NO148856B - Fremgangsmaate ved fremstilling av nye anthelmintiske forbindelser betegnet c-076 - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av nye forbindelser ved fermentering av et næringsmedium med den tidligere ubeskrevne mikroorganisme Streptomyces avermitilis. De nye forbindelser kan isoleres ved oppløsnings-middelekstraksjon og kromatografiske fraksjoneringsmetoder. Forbindelsene, som er beskrevet generelt som C-076, har en betraktelig parasittisk aktivitet. Forbindelsene kan anvendes i prepara-ter for oral eller parenteral administrasjon til dyr for å forhindre og helbrede parasittiske infeksjoner.

De fremstilte nye forbindelser har et betydelig og bredt

spektrum av antiparasittisk aktivitet.

I henhold til foreliggende oppfinnelse fremstilles en gruppe stoffer beskrevet generelt her som C-076, ved dyrkning under kontrollerte betingelser av de ovennevnte stammer av mikroorganismer. I det minste åtte forskjellige, men nært beslektede nye forbindelser fremstilles av Streptomyces avermitilis. De er her betegnet som C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a og B2b. Alle har betraktelig antiparasittisk aktivitet. De kan fåes ved fermentering og utvinning i i det vesentlige ren form som beskrevet i det følgende.

Basert på taksonomiske undersøkelser er mikroorganismene som er istand til å produsere C-076-forbindelsenej en ny art av slekten Streptomyces, som er blitt betegnet Streptomyces avermi"-tilis. En slik kultur, isolert,fra jord, har fått betegnelsen MA-4680 i kultursamlingen til Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. En C-076-produserende prøve av denne kultur er blitt deponert i den permanente kultursamling til Fermentation Section of the Northern Utilization Research Branch, U.S. Department of Agriculture i Peoria, Illinois, og har fått aksesjonsnummer NRRL 8165. En prøve av NRRL 8165 er også blitt deponert, uten restriksjoner på tilgjengelighet, i den permanente kultursamling til American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, og har fått aksesjonsnummer ATCC 31.267 .

De morfologiske og dyrkningsegenskaper til Streptomyces avermitilis er angitt nedenfor:

Morfologi: Sporoforer danner spiraler som sidegrener på luftmycelier. Spiralene er kompakte, men blir mere åpne ettersom kultu-ren eldes. Sporene er i kjeder på mere enn 15 sporer, og er vanligvis runde til ovale ved 970 X forstørrelse. Sporulering gjen-taes på havremel-agar, glycerol-asparagin-agar, salter-stivelses-agar og egg-albuminagar. Sporeoverflaten er glatt selv ved elek-tronmikroskopi.

28 C - God vegetativ vekst og luftmycelier

37° C - God vegetativ vekst og luftmycelier 50° C - Ingen vekst

Oxygenbehov: (Stikkultur i gjærekstrakt

dextrose + salter-agar)

Aerob

Alle avlesninger er tatt etter 3 uker ved 28° C hvor annet ikke er anført. pH av alle medier var tilnærmet nøytral (6,8 - 7,2).

Farvetallsangivelser (x) er tatt fra Color Harmony Manual, 1958, 4. utgave, Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Data fra sammenligning av Streptomyces avermitilis med beskrevne arter av Streptomyces: Streptomyces avermitilis har følgende generelle hovedtrekk: 'Brownish-gray"-modent sporulert luftmycelium, spiralformet spore-kjedemorfologi, sporene har en glatt overflate, produksjon av melanoide pigmenter, evnen til under standardbetingelser å ut-nytte de carbonholdige forbindelser glucose, arabinose, fructose, inositol, lactose, maltose, mannitol, mannose, raffinose, ramnose, sucrose og xylose, og ingen "red", "strong yellow',' "purple" eller "blue" oppløselige pigmenter eller vegetativ vekst. Under anvendelse av nøklene og skjemaene for Streptomyces-arter angitt i standard referansetekster, syntes ni arter å ha det samme generelle mønster av karaktereiendommeligheter som S. avermitilis. De skrevne beskrivelser og bilder av sporofor morfologi av disse arter ble undersøkt nærmere, under anvendelse av følgende standard referansetekster: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., redigert av R. E. Buchanan og N. E. Gibbons, 1974, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Md.; Shirling, E. B. og David Gottlieb, Cooperative description of type cultures of Streptomyces, Part II, Int. J. Syst. Bacteriol..18: 69-189 (1968), Part III, Int. J. Syst, Bacteriol. 18!: 279-392 (1968), Part IV, Int. J. Syst. Bacteriol. 19: 391-512 (1969), Part V, Int. J. Syst. Bacteriol. 22: 265-394

(1972) .

Artene S. collinus, bottropensis, diastochromogenes, luteogriseus, griseosporeus, naganishii, neyagawaensis, olivochromogenes og resistomycificus hadde en spiralmorfologi som var klart for-skjellig fra den hos S. avermitilis. S. avermitilis har lange, kompakte spoler mens de ovenfor oppregnede arter har korte sporekjeder med mange dårlig utviklede spiraler, haker, løkker, spoler, ufullkomne spiraler eller løse åpne spiraler og ofte buktede sporekjeder uten spiraler.

S. naganishii og olivochromogenes sporulerte ikke vel på visse medier på hvilke S. avermitilis viste sterk sporulering.

S. griseosporeus, luteogriseus og naganishii viste "light reddish-gray" eller "yellowish-gray" eller "grayish-white" farge av det sporulerte luftmycelium istedenfor den "dark brownish-gray" farve hos S. avermitilis.

Streptomyces avermitilis skilte seg i én eller flere viktige egenskaper fra hver av de ni arter som svarte nærmest til mønstrene i de seks hovedgruppekategorier. Det ble derfor sluttet at foreliggende kultur var en ny art av Streptomyces.

Ovenstående beskrivelse illustrerer en stamme av Streptomyces avermitilis som kan anvendes for å fremstille C-076-forbindelsene beskrevet her. Foreliggende oppfinnelse omfatter imidlertid også anvendelse av mutanter av den ovenfor beskrevne mikroorganisme. Eksempelvis er anvendelsen av. de C-076-produserende mutanter som fåes ved naturlig utvelgelse eller de som dannes ved muteringsmidler innbefattende røntgenbestråling, ultrafiolett bestråling, sennepsgass og lignende behandlinger, omfattet av foreliggende oppfinnelse.

Et eksempel på en slik organisme er en stamme av Streptomyces avermitilis MA 4848 som ble isolert etter bestråling med ultrafiolett lys av Streptomyces avermitilis MA 4680. Et lyofilisert rør og en frossen ampulle av denne kultur er deponert i den permanente kultursamling til American Type Culture Collection, og har fått aksesjonsnummerne 31272, henholdsvis 31271. Litt høyere fermenteringsutbytter av C-076 er blitt erholdt ved anvendelsen av denne frosne prøve som inoculum. C-076-forbindelsene dannes under den aerobe fermentering av passende vandige næringsmedier under betingelser beskrevet i det følgende, med en produserende stamme av Streptomyces avermitilis. Vandige medier som dem som anvendes ved fremstilling av mange antibiotiske stoffer, er egnet for anvendelse ved denne fremgangsmåte ved fremstilling av C-0 76.

Slike næringsmedier inneholder kilder til carbon og nitrogen som er assimilerbare av mikroorganismen og i alminnelighet lave nivåer av uorganiske salter. Dessuten kan fermenterings-mediene inneholde spor av metaller som er nødvendige for veksten av mikroorganismene. Disse er vanligvis tilstede i tilstrekkelig konsentrasjon i de komplekse kilder til carbon og nitrogen som anvendes som næringsmidler, men kan selvsagt tilsettes separat" til mediet om ønskes.

