reacção deve ser convenientemente efectuada num solvente adequado que é seleccionado de uma cetona, p. ex. acetona; um éter, p. ex. éter dietílico, dioxano ou tetrahidrofurano; um hidrocarhoneto, p. ex. hexano; um hidrocarboneto halogenado, p. ex. clorofórmio ou cloreto de metileno; ou um éster, p. ex. acetato de etilo. Combinações de tais solventes quer sozinhos quer em água também podem ser usadas.
A reacção deve ser realizada a uma temperatura de -509C até +509C, de preferência de 0 a 309 C.
O composto intermediário da formula (II) pode ser preparado como descrito na Publicação de Patente Britânica 2166436.
O composto da fórmula (I), preparado por fermentação ou a partir do composto de fórmula (II) de acordo com os procedimentos mencionados acima, quer como uma solu ção quer como um sólido bruto, pode ser obtido numa forma cristã lina usando métodos convencionais. Assim, por exemplo, uma cristalização pode ser efectuada a partir duma solução do composto, p. ex. suspendendo-o num solvente adequado (p. ex. um álcool tal como metanol ou 2-propanol; acetonitrilo; um hidrocarhoneto tal como hex no; ou um éter tal como éter dietílico, éter diisopropí lico ou éter do petróleo) opcionalmente combinado com água.
Os Exemplos seguintes ilustram a in venção. Todas as temperaturas são em 9C. 'L' refere-se a litro.
Factor A ê o composto da fórmula . (II). O factor A pode ser preparado como descrito na Publicação de Patente Britânica 2166436.
EXEMPLO 1
Agitou-se factor A (250 mg) com diõ xido de manganês activo (1,0 g) por 2,75 horas. Filtrou-se a mis tura através de uma camada de Kieselguhr, e o filtrado foi evapo rado para dar o composto da invenção como uma espuma (240 mg). Uma parte foi cristalizada a partir do éter do petróleo para dar microcristais, λ max (Et0H) 240.5 nm (E^ 495); ^(CDClg), valores: 6.58 (s; 1H), 2.60 (m; 1H) 1.89 (s; 3H), 1.62 (s; 3H), 1.53 (s; 3H), 1.05 (d 6; 3H), 1.00 (d 6; 3H), 0.96 (d 6; 3H) e 0.80 (d 6; 3H); m/z inclui 610, 592, 574, 441 265, 247, 237, 219 e 151.
EXEMPLO 2
Inocularam-se esporos de Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 em cunhas de agar feitos com os seguintes ingredientes Ί £2-
Extracto de levedura (Oxoid L21) 0,5
Extracto de malte (Oxoid L39) 30,0
Peptona micológica )Oxoid L40) 5,0
Agar N9 3 (Oxoid) 15,0
Ãgua destilada para 1 litro
pH ~5,4 e incubou-se a 289 C durante 10 dias.
A cunha madura foi então coberta com 6 ml de uma solução de glicerol a 10% e raspada com um instrumento estéril para libertar os esporos e micêlio. Alíguotas de 0,4 ml da suspensão de esporos resultante foram transferidas para tubos de polipropileno estéreis que foram selados ao calor e armazenados em vapor de azoto líquido até serem precisos.
Dois balões de Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio de sementeira feito como se segue:
D-Glucose 15,0
Glicerol 15,0
Peptona de soja 15,0
NaCl 3,0
Ί K
CaCO3
Ãgua destilada para 1 litro /0 pH não ajustado do meio era 6,7 e foi ajustado a pH com hidróxido de sódio aquoso antes de ir ã autocla ve. 0 pH do meio depois de estar na autoclave era 7,3/ foram inoculados cada um com 0,2 ml de suspensão de esporos toma da de um tubo.
