CH639422A5 - Process for the preparation of novel compounds C-076 - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen C-076 durch Fermentation eines früher noch nicht beschriebenen Mikroorganismus Streptomyces avermitilis in einem Nährmedium. Die neuen Verbindungen können durch Lösungsmittelextraktions- und chromatographische Fraktionierverfahren isoliert werden. Die Verbindungen, die mit ihrem Genericnamen als C-076 bezeichnet werden, besitzen eine ausgeprägte, parasitenvernichtende Aktivität. Die Verbindungen können in Form von Zubereitungen für die orale oder parenterale Verabreichung an Lebewesen für die Prophylaxe und Heilung parasitischer Infektionen verwendet werden.

Erfmdungsgemäss wird eine Klasse von Verbindungen, die mit dem Gattungsnamen C-076 bezeichnet werden, durch Züchten von in der Vergangenheit noch nicht beschriebenen Stämmen von Mikroorganismen bei kontrollierten Bedingungen hergestellt. Mindestens acht individuelle, aber engverwandte, neue Verbindungen wereden von Streptomyces avermitilis gebildet. Sie werden als C-076 Ala, Alb, A2a, A2b,

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Bla, Blb, B2a und B2b bezeichnet. Alle besitzen eine ausgeprägte antiparasitische Aktivität. Sie können durch Fermentation und Isolierung in im wesentlichen reiner Form, wie im folgenden beschrieben, hergestellt werden.

Aufgrund taxonomischer Untersuchungen wurde festge- 5 stellt, dass die Mikroorganismen, die diese C-076-Verbindun-gen bilden können, ein neues Species des Genus Streptomyces sind, das als Streptomyces avermitilis bezeichnet wird. Eine solche Kultur, die aus Boden isoliert wurde, wird als MA-4680 in der Kultursammlung von Merck & Co., Inc. 10 Rahway, New Jersey, bezeichnet. Eine C-076 liefernde Probe dieser Kultur wurde ebenfalls in der Kultursammlung der Fermentation Section of the Northern Utilization Research Branch, U.S. Department of Agriculture at Peoria, Illinois, am 5. April 1976 hinterlegt und hat die Hinterlegungsnum- 15 mer NRRL 8165 erhalten. Eine Probe von NRRL 8165 wurde ebenfalls ohne Beschränkung hinsichtlich der Freigabe in der Kultursammlung von American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 am 7. Februar 1977 hinterlegt und mit der Hinterlegungsnummer 20 ATCC 31 267 bezeichnet.

Die morphologischen und kulturellen Eigenschaften von Streptomyces avermitilis werden im folgenden aufgeführt.

Morphologie: 25

Die Sporenträger bilden Spiralen als Seitenzweige auf Luftmyzelien. Die Spiralen sind kompakt, werden aber beim Älterwerden der Kultur offener. Die Sporen liegen in Ketten von mehr als 15 Sporen vor und sind im allgemeinen kugelförmig bis oval bei einer 970fachen Vergrösserung. Die Spo- 30 renbildung beobachtet man auf Hafermehlagar, Glycerin-As-paraginagar, Agar aus Salzen und Stärke und Eialbuminagar. Die Sporenoberfläche ist, betrachtet durch ein Elektronenmikroskop, glatt.

Agar aus Hefeextrakt-Malzextrakt Vegetatives Wachstum: umgekehrt - dunkelbraun Luftmyzelium: mässig, bräunlichweiss lösliches Pigment: braun.

Agar aus Pepton-Eisen-Heffextrakt Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmyzelium: keins lösliches Pigment: dunkelbraun bis schwarz Melanin: positiv H2S-Bildung: positiv.

Nähragar

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: spärlich, gräulich lösliches Pigment: hellbraun.

Nährstärkeagar

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: spärlich, gräulichweiss lösliches Pigment: hellbraun Hydrolyse der Stärke: gut.

Kartoffelstempel

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: braun, gemischt mit gräulichweiss lösliches Pigment: gräulichbraun.

Loeffler's Blutserum

Vegetatives Wachstum: gräulich-dunkelgelb Luftmyzelium: keines lösliches Pigment: geringes Braunwerden des Mediums Schmelzen: keins.

Hafermehlagar

Vegetatives Wachstum: umgekehrt - sehr dunkelbraun Luftmyzelium: pulverartig, bräunlich-grau(41i)xx, gemischt mit weiss lösliches Pigment: braun.

Czapek Dox Agar (Saccharosenitratagar)

Vegetatives Wachstum: schlecht, farblos

Luftmyzelium: knapp, gräulich lösliches Pigment: hellgräulich-dunkelgelb.

Eialbuminagar

Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: mässig, hellgräulich-gelb-braun (3ge)xx, gemischt mit weiss lösliches Pigment: hellgelblich-dunkelgelb.

Glycerin-Asparaginagar

Vegetatives Wachstum: umgekehrt - gelblichbraun Luftmyzelium: pulverartig, bräunlichgrau (41i)xx, vermischt mit weiss lösliches Pigment: hell, gelblichbraun.

Agar aus anorganischen Salzen und Stärken Vegetatives Wachstum: umgekehrt - gräulich-gelb-lichbraun

Luftmyzelium: pulverartig, hellbräunlichgrau (4ig)x\ gesäumt mit dunklerem bräunlichem grau (41i)xx lösliches Pigment: hellgelblichbraun.

Agar aus Hefeextrakt-Dextrose und Salzen 65

Vegetatives Wachstum: umgekehrt-dunkelbraun Luftmyzelium: mässig, bräunlichweiss lösliches Pigment: braun.

35 Tyrosinnähragar

Vegetatives Wachstum: umgekehrt - dunkelbraun bis schwarz

Luftmyzelium: spärlich, gräulich lösliches Pigment: dunkelbraun 40 Zersetzung von Tyrosin: nein.

Kohlenstoffverwendung

Pridham-Gottlieb-Grundmedium +1 % Kohlenstoffquelle; + = Wachstum; kein Wachstum, verglichen mit ne-45 gativer Kontrolle (keine Kohlenstoffquelle)

Glucose +

Arabinose +

Cellulose —

50 Fructose +

Inosit +

Lactose +

Maltose +

Mannit +

55 Mannose +

Raffmose +

Rhamnose +

Saccharose +

Xylose +

Gelatinenähragar Vegetatives Wachstum: dunkelgelb Luftmyzelium: spärlich, gräulichweiss lösliches Pigment: hellbraun Verflüssigung von Gelatine: gut.

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Gelatinestiche

Vegetatives Wachstum: brauner Ring Luftmyzelium: keins lösliches Pigment: grünlichbraun Verflüssigung von Gelatine: vollständig.

Magermilchagar

Vegetatives Wachstum: dunkelbraun Luftmyzelium: keins lösliches Pigment: dunkelbraun Hydrolyse von Casein: gut.

Lackmusmilch

Vegetatives Wachstum: dunkelbrauner Wachstumsring Luftmyzelium: keines Farbe: dunkelbraun

Koagulation und/oder Peptonisierung: vollständige Pep-tonisierung; Alkalischwerden (pH 8,1).

Magermilch

Vegetatives Wachstum: dunkelbrauner Wachstumsring Luftmyzelium: keines lösliches Pigment: dunkelbraun

Koagulation und/oder Peptonisierung: vollständige Peptonisierung; Alkalischwerden (pH 8,0).

Temperaturbereich: (Agar aus Hefeextrakt-Destrose-+ Salzen)

28 °C - gutes vegetatives Wachstum und Luftmyzelium 37 °C - gutes vegetatives Wachstum und Luftmyzelium 50 °C - kein Wachstum.

Sauerstoffbedarf: (Stichkultur in Agar aus Hefeextrakt, Destrose und Salzen) aerob.