I alminnelighet er carbohydrater som sukkere, f.eks. dextrose, sucrose, maltose, lactose, dextran, cerelose og lignende, og stivelser egnede kilder til assimilerbart carbon i næringsmediene. Den nøyaktige mengde av carbonkilden som anvendes i mediet, vil avhenge delvis av de andre bestanddeler i mediet, men det viser seg i alminnelighet at en mengde av carbo-hydrat mellom ca. 0,5 og 5 vekt% av mediet er tilfredsstillende. Disse carbonkilder kan anvendes individuelt eller flere slike carbonkilder kan kombineres i det samme medium.

Forskjellige nitrogenkilder som gjærhydrolysater, gjær-autolysat, soyabønnemel, caseinhydrolysater, gjærekstrakter, maisstøpvæsker, drank, <b>omullsfrømel, kjøttekstrakt og lignende, assimiliseres lett av Streptomyces avermitilis ved produksjon av C-076-forbindelsene. De forskjellige nitrogenkilder kan anvendes alene eller i kombinasjon i mengder varierende fra ca. 0,2 til 6 vekt% av mediet.

Blandt de uorganiske næringssalter som kan inkorporeres i kulturmediet, er de vanlige salter som er istand til å gi natrium-, kalium-, magnesium-, ammonium, calcium-, fosfat-, sulfat-, klorid-, carbonat-ioner og lignende ioner. Også innbe-fattet er spormetaller som cobolt, mangan, jern og lignende.

Det bør merkes at mediene beskrevet i det følgende og i eksemplene bare er illustrerende for en lang rekke forskjellige medier som kan anvendes, og er ikke beregnet å være begrensende.

De følgende er eksempler på medier egnet for dyrkning av stammer av Streptomyces avermitilis for å danne C-076-forbindelsene .

Medium A

Medium B Medium C Medium D

Medium E

Fermenteringen som anvendes med de C-076-produserende mikroorganismer, kan utføres ved temperaturer fra ca. 20° til ca. 40° C. For optimale resultater er det mest bekvemt å utføre disse fermenteringer ved en temperatur i området fra ca. 24° til ca. 30 o C. Temperaturer på ca. 27 - 28 <0> C er mest foretrukket. pH av næringsmediet egnet for fremstilling av C-076-forbindelsene kan variere fra ca. 5,0 til 9,0 med et foretrukket område fra ca. 6,0 til 7,5.

Fermenteringer i liten skala utføres mest bekvemt ved

å anbringe passende mengder av næringsmedium i en kolbe under anvendelse av kjente sterile metoder, inokulere kolben med enten sporer eller vegetativ cellevekst av en C-076-produserende stamme av Streptomyces avermitilis, korke halsen på kolben løst med bo-■ mull og tillate fermenteringen å forløpe ved en konstant værel-setemperatur på ca. 28° C på en roterende ryster i ca. 3-10 dager. For arbeide i større målestokk foretrekkes det å utføre fermenteringen i passende kar forsynt med en rører og en anordning for å lufte fermenteringsmediet. Fermenteringsmediet fremstilles i karet, og etter sterilisering inoculeres det med en passende kilde til vegetativ cellevekst av en C-076-produserende stamme av Streptomyces avermitilis. Fermenteringen får lov til å fortsette i fra 1 til 3 dager under omrøring og/eller lufting av næringsmediet ved en temperatur i området fra ca. 24 til 37° C. Graden av lufting avhenger av flere faktorer som størrelsen av fermenta-toren, omrøringshastighet og-lignende. I alminnelighet omrøres fermenteringen i større skala ved ca. 95 - 150 r/min og ca. 57 - 566 l/min luft.

De nye stoffer ifølge op<p>finnelsen som generisk er betegnet her som C-076, finnes hovedsakelig i myceliet ved avslut-ningen av fermenteringen av Streptomyces avermitilis, og kan utvinnes og skilles fra hverandre som beskrevet nedenfor. Fire hovedbestanddeler og fire mindre bestanddeler av C-076 dannet av Streptomyces avermitilis har vært isolert. De åtte forskjellige forbindelser er her betegnet som C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a og B2b. Hovedbestanddelene har fått indekset "a" i denne identifiseringsterminologi og de mindre bestanddeler har fått indekset "b". Den strukturelle forskjell mellom "a"- og "b"-forbindelsene antaes å være den samme for hvert av de fire par.

Som det kunne ventes dannes selv hovedforbindelsen av C-07 6 ikke i like store mengder ved de her beskrevne fermenteringer. I alminnelighet har det vist seg at Al-forbindelsene utgjør ca. 20 - 30 vekt% av det totale C-076-kompleks som dannes, A2-forbindelsene ca. 1 - 20 % og Bl- og B2-forbindelsene hver ca. 25 - 35 %. Vektforholdet av "a"-serien av forbindelser til "b"-serien er ca. 85:15 til 99:1.

Adskillelsen av C-076-seriene av forbindelser fra hele fermenteringsvæsken og utvinningen av de enkelte bestanddeler ut-føres ved oppløsningsmiddelekstraksjon og anvendelse av kromato-grafisk fraksjonering ved forskjellige kromatografiske metoder og oppløsningsmiddelsystemer.

C-076-forbindelsene er litt oppløselige i vann, men er oppløselige i organiske oppløsningsmidler. Denne egenskap kan bekvemt anvendes for å utvinne dem fra fermenteringsvæsken. Ved én utvinningsmetode filtreres således hele fermenteringsvæsken og det vandige filtrat kastes. Den våte myceliekake ekstraheres så med et passende organisk oppløsningsmiddel. Skjønt et hvilket som helst organisk oppløsningsmiddel kan anvendes, foretrekkes det å anvende et med vann blandbart oppløsningsmiddel som aceton, mebhanol, ethanol og lignende. I alminnelighet er flere ekstrak-sjoner ønskelig for å oppnå maksimal utvinning. Oppløsningsmid-let fjerner de C-076-aktive forbindelser såvel som andre stoffer som mangler den antiparasittiske aktivitet av C-076. Hvis oppløs-ningsmidlet er vannblandbart, fjernes også vannet fra det våte mycelium. Det ekstraherte mycelium kan kastes. Oppløsningsmid-delekstraktene inndampes for å fjerne det organiske oppløsnings-middel og ekstraheres flere ganger med et annet oppløsningsmiddel. Når der ved den første ekstraksjon anvendes et vannblandbart opp-løsningsmiddel, anvendes fortrinnsvis ved den annen ekstraksjon

et med vann ublandbart oppløsningsmiddel som kloroform, methylenklorid, carbontetraklorid, ethylacetat, methylethylketon, methyl-isobutylketon og lignende. Disse sistnevnte ekstrakter tørres og konsentreres ved kjente metoder for å få et residuum bestående av C-076 blandet med andre materialer. Denne fraksjon kromatografe-

res så bekvemt for å skille de aktive C-076-forbindelser fra andre materialer og også for å skille og isolere de individuelle C-076-forbindelser. De kromatografiske metoder som kan anvendes for å rense C-076-forbindelsene, er alminnelig kjent for fagfolk. Eksempler på slike metoder er kolonnekromatografi, under anvendelse av slike medier som silicagel, aluminiumoxyd, dextratgeler og lignende, og eluering av slike kolonner med forskjellige oppløs-ningsmidler, og/eller en kombinasjon av to eller flere oppløsnings-midler, i varierende forhold. Væskekromatografi anvendes for å påvise C-076-forbindelsene, og høytrykks-væskekromatografi kan anvendes for å isolere rensede fraksjoner inneholdende en eller flere av slike forbindelser. Likeledes kan tynnskiktskromatografi anvendes for å påvirke nærværet av, og for å isolere de individuelle C-076-forbindelser. Anvendelsen av de foregående metoder såvel som andre som er kjent for fagfolk, vil gi rensede prepara-ter omfattende C-076-forbindelsene såvel som selve de individuelle C-076-forbindelser. Nærværet av de aktive C-076-forbindelser bestemmes ved å analysere de forskjellige kromatografiske fraksjoner på antiparasittisk aktivitet, og også ved de spektrale egenskaper (som ultrafiolett og infrarød) av disse forbindelser som beskrevet nedenfor.