Os balões foram incubados a 289 C durante dois dias num agitador rotativo a 250 rpm com um movimen to orbital de 50 mm de diâmetro.
conteúdo de ambos os balões foi usado para inocular um fermentador de 70 L contendo 40 L do mesmo meio de sementeira suplementado com polipropilenoglicol 2000 (0,06% v/v). O polipropilenoglicol 2000 foi adicionado conforme necessário durante a fermentação para controlar a espuma. A fermentação decorreu a 289 C, com agitação e arejamento suficiente para manter um nível de oxigénio dissolvido maior 30% do que a saturação. Depois de 24 horas de fermentação, uma porção de 9 L do caldo foi transferida para um fermentador de 700 L contendo 450 litros de meio feito como se segue: .
gi·
D-Glucose2,8
Dextrina de malte (MD3OE)27,8
Arkasoi 5013,9
Melaços1,7
K2HPO40,14
CaCO31,39
Silicone 525 (Dow Corning) 0,06% (v/v)
O pH foi ajustado a 6,5 antes da esterelização.
A fermentação foi realizada a 289 C com agitação e arejamento. Adicionou-se polipropileno glicol 2000 antiespuma conforme o necessário e o pH foi mantido abaixo de pH
7,2 por adição de H2SO4 até final. A fermentação terminou ao fim de 5 dias.
O caldo foi clarificado numa centrí • fuga Westfalia KA 25 e o sobrenadante residual foi removido com fi agua (20 L). As células recuperadas (25,5 kg) foram agitadas durante uma hora com um misturador Silverson modelo BX em metanol suficiente para dar um volume total de 75 L. Filtrou-se a suspen são e o resíduo sólido foi reextraído com metanol (35 L) e filtrado. 0 filtrado reunido (87 L) diluiu-se com agua (40 L) e extraiu-se com éter do petróleo de 609-809 (30 L). Depois de 30 mi nutos separaram-se as fases numa centrífuga Westfalia NEM 1256 e a fase metanol mais baixa foi reextralda com éter do petróleo de 609-809 (30 L) depois da adição de agua (40 L). Depois da separa ção a fase mais baixa foi extraída outra vez com éter do petróleo de 609-809 (30 L). As fases do éter de petróleo reunidas (85 L) foram concentradas em três passagens através de um evaporador de película deslizante Pfaudler 8,8-12v-27 (pressão do vapor 0,1 bar, temperatura do vapor 209, temperatura do vapor de agua 1279). 0 concentrado (9 L) foi seco com sulfato de sódio (2 kg) e depois concentrado a pressão reduzida a 409 num evapora dor rotativo.
resíduo oleoso (130 g) dissolveu-se em clorofórmio para dar 190 ml e aplicou-se este numa coluna de sílica 60 Merck 7734 de (200x4 cm) carregada com clorofórmio. A coluna foi lavada com clorofórmio (500 ml) e eluída com clorofórmio: acetato de etilo (3:1) e colheram-se fracções de 40 ml aproximadamente depois de prévios 1 400 ml.
Juntaram-se as fracções 32-46 e eva poram-se obtendo-se um óleo (21,2 g). As fracções 47-93 combinaram-se e evaporam-se para dar um óleo (20,1 g) que foi dissolvido em clorofórmio: acetato de etilo (3:1) até 50 ml, e aplicado a uma coluna de sílica 60 Merck 7734 de (200x4 cm) carregada com clorofórmio: acetato de etilo (3:1), e colheram-se fracções de 40 ml aproximadamente depois de prévios 1 400 ml. As fracções 22-36 foram juntas e evaporadas para dar um óleo (3,1 g) que foi adicionado ao õleo obtido das fracções 32-46 da primeira coluna. Os óleos juntos foram dissolvidos em metanol fervente (4 ml) que foi depois adicionado a 2-propanol quente (20 ml) e deixado cri£ talizar. As aguas mães foram evaporadas depois da cristalização obtendo-se um õleo que se dissolveu em igual volume de diclorome tano e se carregou numa coluna de (30x2,2 cm) de Kieselgel 60
Merck (70-230 mesh ASTM, Art. N9 7734) cheia com diclorometano.O leito foi lavado com diclorometano (2 vezes o volume do leito) e eluíu-se com clorofórmio: acetato de etilo (3:1) (2 vezes o volu me do leito). A evaporação do eluído deu um óleo que foi dissolvido em metanol e submetido a HPLC preparativa em Spherisorb S5 ODS-2 (250 mm x 20 mm, Phase Sep. Ltd.). Porções da amostra (5 ml) foram bombeados para a coluna durante um período de 1 minuto e a coluna foi eluída com acetonitrilo:ãgua (7:3) sob as seguintes condições:
Tempo (minutos)
Caudal (ml/minuto)
0,00
1,00
1,10
39,90
40,00
75,00
0,00 )Injecção
0,00 )Tempo
30,00
30,00
35,00
35,00
O material eluído através da coluna de HPLC foi controlado por espectroscopia no UV a 238 nm.