Alle Ablesungen erfolgten nach 3 Wochen bei 28 °C, sofern nicht anders angegeben. Der pH-Wert aller Medien ist ungefähr neutral (6,8 bis 7,2).

Die Farbzahlbezeichnungen (xx) wurden aus dem Color Harmony Manual, 1958,4. Edition Container Corporation of America, Chicago, Illinois, entnommen.

Ein sorgfältiger Vergleich der zuvor aufgeführten Ergebnisse mit den publizierten Beschreibungen einschliesslich Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Eighth Edition) bekannter Mikroorganismen zeigt wesentliche Unterschiede, was andeutet, dass der angemeldete Mikroorganismus als neue Species klassifiziert werden kann. Aufgrund dieser Annahme wurde er als Streptomyces avermitilis bezeichnet.

Die obige Beschreibung ist eine Erläuterung für einen Stamm von Streptomyces avermitilis, der bei der Herstellung der neuen C-076-Verbindungen verwendet wird. Im erfin-dungsgemässen Verfahren können weiterhin Mutanten des oben beschriebenen Mikroorganismus eingesetzt werden. Beispielsweise werden solche C-076 liefernde Mutanten, die durch natürliche Auswahl erhalten werden, oder solche, die durch Mutationsmittel einschliesslich Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Stickstofflost oder ähnliche Behandlungen erhalten werden, im erfindungsgemässen Verfahren verwendet.

Ein Beispiel eines solchen Organismus ist ein Stamm von Streptomyces avermitilis MA 4848, der nach Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von Streptomyces avermitilis MA 4680 isoliert wurde. Ein lyophilisiertes Rohr und eine gefrorene Ampulle dieser Kultur wurden in der permanenten Kultursammlung der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 31272 bzw. 31271. Unter Verwendung dieses gefrorenen Stocks bzw. Materials als Inokulum werden etwas höhere Fermentationsausbeuten an C-076 erhalten.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen C-076 erzeugenden Stamm von Streptomyces avermitilis in einem wässrigen, eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, eine assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische 5 Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen fermentiert und C-076 aus der Fermentationsbrühe gewinnt.

Bei dem erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von C-076 können solche wässrige Medien verwendet werden, wie sie normalerweise für die Herstellung vieler antibiotischer io Substanzen eingesetzt werden.

Solche Nährmedien bzw. -böden enthalten Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, die von dem Mikroorganismus assimilierbar sind, und im allgemeinen niedrige Gehalte an anorganischen Salzen. Zusätzlich können die Fermentations-15 medien Spuren an Metallen enthalten, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich sind. Diese sind normalerweise in ausreichender Konzentration in den komplexen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen vorhanden, die als Nährquellen verwendet werden. Sie können natürlich auch gegebe-2o nenfalls getrennt zu dem Medium zugegeben werden.

Im allgemeinen sind Kohlenhydrate, wie Zucker, z.B. Dextrose, Saccharose, Maltose, Lactose, Dextran, Cerelose u.a., und Stärken geeignete Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff im Nährmedium. In dem Medium wird die genaue 25 Menge der Kohlenstoffquelle, die verwendet wird, teilweise von den anderen Bestandteilen des Mediums abhängen. Es wurde jedoch im allgemeinen gefunden, dass eine Menge an Kohlenhydrat zwischen 0,5 und 5 Gew.-%, bezogen auf das Medium, ausreichend ist. Diese Kohlenstoffquellen können 30 einzeln verwendet werden oder mehrere solcher Kohlenstoffquellen können im gleichen Medium gemeinsam verwendet werden.

Verschiedene Stickstoffquellen, wie Hefehydrolysate, He-feautoysate, Sojabohnenmehl, Caseinhydrolysate, Hefeex-35 trakte, Maiseinweichflüssigkeiten, Schlempe bzw. lösliche Stoffe aus der Branntweinerzeugung, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt u.ä., sind leicht von Streptomyces avermitilis bei der Herstellung von C-076-Verbindungen assimilierbar. Die verschiedenen Stickstoffquellen können allein oder im 4o Gemisch in Mengen im Bereich von 0,2 bis 6 Gew.-%, bezogen auf das Medium, verwendet werden.

Als anorganische Nährsalze können in den Kulturmedien die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Carbonat-45 und ähnliche Ionen ergeben, verwendet werden. Weiterhin können Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan, Eisen u.ä., verwendet werden.

Die hier und in den Beispielen beschriebenen Medien sind nur Beispiele für die grosse Vielzahl von Medien, die verwen-50 det werden können.

Im folgenden werden einige Beispiele von Medien aufgeführt, die zum Züchten der Stämme von Streptomyces avermitilis zur Herstellung der C-076-Verbindungen geeignet sind.

55

Medium A Maismehl

Schlempe bzw. lösliche Stoffe von der Branntweinerzeugung 60 Sojabohnenmehl Natriumeitrat CaCl22H20 Polyglykol P2000 MgS04 • 7H20 65 CoCli • 6H20 FeSÖ4 • 7H20 destilliertes Wasser pH 6,5

20,0 g 10,0 g

15,0 g 4,0 g 0,5 g 2,5 ml 0,1g 0,01g 0,01g 1000 ml

5

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Medium B

lösliche Stärke 20,0 g

Maiseinweichflüssigkeit 15,0 g

Cerelose 5,0 g

Sojabohnenmehl 4,0 g

(NH4)2S04 4,0 g

Maismehl 1,0 g

Sojabohnenöl 2,5 ml

KH2P04 0,3 g

CaC03 6,0 g destilliertes Wasser 1000 ml pH 6,7

Medium C '

Tomatenpaste bzw. -mark 40,0 g

Hafermehl 15,0 g destilliertes Wasser 1000 ml pH 6,0

Medium D

Hafermehl 20,0 g

Tomatenpaste bzw.-mark 20,0 g destilliertes Wasser 1000 ml pH 5,5

Medium E

Dextrose 10,0 g Pepton (erhältlich von Difco

Laboratories, Detroit, Michigan) 5,0 g Hefeautolysat (erhältlich als Ardamine pH von Yeast Products Inc.,

Paterson, New Jersey) 3,0 g

NaCl 12,7 g

KCl 0 72

FeS04(NH4)oS04 • 6H,0 0^035 g

MgCli • 6H->Ö 5,32 g

CaCl2 ■ 2H2Ö 0,73 g destilliertes Wasser 1000 ml pH 7,4

Die Fermentation bei der Verwendung von C-076 liefernden Mikroorganismen kann bei Temperaturen im Bereich von 20 bis etwa 40 °C duchgeführt werden. Für optimale Ergebnisse ist es am zweckdienlichsten, diese Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von 24 bis 30 °C durchzuführen. Temperaturen von 27 bis 28 °C sind am meisten bevorzugt. Der pH-Wert des Nährmediums, der für die Herstellung der C-076-Verbindungen geeignet ist, kann von 5,0 bis 9,0 variieren. Ein bevorzugter Bereich beträgt 6,0 bis 7,5.