De spektrale og andre fysikalsk-kjemiske egenskaper av de individuelle C-076-forbindelser er angitt i tabellform i tabell I. Disse forbindelser er meget oppløselige i de fleste vanlige organiske oppløsningsmidler, og er minimalt oppløselige i vann.

De ultrafiolette spektraldata i tabell I ble erholdt på et "Cary Model 15 Ultraviolet Spectrometer" i methanoloppløsnin-ger i 1 cm kvartsceller. Konsentrasjonen av forbindelsen var ca. 25 yg/ml. Den ultrafiolette absorpsjon, skjønt den er angitt som den for en spesiell "a-serie"-forbindelse, er i virkeligheten absorpsjonen av "a-serie"-forbindelsen som inneholder en mindre mengde av en "b-serie"-forbindelse. "a"- og "b"-seriene skiller seg bare ved en -CH2-gruppe i en lavere alkylsubstituent, hvilken forskjell ikke er forbundet med kromoforen. Ultrafiolett absorpsjon karakteriserer hovedsakelig graden og naturen av umetning som er tilstede i den spesielle forbindelse. De optiske dreinin-ger er bestemt under anvendelse av standardmetoder med et Karl Zeiss-polarimeter. Konsentrasjonsfaktoren (c) er gitt som en prosent av forbindelsen i det angitte oppløsningsmiddel.

13C kjernemagnetisk resonans-spektraldata for C-076 Ala, A2a, Bla og B2a er angitt i tabell II nedenfor. Disse spektra ble erholdt fra et "Varian Nuclear Magnetic Spectrometer Model CFT-20" i deuterert kloroformoppløsning under anvendelse av tetramethylsilan som den innvendige standard. Oppløsningsvolumet cg konsentrasjonen av prøvene er angitt for hvert tilfelle, fulgt av de kjemiske skift i forhold til tetramethylsilan for hver forbindelse angitt i ppm. De kjemiske skift er gitt for et enkelt car-bonatom hvor annet ikke er anført i parentes etter det kjemiske skift.

De karakteristiske massespektrumstopper av åtte C-076-forbindelser er angitt i tabell III. Den første linje av tabell III representerer forholdet mellom massen og ladningen (m/e) for molekylærionet for hver respektive forbindelse, og de gjenværende tall angir forholdet mellom masse og ladning av hoved-fraksjonene av hver forbindelse. Forholdene mellom masse og ladning angitt i den samme horisontale rekke indikerer analoge frag-menter i hver forbindelse. Forholdene mellom masse og ladning som er angitt i hele tall ble erholdt fra en "LKB Mass Spectrometer Model LKB-9000". Forholdene mellom masse og ladning som er angitt til det fjerde desimal, ble erholdt fra et "High Resolution Varian Mass Spectrometer Model MAT-731.

Fig. 1 - 8 er nøyaktige reproduksjoner av infrarøde og proton-kjernemagnetiske resonansspektra for fire av C-076-forbindelsene. Fig. 1 - 4 er infrarøde spektra for henholdsvis C-076 Ala, A2a, Bla og B2a. Fig. 5 - 8 er proton-kjernemagnetiske spektra for henholdsvis C-076 Ala, A2a, Bla og B2a. De infra-røde spektra ble erholdt på et "Perkin-Elmer Infrared Spectrometer Model 4 21" i kloroformoppløsning. De proton-kjernemagnetiske resonansspektra ble erholdt i deuterert kloroformoppløs-ning i et "Varian Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer Model HA-100" og spektrumene viser kjemiske skift angitt i ppm i forhold til tetramethylsilan som en innvendig standard.

Basert på forsøksdata innbefattende undersøkelsene og målingene beskrevet her antaes C-076-forbindelsene å ha følgende Dlanstrukturformel: hvor R er a-L-oleandrosyl-a-L-oleandrosidet med formelen:

og hvor den stiplede linje indikerer en enkelt- eller en dobbel-binding; R^ er hydroxy og er tilstede bare når den stiplede linje indikerer en enkeltbinding;

R2 er isopropyl eller sek-butyl; og

R^ er methoxy eller hydroxy.

I den foregående strukturformel er de individuelle forbindelser som angitt i tabell IV.

Som det kunne ventes oppfører fremgangsmåteforbindelsene hvor R2 er sek-butyl ("a-serien" av forbindelser) og den tilsva-rende forbindelse hvor R2 er isopropyl ("b-serien") seg på lignende måte i de fleste utvinningsmetoder som den som involverer oppløs-ningsmiddelekstraksjonen. I hvert par av "a"- og '^"-forbindelser forekommer "a"-forbindelsen i større mengde og utgjør i alminnelighet ca. 85 til 99 % av en blanding av "a"- og '^"-forbindelsene. Nærværet av isopropylforbindelsene bekreftes av masse-spektrumene av forbindelsene hvor massetoppene som representerer fragmentene inneholdende sek-butylgruppen, har ledsagende topper med en masse 14 enheter (eller en-CH2~gruppe) lavere. Dessuten har høytrykks-væskekromatografi vært anvendt for å skille Alb-komponenten fra Ala-komponenten, og massespekteret av en slik Alb-forbindelse er blitt bekreftet ved høyoppløsnings-massespektro-metri (tabell III).

De nye forbindelser som fremstilles ifølge oppfinnelsen, har betraktelig parasitticid aktivitet som anthelmintica, insecticider og acaricider, i menneske- og dyrehelse og i land-bruk .

Sykdommen eller gruppen av sykdommer beskrevet generelt som helminthiasis skyldes infeksjon av en dyrevert med parasittiske ormer kjent som helminther. Helminthiasis er et fremherskende og alvorlig økonomisk problem i husdyr som svin, sauer, hester, kveg, gjeter, hunder, katter og fjærkre. Blandt helminths bevirker gruppen av ormer beskrevet som nematoder en vidt utbredt og ofte alvorlig infeksjon i forskjellige arter av dyr. De mest vanlige slekter av nematoder som infiserer dyrene omtalt ovenfor er Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris og Parascaris. Enkelte av disse, som Nematodirus, Cooperia og Oesophagostomum angriper hovedsakelig tannkanalen, mens andre som Haemonchus og-Ostertagia er mere fremherskende i maven mens nok andre som Dictyocaulus finnes i lungene. Nok andre parasitter kan være tilstede i andre vev og organer i legemet som hjerte- og blodkarene, subcutant og lymfe-vev og lignende. De parasittiske infeksjoner kjent som helminthi-aser fører til anemi, underernæring, svakhet, vekttap, alvorlig skade på veggene av tarmkanalen og andre vev og organer, og kan, hvis de lates ubehandlet, føre til døden av den infiserte vert. C-076-forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen har uven-tet høy aktivitet mot disse parasitter, og er dessuten også aktive mot Dirofilaria i hunder, Nematospiroides, Syphacia, Aspicu-luris i gnagere, arthropode ectoparasitter på dyr og fugler og som blodmidd, midd, lus, lopper, spyfluer, i sauer Lucilia sp., bitende insekter og slike migrerende tovingede larver som Hypoderma sp. i kveg, Gastrophilus i hester, og Cuterebra sp. i gnagere.