A evaporação das fracções combinadas com picos de eluição a 33,4 minutos deu o composto da invenção (34 mg).
Por espectroscopia de massa E.I. ob tiveram-se um ião molecular a 610 e fragmentos característicos a:
592
574
556
422
259
241
EXEMPLO 3
Streptomyces thermoarchaensis NCIB , 12334 foi armazenado como suspensões de esporos em glicerol a í 20% a -709 dum modo semelhante ao descrita para o Streptomyces
thermoarchaensis NCIB 12015 no Exemplo 2. Descongelaram-se esporos (1 ml) e usaram-se para inocular um balão Erlenmeyer contendo 50 ml de Meio A;
Meio A
D-glucose2,5
Dextrina de Malte MD3OE25,0
Arkasoy 5012,5
Melaço de beterraba1,5
K2HPO40,125
CaCO31,25
MOPS /acido 3-(N-morfolino)propanossulfonico_/21,0
Água destilada até 1 L, pH ajustado a 6,5 antes de ir para a autoclave (15 minutos a 121?).
O balão inoculado foi incubado a
289 durante 2 dias, altura em que 1 ml foi assepticamente transferido para cada um de quatro balões semelhantes (cada um conten do 50 ml de Meio A). Cada balão foi incubado a 289 durante 2 dias com agitação num agitador rotativo (250 rev/minuto) com um diâme tro de percurso de 50 mm. Dois fermentadores de sementeira de 7 L foram então inoculados com cerca de 80 ml /5% (v/v)_7 da massa que o balão do inoculo agita. Cada fermentador de 7 L continha 4 L de Meio B:
-1
Meritose 45,0
Arkasoy 50 18,0
Melaço de Beterraba 2,2
k2hpo4 0,18
CaCO3 (Analar) 1,8
Silicone 1520 (Dow Corning) 2,5 ml em 41
, Água destilada até 4 L com o pH ajustado a 6,5 antes de ir à au* toclave (45 minutos a 1249). A fermentação decorreu a 289 com a1 9
gitação e arejamento.
Inoculou-se um fermentador de 700 L com 5,4 litros transferidos assepticamente dos fermentadores de sementeira ãs 24 h. 0 fermentador continha 450 L do Meio B no qual o CaCOg (Analar) tinha sido substituído por cal Sturcal e a que se tinha adicionado 250 ml de silicone 1520. Ajustou-se o pH a 6,5 usando concentrado antes de esterilizar in situ durante 30 min a 1219. Alem disso três fermentadores de 70 L foram inoculados com 800 ml (2% v/v) transferidos assepticamente do fer mentador sementeira as 24 h. Cada fermentador continha 35 L de Meio B com a composição definida acima a que se tinha adicionado 25 ml de silicone 1520 antes de esterilizar in situ (30 min a 1219).
As fermentações subsequentes foram efectuadas a 349 com agitação e arejamento. Adicionou-se a quantidade necessária de anti-espuma 2000 durante o decurso das fermentações e manteve-se o pH a um valor não superior a 7,4 por adição duma mistura de ácido valêrico/ãcido isobutírico 75:25 atê ã descarga do fermentador.
Depois de 120 horas os conteúdos dos fermentadores foram recolhidos (600 L), misturados com Dicalite (3 kg) e filtrados através de celulose (24 kg Rettenmaior BECO) num filtro de vácuo rotativo. 0 aglomerado de células recolhido (45 kg) foi guardado a -209.