Fermentationen im kleinen Massstab werden zweckdienlich durchgeführt, indem man geeignete Mengen an Nährmedium in einen Kolben unter Verwendung bekannter Sterilisationsverfahren gibt, den Kolben entweder mit Sporen oder vegetativem, cellulärem, gewachsenem Material eines C-076 erzeugenden Stamms von Streptomyces avermitilis inokuliert, die Kolbenhälse lose mit Baumwolle verschliesst und die Fermentation in einem Raum mit konstanter Temperatur von etwa 28 °C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung während 3 bis 10 Tagen ablaufen lässt. Beim Arbeiten in grösserem Massstab ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, die mit einer Rührvorrichtung und Einrichtungen zum Belüften des Fermentationsmediums ausgerüstet sind. Das Nährmedium wird gewöhnlich in dem Tank zubereitet und nach der Sterilisation mit einer geeigneten Quelle an vegetativem, zellulärem Wachstum von einem C-076 liefernden Stamm von Streptomyces avermitilis inokuliert. Die Fermentation kann während 1 bis 8 Tagen unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums bei einer Temperatur im Bereich von 24 bis 37 °C ablaufen. Der Belüftungsgrad hängt von verschiedenen Faktoren, wie der Grösse des Fermenters, der Rührgeschwindigkeit und ähnlichen Faktoren, ab. Im allgemeinen werden grössere Fermenta-s tionsansätze bei etwa 95 bis 150 U/min gerührt und mit etwa 56,6 bis 5661 (2-20 cft.)/min belüftet.

Die neuen erfindungsgemäss erhaltenen Verbindungen, die schematisch hier als C-076 bezeichnet werden, werden hauptsächlich in dem Myzelium bei Beendigung der Strepto-îomyces avermitilis-Fermentation gefunden, und sie können, wie im folgenden beschrieben, isoliert und voneinander getrennt werden. Es wurden vier Hauptkomponenten und vier Nebenkomponenten von C-076, die durch Streptomyces avermitilis gebildet werden, isoliert. Die acht unterschied-i5 liehen Verbindungen werden in der vorliegenden Unterlage als C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a und B2b identifiziert. Den Hauptkomponenten wurde bei der Identifizierungsterminologie die Nachsilbe «a» verliehen und den Nebenkomponenten die Nachsilbe «b». Man nimmt an, dass der 20 Strukturunterschied zwischen den «a»- und «b»-Verbindungen bei allen vier Paaren gleich ist.

Wie zu erwarten war, werden selbst die Haupt-C-076-Ver-bindungen bei den erfindungsgemässen Fermentationen nicht in gleichen Mengen gebildet. Es wurde im allgemeinen gefun-25 den, dass die AI-Verbindungen etwa 20 bis 30 Gew.-% des gesamten, gebildeten C-076-Komplexes, die A2-Verbindun-gen etwa 1 bis 20 Gew.-% und die Bl- und B2-Verbindungen je etwa 25 bis 35 Gew.-% ausmachen. Das Gewichtsverhältnis der Verbindungen der «a»-Reihen zu den «b»-Reihen be-30 trägt etwa 85:15 bis 99:1.

Die Trennung der C-076-Reihen der Verbindungen aus der gesamten Fermentationsbrühe und die Isolierung der einzelnen Komponenten erfolgt bevorzugt durch Lösungsmittelextraktion und chromatographische Fraktionierungen mit 35 verschiedenen chromatographischen Verfahren und Lösungsmittelsystemen.

Die C-076-Verbindungen besitzen in Wasser eine geringe Löslichkeit, sind jedoch in organischen Lösungsmitteln löslich. Diese Eigenschaft wird zweckdienlich bei ihrer Gewin-40 nung aus der Fermentationsbrühe ausgenutzt. Bei dem Isolierungsverfahren wird vorzugsweise die gesamte Fermentationsbrühe filtriert und das wässrige Filtrat wird verworfen. Der feuchte Myzeliumkuchen kann dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel extrahiert werden. Obgleich 45 irgendein organisches Lösungsmittel verwendet werden kann, ist es bevorzugt, ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, Äthanol u.a., zu verwenden. Im allgemeinen sind verschiedene Extraktionen zur maximalen Isolierung erwünscht. Durch das Lösungsmittel werden die C-076 50 aktiven Komponenten wie auch andere Substanzen, denen die antiparasitische Aktivität von C-076 fehlt, entfernt. Ist das Lösungsmittel z.B. ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wird von den feuchten Myzelien ebenfalls Wasser entfernt. Die extrahierten Myzelien werden verworfen. Die Lösungs-55 mittelextrakte werden gewöhnlich zur Entfernung organischer Lösungsmittel eingedampft und mehrere Male mit einem zweiten Lösungsmittel extrahiert. Wenn bei der ersten Extraktion ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel verwendet wird, wird bei der zweiten Extraktion bevorzugt ein mit 60 Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie Chloroform, Methylenchlorid, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylacetat, Me-thyläthylketon, Methylisobutylketon u.ä., verwendet. Diese letzteren Extrakte werden in der Regel nach an sich bekannten Verfahren getrocknet und konzentriert, und man erhält ei-65 nen Rückstand, der aus C-076, vermischt mit anderen Materialien, besteht. Diese Fraktion wird dann zweckdienlich zur Abtrennung der aktiven C-076-Verbindungen aus anderen Materialien und ebenfalls zur Abtrennung und Isolierung der

einzelnen C-076-Verbindungen chromatographiert. Die zur Reinigung der C-076-Verbindungen verwendbaren chromatographischen Verfahren sind dem Fachmann geläufig. Beispiele solcher Verfahren sind die Säulenchromatographie unter Verwendung solcher Medien, wie Silikagel, Aluminiumoxid, Dextrangel u.ä., und Eluierung solcher Säulen mit verschiedenen Lösungsmitteln und/oder Gemischen aus zwei oder mehr Lösungsmitteln in verschiedenen Verhältnissen. Die Flüssigkeitschromatographie wird zum Nachweis der C-076-Verbindungen verwendet, und die Hochdruck-Flüssig-keitschromatographie kann zur Isolierung gereinigter Fraktionen, die eine oder mehrere dieser Verbindungen enthalten, verwendet werden. Die Dünnschichtchromatographie kann zum Nachweis der Anwesenheit und Isolierung einzelner C-076-Verbindungen verwendet werden. Bei dem Einsatz der zuvor beschriebenen Verfahren wie auch bei anderen Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, wird man gereinigte Zusammensetzungen erhalten, die die C-076-Verbindungen wie auch einzelne C-076-Verbindungen selbst erhalten. Die Anwesenheit der aktiven C-076-Verbindungen wird festgestellt, indem man die verschiedenen chromatographischen Fraktionen auf ihre antiparasitische Aktivität analysiert und ebenfalls durch spektrale charakteristische Eigenschaften (wie Ultraviolett- und Infrarotspektrum) der Verbindungen, wie

Tabelle I

Ala Alb A2a

Summenformel C49H74014 C48H72014 C49H76Oi5

optische Drehung +68,5° ±2° +48,8° ±2°

[a]ß (chc13) (C=0,77) C= 1,64)

Molekulargewicht 886 872 904

(bestimmt durch

Massenspektrometrie)

Ultraviolett-Ab- 237 237

sorptionsspektrum (28 700; (28 800;

4,458) 4,459)

Xmax (m|i) 243 243

(31 275; (31 740;

4,495) 4,501)

(e; log s) 252 252

(20 290; (20 425;

4,307) 4,310)

Os im folgenden näher erläutert wird.

Die spektralen und andere physikalisch-chemischen Ei- «

genschaften der einzelnen C-076-Verbindungen sind in Tabel- 6

lenform in Tabelle I zusammengefasst. Diese Verbindungen M

sind in den meisten organischen Lösungsmitteln gut löslich und in Wasser nur gering löslich.

Die spektralen Ultra violettwerte der Tabelle I werden auf einem Cary Modell 15 Ultraviolett-Spektrometer in Methanollösungen in 1 cm Quarzzellen erhalten. Die Konzentrationen der Verbindung beträgt etwa 25 |xg/ml. Die ultraviolette Absorption ist, obgleich sie als die einer besonderen Verbindung der «a»-Reihen angegeben wird, tatsächlich die Absorption der Verbindung der «a»-Reihe, die eine geringe Menge an Verbindung der «b»-Reihen enthält. Die «a»- und «b»-Reihen unterscheiden sich nur durch einen -CH2-Molekülteil im niedrig-Alkylsubstituenten, und dieser Unterschied steht nicht im Zusammenhang mit einem Chromophor. Durch das Ultraviolett-Absorptionsspektrum wird hauptsächlich der Grad und die Art der Unsättigung, die in einer besonderen Verbindung vorhanden ist, beschrieben. Die optischen Rotationen werden unter Verwendung von Standardverfahren mit einem Carl Zeiss-Polarimeter bestimmt. Der Konzentrationsfaktor (c) wird als Prozent der Verbindung in dem angegebenen Lösungsmittel aufgeführt.