Fremgangsmåteforbindelsene er også nyttige mot parasitter som infiserer mennesker. Dernest vanlige slekter av parasitter i mave-tarmkanalen hos mennesker er Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris og Enterobius. Andre medisinsk viktige slekter av parasitter som finnes i blodet eller andre vev og organer utenfor mave-tarmkanalen er filiariaormene som Wuchereria, Brugia, Onchocerca og Loa, Dracunculus og ekstraintestinale stadier av intestinalormene Strongyloides og Rrichinella. Forbindelsene er også verdifulle mot arthropoder som er parasitter i mennsker, bitende insekter og andre tovingede pester som plager mennesker.

Forbindelsene er også aktive mot husholdsningspester som kakerlakk, Blatella sp., klæsmøll, Tincola sp.,(museumsbille, Attagenus sp. og husfluen Musea domestiva.

Forbindelsene er også nyttige mot insektpester i lagret korn som Tribolium sp., Tenebrio sp. og på landbruksplanter som spinnmidd, (Tetranychus sp.), afider, (Acyrthiosiphon sp.): mot migrerende orthoptera som gresshopper 'og ikke helt utviklede stadier av insekter som lever på plantevev. Forbindelsene er nyttige som et nematocid for bekjempelse av jordnematoder og planteparasitter som Meloidogyne spp. som kan være av viktighet i jordbruket.

Disse forbindelser kan administreres oralt i en enhets-doseform som en kapsel, bolus eller tablett, eller som en større væskedose når de anvendes som et anthelmintica i pattedyr.

Slike enhetsdosepreparater kan varieres sterkt med hensyn til deres totalvekt og innhold av det antiparasittiske middel avhenger av faktorer som typen av vertsdyr som skal behandles, alvorligheten og typen av infeksjon og vekten av verten. Når den aktive forbindelse skal administreres via et dyref6r, for-deles det omhyggelig i f6ret eller anvendes som en toppåføring eller i form av tabletter som så kan tilsettes til det ferdige f6r eller eventuelt gis separat. Alternativt kan de antiparasittiske forbindelser ifølge oppfinnelsen administreres til dyr parenteralt, f.eks. ved intraruminal, intramuskulær, intratrakeal eller subcutan injeksjon i hvilket tilfelle den aktive bestand-del oppløses eller dispergeres i et flytende bæremedium.

Ved anvendelse av fremgangsmåteforbindelsene kan de individuelle C-076-komponenter isoleres og renses og anvendes i denne form. Alternativt kan blandinger av to eller flere av de individuelle C-076-komponenter anvendes. Det er ikke nødvendig fullstendig å skille de forskjellige C-076-forbindelser erholdt fra rensningen av fermenteringsvæsken. I alminnelighet fåes en blanding inneholdende to eller flere av C-076-forbindelsene, men med andre ubeslektede forbindelser ekskludert derfra, og en

slik blanding anvendes for å forhindre og behandle parasittiske sykdommer som beskrevet her. En. slik blanding vil i alminnelighet inneholde ulike mengder av C-076-forbindelsene, men alle

forbindelsene har betraktelig aktivitet og den antiparasittiske aktivitet på blandingen kan bestemmes nøyaktig. Spesielt kan det ikke være nødvendig å skille "b"-komponentene fra den beslektede "a"-komponent. Slike forbindelser skiller' seg bare med hensyn til lengden av 25-sidekjeden. Adskillelse a<y> disse nær beslektede forbindelser utføres i alminnelighet ikke da "b"-forbindelsen bare er tilstede i en meget liten vektprosent.

Dessuten er det, når C-076-forbindelsene tilsettes til et dyrs f6r, mulig å anvende den tørrede myceliekake fra fermenteringsvæsken . Myceliene inneholder en overveiende del av aktivitet og da graden av aktivitet av myceliene kan bestemmes, kan det tilsettes direkte til dyrets for. C-076-forbindelsene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, er også nyttige til å bekjempe landbrukspester som påfører skade på avlinger mens de vokser eller mens de lagres. Forbindelsene påføres ved kjente metoder som sprayer, støv, emulsjoner og lignende, til de voksende eller lagrede avlinger for å bevirke be-skyttelse fra slike landbrukspester.

Den anthelmintiske aktivitet av C-076 kan bestemmes ved oral administrasjon via et for, en prøve av C-076-individuell forbindelse, en blanding av C-076-forbindelser, et konsentrert ekstrakt og lignende til en mus som er blitt infisert 3 dager tidligere med Mematospiroides dubius. Den 11., 12. og 13. dag etter påbegynnelse av medisinbehandlingen undersøkes musens feces på M.dubius-egg, og på den neste dag avlives musen og an-tallet ormer som er tilstede i den nærliggende del av tynntarmen, bestemmes. En aktiv forbindelse er tilstede når der er en betraktelig nedsettelse i antall av egg og ormer sammenlignet med infiserte, ikke-medisinbehandlede kontrolldyr.

De følgende eksempler er gitt for å belyse foreliggende oppfinnelse mere fullstendig.

Eksempel 1

Et lyofilisert rør av Streptomyces avermitilis MA-4680 åpnes aseptisk og innholdet suspenderes i 50 ml av Medium 1 i en skovlet 250 ml Erlenmeyer-kolbe. Denne kolbe rystes i 3 dager ved 28° C på en roterende rystemaskin ved 220 r/min med en 4 0 mm diameter sirkulær bane. En 0,2 ml porsjon av dette podemedium anvendes til å inokulere en skråkultur av Medium 3. Det inoku-lerte skråmedium inkuberes ved 28° C i 10 dager og lagres ved 4° C inntil det anvendes til å inokulere ytterligere fire skråkulturer av Medium 3. Disse skråkulturer inkuberes i mørke i 8 dager. En av disse skråkulturer anvendes til å inokulere tre skovlede 250 ml Erlenmeyer-kolber inneholdende 50 ml av nr. 4 podemedium. De podede kolber rystes i 2 dager ved 27 - 28° C på en roterende rystemaskin ved 220 r/min med en 50 ml diameter sirkulær bane. Innholdet av disse kolber forenes og anvendes til å inokulere (5 % inoculum) skovlede 250 ml Erlenmeyer-kolber inneholdende 40 ml av forskjellige produksjonsmedier. Kolbene inneholdende medier 2, 5 og 6 inkuberes i 4 dager ved 28° C på en roterende rystemaskin ved 220 r/min med en 40 mm diameters sirkulær bane.' Det dannede fermenteringsmedium inneholdende C-076 høstes så og prøves på anthelmintisk aktivitet. I alle tilfeller er 6,2 ml av hele fermenteringsvæsken valgt i faste stoffer fra sentrifugering av 25 ml av hele fermenteringsvæsken fullt aktiv mot ,N-dubius-helminth-infeksjoner i mus.

Medium 3 (Skråmedium)

Medium 4 (Podemedium)

Medium 5

Sporelementblanding Medium 6

Eksempel 2

En 0,5 x 1,0 cm løkke av en av de fire skråkulturer av Medium 3 fremstilt som i eksempel l, anvendes til å inokulere en skovle 250 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 50 ml podemedium nr.