Suspendeu-se o aglomerado de células congelado em metanol (55 L) e deixou-se descongelar. Depois de 30 minutos a 59 filtrou-se a suspensão através de um leito de celulose. Resuspendeu-se o resíduo em metanol (50 L), filtrou-se através do leito de celulose e lavou-se com metanol (10 L).
Os filtrados juntos e as lavagens (116 L) foram diluídos com água (22 L) e extraídos com éter do petróleo de 609-809 (100 L). Concentrou-se o extracto de éter do petróleo a baixa temperatura (aprox. 0,15 bar) num evaporador de película deslizante.
O concentrado (8,4 L) foi extraído . 3 vezes com 1,2-propanodiol (3x4,2 L). Agitaram-se os extractos ’ reunidos (13,5 L) com acetato de etilo (22 L) e agua (12 L) e
deixaram-se então repousar e as fases separaram-se. A fase superior (17,5 L) foi lavada duas vezes com agua (12 L e 10 L) e a fase orgânica superior resultante foi levada ã secura e obteve-se um óleo (112 g). Dissolveu-se o óleo em diclorometano (500 ml) e cromatografou-se numa coluna (425 mm x 45 mm diam) de Kiesegel 60 Merck (tipo 7734) cheia do mesmo solvente. Lavou-se a coluna com diclorometano (500 ml) e eluiu-se então com a mistura de diclorometano e êter dietílico (400 ml de 9:1 v/v respectivamente). Levou-se o eluído ã secura até obter uma goma amarela pâ lida (54 g) .
a) Uma parte (1,2 g) de goma dissolveu-se em acetonitrilo (5 ml) e foi cromatografada numa coluna (340 mm x 25 mm diam) de Sephadex LH20 que foi cheia e eluída com acetonitrilo. A fracção eluída entre 110 ml e 130 ml foi seca e redissolvida em acetonitrilo (2,5 ml). Uma parte (2 ml) desta solução diluíu-se com ace tonitrilo aquoso a 70% (2 ml contendo 1,4 ml de acetonitrilo). Cromatografou-se então esta solução em 2 partes iguais numa colu na (250 mm x 25 mm diam) de Spherisorb S5 ODS2 com acetonitrilo aquoso a 70% como solvente eluidor. 0 material eluído entre 0,8 L e 0,95 L foi recolhido das duas vezes e diluído com agua (cerca de 0,9 L). Deitou-se esta solução de novo na mesma coluna de S5 ODS2 e eluíu-se a coluna com acetonitrilo. Removeu-se o aceto nitrilo por evaporação e secou-se a amostra azeotropicamente por meio de uma mistura de acetona e ciclohexano obtendo-se o compo£ to da invenção como um sólido. Os espectros de NMR, de UV e de massa do sólido eram compatíveis com os do produto do Exemplo 1.
b) Uma porção da goma (4,32 g) dissolvida em êter dietílico foi seca atê se obter um sólido, e redissolvida em acetonitri lo numa concentração de 300 mg/mL. Misturou-se esta solução com igual volume de acetonitrilo em água a 75% v/v e cromatografou-se em nove partes numa coluna de Spherisorb ODS-2 (250 mm x 20 mm) . Eluiram-se os vários componentes (25 mL/min) com acetonitri lo a 75%. Recolheu-se o pico eluído entre 0,5 L e 0,61 L de cada uma das vezes e juntaram-se. Misturou-se o conjunto com igual vo lume de água e reabsorveu-se na mesma coluna de Spherisorb. Elu• íu-se a coluna com acetonitrilo. Arrefeceu-se o eluído a 459 e ’ adicionou-se água exactamente atê ã turvação. Arrefeceu-se o elu
ido a 49 e deixou-se cristalizar. Filtraram-se os cristais e secaram-se obtendo-se o composto da invenção (0,26 g) . A analise do sólido por cromatografia analítica liquida de alta pressão em fase inversa mostrou a presença de 4% de impurezas com base na absorção total a 238 nm.