ON

A2b Bla Blb B2a B2b

C48H740]5 C4gH72Oj4 C47H70OI4 C4gH74Oi5 C47H720i5

+ 55,7° ±2° +38,3° ±2°

(C= 1,06) (C = 0,87)

890 872 858 890 876

237

(29 120; 4,464)

243

(31 850; 4,503)

252

(20 510; 4,431)

237

(27 580; 4,441)

243

(30 590; 4,486)

252

(20 060; 4,302)

7

639422

Die Werte für die 13C kernmagnetischen Resonanzspek- B1 (0,3 ml 16%)

trenfürC-076 Ala, A2a, Bla und B2a werden in der folgen- 12,0,12,9,15,1,16,4,17,7,18,4,19,9,20,2,27,5,30,6,34,3

den Tabelle II angegeben. Die Spektren werden auf einem Va- (3C), 35,2,36,6,39,8,40,5,45,7,56,4 (2C), 67,3,67,8,68,2

rian Nuclear Magnetic Spectrometer Modell CFT-20 in deu- (2C), 68,4 (2C), 75,0,76,1,78,3,79,4 (2C), 80,5 (2C), 82,0,

terierter Chloroformlösung unter Verwendung von Tetrame- s95,0,95,8,98,5,118,1,118,4,120,4,124,8, 127,9,135,2,136,2,

thylsilan als Innenstandard bestimmt. Das Lösungsvolumen 137,9 (2C), 139,7,173,6.

und die Konzentration der Probe werden für jeden Fall angegeben, darauf folgen die chemischen Verschiebungen, bezo- B2 (0,6 ml 16%)

gen auf Tetramethylsilan, für jede Verbindungen, angegeben 11,8,12,4,13,8,15,1,17,7,18,4,19,9,20,2,27,3,34,4 (3C),

in Teilen pro Million (ppm). Die chemischen Verschiebungen io35,2,35,8,36,5,39,8,40,8,41,2,45,8,56,4 (2C), 67,3,67,7

werden für ein einzelnes Kohlenstoffatom, sofern nicht nach (2C), 68,3 (3C), 69,9,70,9,76,1,78,3,79,4 (2C), 80,5 (2C),

der chemischen Verschiebung ein Klammerausdruck angege- 81,8,94,9,98,6,99,7,117,7,118,0,120,4,124,8,135,7,138,0

ben ist, aufgeführt. (2C), 139,8,173,5.

Tabellen AI (0,6 ml 16%)

12,0,13,0,15,1,16,4,17,7,18,4,19,9,20,3,27,5,30,6,34,3, (3C), 35,2,36,6, 39,7,40,5,45,7, 56,4 (2C), 57,7,67,3,68,2 (2C), 68,4 (2C), 74,9,76,1,77,0,77,5,78,3,79,4,80,6 (2C), 82,0, 95,0,95,8,98,5, 118,4 (2C), 119,7,124,9,127,8,135,2, 136,0,136,1, 137,6,139,9, 173,8.

A2 (0,6 ml 16%)

11,8,12,4,13,8,15,1,17,7,18,4,19,9,20,3,27,3,34,3 (3C), 35,2,35,8,36,5,39,8,40,8,41,2,45,7,56,4 (2C), 57,7,67,3, 67,7,68,2 (3C), 69,9,70,8, 76,1,77,0,77,6,78,3,79,4,80,6 (2C).81,8,94,9,98,6,99,7,117,7,118,4,119,7, 124,9,135,7, 136,1,137,6,140,0,173,7.

i5 Die charakteristischen Massenspektrenpeaks der acht C-076-Verbindungen werden in Tabellen III angegeben. Die erste Zeile in Tabelle III bedeutet das Masse-zu-Ladung-Ver-hältnis (m/e) des Molekülions jeder betreffenden Verbindung, und die restlichen Zahlen bedeuten das Masse-zu-Ladung-20 Verhältnis der Hauptfragmente jeder Verbindung. Die Mas-se-zu-Ladung-Verhältnisse, die in der gleichen horizontalen Reihe aufgeführt sind, weisen auf analoge Fragmente in jeder Verbindung hin. Die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, die als ganze Zahlen aufgeführt sind, werden an einem LKB Mas-25 senspektrometer Modell LKB-9000 erhalten. Die Masse-zu-Ladung-Verhältnisse, die bis zur vierten Dezimale aufgeführt sind, werden auf einem High Resolution Varian Massenspek-trometer Modell MAT-731 gemessen.

Tabelle III

Charakteristische Peaks im Massenspektrum

Ala

Alb

A2a

A2b

Bla

Blb

B2a

B2b

886.5072

872

904

890

872

858

890

876

742.4249

728

760

746

728

714

746

732

580.3406

566.3265

598

584

566

552

584

570

548.3136

534

566

552

548.3131

534

566

552

456.2886

442

456

442

456

442

456

442

305.2120

291.1962

323.2225

309.2070

305

291

323

309

305

291

305

291

275.1292

275

275

275

261.1139

261

261

261

257.1382

257

257

257

257

257

257

257

221.1527

207

239.1637

225

221

207

239

225

193.1587

179.1429

211.1691

197.1542

193

179

211

197

199.1101

199

199

199

199

199

199

199

169.1226

155

179.1076

179

169

155

179

179

145.0867

145

145

145

145

145

145

145

137.0954

137

137

137

137

137

137

137

127.0754

127

127

127

127

127

127

127

113.0604

113

113

113

113

113

113

113

95.0496

95

95

95

95

95

95

95

87.0444

87

87

87

87

87

87

87

Die beigefügten Fig. 1 bis 8 sind genaue Reproduktionen der Infrarotspektren und der kernmagnetischen Protonenre-sonanzspektren von vier der C-076-Verbindungen. Die Fig. 1 bis 4 sind Infrarotspektren für C-076 Ala, A2a, Bla und B2a. Die Fig. 5 bis 8 sind kernmagnetische Protonenspektren für C-076 Ala, A2a, Bla und B2a. Die Infrarotspektren werden auf einem Perkin-Elmer Infrarotspektrometer Modell 421 in Chloroformlösung aufgenommen. Die kernmagnetischen Protonenresonanzspektren werden in deuterierter Chloroformlösung auf einem Varian kernmagnetischen Resonanz-

spektrometer Modell HA-100 aufgenommen, und die in den 60 Spektren aufgeführten chemischen Verschiebungen werden in Teilen pro Million (ppm), bezogen auf Tetramethylsilan als Innenstandard, angegeben.

65 Aufgrund von Versuchsergebnissen einschliesslich der hier beschriebenen Untersuchungen und Messungen wird angenommen, dass die C-076-Verbindungen die folgende planare Strukturformel besitzen

639 422

R-0

CH.

in der

R das a-L-Oleandrosyl-a-L-oleandrosid der Strukturformel bedeutet, die gestrichelte Linie eine Einfach- oder eine Doppelbindung anzeigt,

R] die Hydroxygruppe bedeutet und nur dann vorhanden ist, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung darstellt, R2 Isopropyl, oder sek.Butyl bedeutet und R3 Methoxy oder Hydroxy bedeutet.