4. Den podede kolbe rystes i 1 dag ved 27 - 28° C på en roterende rystemaskin ved 220 r/min med en 50 mm diameter sirkulær bane. Podekolben lagres så stasjonært ved 4° C inntil den skal anvendes.. Innholdet av denne kolbe anvendes så til å inokulere (5 % inoculum) 20 uskovlede 250 ml Erlenmeyer-kolber inneholdende 40 ml av Medium nr. 2. Etter 4 dagers inkubering ved 28° C på en roterende rystemaskin ved 220 r/min med 50 diameter sirkulær bane, høstes og forenes 19 av kolbene. De forenede fermen-teringsvæsker inneholdende C-076 filtreres hvilket gir 500 ml filtrat og 84 g mycelium. 78 g av myceliet ekstraheres med 150 ml aceton i 1/2 time under omrøring og blandingen filtreres. Filterkaken vaskes med 50 ml aceton og filtratet og vaskingene forenes og inndampes til 46,5 ml. 30 ml av konsentratet innstilles på pH 4 med fortynnet saltsyre og ekstraheres tre ganger med 30 ml's porsjoner kloroform. Ekstraktene tørres ved filtrering gjennom tørr infusoriejord ("Super-Cel"), ferenes og inndampes til tørrhet i vakuum. Det oljeaktige residuum av C-076 som veier 91,4 mg oppløses i kloroform tilstrekkelig til å gi 3 ml oppløsning som representerer 1 % av fermenteringsvæskevolu-met. C-076 erholdt ved denne gjenvinningsmetode er fullt aktiv mot N.dubius-infeksjoner i mus. Dessuten kan kloroformekstrak-sjonen en 70 ganger rensning av C-076 fra hele fermenteringsvæsken .

Eksempel 3

Trinn A

En 250 ml skovlet Elermeyer-kolbe inneholdende 50 ml - av Medium 7 inoculeres med en frossen ampulle av Streptomyces avermitilis MA-4680. Kolben inkuberes ved 28° C på en roterende rystemaskin ved 160 r/min med en 50 mm diameter sirkulær bane i 2 4 timer.

Medium 7

Trinn B:

To stykker 2 liters skovlede Erlenmeyer-kolber inneholdende 500 ml hver av Medium 7 inokuleres med 10 ml av kolbeinnholdet fra trinn A. Mediene inkuberes ved 28° C på en roterende rystemaskin ved 160 r/min med en 50 mm diameter sirkulær bane i 24 timer.

Trinn C

Til et 756 liters rustfritt stål-fermenteringskar inneholdende 467 liter av Medium 8 tilsettes 1 liter av hele fermenteringsmediet fra trinn B. Fermenteringskaret omrøres ved 28° C ved 130 r/min i 96 timer og under lufting med en luftstrøm på 283 l/min.

Medium 8

Ved utløpet av denne tid filtreres 15,5 liter av hele fermenteringsvæsken og myceliet inneholdende C-076 vaskes med vann. Det våte mycelium (2268 g) ekstraheres med 3 liter aceton under omrøring. Blandingen filtreres og filtratet inndampes til 1550 ml og innstilles på pH 4,0 med fortynnet saltsyre. Denne oppløsning ekstraheres tre ganger med like store volum kloroform. Kloroformekstraktene tørres ved filtrering gjennom tørr infusoriejord ("Super-Cel"), forenes og inndampes til tørrhet i vakuum. Den gjenværende olje av C-076 veier 5,12 g. 3,3 mg er fullt aktiv mot N.dubius i mus.

4,69 g av denne olje oppløses i 142 ml kloroform og kromatograferes på en kolonne inneholdende 90 g silicagel pakket i kloroform. Kolonnen utvikles med 1400 ml kloroform. Kolonnen elueres så med kloroform/ethanol (49:1) idet der oppsamles 145 fraksjoner hver på 5 ml. Deretter elueres kolonnen med kloroform/ethanol (19:1) idet fraksjonene 146 - 226 hver på 5 ml oppsamles. Fraksjonene 49 - 72 forenes og inndampes til tørrhet' hvilket gir 200 mg av en olje (A). Fraksjonene 79 - 184 forenes likeledes og inndampes hvorved man får 291 mg av en olje (B).

400 ug av hver fraksjon er fullt aktiv mot N.dubius i mus. Disse to fraksjoner (A og B) anlyseres hver for seg på silicagel-tynnskiktskromatografiske plater ("Quanta/Gram QIF" plater, til-

gjengelig fra Quanta/Gram Inc., Fairfield, New Jersey). Platene utvikles med kloroform/methanol (19:1). Løkkene analyseres på deres ultrafiolette aktivitet og en flekk av hver fraksjon har den karakteristiske ultrafiolette absorpsjon for C-076-forbindelsene (se tabell I). Fra fraksjon A har flekken med en Rf på 0,03 og fra fraksjon B har flekken med en Rf på 0,57 en slik absorpsjon. Disse flekker representerer C-076A-forbindelsene, henholdsvis C-076B-forbindelsene.

198 mg av oljen (A) ovenfor kromatograferes på 80 g silicagel pakket i kloroform under eluering med kloroform/methanol (199:1) inntil 520 ml er oppsamlet, fulgt av kloroform/methanol (99:1) idet der oppsamles fraksjoner hver på 10 ml. Fraksjonen fra 630 til 720 ml gir 30,4 mg; fraksjonen fra 730 til 950 ml gir 78,4 mg og fraksjonen fra 950 til 1040 ml gir 20 mg av et oljeaktig materiale. Fraksjoner 1 og 2 inneholdende C-076A-komponenter var, når de ble prøvet på mus mot N.dubius i mengder på 1,0, 0,5 og 0,25 mg, fullt aktive.