ESPECTRO DE NMR 1H
Um espectro de nmr a 200 MHz de uma solução em deuteroclorofórmio inclui sinais cerca das seguin tes posições:
6 6.55 (alargado s; 1H) 1.88 (alargado s; 31
5.86 (dl5; 1H) 1.60 (s; 3H)
5.72 (dd 15,11; 1H) 1.52 (s; 3H)
1.03 (d7; 3H)
1.00 (d7; 3H)
0.95 (d7; 3H)
0.79 (d6; 3H)
ESPECTRO DE NMR 13 C
Um espectro , 13 de nmr C de 25,05 MHz
de uma solução em deuteroclorofórmio tem sinais cerca das seguin
tes posições:
8192.2 (s) 130.7 (s)
171.9 (s) 123.4 (d)
143.9 (d) 121.9 (d)
138.4 (d) 120.4 (d)
137.7 (s) 99.8 (s)
137.4 (s) 82.0 (s)
137.3 (d) 81.0 (d)
136.7 (s) 76.8 (d)
69.9 (t) 34.8 (t)
69.3 (d) 26.9 (d)
68.6 (d) 22.9 (q)
48.4 (t) 22.2 (q)
46.6 (d) 15.6 (q)
41.1 (t) 14.0 (q)
40.8 (t)
36.1 (?)
11.0 (q)
O pico & 36,1 resulta de vários sinais sobrepostos e a sua multiplicidade é por isso incerta.
ESPECTRO DE U.V.
Um espectro de U.V. em metanol (ç = = 0,001 %) tem num^max de cerca de 240,4 nm E^ 509.
ESPECTRO DE IV
Um espectro de IV de uma solução de bromofõrmio (C=l%) inclui bandas a cerca de 3500 (OH), 1710 (éster) , 1678 (cetona conjugada) e 996 cm 1 (c-O).
ESPECTRO DE MASSA
Um espectro de massa E.I de baixa resolução deu um ião molecular a m/Z 610 e fragmentos de iões a m/Z 592, 574, 480, 441, 440, 423, 422, 265, 259, 247, 241, 237, 219 e 151.
MICROANÃLISE
A microanãlise dá C 70,95 %, H 8,33 %. (calculado C 70,82 %, H 8,20 %)
EXEMPLO 4
Usou-se 1 ml de suspensão de esporos de Streptomyces thermoarchaensis NCIN12334 (preparada de acordo com o Exemplo 3) para inocular um balão de agitação de 250 ml contendo Meio A (50 ml, pH ajustado a 6,5 antes de ir ã autoclave) . Incubou-se o balão a 289 durante 2 dias com agitação num agitador rotativo (250 rev/min) com um diâmetro de percurso de 50 mm. Porções de 1 ml de inoculo desenvolvido de dois dias foram transferidas para cada um de seis balões semelhantes conten• Me^-a A (50 ml) e fermentado da mesma maneira durante dois di’ as. Um fermentador (20 L) contendo Meio B (12 L, pH ajustado a
inoculado com cerca de 300 ml /2 % (v/v)J7 com o inoculo reunido dos balões. A fermentação decorreu a 289 com agitação e arejamen to, durante 24 horas.
Um fermentador (700 L) contendo Meio B (450 L, pH ajustado a 6,5 antes de esterelização a 1219 durante 30 min) foi inoculado com 12 L do inoculo desenvolvido de 24 horas. A fermentação foi levada a efeito a 349 com agitação e arejamento e o pH controlado abaixo de pH 7,4 com H^SO^ a 10%.
Depois de 90 horas o caldo resultan te (400 L) foi filtrado através de celulose (Rettenmaier BECO) com uma mistura de Dicalite (2 kg) e celulose (2 kg) como adjuvante de filtração. Suspendeu-se o aglomerado de células recolhi do em metanol (cerca de 100 L) e filtrou-se depois de cerca de 45 minutos. Reextrairam-se as células com metanol (cerca de 50 L). Os extractos reunidos (145 L) foram diluídos com agua (35 L) e extraídos com hexano num Robatel Lx204, juntando agua no tercei ro estagio de extracção. Concentrou-se o extracto de hexano (145 L) .