Die einzelnen Verbindungen, die unter die zuvor beschriebene Strukturformel fallen, werden in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

Ri

R2

R3

Ala

Doppelbindung sek.Butyl

-OCH,

Alb

Doppelbindung

Isopropyl

-OCH

A2a

-OH

sek.Butyl

-OCH

A2b

-OH

Isopropyl

-OCH,

Bla

Doppelbindung sek.Butyl

-OH

Blb

Doppelbindung

Isopropyl

-OH

B2a

-OH

sek.Butyl

-OH

B2b

-OH

Isopropyl

-OH

Wie zu erwarten war, verhalten sich die erfindungsgemäss erhaltenen Verbindungen, worin R2 sek.Butyl bedeutet (die «a»-Reihen der Verbindungen), und die entsprechenden Verbindungen, worin R2 Isopropyl bedeutet (die «b»-Reihen) in den meisten Isolierungsverfahren, wie solchen, bei denen eine Extraktion mit Lösungsmitteln verwendet wird, ähnlich. Bei jedem Paar von «a»- und «b»-Verbindungen wurde die «a»-Verbindung in grösserer Menge festgestellt und macht im allgemeinen etwa 85 bis 99% in dem Gemisch der «a»- und «b»-Verbindungen aus. Die Anwesenheit der Isopropylverbin-dungen wird durch das Massenspektrum der Verbindungen sichergestellt, worin die Massenpeaks, die die Fragmente darstellen, die eine sek.Butylgruppe enthalten, begleitende Peaks mit 14 Masseneinheiten (oder eine -CH2-Gruppe) weniger aufweisen. Weiterhin wurde die Hochdruckflüssigkeitschromatographie zur Abtrennung der Alb-Komponente von der Ala-Komponente verwendet, und das Massenspektrum einer 5 solchen Alb-Komponente wurde durch Hochresolutions-massenspektrometrie verifiziert (vergi. Tabelle III).

Die neuen erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen besitzen eine ausgeprägte parasitenvernichtende Aktivität als Anthelminthika, Insektizide und Acarizide für die mensch-lo liehe und tierische Gesundheit und in der Landwirtschaft.

Die Krankheit oder Gruppe von Krankheiten, die allgemein als Helminthose bezeichnet wird, beruht auf der Infektion eines lebenden Wirts mit parasitischen Würmern, die als Helminthen bekannt sind. Die Helminthose ist ein schwerwie-15 gendes und ernstes wirtschaftliches Problem bei domestizierten Tieren, wie Schweinen, Schafen, Pferden, Kühen bzw. Kälbern, Ziegen, Hunden, Katzen und Geflügel. Unter den Helminthen verursacht die Gruppe von Würmern, die als Ne-mathoden bezeichnet werden, eine weitverbreitete und oft 20 ernste Infektion bei verschiedenen Tierspecies. Die wichtigsten Arten der oben erwähnten Nematoden, die Tiere infizieren, sind Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nema-todirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagosto-mum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyo-25 caulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris und Parascaris.

Bestimmte Nematoden, wie Nematodirus, Cooperia und Oesophagostomum, greifen hauptsächlich den intestinalen Trakt an, während andere, wie Maemonchus und Ostertagia, 30 im Magen überwiegen, während noch andere, wie Dictyocau-lus, in den Lungen gefunden werden. Noch andere Parasiten können in anderen Geweben und Organen des Körpers, wie in Herz- und Blutgefässen, den subkutanen und lymphatischen Geweben bzw. Gefässe u.ä., auftreten. Die parasiti-35 sehen Infektionen, die als Helminthose bekannt sind, führen zu Anämie, Unterernährung, Schwachheit, Gewichtsverlust, starken Schäden an den Wänden des intestinalen Trakts und anderen Geweben und Organen und können, sofern sie nicht behandelt werden, den Tod des infizierten Wirts hervorrufen. 40 Die erfindungsgemäss erhaltenen C-076-Verbindungen besitzen eine überraschend hohe Aktivität gegenüber diesen Parasiten, und zusätzlich sind sie gegenüber Dirofilaria bei Hunden, Nematospiroiden, Syphacia und Aspiculuris bei Nagetieren, arthropoden Ectoparasiten bei Tieren und Vögeln, wie 45 Zecken, Milben, Läusen, Flöhen, Schmeissfliegen und Fliegen, bei Schafen Lucilia sp., beissenden Insekten und wandernden, zu den Dipteren gehörenden Larven, wie Hypo-derma sp., bei Rindern, Gastrophilus bei Pferden und Cute-rebra sp. bei Nagetieren aktiv.

50 Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen sind weiterhin gegen Parasiten, die Menschen infizieren, wirksam. Die häufigsten Arten von Parasiten des gastro-intestinalen Trakts von Menschen sind Anylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris und En-55 terobius.

Andere, medizinisch wichtige Arten von Parasiten, die im Blut und anderen Geweben und Organen ausserhalb des ga-stro-intestinalen Trakts auftreten, sind die Filialwürmer (fi-60 liarial worms), wie Wuchereria, Brugia, Onchocerca und Loa, Dracunculus und extra intestinale Stufen der intestinalen Würmer Strongyloides und Trichinella. Die neuen Verbindungen sind ebenfalls von Wert gegenüber Arthropoden, die Menschen bzw. Lebewesen als Parasiten befallen, beissenden ss Insekten und anderen, zu den Dipteren gehörenden Schädlingen, die Menschen bzw. Lebewesen belästigen.

Die Verbindungen sind weiterhin gegenüber Haushaltsschädlingen, wie Schaben bzw. Küchenschaben, Blatella sp.,

9

639 422

Kleidermotten, Tineola sp., Teppich- bzw. Tapetenkäfer und gen können unter Verwendung an sich bekannter Verfahren

Hausfliegen Musca domestica, aktiv. als Sprays, Bestäubungsmittel, Emulsionen u.ä. auf die wach-

Die Verbindungen sind weiterhin gegenüber Insekten- senden oder gelagerten Nutzpflanzen angewendet werden, da-

schädlingen von gelagertem Getreide, wie Tribolium sp., Te- mit man gegenüber diesen landwirtschaftlichen Schädlingen nebrio sp., und von landwirtschaftlichen Pflanzen, wie Spin- 5 einen Schutz erhält.

nenmilden (Tetranychus sp.), Aphiden (Acyrthiosiphon sp.); Die anthelminthische Aktivität von C-076 kann durch gegenüber wandernden Geradflüglern, wie Heuschrecken, orale Verabreichung über das Futter, einer Probe einer einzel-

und unentwickelten Stufen von Insekten, die auf Pflanzenge- nen C-076-Verbindung, eines Gemisches aus C-076-Verbin-

webe leben. Die Verbindungen sind wertvolle Nematozide für düngen, eines konzentrierten Extraktes u.ä. an eine Maus, die die Kontrolle von Bodennematoden und Pflanzenparasiten, 10 3 Tage zuvor mit Nematospiroides dubius infiziert wurde, be-

wie Meloidogyne spp., die in der Landwirtschaft Bedeutung stimmt werden. An dem 11., 12. und 13. Tagnachder Initi-

haben können. ierung der Medikation werden die Exkremente der Maus auf

Diese Verbindungen können oral in Dosiseinheitsformen, N. dubius-Eier geprüft, und am nächsten Tag wird die Maus wie Kapseln, grossen Pillen oder Tabletten, oder in Form ei- getötet und die Anzahl der in dem proximalen Teil des Dünn-

nes flüssigen Arzneitranks, wenn sie bei Säugetieren als An- 15 darms vorhandenen Würmer wird bestimmt. Eine aktive Ver-

thelminthika verwendet werden, verabreicht werden. bindung stellt man fest, wenn eine wesentliche Verminderung

Solche Dosiseinheitszubereitungen können stark variieren in den Ei- und Wurmzählungen beobachtet wird, verglichen und werden abhängig von dem Gesamtgewicht und dem Ge- mit den infizierten Kontrolltieren, denen kein Medikament halt an antiparasitischem Mittel und abhängig von solchen verabreicht wurde.