Eksempel 4

Trinn A

En 250 ml skovlet Erlenmeyer-kolbe inneholdende 50 ml av Medium 8 inokuleres med en frossen ampulle av Streptomyces avermitilis MA 4680. Kolben inkuberes ved 28° C på en roterende rystemaskin ved 160 r/min med en 50<*>mm diameter sirkulær bane i 24 timer. ;Trinn B ;En 2 liter skovlet Erlenmeyer-kolbe inneholdende 500 ml av Medium 8 inokuleres med 10 ml av kolbeinnholdet fra trinn A. Mediet inkuberes ved 28° C på en roterende rystemaskin ved 160 r/min med en 50 mm diameter sirkulær bane i 24 timer. ;Trinn C ;Til et 189 liter rustfritt fermenteringskar inneholdende 160 liter av Medium 9 tilsettes 500 ml av inoculum fra Trinn B. Fermenteringkaret inkuberes ved 28° C under omrøring ved 150 r/ min i 24 timer idet der luftes med en hastighet på 851/min. ;Medium 9 ;;Trinn D ;Til et 756 liter rustfritt stål-fermenteringskar inneholdende 467 liter av Medium 6 tilsettes 43 liter inoculum fra trinn C. Fermenteringskaret inkuberes ved 28° C under omrøring ved 130 r/min i 144 timer og under luftning med en luftstrømshas-tighet på 283 l/min. ;Trinn E ;Ved utløpet av denne tid filtreres hele fermenteringsvæsken og filterkaken inneholdende C-076 vaskes med vann. Filterkaken oppslemmes i 120 liter aceton i 30 minutter, filtreres og de faste stoffer vaskes med 30 liter aceton. Acetonvaskingene forenes og inndampes under nedsatt trykk til et volum på 40 liter. Konsentratet innstilles på pH 4,0 med fortynnet saltsyre. Konsentratet ekstraheres tre ganger med like store volum kloroform. Kloroformekstraktene tørres ved filtrering gjennom et lag tørr infusoriejord ("Super-Cel"). Ekstraktene føres gjennom "Super-Cel"-laget og forenes så. De forenede ekstrakter inndampes under nedsatt trykk til et volum på 4 liter. Kloroformkonsentratet filtreres og føres gjennom en kolonne av 2,4 kg silicagel i kloroform. Kolonnen elueres med kloroform idet der oppsamles 3,5 liter fraksjoner. Kolonnen elueres så med kloroform/methanol (49:1) idet der oppsamles ytterligere åtte 3,5 liters fraksjoner (fraksjoner 9 - 16). Fraksjon nr. 3 inndampes til tørrhet hvilket gir 76 g av et oljeaktig materiale inneholdende en overveiende del av C-076-materialene. 97 % av dette materiale oppløses i 685 ml methylenklorid og kromatograferes gjennom 800 g kiselsyre (Mallinckrodt Chemical Co. 100 mesh siktet igjen gjennom en 80 mesh sikt). Kolonnen (7,62 cm diameter, 36 cm lang) utvikles med methylenklorid/benzen (7:3), ca. 7,5 1, fulgt av 5 % isopropanol i methylenklorid/benzen (7:3), 2,25 1. Fraksjonen eluert med 5 % isopropanol i methylenklorid/benzen, som inneholder et sterkt farvet bånd, inneholder praktisk talt alt C-076-materialet, bestemt ved tynnskiktskromatografi (som beskrevet i eksempel 5). Denne fraksjon (500 ml) inndampes og rekromatograferes på 105 g kiselsyre (kolonne 3,7 cm diameter, 18 cm lengde) i methylenklorid. Kolonnen utvikles med 100 ml porsjoner methylenklorid inneholdende 5, 10 og 20 % ether. Videre eluering med 20 % ether i methylenklorid gir to farvede bånd. Fraksjonene mellom de to bånd inneholdt praktisk talt alt av C-076-materialet bestemt ved tynnskiktskromatografi. ;Den C-076-inneholdende fraksjon kromatograferes på 59 ;g kiselsyre (kolonne 3,7 cm diameter, 11 cm lang) i methylenklorid. Kolonnen utvikles med 10 % ether i methylenklorid. Etter at det første materiale begynner å elueres, taes en fraksjon på 70 ml fulgt av 26 fraksjoner hver på 5 - 6 ml. Fraksjoner 3 - 26 forenes, hvilket gir 1,35 g materiale, og analyseres ved tynn-skiktskromatograf i (silicagelplater-"Analtech GF 254", utviklet med 5 % isopropanol i methylenklorid). Materialet med en Rf på 0,28 i dette system er C-076 Al. ;Kolonnen elueres så med 20 % ether i methylenklorid (200 ml) fulgt av 50 % ether i methylenklorid (800 ml). En liten mengde C-076 Al/A2-blanding elueres fulgt av alt C-076 A2. Det totale residuum av C-076 A2-fraksjonen er 800 mg. ;Videre eluering med 5 % isopropanol i methylenklorid ga C-076 Bl (135 mg). Separasjonen følges ved å iaktta den ultrafiolette absorpsjon av elueringsavløpet. C-076 Bl og A2 har meget like Rf-verdier på silicagel-tynnskiktskromatografi-plater ("Analtech GF 254") i 5 % isopropanol i methylenklorid. De to komponenter er imidlertid klart synlige på de samme plater utviklet med 15 % isopropanol i hexan. ;Hele C-076 Al-fraksjonen påføres på 14 silicagelplater ;("Analtech HF 254, 20x20 cm 500 ym tykke). Platene utvikles i 10 % isopropanol i hexan. Båndet inneholdende C-076 Al fjernes fra platene, ekstraheres med ether, inndampes og påføres igjen på ytterligere seks plater og utvikles fem ganger med 5 % isopropanol i hexan. C-076 Al fjernes fra platene og kromatograferes igjen, utvikles med ren ether hvilket gir 2 70 mg av i det vesentlige rent C-076 Al. De infrarøde og kjernemagnetiske resonansspektra for denne prøve er angitt som fig. 1 og 5 og henholdsvis Tabell II. C-076 A2-fraksjonen kromatograferes på ti silicagelplater ("Analtech HF 254") og utvikles fem ganger med 15% isopropanol i hexan hvilket gir 265 mg av i det vesentlige rent C-076 A2. De infrarøde og kjernemagnetiske resonansspektra for denne prøve er gjengitt i fig. 2, henholdsvis 6, og tabell II. C-076 Bl-fraksjonen kromatograferes på to plater (som ovenfor) i 15 % isopropanol i hexan hvilket gir 55 mg i det vesentlige rent C-076 Bl. Det kjernemagnetiske resonansspektrum for denne prøve er gjengitt i fig. 7, og tabell II. ;Eksempel 5 ;Fermenteringen beskrevet i eksempel 6 ble gjentatt to ganger og hele fermenteringsvæsken ble forenet. Fermenteringsvæsken ble opparbeidet som beskrevet i eksempel 6 idet der ble utvunnet 3,3 1 av et første kloroformekstrakt som inneholdt 60 mg/ml totalt faststoff og ble bestemt til å ha 0,5 % C-076 ved tynnskiktskromatografisk analyse. 3 liter av denne kloroformoppløsning ble kromatografert på 2400 g silicagel ("Davidson Grade 62") pakket i kloroform. Kolonnen (9,5 x 122 cm) ble utviklet med 8 x 3800 ml kloroform (fraksjoner 1-8) fulgt av 8 x 3000 ml porsjoner kloroform/methanol (49:1 fraksjoner 9 - 16). De individuelle fraksjoner ble analysert ved tynnskiktskromatografi (silicagelplater, "Quanta/Gram QIF") utviklet med kloroform/methanol 19:1. Fraksjoner 9-11, 12 - 13 og 14 ble hver inndampet til tørrhet hvilket ga 6,63 g faststoff inneholdende C-076 A-komponentene i fraksjoner 9 - 11, 24,91 g faststoff inneholdende C-076 B-komponenter i fraksjoner 12 - 13, og 4,71 g faststoff også inneholdende C-076 B-komponentene i fraksjon 14. ;Materialet fra fraksjonene 12 - 14 forenes (29,62 g), oppløses i 100 ml methylenklorid og kromatograferes på 400 g ;silicagel ("Davidson Grade 62") i methylenklorid. Kolonnen elueres med 1500 ml-methylenklorid/2-propanol (99:1); 1500 ml methylenklorid/2-propanol (49:1); 2000 ml methylenklorid/2-pro-panol (19:1); og 1000 ml methylenklorid/2-propanol (9:1). Elu-entvolumene mellom 5500 - 6000 ml (2,56 g) og 6000 - 6500 ml (5,03 g) ble forenet i 25 ml methylenklorid og kromatografert på 60 g silicagel i hexan. Et forløp på 70 ml hexan og 100 ml ;hexan/diethylether (4:1) ble oppfanget og kolonnen ble så utviklet med 600 ml hexan/diethylether (1:4) idet der ble oppfanget 200 ml porsjoner, og tilslutt ble der eluert med 700 ml ether idet der ble oppfanget 100 ml porsjoner. Kolonneeluentvolumene fra 400 til 600 ml ga 2,035 g faststoff inneholdende C-076 Bl-komponenter; volumene 600 - 1100 inneholdt 0,881 g faststoff inneholdende blandede C-076 Bl/B2-komponenter; og volumene 1100 - 1500 ml inneholdt 0,381 g faststoff inneholdende C-076 B2-komponenter. ;De blandede C-076 Bl/B2-komponenter ble så oppløst i 4,2 ml methylalkohol/vann (4:1) og kromatografert på "C18 Porasil" ("Bondapak-37-75" mikron størrelse) i det samme oppløs-ningsmiddel. Reversfase-høytrykkskolonne (mere polare forbindelser eluert først) er 1,2 m x 16 mm, og elueres med en hastighet, på 800 ml pr. time under oppfangning av 21,3 ml fraksjoner. Nærværet av C-076-komponenter ble fulgt ved observasjon av den ultrafiolette absorpsjon av fraksjonene. C-076 B2 ble utvunnet i fraksjoner 24 til 37, og C-076 Bl ble utvunnet i fraksjoner 51 - 70 under gjenvinnelse av 195,4 mg C-076 B2 og 137 mg C-076 Bl. ;Hver prøve ble så separat kromatografert på 4 g kolonner silicagel ("Davidson Grade 62") i methylenklorid. Kolonnene ble eluert med 35 ml methylenklorid/methanol (9:1). De siste 20 ml eluent fra hver kolonne ble oppsamlet og inndampet til tørrhet hvilket ga 155,3 mg C-076 B2 og 90 mg C-076 Bl. ;Derpå ble 50 mg C-076 Bl og 100 mg C-076 B2 kromato-graf ert på preparative silicagelplater ("Analtech HF 254"), utviklet med 12 % isopropanol i hexan fulgt av utvikling med ether, idet der ble utvunnet C-076 Bl og C-076 B2 som var praktisk talt rent. Det infrarøde absorpsjonsspektrum av det således utvundne C-076 Bl og B2 er som vist i fig. 3, henholdsvis 4. Det kjernemagnetiske spektrum for det således utvundne C-076 B2 er vist i fig. 8. ;Eksempel 6 ;En 250 ml skovlet Erlenmeyer-kolbe inneholdende 50 ml av følgende medium: ;ble inokulert med innholdet av en frossen ampulle av Streptomy-des avermitilis MA 4848 og inkubert på en roterende ryster ved 28° C i 24 timer ved 150 r/min. 10 ml av det ovennevnte fermenteringsmedium ble anvendt til å inokulere 500 ml av det samme medium som ovenfor i en 2 liter skovlet Erlenmeyer-kolbe. Fermenteringsmediet ble inkubert ved 150 r/min på en roterende ryster ved 28° C i 24 timer. ;Alle de foregående medier anvendes til å inokulere 467 liter av det følgende medium i et 756 liter rustfritt stål-fermenteringskar: ;Fermenteringsmediet ble inkubert ved 28° C i 40 timer med en luftstrøm på 283 l/min og en omrøringshastighet på 130 * r/min.

230 liter av ovenstående medium ble anvendt til å inokulere 4310 liter av det følgende medium i et 5670 liter rustfritt stål-fermenteringskar:

Fermenteringen fortsettes i 144 timer ved 26° C med en luftstrøm-ningshastighet på 1538 l/min og en omrøring på 120 r/min.

Fermenteringsmediet ble filtrert og mycelie-filterkaken ble vasket med ca. 550 liter vann, og filtratet og vaskingene ble kastet. Filterkaken ble omrørt med ca. 1500 liter aceton i ca. 1 time og filtrert. Filterkaken ble vasket med en blanding av ca. 150 liter aceton og 4 0 liter avionisert vann hvilket ga ca. 2000 liter ekstrakt.

Den foregående fermentering og ekstraksjon ble gjentatt på samme skala hvilket ga ytterligere 2000 liter aceton-ekstrakt som ble forenet med det første ekstrakt og inndampet til et volum på ca. 800 liter. pH av konsentratet ble innstilt på ca. 4,7 med konsentrert saltsyre og forenet med ca. 800 liter methylenklorid. De forenede oppløsningsmidler ble omrørt i ca. 4 timer og skilt. Det vandige skikt ble forenet med ytterligere 800 liter methylenklorid og omrørt i ca. 4 timer. Skiktene ble skilt og hvert methylenkloridekstrakt ble separat behandlet med ca. 10 kg "Super-Cel" og filtrert. Begge ekstrakter ble inndampet til et forenet volum på ca. 60 liter.

Eksempel 7

Den 60 liter oppløsning av C-076 i methylenklorid fra det foregående eksempel ble inndampet til tørrhet i vakuum og residuet ble forenet tre ganger med 60 liter porsjoner methanol og inndampet til tørrhet for å fjerne eventuelt gjenværende methylenklorid. Det endelige methanolkonsentratvolum var ca.

36 liter. Methanoloppløsningen ble oppbevart over natten og filtrert. Filterkaken ble vasket med 40 liter frisk methanol og methanolfiltratene og vaskinger ble forenet. Methanoloppløs-ningen ble forenet med 95 liter ethylenglycol og 130 liter hep-tan. Den 2-skikts oppløsning ble omrørt i 5 minutter og det undre skikt (ethylenglycol og methanol) ble fraskilt. Heptan-oppløsningen ble vasket med en blanding av 20 liter ethylenglycol og 6,3 liter methanol. Etter 5 minutters omrøring fraskil-

a

les det undre skikt og kombineres med det første ethylenglycol/ methanolekstrakt. Et like stort volum vann (ca. 150 liter) inneholdende 79 g salt pr. liter ble tilsatt til ethylenglycol/ methanolekstraktene. Denne oppløsning ble ekstrahert med 150 liter ethylether under omrøring i 5 minutter. Etherskiktet ble vasket med 75 liter vann (1/2 volum) og omrørt i 5 minutter og lagene skilt. Denne prosess ble gjentatt ytterligere to ganger (det siste vann inneholdt 20 g salt pr. liter) hvilket ga et endelig etherskiktvolum på 110 liter. Etherskiktet ble inndampet i vakuum til et minimalt volum, idet temperaturen ble holdt under 25° C. 40 liter methylenklorid ble tilsatt til residuet og opp-løsningen ble inndampet til tørrhet. Denne prosess ble gjentatt og det endelige residuum inndampet i vakuum ved 50° C til tørrhet.

Eksempel 8

En 3 0 cm diameter kolonne ble fremstilt med et lag av 34 kg aktivert aluminiumoxyd fulgt av et lag av 34 kg aktivert carbon i en oppløsning av methylenklorid. Residuet fra det foregående eksempel ble oppløst i methylenklorid til et volum på 34 liter og påført på kolonnen og eluert med 34 liter methylenklorid. Disse fraksjoner ble kastet. En 3 % oppløsning av isopropanol og methylenklorid (20,8 liter isopropanol og 660 liter methylenklorid) ble påført på kolonnen og eluert i ca. 200 liter fraksjoner. De forenede isopropanol og methylenkloridfraksjoner ble inndampet i vakuum ved en badtemperatur på ca. 60° C til et volum på ca. 20 liter. Badtemperaturen ble redusert til ca. 4 5° C og ekstraktet ble inndampet til tørrhet i vakuum. Residuet ble oppløst i 10 deler methylenklorid, 10 deler hexan og 1 del methanol til et sluttvolum på 15 liter. Denne oppløsning ble påført direkte på "Sephadex LH-20"-kolonnen i neste eksempel.

Eksempel 9

En 3 0 cm diameter kolonne ble fremstilt i methanol med 36 kg "Sephadex LH-20" (tilgjengelig fra Pharmacia Fine Chemi-cals, 800 Centennial Avenue, Piscataway, New Jersey 08854) og vasket med et oppløsningsmiddel bestående av 10 deler methylenklorid, 10 deler hexan og 1 del methanol. En fjerdedel av C-076-oppløsningen fra eksempel 10 ble påført på kolonnen og kolonnen ble eluert med en hastighet på 250 ml pr. minutt. To stykker 20 liter forløp ble oppsamlet og kastet, fulgt av tyve 2 liters rike fraksjoner (identifisert som fraksjoner 1 - 20), fulgt av en enkelt 20 liters endefraksjon, som ble kastet. Fraksjoner 1-8 viste seg å inneholde C-076 A-forbindelsene og fraksjonene 9-20 viste seg å inneholde C-076 B-forbindelsene.

Eksempel 10

Fremgangsmåten i eksempel 9 ble gjentatt i samme målestokk ytterligere tre ganger og alle fraksjoner inneholdende C- 076 B-komponentene (fraksjoner 9-20) ble forenet og inndampet til tørrhet hvilket ga 818 g rå blandede C-076 B-komponenter. Prøven viste seg å inneholde 55 % C-076 Bl og 39 % C-076 B2. 680,5 g av denne prøve ble oppløst i 2 liter methylenklorid og anbragt i en 22 liter trehalset rundkolbe fulgt av tilsetning av 13,6 liter methanol. Methylenkloridet ble fjernet ved destilla-sjon. 13,6 liter ethylenglycol ble tilsatt ettersom methanolen ble avdestillert under nedsatt trykk. Destillasjonshastigheten ble opprettholdt slik at temperaturen av oppløsningen ikke gikk under 65° C. Da tilsetningen av ethylenglycolen var fullstendig, fikk oppløsningen lov til å avkjøles ved 5° C i 16 timer. Krystallene ble frafiltrert og vasket med 1 liter kold ethylenglycol. Krystallene ble så igjen oppløst i 2 liter methylenklorid, og oppløsningen ble anbragt i en 22 liter trehalset rundkolbe. Prosessen beskrevet ovenfor ble gjentatt to ganger. Den første gang ble der anvendt 12,5 liter av hver av methanol og ethylenglycol, og den annen gang 13,6 liter av hver av methanol og ethylenglycol. De endelige krystaller ble vasket med 1 liter kold ethylenglycol og 1 liter vann. Krystallene ble oppløst, i 4 liter vann og tørret ved filtrering gjennom natriumsulfat. Ben-zenoppløsningen ble inndampet til et volum på 2 liter og lyofilisert hvilket ga 241,2 g av et hvitt pulver bestående av 98 % C-076 Bl og 1 % C-076 B2.

Morlutene (22 liter) fra de første to krystallisasjo-ner ovenfor ble forenet og fortynnet med 22 liter vann. Den vandige oppløsning ble ekstrahert med 60 liter toluen og igjen med 15 liter toluen. Toluenekstraktet ble så vasket med 48 liter vann. Den organiske fase ble filtrert gjennom "Super-Cel" for å fjerne eventuelt gjenværende vann og ble så inndampet hvilket ga 336 g fast materiale bestående av 79 % C-076 B2 og 16% C-076 Bl-forbindelser.

Eksempel 11

I de fire "Sephadex LH-20"-kolonner i fremgangsmåten i eksempel 11 inneholder fraksjoner 1-8 C-076 A-forbindelsene og forenes. Ved HPLC-analyse viste blandingen seg å inneholde 252 g C-076 A2a, 16 g A2b, 94 g Ala og 24 g Alb. Materialet ble opp-løst i et oppløsningsmiddelsystem bestående av hexan:toluen: methanol i forholdet 6:1:1 og ble påført på "Sephadex LH-20"-kolonnen av de samme dimensjoner som dem som ble anvendt i eksempel 11, i ovenstående oppløsningsmiddel. Fraksjoner ble oppsamlet med en hastighet på 250 ml/min og et 20 liter forløp ble oppsamlet og kastet. Videre eluering ga ytterligere to 20 liters forløp som også ble kastet og femti 4 liters rike fraksjoner som inneholdt C-076 A-forbindelser. Fraksjoner 3-8 viste seg å inneholde overveiende C-076 Al-komponenter (40,2 g Ala og 6,7 g Alb), og fraksjoner 29 - 36 viste seg å inneholde C-076 A2-forbindelser (117,2 g, A2a og 7,35 g A2b). Fraksjoner 9-28 inneholdt en blanding av C-076 Al og A2-forbindelser.

Eksempel 12

En prøve på 150 g av C-076 Bl fra eksempel 12 ble opp-løst i 3 liter av en oppløsningsmiddelblanding av hexan:toluen: methanol i forholdet 3:1:1. Oppløsningen ble ført gjennom en kolonne av "Sephadex LH-20" (av samme dimensjoner som dem som ble anvendt i eksempel 9) i ovenstående oppløsningsmiddel, idet der ble tatt fraksjoner med en hastighet på 250 ml pr. minutt. Etter at to 20 liters porsjoner av oppløsningsmiddelblandingen var oppsamlet og kastet, ble forløp på 10 liter tatt og kastet. Derpå ble tredve rike fraksjoner hver på 2 liter tatt. Fraksjoner 1 - 13 og 25 - 30 ble kastet. Fraksjoner 14 - 16 ble forenet og inneholdt 80 g av overveiende C-076 Bla. Fraksjoner 22 - 24 ble forenet og inneholdt 6,7 g av overveiende C-076 Blb. Fraksjoner 17 - 21 inneholdt en blanding av C-076 Bla og Blb.

Fraksjoner 17 - 21 ovenfor ble forenet og inndampet

og ført gjennom en "Sephadex LH-20"-kolonne med det samme opp-

løsningsmiddelsystem som ovenfor. Tre 20 liters forløp ble tatt og kastet. Rike fraksjoner ble så tatt som følger: fem fraksjoner hver på 2 liter (fraksjoner 1-5); tyve fraksjoner hver på 1 liter (fraksjoner 6 - 25); og ti fraksjoner hver på 2 liter (fraksjoner 26 - 35). Fraksjoner 1-15 ble kastet; fraksjoner 16 - 21 inneholdt 13,5 g C-076 Bla og 0,4 g C-076 Blb; fraksjoner 22 - 26 inneholdt 44 g C-076 Bla og 0,13 g C-076 Blb; fraksjoner 27 - 30 inneholdt 10,2 g C-076 Bla og 0,8 g C-076 Blb.

Eksempel 13

En blanding av alle åtte C-076-komponenter ble kromatografert på en høytrykks-væskekromatografisk kolonne 4 mm x 30 cm pakket med 10 ym "Bondapak C^g" silicagel (tilgjengelig fra Waters Associates Inc., Maple Street, Milford, Massachusetts 01757) under eluering med 85:15 volumforhold methanol:vann ved en konstant temperatur på 40° C. Ved en strømningshastighet på 1,2 ml pr. minutt ble alle åtte forbindelser adskilt og eluerings-volumene, som under de foregående konstante betingelser er karakteristiske for de individuelle forbindelser, er som følger:

Adskillelsen av C-076 "b"-komponentene fra de respektive "a"-komponenter utføres ved anvendelse av metoder som høy-trykks-væskekromatograf i . En absolutt methanoloppløsning av 30 yl av en blanding av C-076 Ala og Alb, beregnet å inneholde 30 yg C-076 Alb anbringes på en 3 x 250 mm høytrykks-væskekromato-grafisk kolonne inneholdende "Spherisorb 5 micron ODS" (tilgjengelig fra Spectra Physics) som pakning. Kolonnen elueres med 85:15 methanol-vann med en hastighet på 0,15 ml/min. Elueringen av produktene følges ved å gjenta den ultrafiolette absorpsjon av eluenten og oppsamle de individuelle komponenter ved utløpet av UV-monitoren. 30 yg C-076 Alb utvinnes og analyseres i et massespektrometer. Massespektrumet for denne prøve er angitt i den annen kolonne av tabell III.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av C-076 med følgende planstrukturformel:

hvor R er a-L-oleandrosyl-a-L-oleandrosidet med formelen:

og hvor den stiplede linje indikerer en enkelt- eller en dobbel-binding; R^ er hydroxy og er tilstede bare når den stiplede linje indikerer en enkeltbinding; 1*2 er isopropyl eller sek-butyl; og

er methoxy eller hydroxy,

karakterisert ved at en stamme av Streptomyces avermitilis dyrkes under aerobe betingelser i et vandig næringsmedium inneholdende en assimilerbar kilde til carbon, en assimilerbar kilde til nitrogen og uorganiske salter hvorefter C-076 utvinnes fra fermenteringsvæsken.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,

karakterisert ved at der som C-076-produserende stamme anvendes Streptomyces avermitilis NRRL 8165 (ATCC 31267).