O concentrado (2 L) foi extraído três vezes com porções de 1 L de 1,2-propanodiol. Reuniram-se os extractos (3,16 L) e misturaram-se com acetato de etilo (3,34 L) e água (3,0 L). A camada superior de acetato de etilo foi recolhida e lavada com água. Removeu-se o acetato de etilo e o óleo residual foi seco azeotropicamente com acetona até uma espuma se ca (71 g).
O sólido foi dissolvido em metanol (300 ml) e agua (32 ml) e aplicado a uma coluna (4,6 L, 12,8x36 cm) de sílica de fase inversa Whatman ODS3 Prep. 40. Eluíu-se a coluna com metanol/ãgua (9:1) e as fracções eluídas entre 8,6 L e 10,2 L foram reunidas e concentradas até o precipitado começar a formar-se. Depois de repousar durante a noite a 49 filtrou-se o sólido e secou-se sob vácuo.
Uma parte do sólido (8,5 g) foi dis_ . solvido numa mistura de acetonitrilo (140 ml), tetrahidrofurano ’ (17 ml) e água (13 ml). Cromatografaram-se então porções desta solução numa coluna (25 x 2,1 cm) de Spherisorb ODS2 (5 ) usando acetonitrilo/ãgua (4:1) como solvente eluidor adicionado a uma cadência de 25/ml/minuto. Os picos que surgiram entre 9,8 minutos e 13,6 minutos foram reunidos (2,75 L), diluidos com água (1,5 L) e a solução partida em 3 porções. Cada porção foi deitada na coluna e eluída com acetonitrilo. As três amostras reuniram-se, evaporaram-se atê se obter um sólido e recristalizaram-se do acetonitrilo para dar cristais do composto da invenção (4,8) . A análise do sólido por cromatografia analítica líquida de alta pressão normal e em fase inversa mostrou a presença de menos de 2% de impurezas.
EXEMPLO 5 caldo resultante (25 L, preparado de acordo com o método do Exemplo 3) foi acidificado a pH 3 com ácido sulfurico a 15% v/v e depois aquecido a 909 durante 15 minutos antes de filtração através de um leito de hyflo. O aglomerado de células (1556 g) foi agitado com metanol (3,9 L) duran te 30 minutos. A mistura foi filtrada e o resíduo sólido ressuspendido em metanol (3,9 L) e refiltrado. Os filtrados combinados foram ajustados a pH 4 com ácido sulfurico a 15% v/v e passados através de um leito de resina IRA 68 (ciclo de acetato, 750 ml) a 3750 ml/h. Lavou-se a coluna com metanol e os percolados metanõlicos reunidos concentraram-se atê 3,5 L e adicionaram-se simultaneamente com ácido sulfurico (10,5 L) 0,1 % v/v a ácido sul fúrico a 0,1 % 50 ml, frio (cerca de 59) agitado. A mistura foi agitada durante 10 minutos, filtrada e a mistura sólida lavada com água fria antes da secagem. O sólido seco continha 12,9 g do composto de invenção por comparação por meio de cromatografia li quida de alta pressão com uma amostra autêntica.
EXEMPLO 6 caldo conseguido (25 L, preparado de acordo com o método do Exemplo 3) acidificou-se a pH 3 com ácido sulfurico a 15% v/v e depois aqueceu-se a 909 durante 15 minutos antes da filtração através dum leito de hyflo. Uma por? ção do aglomerado de células (500 g) foi agitada com metanol (750 ml) durante 30 min, a mistura filtrada e o resíduo solido resuspendido em metanol (750 ml) e filtrado. Os filtrados reunidos foram diluídos com água (617 ml) e extraídos com 3 aliquotas de hexano (706 ml). Os extractos de hexano foram reunidos (2790 ml) e uma parte (1390 ml) foi concentrada até 250 ml e passado através de um leito de resina XAD 1180 (10 ml), preparado em hexano, a 50 ml/h. A resina foi lavada com hexano (10 ml) e o hexa no reunido concentrou-se até 20 ml. Uma parte (10,2 ml) do hexano concentrado foi carregada numa coluna (100 ml) de sílica gel Crossfield SD 210 preparada em hexano. O leito foi lavado com acetona/hexano a 5% v/v (700 ml) a 100 ml/h e eluído com acetona/hexano a 10% v/v a 100 ml/h. 0 eluído foi controlado com cromatografia líquida de alta pressão e aquelas fracções contendo o composto da invenção juntas e evaporadas até ã obtenção dum oleo> Dissolveu-se o óleo em metanol (150 ml) e ãgua (70 ml), seguido por evaporação do metanol sob vãcuo para dar um solido que foi filtrado e seco. 0 solido seco continha 0,21 g do composto da invenção por comparação por meio de cromatografia líquida de alta pressão com uma amostra autêntica.
Os seguintes são exemplos de formulações de acordo com a invenção. O termo Ingrediente Activo como usado a seguir significa o composto da invenção.
Injecção parenteral multidose
Variaçao
Ingrediente Activo
Álcool benzílico
Triacetato de glicerilo
Propileno glicol
4,0
2,0
0,1-7,5% p/v i 30,0 atê 100,0
Dissolver o ingrediente activo no álcool benzílico e triacetato de glicerilo. Adicione o propileno glicol e perfaça o volume. Es terelize o produto pelos métodos farmacêuticos convencionais, por exemplo filtração estéril ou por aquecimento em autoclave e emba le asepticamente.
Spray de aerosol % v/v
Ingrediente Activo 0,1
Tricloroetano 29,9
Triclorofluorometano 35,0
Diclorodifluorometano 35,0
Variação
0,01-2,0% v/v
Misture o ingrediente activo com tricloroetano e encha o contentor aerosol. Purgue o espaço do cimo com o propelante gasoso e aperte a válvula na posição. Encha com o peso necessário do líquido propelante sob pressão através da válvula. Equipe com pres sor e tampa.
Comprimidos
Método de confecção - granulação em húmido mg
Ingrediente Activo 250,0 Estearato de magnésio 4,5 Amido de milho 22,5 Amido glicolato de sõdio 9,0 Lauril sulfato de sódio 4,5
Celulose microcristalina até um peso de núcleo de comprimido de 450 mg
Adicione uma quantidade suficiente de pasta de amido a 10% ao in grediente activo para produzir uma massa húmida adequada para granulação. Prepare os grânulos e seque usando um tabuleiro ou um secador de leito fluidizado. Peneire através dum peneiro, adi cione os restantes ingredientes e comprima em comprimidos.
Se necessário, revista os núcleos dos comprimidos usando hidroxipropilmetil celulose ou outro mate rial de revestimento semelhante usando quer um sistema aquoso ou não aquoso. Um plasticizante e um corante adequado podem ser incluídos na solução de revestimento.
Comprimidos veterinários para uso em pequenos animais domésticos
Método de fabricação - granulação a seco mg
50,0
7,5
Ingrediente Activo Estearato de magnésio
Celulose microcristalina para núcleos de comprimido com o peso de 75,0
Misture o ingrediente activo com o estearato de magnésio e a celulose microcristalina. Compacte a mistura em pastilhas. Parta as pastilhas passando através dum granulador rotativo para produ zir grânulos soltos. Comprima em comprimidos.
Os núcleos dos comprimidos podem de pois ser revestidos, se se desejar, como descrito acima.
Injecções intramamãrias veterinárias mg/dose Variação
Ingrediente Activo 150 mg 0,05 - 1,0 g
Polissorbato 60 3,0% p/p )
Cera virgem branca 6,0% p/p até 3 g) até 3 ou 15g
Õleo de amendoim 91,0% p/p )
Aqueça o óleo de amendoim, a cera virgem branca e o polissorbato 60 a 1609 C com agitação. Mantenha a 1609 C durante duas horas e depois arrefeça ã temperatura ambiente com agitação. Adicione assepticamente o ingrediente activo ao veículo e disperse-o usan do um misturador de alta velocidade. Clarifique passando através dum moinho coloidal. Encha assepticamente com o produto seringas plásticas estéreis.
Purgante veterinário oral
% p/v Variação
Ingrediente Activo 0,35 0,01-2% p/v
Polisorbato 85 5,0
Ãlcool benzílico 3,0
Propileno glicol 30,0
Tampão fosfato como pH 6,0-6,5
Âgua até 100
Dissolva o ingrediente activo em co e propileno glicol. Ponha uma pH a 6,0-6,5 com tampão fosfato, volume final com ãgua. Encha com polisorbato 85, álcool benzíliquantidade de agua e ajuste o se necessário. Perfaça para o o produto o contentor do purgan te
Preparação veterinária oral
% p/p Variação
Ingrediente Activo 7,5 1 - 30% p/p
Sacarina 25,0
Polisorbato 85 3,0
Diestearato de alumínio 5,0
Ôleo de coco destilado atê 100,0
Disperse o diestearato de alumínio no óleo de coco destilado e polisorbato 85 por aquecimento. Arrefeça ã temperatura ambiente e misture a sacarina no veículo oleoso. Misture o ingrediente ac tivo na base. Encha seringas plásticas.
Grânulos para administração na alimentação em veterinária % p/p Variação
Ingrediente Activo 2,5 0,05-5% p/p
Sulfato de cálcio, hemi-hidra tado até 100,0
Misture o ingrediente activo com sulfato de cálcio. Prepare os grânulos usando um processo de granulação em húmido. Seque usando tabuleiro ou um secador de leito fluidizado. Carregue em contentor apropriado.
Concentrado emulsificável
Ingrediente Activo 50g
Emulsificador aniõnico 40g (p. ex. Fenil sulfonato CALX)
Emulsificador nao-ionico 60g )p. ex. Syperonic NP13)
Solvente aromático (p. ex. Solvesso 100) atê 1 litro
Misture todos os ingredientes, agite até à dissolução.
Grânulos (a) Ingrediente Activo50 g
Resina de madeira40 g
Grânulos de gesso (20-60 mesh) até 1 kg (p. ex. Agsorb 100 A) (b) Ingrediente Activo50 g
Syperonic NP1340 g
Grânulos de gesso (20-60 mesh) até 1 kg.
Dissolva todos os ingredientes num solvente volátil p. ex. clore to de metileno, adicione aos grânulos que rolam num misturador. Secar para remover o solvente.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Processo para a preparação do cornposto da formula (I) (I) ear acterizado por:
    a) gênero Streptomyces e, caso
    b) cultivar-se um microorganismo do se pretenda, isolar-se o dito composto a partir daí; sendo o microorganismo usado, um mutante de uma estirpe susceptível de produzir o composto da fórmula (I) e que não produz qualquer quantidade substancial de composto 5^3-hidroxi ou 5^-m toxi S541; ou oxidar-se o correspondente composto 5^-hidroxi.
    Processo de acordo com a reivindica ção 1 caracterizado por o produto ser isolado na forma cristalina.
    X pe de Streptomyces thermoarchaensis ou Streptomyces cyaneogriseus nocyanogenus capaz de produzir o composto da formula (I) e que não produz qualquer quantidade substancial de compostos anti biéticos S541 5p-hidroxi ou 5^3-metoxi.
    Processo de acordo com a reivindica I ção 1 caracterizado por o referido mutante ser Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12334 ou um seu mutante.
    - 6- Processo para a produção duma compo sição para combater pragas, especialmente de insectos, acarídeos ou nemãtodos, na agricultura, horticultura ou silvicultura ou em armazéns, edifícios ou outros locais públicos, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade adequada do . composto da formula (I) quando preparado de acordo com a reivindicação 1 em conjunto com um ou mais veículos e/ou excipientes.
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