Faktoren, wie der Art des zu behandelnden Wirttiers, der 20 Die folgenden Beispiele erläutertn die Erfindung.

Stärke und der Art der Infektion und dem Gewicht des Wirts ausgewählt. Zusammensetzung der Medien

Wenn die aktive Verbindung über das Tierfutter verab- Medium 1

reicht werden soll, wird sie gut in dem Tierfutter dispergiert, Dextrose oder sie wird als Zubereitung auf dem Tierfutter oder in Form 25 Pepton von Pellets verwendet, die dann zu dem fertigen Futter zuge- Fleischextrakt geben werden können oder gegebenenfalls getrennt verfüttert primäre Hefe werden können. NaCl

Alternativ können die erfindungsgemäss erhaltenen anti- CaC03 (nach der pH-Einstellung)

parasitischen Verbindungen Tieren parenteral, z.B. durch in- 30 destilliertes Wasser traruminale, intramuskuläre, intratracheale oder subkutane pH 7,0 Injektion, verabreicht werden, wobei in diesem Fall der aktive

Bestandteil in einem flüssigen Trägerstoff gelöst oder disper- Medium 2

giert ist. Tomatenpaste bzw. -mark

Bei der Verwendung der erfindungsgemäss hergestellten 35 modifizierte Stärke (CPC)

Verbindungen können die verschiedenen C-076-Komponen- primäre Hefe ten isoliert und gereinigt werden und in dieser Form verwen- CoCl2 6H20

det werden. Alternativ können Gemische aus zwei oder meh- destilliertes Wasser reren der einzelnen C-076-Komponenten verwendet werden. pH 7,2 bis 7,4

Es ist nicht erforderlich, die verschiedenen C-076-Verbindun- 40

gen, die man bei der Reinigung der Fermentationsbrühe er- Beispiel 1 hält, vollständig zu trennen. Im allgemeinen erhält man ein Ein lyophilisiertes Rohr von Streptomyces avermitilis Gemisch, das zwei oder mehr der C-076-Verbindungen ent- MA-4680 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in hält und aus dem andere, nichtverwandte Verbindungen ent- 50 ml Medium 1 in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit fernt sind. Ein solches Gemisch kann für die Verhinderung 45 Umlenkorganen suspendiert. Dieser Kolben wird 3 Tage bei und Behandlung parasitischer Krankheiten, wie hier beschrie- 28 °C auf Rotationsschüttelmaschine bei 220 U/min mit einer ben, verwendet werden. Ein solches Gemisch wird im allge- kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von meinen ungleichmässige Anteile an C-076-Verbindungen ent- 5,08 cm (2 in.) geschüttelt. Ein 0,2 ml Teil dieses Impfmedihalten, jedoch besitzen alle Verbindungen wesentliche Aktivi- ums wird zur Inokulierung einer Schrägkultur von Medium 3 tät, und die antiparasitische Aktivität des Gemisches kann ge- so verwendet. Das inokulierte Schrägkulturmedium wird 10 nau bestimmt werden. Insbesondere wird es nicht erforderlich Tage bei 28 °C inkubiert und bei 4 °C gelagert, bis es zur In-sein, die «b»-Komponenten von den verwandten «a»-Kom- okulation von vier weiteren Schrägkulturen von Medium 3 ponenten zu trennen. Diese Verbindungen unterscheiden sich verwendet wird. Diese Schrägkulturen werden 8 Tage in der nur in der Länge der 25 Seitenkette. Die Abtrennung der eng- Dunkelheit inkubiert. Eine dieser Schrägkulturen wird zur Inverwandten Verbindungen wird im allgemeinen nicht prakti- 55 okulation von drei 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkziert da die «b»-Verbindung nur in einer geringen Menge, Organen, die 50 ml Nr. 4 Impfmedium enthalten, verwendet, ausgedrückt als Gew.-%, vorhanden ist. Die Impfkolben werden 2 Tage bei 27 bis 28 °C auf einer Ro-Zusätzlich ist es, wenn die C-076-Verbindungen zu Tier- tationsschüttelmaschine bei 220 U/min in einer kreisförmigen futter zugegeben werden, möglich, den getrockneten Myze- Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm geschüttelt, lienkuchen aus der Fermentationsbrühe zu verwenden. Die 60 Die Inhalte dieser Kolben werden vereinigt und zur Inokula-Myzelien enthalten das Übergewicht an Aktivität, und da der tion (5% Inokulum) von 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Um-Aktivitätsgehalt der Myzelien bestimmt werden kann, kön- lenkorganen, die 40 ml verschiedener Produktionsmedien nen sie direkt zu dem Tierfutter zugegeben werden. enthalten, verwendet. Die Kolben, die die Medien 2,5 und 6 Die erfindungsgemäss herstellbaren C-076-Verbindungen enthalten, werden 4 Tage bei 28 °C auf einer Rotationsschüt-können ebenfalls zur Bekämpfung landwirtschaftlicher es telmaschine bei 220 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn Schädlinge, die eine Beschädigung der Nutzpflanzen während mit einem Durchmesser von 5,08 cm inkubiert. Die entste-des Wachstums oder während der Lagerung verursachen, ver- hende, C-076 enthaltende Brühe wird dann entnommen und wendet werden. Die erfindungsgemäss erhaltenen Verbindun- auf ihre anthelminthische Aktivität geprüft. In allen Fällen

20 g

5g 5g 3g 5g 3g

1000 ml

20 g 20 g 10 g 0,005 g 1000 ml

639 422

10

sind 6,2 ml der gesamten Brühe und die Feststoffe, die man beim Zentrifugieren von 25 ml der gesamten Brühe erhält, voll aktiv gegenüber N.dubius-Wurminfektionen bei Mäusen.

Medium 3 (Schrägkultur)

Dextrose

Bacto Asparagin

K2HP04

Bacto Agar destilliertes Wasser pH 7,0

Medium 4 (Impfmedium) Lösliche Stärke Ardamine pH NZ Amin E Rinderextrakt MgS047H20 Cerelose Na2HP04

kh2po4

CaC03

destilliertes Wasser pH 7,0 bis 7,2

Medium 5

Tomatenpaste bzw. -mark

Hafermehl

Cerelose

Maiseinweichflüssigkeit Spurenelementmischung destilliertes Wasser pH 6,8.

Spurenelementmischung FeS04 • 7H20 MnS04 • 4H20 CuC12 • 2H20 CaCl2

h2bo3

(NH4)2Mo04 • 4H20 ZnS04 • 7H20 destilliertes Wasser pH

10,0 g 0,5 g 0,5 g 15,0 g 1000 ml

10,0 g 5,0 g 5,0 g 3,0 g 0,5 g 1,0 g 0,190 g 0,182 g 0,5 g 1000 ml

40,0 g 10,0 g 10,0 g 5,0 g 10,0 ml 1000 ml

1000 mg 1000 mg 25,0 mg 100,0 mg 56,0 mg 10,0 mg 200,0 mg 1000 ml

2 enthalten, verwendet. Nach 4 Tagen Inkubation bei 28 °C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 220 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm wird aus neunzehn Kolben der Inhalt gewonnen und 5 vereinigt. Die vereinigten, C-076 enthaltenden Fermentationsbrühen werden filtriert; man erhält 500 ml Filtrat und 86 g Myzelien. 78 g Myzelium werden mit 150 ml Aceton während einer halben Stunde unter Rühren extrahiert, und das Gemisch wird filtriert. Der Filterkuchen wird mit 50 ml io Aceton gewaschen, und das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt und auf 46,5 ml konzentriert. Der pH-Wert von 30 ml Konzentrat wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 4 eingestellt. Das Konzentrat wird dreimal mit 30 ml-Teilen Chloroform extrahiert. Die Extrakte werden i5 durch Filtern durch trockene Infusorienerde (Super-Cel) getrocknet, vereinigt und zur Trockene im Vakuum konzentriert. Der ölige Rückstand von C-076 wiegt 91,4 mg; er wird in ausreichend Chloroform gelöst, so dass man 3 ml Lösung erhält, was einem 1 %igen Brühenvolumen entspricht. 20 Das bei diesem Isolierungsverfahren gewonnene C-076 ist gegenüber N-dubius-Infektionen bei Mäusen voll aktiv. Zusätzlich ergibt die Chloroformextraktion eine 70fache Reinigung von C-076 aus der gesamten Brühe.

25 Beispiel 3

Stufe A

Ein 50 ml Medium 7 enthaltender 250 ml Erlenmeyerkol-ben mit Ablenkorganen wird mit einer gefrorenen Ampulle von Streptomyces avermitilis MA-4680 inokuliert. Der Kol-30 ben wird bei 28 °C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm während 24 h inkubiert.

Medium 7

35 Dextrose 1 g

CPC industrielle Stärke, modifiziert 10 g Fleischextrakt 3 g NZ Amin E 5 g autolysierte Hefe (Ardamine pH) 5 g 4o MgS04 • 7H20 0,05 g Na4HP04 0,19 g KH2P04 0,182 g CaCO 0,5 g destilliertes W asser 1000 ml 45 pH 7,0 bis 7,2

Medium 6

CPC industrielle Stärke, modifiziert (erhältlich von CPC Corp.) 40,0 g lösliche Stoffe aus der Branntweinherstellung 7,0 g autolysierte Hefe

(Ardamine pH, erhältlich von Yeast Products Inc.) 5,0 g

CoCl2 • 6H20 50,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml pH 7,3.

Beispiel 2

Eine 0,5 x 1,0 cm Schlinge von einer der vier Schrägkulturen von Medium 3, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wird zum Inokulieren eines 50 ml Impfmedium 4 enthaltenden 250 ml Erlenmeyer-Kolbens mit Umlenkorganen verwendet. Der Impf kolben wird 1 Tag bei 27 bis 28 °C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 220 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm geschüttelt. Der Impfkolben wird dann stationär bei 4 °C bis zu seiner Verwendung gelagert. Der Inhalt dieses Kolbens wird dann zur Inokulierung (5% Inokulum) von zwanzig 250 ml Erlenmeyer-Kolben ohne Umlenkorgane, die 40 ml Medium

55

Stufe B

Zwei 21 Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen, die je 500 ml Medium 7 enthalten, werden mit 10 ml des Kolbenin-50 halts der Stufe A inokuliert. Die Medien werden bei 28 °C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 U/min auf einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm 24 h inkubiert.

Stufe C

In einen 7561 rostfreien Stahlfermenter, der 4671 Medium 8 enthält, gibt man 11 des gesamten Fermentationsmediums von Stufe B. Der Fermenter wird 96 hbei28 "Cund 130 U/ min gerührt und mit einer Luftströmung von 283 1 (10 cft.)/ , min belüftet.

60

Medium 8

Tomatenpaste bzw. -mark primäre Hefe N.F.

Stärke, modifizierte, CPC 65 CoCl2 • 6H20 Polyglykol 2000 destilliertes Wasser pH 7,2 bis 7,4.

20 g/1 10g/l 20 g/1 5 mg/1 0,321 ml/1 q.s.

Gegen Ende dieser Zeit werden 15,51 der Gesamtbrühe filtriert und die C-076 enthaltenden Myzelien werden mit Wasser gewaschen. Die feuchten Myzelien (2268 g) werden mit 31 Aceton unter Rühren extrahiert. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat wird auf 1550 ml konzentriert und mit verdünnter HCl wird der pH-Wert auf 4,0 eingestellt. Diese Lösung wird dreimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden durch Filtrieren durch trockene Infusorienerde (Super-Cel) getrocknet, sie werden vereinigt und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das zurückbleibende Öl von C-076 wiegt 5,12 g. 3,3 mg sind gegenüber N-dubius bei Mäusen vollständig aktiv.

4,69 g dieses Öls werden in 142 ml Chloroform gelöst und auf einer 90 g Silikagel enthaltenden, mit Chloroform gepackten Säule chromatographiert. Die Säule wird mit 1400 ml Chloroform entwickelt. Die Säule wird dann mit Chloroform/Äthanol (49:1) eluiert, wobei 145 Fraktionen von je 5 ml gesammelt werden. Danach wird die Säule mit Chloroform/Äthanol (19:1) eluiert, wobei die Fraktionen 146 bis 226 von je 5 ml gesammelt werden. Die Fraktionen 49 bis 72 werden vereinigt und zur Trockene eingedampft; man erhält 200 mg eines Öls (A). Die Fraktionen 79 bis 184 werden ähnlich vereinigt und eingedampft; man erhält 291 mg eines Öls (B). 400 ng jeder Fraktion sind gegenüber N-dubius bei Mäusen vollständig aktiv. Diese beiden Fraktionen (A und B) werden getrennt chromatographisch an Silikageldünnschicht-platten (Quanta/Gram QIF-Platten, erhältlich von Quanta/ Gram Inc., Fairfield, New Jersey) analysiert. Die Platten werden mit Chloroform/Methanol (19:1) entwickelt. Die Flecken werden auf ihre Ultraviolettaktivität analysiert und ein Flek-ken jeder Fraktion hat die charakteristische UV-Absorption für die C-076-Verbindungen (vergi. Tabelle I). Bei der Fraktion A besitzt der Flecken mit einem Rf-Wert von 0,83 diese Absorption, und bei der Fraktion B besitzt der Flecken mit einem Rf-Wert von 0,57 diese Absorption. Diese Flecken stellen die C-076 A-Verbindungen bzw. die C-076 B-Verbindun-gen dar.

198 mg des obigen Öls (A) werden an 80 g Silikagel, das mit Chloroform gepackt wurde, chromatographiert. Man eluiert mit Chloroform/Methanol (199:1), bis 520 ml gesammelt sind, und anschliessend mit Chloroform/Methanol (99:1), wobei jeweils 10 ml-Fraktionen gesammelt werden. Die Fraktion von 630 bis 720 ml ergibt 30,4 mg; die Fraktion von 730 bis 950 ml ergibt 78,4 mg; und die Fraktion von 950 bis 1040 ml ergibt 20 mg eines öligen Materials. Die C-076 A-Komponenten enthaltenden Fraktionen 1 und 2 sind bei der Prüfung bei Mäusen gegenüber N.dubius bei Gehalten von 1,0,0,5 und 0,25 mg vollständig aktiv.

Beispiel 4

Stufe A

Ein 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Ablenkorganen, der 50 ml Medium 8 enthält, wird mit einer gefrorenen Ampulle von Streptomyces avermitilis inokuliert. Der Kolben wird bei 28 °C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm 24 h inkubiert.

Stufe B

Ein 500 ml Medium 8 enthaltender 21 Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen wird mit 10 ml des Kolbeninhalts der Stufe A inokuliert. Das Medium wird bei 280 C auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 160 U/min mit einer kreisförmigen Kreisbahn mit einem Durchmesser von 5,08 cm 24 h inkubiert.

Stufe C

In einen 1891 rostfreien Stahlfermenter, der 1601 Medium

639 422

9 enthält, gibt man 500 ml Inokulum von Stufe B. Der Fermenter wird bei 28 °C unter Rühren bei 150 U/min 24 h und Belüften in einer Rate von 84,91 (3 cft.)/min inkubiert.

lg/1

10 g/1 3 g/1 5 g/1 0,05 g/1 0,10 g/1 0,182 g/1 0,5 g/1 q.s.

Stufe D

In einen 4671 Medium 6 enthaltenden 7561 rostfreien Stahlfermenter gibt man 43 1 Inokulum von Stufe C. Der Fer-2omenter wird bei 28 °C unter Rühren bei 130 U/min während 144 h und Belüften mit einer Luftströmungsrate von 283,11 (10 cft.)/min inkubiert.

Stufe E

Gegen Ende dieser Zeit wird die Gesamtbrühe filtriert 25 und der C-076 enthaltende Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen.

Der Filterkuchen wird 30 min in 1201 Aceton aufgeschlämmt, filtriert und die Feststoffe werden mit 301 Aceton gewaschen. Die Acetonwaschlösungen werden vereinigt und 30 bei vermindertem Druck auf ein Volumen von 401 eingedampft. Mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure wird der pH-Wert des Konzentrats auf 4,0 eingestellt. Das Konzentrat wird dreimal mit gleichen Volumina Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden getrocknet, indem man sie 35 durch eine Schicht aus trockener Infusorienerde (Super-Cel) filtriert. Die Extrakte werden durch Super-Cel geleitet und dann vereinigt. Die vereinigten Extrakte werden bei vermindertem Druck auf ein Volumen von 41 konzentriert. Das Chloroformkonzentrat wird filtriert und durch eine Säule von 40 2,4 kg Silikagel in Chloroform geleitet. Die Säule wird mit Chloroform eluiert, wobei man acht 3,51 Fraktionen sammelt. Die Säule wird dann mit Chloroform/Methanol (49:1) eluiert, wobei man acht weitere 3,51 Fraktionen (Fraktionen 9 bis 16) sammelt. Die Fraktion Nr. 3 wird zur Trockene ein-45 gedampft; man erhält 76 g eines öligen Materials, das die Hauptmenge der C-076-Materialien enthält.

97% dieses Materials werden in 685 ml Methylenchlorid gelöst und durch 800 g Kieselsäure (Mallinckrodt Chemical Co.), 0,149 mm= 100 mesh, die durch ein Sieb mit 0,177 mm so Öffnungen - 80 mesh gesiebt wurde, chromatographiert. Die Säule (Durchmesser 7,62 cm, Länge 36 cm) wird mit etwa 7,51 Methylenchlorid/Benzol(7:3) und anschliessend mit 2,2515%igem Isopropanolin Methylenchlorid/Benzol (7:3) entwickelt. Die Fraktion, die mit dem 5%igen Isopropanol in 55 Methylenchlorid/Benzol eluiert wird, enthält eine stark gefärbte Bande und enthält im wesentlichen das gesamte C-076-Material, bestimmt durch Dünnschichtchromatographie (wie in Beispiel 3 beschrieben). Diese Fraktion (500 ml) wird eingedampft und an 105 g Kieselsäure (Säule mit 3,7 cm Durch-60 messer und 18 cm Länge) in Methylenchlorid erneut chromatographiert. Die Säule wird mit 100 ml-Teilen Methylenchlorid, die 5,10 und 20% Äther enthalten, entwickelt. Weitere Eluierung mit 20% Äther in Methylenchlorid ergibt zwei gefärbte Banden. Die Fraktionen zwischen den beiden Banden 65 enthalten im wesentlichen das gesamte C-076-Material, bestimmt durch Dünnschichtchromatographie.

Die C-076 enthaltende Fraktion wird an 59 g Kieselsäure (Säule mit 3,7 cm Durchmesser und 11 cm Länge) in Methy-

11

5 Medium 9 Dextrose Maisstärke Fleischextrakt autolysierte Hefe (Ardamine pH) ioMgS04.7H20 Na2HP04 KH2P04 CaCOj destilliertes Wasser 15 pH 7,0 bis 7,2.

639422

lenchlorid chromatographiert. Die Säule wird mit 10% Äther in Methylenchlorid entwickelt. Nachdem das erste Material zu eluieren beginnt, wird eine Fraktion von 70 ml entnommen und anschliessend werden 26 Fraktionen von je 5 bis 6 ml entnommen. Die Fraktionen 3 bis 26 werden vereinigt; man erhält 1,35 g Material. Dieses wird dünnschichtchroma-tographisch analysiert (Silikagelplatten-Analtech GF 254, entwickelt mit 5%igem Isopropanol in Methylenchlorid). Das Material mit einem Rf-Wert von 0,28 ist in diesem System C-076 AI.

Die Säule wird dann mit 20% Äther in 200 ml Methylenchlorid und anschliessend mit 50% Äther in 800 ml Methylenchlorid eluiert. Eine geringe Menge des C-076 A1/A2-Gemisches wird eluiert und anschliessend wird das gesamte C-076 A2 eluiert. Der Gesamtrückstand der C-076 A2-Frak-tion beträgt 800 mg.

Weitere Elution mit 5%igem Isopropanol in Methylenchlorid ergibt C-076 B1 (135 m). Die Trennung erfolgt, indem man die Ultraviolettabsorption des eluierten Materials beobachtet. C-076 B1 und A2 besitzen sehr ähnliche Rf-Werte an dünnschichtchromatographischen Silikagelplatten (Analtech GF 254) in 5%igem Isopropanol in Methylenchlorid. Die beiden Komponenten unterscheiden sich jedoch eindeutig bei den gleichen Platten, die mit 15%igem Isopropanol in Hexan entwickelt werden.

Die gesamte C-076 AI-Fraktion wird auf 14 Silikagelplatten (Analtech HF 254,20 x 20 cm, 500 h dick) aufgebracht. Die Platten werden mit 10%igem Isopropanol in Hexan entwickelt. Die das C-076 AI enthaltende Bande wird aus den Platten entfernt, mit Äther extrahiert, eingedampft und erneut auf 6 weitere Platten angewendet und fünfmal mit 5%igem Isopropanol in Hexan entwickelt. Das C-076 AI wird von den Platten entfernt und erneut chromatographiert und mit reinem Äther entwickelt; man erhält 270 mg im wesentlichen reines C-076 AI. Die Infrarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren für diese Probe sind in den Fig. 1 und 5 und in Tabelle II dargestellt.

Die C-076 A2-Fraktion wird an 10 Silikagel (Analtech HF 254)-Platten chromatographiert und fünfmal mit 15%igem Isopropanol in Hexan entwickelt; man erhält 265 mg im wesentlichen reines C-076 A2. Die Infrarot- und kernmagnetischen Resonanzspektren für diese Probe sind in den Fig. 2 bzw. 6 und in Tabelle II dargestellt.

Die C-076 Bl-Fraktion wird an 2 Platten (wie oben) in 15%igem Isopropanol in Hexan chromatographiert; man erhält 55 mg im wesentlichen reines C-076 B1. Das kernmagnetische Resonanzspektrum dieser Probe ist in Fig. 7 und in Tabelle II dargestellt.

Beispiel 5

Die in Beispiel 6 beschriebene Fermentation wird zweimal wiederholt und die gesamten Brühen werden vereinigt. Die Fermentationsbrühe wird, wie in Beispiel 6 beschrieben, aufgearbeitet; man erhält 3,31 eines ersten Chloroformextraktes, der 60 mg/ml Gesamtfeststoffe enthält und nach Schätzung anhand der dünnschichtchromatographischen Analyse 0,5% C-076 enthält.

31 dieser Chloroformlösung werden an 2400 g Silikagel (Davidson Grade 62), gepackt in Chloroform, chromatographiert. