DK162099B

DK162099B - Antibiotika, fremgangsmaade til fremstilling deraf samt mikroorganismer til anvendelse ved fremgangsmaaden

Info

Publication number: DK162099B
Application number: DK418085A
Authority: DK
Inventors: John Barrie Ward; Hazel Mary Noble; Neil Porter; Richard Alan Fletton; David Noble
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1984-09-14
Filing date: 1985-09-13
Publication date: 1991-09-16
Also published as: SE8802985D0; FR2570390A1; IE852263L; FI853520L; FI87366C; AU596565B2; KR860002576A; ES8802555A1; HU197046B; NZ213463A; US4898821A; ES546962A0; US4935531A; PH24247A; DE3532794A1; IT8548551A0; JPH07116199B2; ES557237A0; DK162099C; UA19162A

Description

DK 162099 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte antibiotiske forbindelser, fremgangsmåde til fremstilling deraf samt mikroorganismer til anvendelse ved fremgangsmåden. Opfindelsen angår nærmere betegnet antibiotiske forbindelser, der kan fremstilles ved fermentering af 5 Streptomyces-organismer.

I ét aspekt angår opfindelsen to hidtil ukendte forbindelser tilhørende den klasse af forbindelser, der betegnes antibiotika S541, og som kan fremstilles ved dyrkning af en hidtil ubeskrevet stamme af en mikroorganisme under kontrollerede betingelser. Antibiotika S541 har 10 antibiotisk og især anti-endoparasitisk, anti-ectoparasitisk, antifungal, insecticid, nematicid og acaricid virkning og er af særlig interesse til anvendelse inden for landbrug, gartneri og veterinære og humane sundhedsaspekter. Forbindelserne kan også anvendes som mellemprodukter til fremstilling af yderligere aktive forbindelser.

15 Forbindelserne kan fremstilles ved fermentering og isoleres i i det væsentlige ren form som beskrevet nedenfor.

Antibiotika S541 er en gruppe af beslægtede forbindelser med den partielle formel I

OH

p> · , ,*V> !rV®Y )5.,¾

n"' N „ 18kj9^20 H

H li'H

20 i Λά;Η3

(_6 i L

iT>

o-S

De indledningsvis isolerede antibiotika S541-forbindelser kan let adskilles ved chromatografi på silica som beskrevet nedenfor i to 2

DK 162099 B

komponenter med antibiotisk, fx anthelmintisk aktivitet, og som slukker UV-fluorescens ved 254 nm. Komponent I er karakteriseret ved en Rf-værdi i området 0,70-0,75, og komponent II er karakteriseret ved en Rf-værdi i området 0,39-0,46, idet Rf-værdierne er bestemt ved 5 tyndtlagschromatografi på Merck 5735 silica 60-plader under eluering med chloroform/ethylacetat (3:1).

Komponent I kan i sig selv oprenses yderligere og har givet to forbindelser med den partielle formel I med antibiotisk, fx anthelmintisk aktivitet. I ét aspekt angår opfindelsen således forbindelser 10 med den almene formel III

OH

“3 A/"3

Sr\ ‘ nu \ \/° 0 sV^^'CH·)

H i J

•ch3 hvor r! betegner ethyl eller isopropyl.

15 Til visse anvendelser, fx inden for landbrug eller gartneri eller veterinærmedicin, kan det være mere hensigtsmæssigt at anvende antibiotika S541 uden adskillelse i enkelte bestanddele, men til andre anvendelser, fx inden for humanmedicin, kan det være foretrukket at anvende individuelle forbindelser. Opfindelsen omfatter således en 20 forbindelse ifølge opfindelsen, hvilken forbindelse er blandet med mindst den anden forbindelse ifølge opfindelsen, samt de individuelle forbindelser, fx i i det væsentlige ren form eller i det væsentlige i fraværelse af andre makrolide forbindelser.

3

DK 162099 B

Fra DK fremlæggelsesskrift nr. 152129 kendes forbindelser som svarer til formlen III, men hvor substituenten i 25-stillingen er n-propyl eller sek.butyl i stedet for ethyl- eller isopropylsubstitueret isopropenyl, som er i 25-stillingen i forbindelserne ifølge den 5 foreliggende opfindelse. Såvel forbindelserne ifølge DK 152129 som ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles ved fermentering.

De to forbindelser med den almene formel III har fået betegnelsen Faktor E (R^- - ethyl) og Faktor F (R^ = isopropyl).

Forbindelserne ifølge opfindelsen har antibiotisk virkning, fx an-10 thelmintisk virkning, fx mod nematoder, og har især anti-endoparasi-tisk og anti-ectoparasitisk virkning. Generelt er forbindelserne anvendelige til bekæmpelse af parasitter såsom ectoparasitter og endoparasitter. Ectoparasitter og endoparasitter inficerer mennesker og en række dyr og forekommer især hos husdyr såsom svin, får, kvæg, 15 geder og fjerkræ, heste og kæledyr såsom hunde og katte. Parasitisk infektion af husdyr med anæmi, fejlernæring og væksttab til følge, er én af hovedårsagerne til økonomisk tab over hele verden.

Eksempler på slægter af endoparasitter, som inficerer sådanne dyr og/eller mennesker, er Ancylostoma, Ascaridia, Ascaris, Aspicularis, 20 Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Dictyocaulus, Diro-fLlaria, Enterobius, Haemonchus, Heterakis, Necator, Nematodirus,

Nemato spiroides, Nippostrongylus, Oesophagostomum, Ostertagia,

Oxyuris, Parascaris, Strongylus, Strongyloides, Syphacia, Toxascaris, Γοχο cara, Trichonema, Trichostrongylus, Trichinella, Trichuris og 25 Unci naria.

Eksempler på ectoparasitter, som inficerer dyr og/eller mennesker, er arthropode ectoparasitter såsom bidende insekter, spyfluer, lopper, lus, mider, sugende insekter, tæger og andre diptera-skadedyr.

Eksempler på slægter af sådanne ectoparasitter, der inficerer dyr 30 og/eller mennesker, er Ambylonma, Boophilus, Coroptes, Culliphore,

Damodex, Damolinia, Gastrophilus, Haematobia, Haematopinus, Haemo-physalis, Hyalomma, Linognathus, Lucilia, Melophygus, Oestrus, Pso-rergates, Psoroptes, Rhipicephalus, Sarcoptes og Stomoxys.

DK 162099B

4

Forbindelserne ifølge opfindelsen har vist sig at være effektive såvel in vitro som in vivo mod en række endoparasitter og ectopara-sitter. Det har navnlig vist sig, at forbindelser ifølge opfindelsen er virksomme mod parasitiske nematoder såsom Haemonchus contortus, 5 Ostertagia circxmcincta, Trichostrongylus colubiformis, Dictyocaulus viviparus, Cooperia oncophera, Ostertagia ostertagi og Nippostrongy-lus braziliensis og parasitiske mider såsom Sarcoptes sp. og Psorop-tes sp.

Forbindelserne ifølge opfindelsen er derfor nyttige til behandling af 10 dyr og mennesker med endoparasitiske og/eller ectoparasitiske infektioner .

Parasitarten varierer i overensstemmelse med værten og det dominerende infektionssted. Således inficerer fx Haemonchus contortus,

Ostertagia circumcincta og Trichostrongylus colubiformis generelt får 15 og er hovedsagelig lokaliseret i maven og tyndtarmen, hvorimod Dictyocaulus viviparus, Cooperia oncophora og Ostertagia ostertagi generelt inficerer kvæg og hovedsagelig er lokaliseret i henholdsvis lungen, tarmen eller maven.

Forbindelserne ifølge opfindelsen har endvidere vist sig at have 20 antifungal aktivitet, fx mod stammer af Candida sp. såsom Candida albi cans og Candida glabrata og mod gær såsom Saccharomyces earls -ber gensis.

Forbindelserne ifølge opfindelsen har også vist sig at være virksomme mod den fritlevende nematode Caenorhabditis elegans.

25 Forbindelserne ifølge opfindelsen har også vist sig at være virksomme til bekæmpelse af insekt-, mide- og nematodeskadedyr inden for landbrug, gartneri, skovbrug, almen hygiejne og lagrede produkter. Skadedyr for jord- og planteafgrøder, herunder kornsorter (fx hvede, byg, majs og ris), grønsager (fx soja), frugt (fx æbler, druer og 30 citrusfrugter) samt rodafgrøder (fx sukkerroer og kartofler) kan hensigtsmæssigt behandles.

5

DK 162099 B

Det har navnlig vist sig, at forbindelserne ifølge opfindelsen er aktive mod fx frugtmider og bladlus såsom Aphis fabae, Aulacorthum circumflexum, Myzus persicae, Nephotettix cincCiceps, Nilparvata lugens, Panonychus ulmi, Phorodon humuli, Phyllocoptruta oleivora, 5 Tetranychus urticae og medlemmer af slægten Trialeuroides, nematoder såsom medlemmer af slægterne Aphelencoides, Globodera, Heterodera, Meloidogyne og Panagrellus, lepitoptera såsom Heliothis, Plutella og Spodoptera, kornsnudebiller såsom Anthonomus grandis og Sitophilus granarius, rismelsbiller såsom Tribolium castaneum, fluer såsom Musca 10 domestica, tropiske stikmyrer, bladminerere, Pear psylla, Thrips tabaci, kakerlakker såsom Blatella germanica og Periplaneta americana og myg såsom Aedes aegypti.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes derfor forbindelser med formlen III som defineret ovenfor, hvilke forbindelser kan anvendes som antibio-15 tika. De kan navnlig anvendes til behandling af dyr og mennesker med endoparasitiske, ectoparasitiske og/eller fungale infektioner og inden for landbrug, gartneri eller skovbrug som pesticider til bekæmpelse af insekt-, mide- og nematode-skadedyr. De kan også anvendes generelt som pesticider til bekæmpelse eller kontrol af skadedyr 20 under andre forhold, fx i forretninger, bygninger eller andre offentlige steder eller lokaliteter for skadedyrene. Generelt kan forbindelserne enten påføres på værten (dyr eller menneske eller planter eller anden vegetation) eller på selve skadedyrene eller en lokalitet derfor. Forbindelser ifølge opfindelsen kan formuleres til admini-25 stration på en hvilken som helst hensigtsmæssig måde til anvendelse inden for veterinær- eller humanmedicinen. Farmaceutiske præparater, som omfatter en forbindelse ifølge opfindelsen, er tilpasset anvendelse inden for veterinær- eller humanmedicinen. Sådanne præparater kan gøres klar til brug på sædvanlig måde ved hjælp af én eller flere 30 hensigtsmæssige bærere eller excipienser.

Præparaterne omfatter præparater i en form, der er særlig formuleret til parenteral (herunder intramammal administration), oral, rektal, topisk eller implantationsanvendelse. Når den aktive bestanddel er formuleret i et præparat, som skal være sterilt, fx injektioner 35 (herunder intramammale præparater), øjendråber, salver og implantationer, kan selve den aktive bestanddel være fremstillet aseptisk 6

DK 162099 B

eller steriliseres efter fremstillingen ved metoder såsom gammabestråling eller udsættelse for ethylenoxid.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan formuleres til anvendelse inden for veterinær- eller humanmedicin ved injektion og kan foreligge i 5 enhedsdosisform, i ampuller eller andre enhedsdosisbeholdere, eller i multidosisbeholdere, idet der om nødvendigt er tilsat et konserveringsmiddel. Præparaterne til injektion kan have form af suspensioner, opløsninger eller emulsioner i olieholdige eller vandige bærere og kan indeholde formuleringsmidler såsom suspensionsmidler, stabili-10 seringsmidler, solubiliseringsmidler og/eller dispergeringsmidler.

Alternativt kan den aktive bestanddel have form af et sterilt pulver til rekonstituering med en hensigtsmæssig bærer, fx sterilt pyrogen-frit vand, før anvendelsen. Olieholdige bærere omfatter multivalente alkoholer og estere deraf såsom glycerolestere, fedtsyrer, vegetabil-15 ske olier såsom jordnøddeolie eller bomuldsfrøolie, mineralolier såsom flydende paraffin, og ethyloleat og andre tilsvarende forbindelser. Der kan også anvendes andre bærere såsom propylenglycol.

Præparater til veterinærmedicin kan også formuleres som intramammale præparater med enten langtidsvirkning eller hurtig afgivelse og kan 20 være sterile opløsninger eller suspensioner i vandige eller olieholdige bærere. De olieholdige bærere kan fx være de ovenfor beskrevne og kan også indeholde et fortyknings- eller suspensionsmiddel såsom blød eller hård paraffin, bivoks, 12-hydroxystearin, hydrogeneret ricinusolie, aluminiumstearater eller glyceryl-monostearat. I præ-25 paratet kan der alene eller i kombination anvendes sædvanlige ikke-ioniske, kationiske eller anioniske overfladeaktive midler.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan også tilberedes til veterinær eller human anvendelse i en form, som egner sig til oral administration, fx i form af opløsninger, sirupper eller suspensioner eller et 30 tørt pulver til konstituering med vand eller en anden hensigtsmæssig bærer før anvendelsen, eventuelt med smags- og farvestoffer. Faste præparater såsom tabletter, kapsler, pastiller, piller, boluser, pulver, pastaer eller granuler kan også anvendes. Faste og flydende præparater til oral anvendelse kan fremstilles i henhold til metoder, 35 der er velkendte inden for området. Sådanne præparater kan også 7

DK 162099 B

indeholde én eller flere farmaceutisk acceptable bærere og excipien-ser, som kan være i fast eller flydende form. Eksempler på hensigtsmæssige farmaceutisk acceptable bærere til anvendelse i faste dosis -former omfatter bindemidler (fx forgelatiniseret majsstivelse, poly-5 vinylpyrrolidon eller hydroxypropylmethylcellulose), fyldstoffer (fx lactose, mikrokrystallinsk cellulose eller calciumphosphat), glitte-midler (fx magnesiumstearat, talkum eller siliciumdioxid), sprængmid-ler (fx kartoffelstivelse eller natriumstivelsesglycollat) eller befugtningsmidler (fx natriumlaurylsulfat). Tabletter kan overtrækkes 10 ved metoder, som er velkendte inden for området. Eksempler på hensigtsmæssige farmaceutisk acceptable tilsætningsstoffer til anvendelse i flydende dosisformer omfatter suspensionsmidler (fx sorbitolsirup, methylcellulose eller hydrogenerede spiselige fedtstoffer), emulgatorer (fx lecithin eller acaciagummi), ikke-vandige bærere (fx 15 mandelolie, olieestere eller ethylalkohol) og konserveringsmidler (fx methyl- eller propyl- p-hydroxybenzoater eller sorbinsyre); stabiliserings- og solubiliseringsmidler kan også inkorporeres.

Pastaer til oral administration kan formuleres i henhold til metoder, som er velkendte inden for området. Eksempler på hensigtsmæssige 20 farmaceutisk acceptable tilsætningsstoffer til anvendelse i pastaformuleringer omfatter suspensions- eller geleringsmidler, fx aluminium-distearat eller hydrogeneret ricinusolie, dispergeringsmidler, fx polysorbater, ikke-vandige bærere, fx jordnøddeolie eller olieestere, stabiliserings- og solubiliseringsmidler. Forbindelserne ifølge 25 opfindelsen kan også inden for veterinærmedicinen administreres ved at inkorporere dem i dyrenes daglige faste eller flydende foder, fx som en del af dyrenes daglige foder eller drikkevand.

Til buccal administration kan præparatet have form af tabletter, pastaer eller pastiller, som er formuleret på sædvanlig måde.

30 Forbindelserne ifølge opfindelsen kan også inden for veterinærmedicinen administreres oralt i form af en flydende dosis i form af fx en opløsning, suspension eller dispersion af den aktive bestanddel sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer eller excipiens.

8

DK 162099 B

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan fx også formuleres som suppositorier, der fx indeholder sædvanlige suppositorie-grundmaterialer, til anvendelse inden for veterinær- eller humanmedicin.

Forbindelser ifølge opfindelsen kan formuleres til topisk admini-5 stration til anvendelse inden for veterinær- og humanmedicin i form af salver, cremer, lotioner, pulvere, pessarer, som spray, neddyp-ningsmidler, aerosoler eller dråber (fx øjen- eller næsedråber).

Salver og cremer kan fx formuleres med et vandigt eller olieholdigt bæremateriale ved tilsætning af hensigtsmæssige fortyknings- og/eller 10 geleringsmidler. Salver til øjenadministration kan fremstilles på steril måde under anvendelse af steriliserede bestanddele.

Lotioner kan formuleres med et vandigt eller olieholdigt bæremateriale og indeholder generelt også én eller flere emulgatorer, stabiliseringsmidler, dispergeringsmidler, suspensionsmidler, fortyknings-15 midler eller farvestoffer.

Puddere kan formuleres ved hjælp af et hvilket som helst egnet pud-der-bæremateriale. Dråber kan formuleres med et vandigt eller ikke-vandigt bæremateriale, der også omfatter ét eller flere dispergeringsmidler, stabiliseringsmidler, solubiliseringsmidler eller 20 suspensionsmidler. De kan også indeholde et konserveringsmiddel.

Til topisk administration ved inhalation kan forbindelserne ifølge opfindelsen tilberedes til anvendelse inden for veterinær- eller humanmedicin i form af en aerosolspray eller en insufflator.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan administreres sammen med andre 25 farmaceutisk aktive bestanddele. De samlede daglige doser af forbindelser ifølge opfindelsen, hvilke forbindelser anvendes inden for veterinær- og humanmedicinen, vil hensigtsmæssigt være i området 1-2000 Atg/kg legemsvægt, fortrinsvis 10-1000 /ig/kg legemsvægt, især 100-500 jug/kg legemsvægt, og disse kan indgives i delte doser, fx 1-4 30 gange daglig.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan formuleres på en hvilket som helst hensigtsmæssig måde til anvendelse inden for gartneri og land- 9

DK 162099 B

brug. Præparater, der omfatter en forbindelse ifølge opfindelsen, er tilpasset anvendelse inden for gartneri eller landbrug. Sådanne formuleringer omfatter tørre eller flydende typer, fx puddere, fx pudderbærematerialer eller koncentrater, pulvere, herunder opløselige 5 eller befugtelige pulvere, granulater, herunder mikrogranuler og dispergerbare granuler, pellets, flydbare pulvere, emulsioner såsom fortyndede emulsioner eller emulgerbare koncentrater, dypningsformuleringer såsom roddypnings- og frødypningsformuleringer, frøbejdser, frøpellets, oliekoncentrater, olieopløsninger, injektioner, fx 10 stængelinjektioner, spray og forstøvningsformuleringer.

Sædvanligvis vil sådanne formuleringer omfatte forbindelsen sammen med en hensigtsmæssig bærer eller et hensigtsmæssigt fortyndings-middel. Sådanne bærere kan være flydende eller faste og beregnet til at hjælpe påføring af forbindelsen enten ved at dispergere den, hvor 15 den skal påføres, eller ved at tilvejebringe en formulering, der af brugeren kan omdannes til et dispergerbart præparat. Sådanne formuleringer er velkendte inden for området og kan fremstilles ved sædvanlige metoder som fx blanding og/eller formaling af den eller de aktive bestanddele sammen med bæreren eller fortyndingsmidlet, fx en 20 fast bærer, opløsningsmiddel eller overfladeaktivt middel.

Hensigtsmæssige faste bærere til anvendelse i formuleringer såsom puddere, granulater og pulvere kan fx vælges blandt naturlige mineralske fyldmaterialer såsom diatomit, talkum, kaolinit, montmorillo-nit, pyrophyllit eller attapulgit. Højdispergeret kiselsyre eller 25 højdispergeret absorberende polymerer kan om ønsket inkorporeres i præparatet. Granulerede adsorberende bærere, der kan anvendes, kan være porøse (såsom pimpsten, formalede mursten, sepiolit eller bento-nit) eller ikke-porøse (såsom calcit eller sand). Hensigtsmæssige forgranulerede materialer, der kan anvendes, og som kan være organis-30 ke eller uorganiske, omfatter dolomit og formalede planterester.

Hensigtsmæssige opløsningsmidler til anvendelse som bærere eller fortyndingsmidler omfatter aromatiske carbonhydrider, aliphatiske car-bonhydrider, alkoholer og glycoler eller ethere deraf, estere, ketoner, syreamider, stærkt polære opløsningsmidler, eventuelt epoxide-35 rede vegetabilske olier og vand.

10

DK 162099 B

Sædvanlige ikke-ioniske, kationiske eller anioniske overfladeaktive midler, fx ethoxylerede alkylphenoler og alkoholer, alkalimetal-eller jordalkalimetalsalte af alkylbenzensulfonsyrer, lignosulfon-syrer eller sulforavsyrer eller sulfonater af polymere phenoler, som 5 har gode emulgerende, dispergerende og/eller befugtende egenskaber, kan også anvendes enten alene eller i kombination i præparaterne.

Om ønsket kan der i præparaterne inkorporeres stabiliseringsmidler, anti-sammenbagningsmidler, anti-skumningsmidler, viskositetsregulerende midler, bindemidler og adhæsiver, fotostabiliseringsmidler samt 10 gødningsstoffer, foderindtagelsesstimulerende midler eller andre aktive stoffer. Forbindelserne ifølge opfindelsen kan også formuleres i blanding med andre insecticider, acaricider og nematicider.

I formuleringerne er koncentrationen af aktivt materiale generelt 0,01-99 vægtprocent, fortrinsvis 0,01-40 vægtprocent.

15 Kommercielle produkter tilvejebringes sædvanligvis som koncentrerede præparater, der skal fortyndes til en hensigtsmæssig koncentration af aktivt materiale, fx 0,001-0,0001 vægtprocent, til anvendelse.

Til anvendelse inden for gartneri og landbrug eller til anvendelse inden for veterinærmedicin kan det være ønsket at anvende hele fer-20 menteringsvæsken uden adskillelse i komponenter eller faktorer som kilde til de aktive forbindelser. Det kan være hensigtsmæssigt at anvende tørret væske (der indeholder mycelier) eller at anvende lyserede mycelier, levende eller døde mycelier, som er skilt fra væsken under anvendelse af fast/flydende separations- eller inddampnings-25 teknikker eller at anvende den efter separation af mycelierne tilbageblevne fermenteringsvæske. Om ønsket kan mycelierne pasteuriseres eller især tørres, fx ved sprøjtetørring eller valsetørring. Om ønsket kan væsken eller mycelierne formuleres til præparater, som omfatter sædvanlige inerte bærere, excipienser eller fortyndingsmid-30 ler som beskrevet ovenfor.

Det fremgår af ovenstående, at forbindelserne ifølge opfindelsen generelt kan anvendes til bekæmpelse af infektioner eller skadedyrs- 11

DK 162099 B

angreb ved på den organisme, som er ansvarlig for infektionen eller angrebet eller en lokalitet derfor, at påføre en effektiv mængde af én eller begge de nævnte forbindelser.

I et yderligere aspekt angår opfindelsen en fremgangsmåde til frem-5 stilling af de to faktorer E og F af antibiotika S541, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en mikroorganisme valgt blandt Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015, NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 og NCIB 12114 fermenteres under aerobe betingelser i nærværelse af assimilerbare carbon-, nitrogen- og mineralsaltkilder 10 ved en temperatur på 20-50°C og et pH på 5,5-8.5, hvorved forbindelserne dannes, og én eller begge forbindelserne derefter om ønsket skilles fra fermenteringsvæsken. Organismen er fortrinsvis en organisme, der hovedsagelig danner én eller begge forbindelser ifølge opfindelsen.

15 Baseret på taxonomiske undersøgelser er en særlig mikroorganisme, der er i stand til at danne de ovennævnte stoffer, en hidtil ukendt art af slægten Streptomyces og benævnes Streptomyces thermoarchaensis. En prøve af denne mikroorganisme, som er et jordisolat, blev deponeret i overensstemmelse med Budapesttraktaten i den permanente kultursamling 20 i National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry

Research Station, Aberdeen, Storbritannien, under deponeringsnummeret NCIB 12015. De morfologiske og dyrkningsmæssige karakteristika for Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 er beskrevet nedenfor, og denne organisme udgør sammen med de andre ovennævnte antibiotika 25 S541-producerende stammer af Streptomyces et yderligere aspekt af opfindelsen.

Organismen fra slægten Streptomyces er fortrinsvis Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015.

Mutanter af Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 kan opstå spon-30 tant eller kan fremstilles ved en række metoder, herunder de metoder, som er beskrevet i H.I. Adler, "Techniques for the Development of Micro-organisms", Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms, Proceedings of the Symposium, Wien 1973, International Atomic Energy Authority, s. 241. Sådanne metoder omfatter ionise- 12

DK 162099 B

ringsbestråling, kemiske metoder, fx behandling med N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), varme, genetiske teknikker såsom rekombination, transduktion, transformation, lysogenisering og lysogen omdannelse og selektionsteknikker for spontane mutanter. Der er fx 5 opnået fire mutante stammer af Streptomyces thermoarchaensis NCIB

12015, og hver af disse er deponeret i den permanente kultursamling i National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Storbritannien, under deponeringsnumrene NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 og NCIB 12114. Streptomyces ther-10 moarchaensis NCIB 12111, 12112, 12113 og 12114 udgør som nævnt et yderligere aspekt af opfindelsen. Stamme NCIB 12015 blev deponeret den 10. september 1984 i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

Stammerne NCIB 12111-12114 blev deponeret den 26. juni 1985 i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

15 Mutantstammerne NCIB 12111, 12112 og 12113 blev dannet ved behandling af sporer af Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 med NTG og blev derefter karakteriseret ved den af R. Holliday, Nature 178, 1956, s.

987, beskrevne éttrinsmetode.

Mutantstammen NCIB 12114 opstod ved spontan mutation af Streptomyces 20 thermoarchaensis NCIB 12015 og blev identificeret som modstandsdygtig over for streptomycin efter at være forblevet levedygtig efter udsættelse for 100 /Jg/ml streptomycinsulfat ved 28°C i 5 dage.

Taxonomiske undersøgelser viser, at Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 er en ikke tidligere beskrevet mikroorganisme af en hidtil 25 ukendt art, hvis karakteristika er beskrevet nedenfor og i det væsentlige er de samme som for arten som helhed.

På de foretrukne sporedannelsesmedier, hvedemelsagar, malt-gæragar og uorganiske salte/stivelsesagar (E.B. Shirling og D. Gottlieb, Int. J.

Syst. Bacteriol. 16, 1966, s. 313-340) vokser Streptomyces thermo-30 archaensis NCIB 12015 kraftigt og danner et stabilt substratmycelium og et luftmycelium, som bærer sporer i åbne spiralkæder som sidegrene fra hovedhypherne. På disse medier er pigmenteringen på den mod mediet vendende side gulbrun, og sporophorerne er grå. Ved 100 ganges forstørrelse indeholder sporophorerne 2-5 omdrejninger pr. kæde med 13

DK 162099 B

5-10 sporer inden for hver omdrejning af spiralen. Sporophorerne indeholder gennemsnitligt mellem 20 og 50 sporer. Scanningselektronmikroskopi ved 12.000 ganges forstørrelse afslører, at sporerne er glatvæggede og har ellipsoid form med dimensioner på 0,7 x 1,4 μια på 5 det bredeste sted. Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 er grampositiv og i stand til at vokse og sporulere ved temperaturer på mellem 20°C og 50°G.

En sammenligning af de ovenstående data med publicerede beskrivelser i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. udgave) viser, at 10 organismen Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 tilhører slægten Streptomyces.

Identifikation af Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 til artsgruppeniveau blev udført under anvendelse af en datamatidentifika-tionsmatrix, som er beskrevet i Williams et al., J. Gen. Microbiol.

15 129, 1983, s. 1815-1830. Resultaterne af de 41 taxonomiske tests, som er beskrevet af ovennævnte forfattere, er som følger for Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015:

DK 162099B

14

Egenskab Resultat

Sporekæde-verticillati Sporekæde-retinaculiaperti 5 Sporekæde-rectiflexibiles

Sporekæde-spiraler +

Fragmentering af mycelium

Sporeoverflade glat +

Sporeoverflade ru 10 Sporefarve grå +

Sporefarve rød Sporefarve grøn

Mod mediet vendende side gulbrun +

Mod mediet vendende side rød-orange 15 Melanindannelse

Anvendelse af adonitol

Anvendelse af cellobiose +

Anvendelse af D-fructose +

Anvendelse af meso-inositol 20 Anvendelse af inulin +

Anvendelse af mannitol

Anvendelse af raffinose +

Anvendelse af rhamnose +

Anvendelse af D-xylose + 25 Anvendelse af DL-a-aminosmørsyre

Anvendelse af L-bistidin +

Anvendelse af L-bydroxyprolin

Nedbrydning af allantoin +

Nedbrydning af arbutin + 30 Nedbrydning af xanthin +

Nedbrydning af pectin +

Nedbrydning af lecithin

Nitratreduktion +

Hydrogensulfiddannelse + 35 Tåler natriumazid (0,01% w/v) Tåler natriumchlorid (7% w/v) Tåler phenol (0,1% w/v) + Vækst ved 45°C + 15

DK 162099 B

Egenskab Resultat

Modstandsdygtighed over for neomycin (50 ^g.ml*^-)

Modstandsdygtighed over for rifampicin (50 pg.ml*!) + 5 Antibiose over for Aspergillus niger LIV 131 +

Antibiose over for Bacillus subtilis NCIB 3610 Antibiose over for Streptomyces murinus ISP 5091 +

Organismen blev ikke identificeret som tilhørende nogen af de vig-10 tigste 23 artsgrupper (S.T. Williams et al., J. Gen. Microbiol. 129, 1983, s. 1815-1830) eller nogen af de mindre artsgrupper og enkelte medlemsklynger, der blev defineret af Williams et al., J. Gen. Microbiol. 129, 1983, s. 1743-1813. Egenskaberne hos Streptomyces ther-moarchaensis NCIB 12015 blev også sammenlignet med beskrivelser af 15 kendte Streptomyces-arter i Bergey's Manual of Determinative Bac teriology (8. udgave), i ISP-rapporter af Shirling og Gottlieb (Int.

J. Syst. Bacteriol. 18, 1968, s. 69-189; Int. J. Syst. Bacteriol. 18, 1968, s. 279-392; Int. J. Syst. Bacteriol. 19, 1969, s. 391-512; Int.

J. Syst. Bacteriol. 22, 1972, s. 265-394) og med nye arter, der er 20 indgående beskrevet i International Journal of Systematic Bacteriology siden 1980.

Organismen Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 adskiller sig fra Streptomyces cyaneogrisens non-cyanogenus NRRL 15773 som er beskrevet i DK patentansøgning nr. 2488/85. Dette blev påvist ved at underkaste 25 dem de tre nedenstående standardtests med de anførte resultater: NRRL 15773 NCIB 12015

Nedbrydning af pektin - +

Nedbrydning af arbutin - + 30 Vækst ved NaCl (7% vægt/vol.) +

Der kunne således ikke etableres identitet mellem Streptomyces ther-moarchaensis NCIB 12015 og en beskreven art, og på dette grundlag formodes det, at Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 er det 35 første kendte medlem af en ny art tilhørende slægten Streptomyces.

DK 162099B

16

Mutantstammerne NCIB 12111, 12112, 12113 og 12114 har alle i det væsentlige tilsvarende væsentlige egenskaber som Streptomyces ther-moarchaensis. Imidlertid kræver NCIB 12111 adenin til vækst, NCIB 12112 kræver serin til vækst, NCIB 12113 kræver histidin til vækst, 5 og NCIB 12114 er modstandsdygtig over for streptomycin.

Produktionen af S541-forbindelserne ved fermentering af de nævnte Streptomyces-organismer kan udføres på sædvanlig måde, dvs. ved dyrkning af Streptomyces-organismen i nærværelse af assimilerbare kilder til carbon, nitrogen og mineralsalte.

10 Assimilerbare carbon-, nitrogen- og mineralkilder kan tilvejebringes af enten simple eller komplekse næringsstoffer. Carbonkilder omfatter sædvanligvis glucose, maltose, stivelse, glycerol, melasse, dextrin, lactose, saccharose, fructose, carboxylsyrer, aminosyrer, glycerider, alkoholer, alkaner og vegetabilske olier. Carbonkilder omfatter gene-15 relt 0,5-10 vægtprocent af fermenteringsmediet.

Nitrogenkilder omfatter sædvanligvis sojabønnemel, maj sstøbevand, opløseligt materiale fra destillation, gærekstrakter, bomuldsfrømel, peptoner, jordnøddemel, maltekstrakt, melasse, casein, aminosyre-blandinger, ammoniak (gasformig eller opløst), ammoniumsalte eller 20 nitrater. Der kan også anvendes urea og andre amider. Nitrogenkilder omfatter sædvanligvis 0,1-10 vægtprocent af fermenteringsmediet.

Mineralske næringssalte, der kan inkorporeres i dyrkningsmediet, omfatter de sædvanligvis anvendte salte, som er i stand til at tilvejebringe natrium-, kalium-, ammonium-, jern-, magnesium-, zink-, nik-25 kel-, cobalt-, mangan-, vanadium-, chrom-, calcium-, kobber-, molybdæn-, bor-, phosphat-, sulfat-, chlorid- og carbonationer.

Et antiskumningsmiddel kan være til stede for at regulere for meget opskumning og tilsættes i intervaller efter behov.

Dyrkning af Streptomyces-organismen udføres ved en temperatur på 20-30 50eC, fortrinsvis 25-40°C, især ca. 34°C, og finder fortrinsvis sted under beluftning og agitering, fx ved rystning eller omrøring. Mediet 17

DK 162099 B

kan indledningsvis inokuleres med en lille mængde af en suspension af den sporulerede mikroorganisme, men for at undgå en forsinkelse i vækst kan et vegetativt inokulum af organismen fremstilles ved at inokulere en lille mængde af dyrkningsmediet med sporeformen af 5 organismen, og det vundne vegetative inokulum kan overføres til fermenteringsmediet eller fortrinsvis til ét eller flere spiringstrin, hvor yderligere vækst finder sted før overførsel til det egentlige fermenteringsmedium. Fermenteringen udføres i pH- området 5,5-8,5, fortrinsvis 5,5-7,5.

10 Fermenteringen kan udføres i et tidsrum af 2-10 dage, fx ca. 5 dage.

Når det ønskes at skille materiale, som indeholder de omhandlede antibiotika S541-forbindelser fra hele fermenteringen, eller at isolere en af disse forbindelser, kan dette udføres ved sædvanlig isolerings- og separationsteknikker. Antibiotika S541-forbindelserne 15 ifølge opfindelsen er hovedsagelig indeholdt i cellernes mycelium, men kan også findes i fermenteringsvæsken, og isoleringsteknikkerne kan også anvendes på fermenteringsvæsken enten før eller efter klaring. Det er klart, at valget af isoleringsteknikker kan varieres meget.

20 Antibiotika S541-forbindelserne kan isoleres og fraskilles ved en række fraktioneringsteknikker, fx adsorption/eluering, udfældning, fraktioneret krystallisation og opløsningsmiddelekstraktion, hvilke teknikker kan kombineres på forskellige måder.

Opløsningsmiddelekstraktion og chromatografi og fraktioneret krystal-25 lisation har vist sig at være de mest hensigtsmæssige metoder til isolering og adskillelse af forbindelserne ifølge opfindelsen.

Efter fermenteringen kan mycelierne høstes under anvendelse af sædvanlige teknikker, fx filtrering eller centrifugering. Derefter kan materialet fx ekstraheres fra mycelierne med et hensigtsmæssigt or-30 ganisk opløsningsmiddel såsom keton, fx acetone, methylethylketon eller methylisobutylketon, et carbonhydrid, fx hexan, et halogeneret carbonhydrid, fx chloroform, carbontetrachlorid eller methylen-chlorid, en alkohol, fx methanol eller ethanol, eller en diol, fx 18

DK 162099 B

propan-l,2-diol, eller en ester, fx methylacetat eller ethylacetat.

Det er klart, at hvis mycelierne indeholder betydelige mængder vand, er det en fordel at anvende et vandopløseligt opløsningsmiddel.

Generelt er mere end én ekstraktion ønskelig for at opnå optimalt ud-5 bytte. Fortrinsvis udføres den første ekstraktion under anvendelse af et med vand blandbart opløsningsmiddel såsom methanol eller acetone. Antibiotikaene kan isoleres som en råekstrakt ved fjernelse af opløsningsmidlet. Opløsningsmiddelekstrakterne kan i sig selv ekstraheres, om ønsket efter nedbringning af opløsningsmiddelvolumenet, fx ved 10 inddampning. I dette trin foretrækkes det at anvende et med vand ikke blandbart opløsningsmiddel såsom hexan, chloroform, methylenchlorid eller ethylacetat eller blandinger deraf, idet der tilsættes en tilstrækkelig mængde vand til at opnå tilfredsstillende fordeling af de antibiotiske forbindelser. Ved fjernelse af den med vand ikke 15 blandbare fase fås et materiale, som indeholder antibiotika S541-for-bindelserne.

Oprensning og/eller separation af de aktive faktorer (fuldstændigt eller fra andre tilstedeværende makrolide forbindelser) kan udføres under anvendelse af konventionelle teknikker som fx chromatografi 20 (herunder højtryksvæskechromatografi) på et hensigtsmæssigt underlag såsom silicagel, en ikke-funktionel makroretikulær adsorptionsharpiks som fx tværbundne polystyrenharpikser, fx Amberlite® XAD-2, XAD-4 eller XAD-1180 (Rohm & Haas Ltd), eller en S112-harpiks (Kasteil Ltd) eller en med et organisk opløsningsmiddel kompatibel tværbundet 25 dextran såsom Sephadex® LH20 (Pharmacia UK Ltd) eller i tilfælde af højtryksvæskechromatografi omvendt-faset bærer såsom carbonhydrid-bundet silicagel, fx C^g-bundet silicagel. Underlaget kan have form af et leje eller kan fortrinsvis være pakket i en søjle. I tilfælde af ikke-funktionelle makroretikulære harpikser såsom XAD-1180 eller 30 S112 kan der til eluering anvendes blandinger af organiske opløs ningsmidler såsom acetonitril med vand.

En opløsning af forbindelserne i et egnet opløsningsmiddel vil sædvanligvis blive anbragt på silicagel- eller Sephadex®-søjlerne, om ønsket, efter at opløsningsmidlets volumen først er nedbragt. Søjlen 35 kan eventuelt vaskes og derefter elueres med et opløsningsmiddel med 19

DK 162099 B

hensigtsmæssig polaritet. I tilfælde af Sephadex® og silicagel kan der som opløsningsmiddel anvendes alkoholer såsom methanol, carbon-hydrider såsom hexan, acetonitril, halogenerede carbonhydrider såsom chloroform eller methylenchlorid eller estere såsom ethylacetat.

5 Kombinationer af sådanne opløsningsmidler enten alene eller med vand kan også anvendes.

Eluering og separation/oprensning af forbindelserne ifølge opfindelsen kan overvåges ved sædvanlige teknikker såsom chromatografi, fx tyndtlagschromatografi og højtryksvæskechromatografi eller ved at ud-10 nytte forbindelsernes ovenfor beskrevne egenskaber.

Chromatografi på silicagel, fortrinsvis under anvendelse af et elue-ringsmiddel såsom chloroform/ethylacetat, adskiller let antibiotika S541-forbindelserne i komponent I og II, idet komponent I elueres først. Faktor E og F kan derefter let fås fra komponent I under 15 anvendelse af chromatografi, fx højtryksvæskechromatografi. Alternativt kan Faktor E og F oprenses ved krystallisation fra en alkohol såsom methanol eller isopropanol. Moderluden, der indeholder Faktor E og F, kan om ønsket underkastes yderligere oprensning, fx chromatografi på silicagel, og Faktor E og F kan isoleres under anvendelse af 20 højtryksvæskechromatografi. De vundne faktorer kan derefter yderligere oprenses ved krystallisation af fx methanol, isopropanol eller en methanol/vandblanding, og opfindelsen omfatter forbindelser ifølge opfindelsen i krystallinsk form.

Ved en hensigtsmæssig kombination af ovenstående fremgangsmåder er 25 forbindelserne ifølge opfindelsen blevet isoleret som faste stoffer.

Det er klart, at den rækkefølge, i hvilken de ovenstående oprensningstrin udføres, og valget af de oprensningstrin, der anvendes, kan varieres inden for vide rammer.

Således er Faktor E og F blevet vundet med en renhed på over 90%.

30 Faktorerne kan imidlertid som beskrevet ovenfor anvendes i renheds-niveauer, der er hensigtsmæssige for deres påtænkte anvendelse. Til anvendelse inden for humanmedicin er renheder på mindst 90%, fortrinsvis over 95%, ønskelige. Til veterinær, landbrugs- eller gart- 20

DK 162099 B

nerianvendelse er lavere reriheder tilstrækkelige, fx 50% eller derunder.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler. Der anvendes følgende forkortelser: TLC - tyndtlagschromatografi (under anvendelse 5 af Merck 5735 silica 60-plader og elueret med CHC^/ethylacetat (3:1), medmindre andet er angivet), CCM =* søjlechromatografi under anvendelse af Merck 7734 silica 60 (200 x 4 cm's søjle, medmindre andet er angivet) pakket og elueret med CHC^/ethylacetat (3:1), medmindre andet er angivet), HPLC = høj tryksvæskechroma tograf i, PE = 10 petroleumsether (kogepunkt 60-80°C, medmindre andet er angivet), EA = ethylacetat.

De i eksemplerne anvendte medier A, B og C er:

Medium A gi ^ 15 D-Glucose 15,0

Glycerol 15,0

Sojapepton 15,0

NaCl 3,0

CaC03 1,0 20 Destilleret vand til 1 liter, pH indstillet til 7,0 med vandigt NaOH før autoklavering.

Medium B gi ^ D-Glucose 2,5 25 Maltdextrin MD 30E (Roquette (UK) Ltd) 25,0

Arkasoy 50 (British Arkady Co. Ltd) 12,5

Melasse 1,5 K2HP04 0,125

Calciumcarbonat 1,25 30 MOPS (3-(N-morpholino)propan- sulfonsyre) 21,0 21

DK 162099 B

Destilleret vand til 1 liter, pH indstillet til 6,5 med 5N NaOH før autoklavering.

Medium C gi 1 5 D-Glucose 2,5

Maltdextrin MD 30E (Roquette (UK) Ltd) 25,0

Arkasoy 50 12,5

Roemelasse 1,5 K2HP04 0,125 10 CaC03 1,25

Silicone 1520 (Dow Corning) 0,625

Destilleret vand til 1 liter, pH indstillet til 6,5 før sterilisation.

EKSEMPEL 1 15 Sporer af Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 blev inokuleret på skråagar, som bestod af følgende bestanddele: gi'1 Gærekstrakt (Oxoid L21) 0,5 20 Maltekstrakt (Oxoid L39) 30,0

Mycologisk pepton (Oxoid L40) 5,0

Agar nr. 3 (Oxoid L13) 15,0

Destilleret vand til 1 liter, pH ca. 5,4, og blev inkuberet ved 28°C i 10 dage. Den modne skråagar blev der-25 efter dækket med en 10%'s glycerolopløsning (6 ml) og skrabet med et sterilt værktøj for at løsne sporerne og mycelium. 0,4 ml's alikvoter af den resulterende sporesuspension blev overført til sterile tynde polypropylenrør, som derefter blev varmeforseglet og oplagret i flydende nitrogendamp, indtil de skulle bruges.

22

DK 162099 B

Indholdet af et enkelt rør blev anvendt til at inokulere 10 ml medium A, som derefter blev inkuberet ved 28°C i 3 dage på et rysteapparat, som roterede med 250 omdrejninger/minut med en orbitalbevægelse på 50 mm i diameter. Dette inkuberede medium blev anvendt til at in-5 okulere 15 reagensglas og to 250 ml's Erlenmeyer-kolber, der indeholdt henholdsvis 10 ml og 50 ml medium B, i et niveau på 2%.

Reagensglassene og kolberne blev dyrket ved 28“C i 5 dage, og derefter blev kulturerne filtreret separat i vakuum og cellerne rystet i 30 minutter med et volumen methanol, som svarede til kulturfiltratets 10 volumen.

Aktivitet mod Caenorhabditis elegans blev detekteret i ekstrakter af celler, der var dyrket i både reagensglas og kolber, og disse myce-lieekstrakter blev samlet, inddampet til tørhed og reekstraheret med methanol til et koncentrat (6 ml), som blev anbragt på en søjle af 15 Sephadex® LH20 (110 x 2,5 cm), pakket og elueret med methanol.

10 ml's fraktioner blev indsamlet.

Fraktionerne 21-28 blev samlet i pulje og inddampet, hvilket gav en olieagtig remanens (156 mg), som blev ekstraheret med CHCI3/EA (3:1), hvilket gav en ekstrakt (3 ml), som blev underkastet CCM (55 x 20 2,5 cm's søjle). 10 ml fraktioner blev indsamlet og analyseret ved TLC under anvendelse af plader, som indeholdt en fluorescensindikator. Fraktionerne 20-23 og fraktionerne 36-44 resulterede i to hovedområder, som slukkede fluorescensen, og som er blevet identificeret som komponent I (Rf-værdi 0,70) og komponent II (Rf-værdi 0,43).

25 Inddampning af fraktionerne 20-23 gav komponent I i form af et fast stof (9 mg), λ 238 nm, El· 340; λ 245 tun, El· 350; og λ 254 nm, e| 200. Inddampning af fraktionerne 36-44 gav komponent II i form af et fast stof (11 mg), λ 238 nm, El· 440; λ 245 nm, El· 0 max L max 460; og λ 254 nm, El· 280.

0 max L

30 EKSEMPEL 2

To 250 ml's Erlenmeyer-kolber, som indeholdt 50 ml medium A, blev hver især inokuleret med 0,2 ml af en sporesuspension af Streptomyces 23

DK 162099 B

thermoarchaensis NCIB 12015, som blev taget fra et tyndt rør, der var fremstillet som beskrevet i eksempel 1. Kolberne blev inkuberet ved 28°C i 3 dage på et rysteapparat, som roterede med 250 omdrej-ninger/minut med en orbitalbevægelse på 50 mm i diameter, og ind-5 holdet af begge kolber blev derefter anvendt til at inokulere en 20 l's fermenteringsbeholder, som indeholdt medium B (12 1). Kulturen blev høstet efter 5 dages vækst.

EKSEMPEL 3 0,4 ml af en sporesuspension af organismen Streptomyces thermoar 10 chaensis NCIB 12015, som blev taget fra et tyndt rør, der var fremstillet som beskrevet i eksempel 1, blev anvendt til at inokulere en 250 ml's Erlenmeyer-kolbe, som indeholdt 50 ml medium A. Kolben blev inkuberet ved 20°C i 4 dage på et rysteapparat, som roterede med 250 omdrejninger/minut med en orbitalbevægelse på 50 mm i diameter.

15 8 ml's portioner blev derefter anvendt til at inokulere hver af to 2 l's fladbundede kolber, som hver indeholdt 400 ml af det samme medium, før inkubation under de samme betingelser i 3 dage.

EKSEMPEL 4

Et inokulum af Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12015 blev frem-20 stillet som beskrevet i eksempel 3, idet vækstperioden var to dage, og anvendt til at inokulere en fermenteringsbeholder (70 1), som indeholdt 40 1 medium B beriget med polypropylen 2000 (0,06¾ vol/vol) i stedet for Silicone 525. Polypropylen 2000 blev tilsat efter behov under hele fermenteringen for at kontrollere opskumning. Fermenterin-25 gen blev udført ved 28°C under tilstrækkelig agitation og beluftning til at opretholde et niveau af opløst oxygen på over 30%'s mætning.

Efter 24 timers fermentering blev en 9 l's portion af væsken overført til en fermentor (700 1), som indeholdt 450 1 af et medium med følgende sammensætning: 24

DK 162099 B

gr1 D-Glucose 2,8

Maltdextrin (MD 30E) 27,8 5 Arkasoy 50 13,9

Melasse 1,7 K2HP04 0,14

CaC03 1,39

Silicone 525 (Dow Corning) 0,06% (vol/vol) 10 Indstillet til en pH-værdi på 6,5 før sterilisation.

Fermenteringen blev udført ved 28°C under tilstrækkelig agitation og beluftning til at opretholde et niveau af opløst oxygen på over 20%'s mætning. Polypropylen 2000 antiskumningsmiddel blev tilsat efter behov. Efter 2 dage blev pH-værdien indstillet til 7,2 ved tilsætning 15 af H2SO4. Fermenteringen blev høstet efter 5 dage.

Fermenteringsvæsken (450 1) blev klaret ved centrifugering, og den resterende supernatant blev fortrængt med 20 1 vand. De isolerede celler (25,5 kg) blev omrørt i 1 time i en tilstrækkelig mængde methanol til at give et samlet volumen på 75 1. Suspensionen blev 20 filtreret, og den faste remanens blev reekstraheret med 35 1 methanol og filtreret. Det kombinerede filtrat (87 1) blev fortyndet med 40 1 vand og ekstraheret med PE. Efter 30 minutter blev faserne adskilt ved centrifugering, og den lavere methanolfase blev reekstraheret med 30 1 PE efter tilsætning af 40 1 vand. Efter separation blev den . 25 lavere fase igen ekstraheret med 30 1 PE. De kombinerede PE-faser (85 1) blev koncentreret ved tre passager gennem en Pfandler 8,8-12v-27 filmafstrygningsfordamper (damptryk 0,1 bar, damptemperatur 20QC, vanddamptemperatur 127eC). Koncentratet (9 1) blev tørret med 2 kg natriumsulfat og yderligere koncentreret under reduceret tryk ved 30 40eC i en rotations-filmfordamper. Den olieagtige remanens (130 g) blev opløst i CHCI3 op til 190 ml, og denne opløsning blev underkastet CCM (søjle pakket og vasket (500 ml) med CHCI3), idet der blev indsamlet fraktioner på ca. 40 ml efter et indledende gennemløb på 1400 ml.

25

DK 162099 B

Fraktionerne 32-46 blev kombineret og inddampet, hvilket gav en olie (21,2 g). Fraktionerne 47-93 blev kombineret og inddampet, hvilket gav en olie (20,1 g), som blev opløst i CHCI3/EA (3:1) til 50 ml og underkastet CCM, idet fraktioner på ca. 40 ml blev indsamlet efter et 5 indledende gennemløb på 1400 ml. Fraktionerne 22-36 blev kombineret og inddampet, hvilket gav en olie (3,1 g), som blev sat til den olie, som blev vundet fra fraktionerne 32-46 fra den første søjle. De kombinerede olier blev opløst i 4 ml kogende methanol, som derefter blev sat til 20 ml varm propan-2-ol, hvilket ved henstand gav den 10 krystallinske Faktor B (2,57 g).

Moderluden efter krystallisation af Faktor B blev inddampet, hvilket gav en olie, der blev opløst i et lige så stort volumen CH2CI2 og anbragt på en søjle (30x2,2 cm) af Merck silicagel 60 (63-210 μτα, artikel nr. 7734) pakket i CH2CI2. Lejet blev vasket med CH2CI2 (2 15 lejevolumener) og elueret med CHCI3/EA (3:1) (2 lejevolumener).

Inddampning af eluatet gav en olie, der blev opløst i methanol og underkastet præparativ HPLC på Spherisorb S5 0DS-2 (250 x 20 mm,

Phase Sep. Ltd.). Prøven (5 ml) blev pumpet på søjlen i løbet af 1 minut, og søjlen blev elueret med acetonitril/vand (7:3) under føl-20 gende betingelser:

Tid Gennemstrømning (minutter) (ml/minut) 0,00 0,00 ) Injektions- 25 1,00 0,00 ) tid 1,10 30,00 39,90 30,00 40.00 35,00 75.00 35,00 30 -

Materiale, som blev elueret fra HPLC-søjlen, blev overvåget ved UV-spektroskopi ved 238 nm. Inddampning af de kombinerede fraktioner med toppe, som blev elueret ved 26,3 minutter, gav Faktor E som et fast stof. Inddampning af de kombinerede fraktioner med toppe, der eluer- 26

DK 162099 B

ede ved 36,4 minutter, gav Faktor F som et fast stof. Yderligere karakteristika for Faktor E og F er beskrevet nedenfor.

EKSEMPEL 5

Fermenteringsvæske (svarende til den i eksempel 2 fremstillede) høs-5 tet efter 117 timer blev autoklaveret (121°C, 1 time), afkølet til stuetemperatur og omrørt ved hjælp af en magnetomrører, hvilket gav en homogen cellesuspension. To portioner (2 ml) blev centrifugeret (12.000 x g, 2 minutter, stuetemperatur), supernatanterne blev hældt fra, og de resterende celler blev suspenderet i 2 ml vand, blandet 10 grundigt og på ny underkastet centrifugering (12.000 x g, 2 minutter, stuetemperatur). Efter fradekantering af supernatanterne blev cellerne vasket yderligere to gange med destilleret vand (2 ml's portioner) . De vaskede celler blev derefter grundigt blandet med enten 2 ml vand eller 2 ml methanol og lodes henstå ved stuetemperatur med 15 intermitterende omrystning i 1,5 time. Suspensionerne blev på ny centrifugeret (12.000 x g, 2 minutter, stuetemperatur), og supernatanterne blev sekventielt fortyndet i vand. Cellerne fra de vandige suspensioner blev resuspenderet i vand og omgående sekventielt fortyndet i vand. Portioner (10 /il) af hver af fortyndingerne blev sat 20 til en suspension (200 /il) af nematoden Caenorhabditis elegans i en pufferopløsning indeholdende 6 g/1 Na2HP04, 3 g/1 K2HPO4, 5 g/1 NaCl og 0,25 g/1 MgS04.7H20 og indstillet til pH 7,0. Efter 4 timer blev nematodesuspensionerne undersøgt for at finde ud af, hvilke fortyndinger af testblandingen der forårsagede total irihibering af motili-25 tet hos over 98% af nematoderne i assaysuspensionen. Det viste sig, at 1:5, 1:25, 1:250 og 1:500 fortyndinger af methanolekstrakten, 1:5, 1:25, 1:250, 1:500 og 1:1000 fortyndinger af cellesuspensionen og 1:2, 1:4 og 1:8 fortyndinger af den vandige ekstrakt forårsagede en sådan inhibering af nematoderne, når 10 μΐ sattes til 200 μΐ af 3 0 nematodesuspens ionerne.

27

DK 162099 B

EKSEMPEL 6

Faktor E og F har vist sig at have følgende karakteristika: i) De indeholder kun carbon, hydrogen og oxygen.

ii) Elektronkollisions (E.I.) massespektroskopi af Faktor E og F gav 5 følgende resultater:

Faktor Molekylarion Svarer til bruttoformlen E 612,3638 C36H52°8 F 626,3807 C37h54°8

Feltdesorptionsmassespektroskopi af Faktor E gav følgende resultat: M/Z 612 M+, og af Faktor F følgende resultat: M/Z 626 M+.

En nøjagtig massemåling af Faktor E ved E.I.-ioniseringsmetoden gav en ion ved 452,2908 ^29^()^4' og for Faktor F en ion ved 466,3067 15 C30H24°4, iii) Faktor E og F har karakteristiske IR-spektre i bromoform, herunder følgende toppe: for Faktor E toppe ved ca. 3500 (OH), 1708 (ester) og 994 cm"^ (C-0); og 20 for Faktor F bånd ved ca. 3500 (OH), 1708 (ester) og 997 cnT^ (C-0).

De komplette spektre for Faktor E og F er vist i fig. 1 og 2.

iv) Faktor E og F har et UV-spektrum i methanol (c = 0,001%), der viser følgende (hvor I - infleksion, og M - maksimum): 28

DK 162099 B

Faktor λ (nm) e| E 252 (I) 266 244 (M) 402 5 238 (M) 373 F 252 (I) 285 244,5 (M) 421 239 (M) 389 10 Det skal bemærkes, at medens de ovenfor viste λ -værdier er ka- rakteristiske for hver Faktor, afspejler e|-værdierne renheden af det vundne materiale. Imidlertid er forholdene mellem e|-værdierne karakteristiske for forbindelsen som sådan.

v) Et 200 MHz proton NMR-spektrum af en opløsning af hver Faktor i 15 deuterochloroform omfatter signaler (t-værdier med multipliciteter, koblingskonstanter (Hz) og integrationsværdier i parentes) centreret ved ca.:

Faktor E: 4,1-4,3 (m, 2H), 4,5-4,8 (m, 4H i alt), 5,04 (m, IH), 5,2-5,5 (m, 2H), 6,01 (d, 5, IH), 6,05 (d, 5, IH), 6,11 (s, IH), 6,1-6,4 20 (m, 3H), 6,45 (d, 10, IH), 6,51 (s, 3H), 6,70 (q, 2, IH), 7,60 (m, IH), 8,20 (s, 3H), 8,41 (s, 3H), 8,47 (s, 3H), 8,60 (t, 11, IH), 9,00 (t, 7, 3H), 9,02 (d, 6, 3H), 9,11 (q, 11, IH), 9,20 (d, 7, 3H).

Faktor F: 4,2-4,4 (m, 2H), 4,62 (s, IH), ca. 4,70 (m, 2H), 4,80 (d, 9, IH), 5,04 (m, IH), 5,2-5,5 (m, 2H), 5,99 (d, 5, IH), 6,05 (d, 5, 25 IH), 6,11 (s, IH), 6,1-6,3 (m, 2H), ca. 6,36 (m, IH), 6,45 (d, 10, IH), 6,51 (s, 3H), 6,70 (q, 2, IH), 7,42 (m, IH), 7,58 (m, IH), 8,19 (s, 3H), 8,40 (s, 3H), 8,47 (s, 3H), 8,60 (t, 11, IH), 8,95 (d, 7, 3H), 9,05 (d, 7, 3H), 9,01 (d, 7, 3H), 9,10 (q, 11, IH), 9,21 (d, 6, 3H) .

30 I det følgende beskrives eksempler på præparater indeholdende forbindelserne Ifølge opfindelsen. Udtrykket "aktiv bestanddel" betegner i det følgende en forbindelse ifølge opfindelsen og er én af Faktorerne E eller F.

29

DK 162099 B

Multidosis parenteral injektion % vægt/vol. Område

Aktiv bestanddel 4,0 1-5% vægt/vol.

Benzylalkohol 2,0 5 Glyceryltriacetat 30,0

Propylenglycol til 100,0

Den aktive bestanddel opløses i benzylalkoholen og glyceryltriacetat-et. Hertil sættes propylenglycol op til det givne volumen. Opløsningen filtreres for at fjerne eventuel partikelkontamination. Pro-10 duktet fyldes aseptisk på injektionsbeholdere, der lukkes med gummi-segl eller propper, der holdes på plads med aluminiumsegl. Produktet steriliseres til slut ved opvarmning i autoklav.

Aerosol-spray Z vægt/vægt Område 15 Aktiv bestanddel 0,1 0,01-0,50% vægt/vægt

Trichlorethan 29,9

Trichlorfluormethan 35,0

Dichlordifluormethan 35,0

Den aktive bestanddel blandes med trichlorethan og fyldes på aerosol-20 beholderen. Rummet herover renses med det gasformige drivmiddel, og ventilen sættes på plads. Den nødvendige mængde flydende drivmiddel fyldes på under tryk gennem ventilen. Beholderen forsynes med dyse og støvhætte.

Tablet 25 Fremstillingsmetode: vådgranulering % vægt/vægt mg

Aktiv bestanddel 250,0

Magnesiumstearat 1 4,5

Majsstivelse 5 22,5 30 Natrium-stivelsesglycolat 2 9,0

Natriumlaurylsulfat 1 4,5 30

DK 162099 B

Mikrokrystallinsk cellulose til en tabletkernevægt på 450 mg En tilstrækkelig mængde af en 10%'s stivelsespasta sættes til den aktive bestanddel til dannelse af en hensigtsmæssig våd masse til granulering. Granulerne fremstilles og tørres vinder anvendelse af en 5 bakke- eller fluidiseringstørrer. Der sigtes gennem en sigte, de resterende bestanddele tilsættes, og der komprimeres til tabletter.

Om nødvendigt kan tabletterne filmovertrækkes under anvendelse af hydroxypropylmethylcellulose eller et tilsvarende filmdannende materiale under anvendelse af enten et vandigt eller ikke-vandigt opløs-10 ningsmiddelsystem. I filmovertræksopløsningen kan der inkorporeres en blødgører og et hensigtsmæssigt farvestof.

Veterinærtablet til kæledyr

Fremstillingsmetode: tør granulering mg 15 Aktiv bestanddel 50,0

Magnesiumstearat 7,5

Mikrokrystallinsk cellulose til en tabletkernevægt på 75,0

Den aktive bestanddel blandes med magnesiumstearatet og den mikro-20 krystallinske cellulose. Blandingen kompakteres til kugler. Kuglerne nedbrydes ved at passere gennem en roterende granulator til dannelse af fritflydende granuler, der komprimeres til tabletter.

Tabletkernerne kan derefter om ønsket filmovertrækkes som beskrevet ovenfor.

25 Veterinær intrammal injektion mg/dosis Område

Aktiv bestanddel 150 mg 150-500 mg

Polysorbat 60 3,0% vægt/vægt til 3 eller 5 g

Hvid bivoks 6,0% vægt/vægt til 3 g til 3 eller 5 g 30 Jordnøddeolie 91,0% vægt/vægt til 3 eller 5 g 31

DK 162099 B

Jordnøddeolie, hvid bivoks og polysorbat 60 opvarmes til 160°C under omrøring. Blandingen holdes ved 160°C i 2 timer, hvorefter den under omrøring afkøles til stuetemperatur. Den aktive bestanddel sættes aseptisk til bæreren og dispergeres under anvendelse af en blander 5 med høj hastighed. Blandingen raffineres ved at blive ledt gennem en kolloidmølle. Produktet fyldes aseptisk i sterile plastkanyler.

Veterinær oral dosis % vægt/vol. Område

Aktiv bestanddel 0,35 0,05-0,50% vægt/vol.

10 Polysorbat 85 5,0

Benzylalkohol 3,0

Propylenglycol 30,0

Phosphatpuffer til pH-værdi 6,0-6,5

Vand til 100,0 15 Den aktive bestanddel opløses i polysorbat 85, benzylalkohol og propylenglycol. En del af vandet tilsættes, og pH-værdien indstilles om nødvendigt til 6,0-6,5 med phosphatpuffer. Resten af vandet tilsættes. Produktet fyldes i dosisbeholderen.

Veterinær oral pasta 20 % vægt/vægt Område

Aktiv bestanddel 7,5 1-10% vægt/vægt

Saccharin 25,0

Polysorbat 85 3,0

Aluminiumdistearat 5,0 25 Fraktioneret kokosolie til 100,0

Aluminiumdistearatet dispergeres i den fraktionerede kokosolie og polysorbat 85 ved opvarmning. Der afkøles til stuetemperatur, og saccharinet dispergeres i den olieholdige bærer. Den aktive bestanddel dispergeres i bæreren. Produktet fyldes på plastkanyler.

32

DK 162099 B

Granuler til veterinær administration i foderet % vægt/vægt Område

Aktiv bestanddel 2,5 0,05-5% vægt/vægt

Kalkstensmel til 100,0 5 Den aktive bestanddel blandes med kalkstensmelet. Der fremstilles granuler ved vådgranulering. De tørres under anvendelse af en bakke-eller fluidiseringstørrer. Produktet fyldes på en hensigtsmæssig beholder.

Emulgerbart koncentrat 10 Aktiv bestanddel 50 g

Anionisk emulgator (fx phenyl-sulfonat CALX) 40 g

Ikke-ionisk emulgator (fx Sype-ronic NP 13) 60 g 15 Aromatisk opløsningsmiddel (fx Solvesso 100) til 1 liter

Alle bestanddelene blandes og omrøres, til de er opløst.

Granuler a) Aktiv bestanddel 50 g 20 Træharpiks 40 g

Gipsgranuler (250-841 /im) (fx Agsorb 100A) til 1 kg b) Aktiv bestanddel 50 g

Syperonic NP13 40 g 25 Gipsgranuler (250-841 μή) til 1 kg

Alle bestanddelene opløses i et flygtigt opløsningsmiddel, fx methy-lenchlorid, og sættes til granuler, som kastes rundt i en blander.

Produktet tørres for at fjerne opløsningsmidlet.

33

DK 162099 B

Aktiviteten af Faktor E og F blev bestemt under anvendelse af en række skadedyr og deres værter, herunder følgende: Tetranychus urti-cae (snittebønne og Myrobalan B-blomme), Myzus persicae (kinakål og -radise), Heliothis virescens (bomuld), Chilo portellus (rapsbønne), 5 Meloidogyne incognita (Mung-bønne), Panonchus ulmi (Myrobalan B-blomme), Phorodon humuli (humle), Aulacorthum circumflexum (alpe-viol).

Produktet blev anvendt i form af et flydende præparat. Præparaterne blev fremstillet ved opløsning af produktet i acetone. Opløsningerne 10 blev derefter fortyndet med vand, der indeholdt 0,1 eller 0,01 vægtprocent af et befugtningsmiddel, indtil de flydende præparater indeholdt den nødvendige koncentration af produktet.

Den testprocedure, der blev anvendt med hensyn til hvert skadedyr, omfattede opdræt af et antal af skadedyrene på et medium, som sæd-15 vanligvis var en værtsplante, og behandling af mediet med præparatet (residualtest). I tilfælde af Tetranychus urtlcae blev både skadedyrene og mediet behandlet med præparatet (kontakttest).

Ifølge denne fremgangsmåde viste Faktor E og F sig at være effektiv ved koncentrationer (beregnet på produktets vægt) på 500 dele pr.

20 million eller derunder.

Virkning over for Caenorhabditis elegans

Forbindelserne ifølge opfindelsen blev testet for deres virkning på den fritlevende nematode Caenorhabditis elegans. Opløsninger eller suspensioner af forbindelserne blev fremstilles i methanol, og der 25 blev fremstillet rækkefortyndinger (400 μg/ml og nedefter) i 20%'s propylenglycol. 10 μΐ af hver af de fremkomne opløsninger blev hver blandet med 200 μΐ vandig opløsning indeholdende 100-200 Caenorhabditis elegans-orme og bibeholdt ved stuetemperatur i 20 timer.

De nedenstående resultater er udtrykt som den minimale letale kon-30 centration, hvor over 98% af ormene fremtræder døde/paralyserede:

Claims

5 F 0,01

1. Antibiotisk forbindelse med den almene formel III OH f3 i Av"™3 ,1 LJ 0 s i C1)3 Ml B IS Si

10 V I gH UH ifl ΗγΜ hvor R^· betegner ethyl eller isopropyl.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en mikroorganisme valgt blandt Strep- 15 tomyces thermoarchaensis NCIB 12015, NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 og NCIB 12114 fermenteres under aerobe betingelser i nærværelse af assimilerbare carbon-, nitrogen- og mineralsaltkilder ved en temperatur på 20-50°C og et pH på 5,5-8.5, hvorved forbindelserne dannes, og én eller begge forbindelserne derefter om ønsket skilles 20 fra fermenteringsvæsken. DK 162099 B

3. Mikroorganisme til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er stammen Streptomyces ther-moarchaensis NCIB 12015.

4. Mikroorganismer til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 2, 5 kendetegnet ved, at de er af stammen Streptomyces thermoarchaensis NCIB 12111, NCIB 12112, NCIB 12113 eller NCIB 12114.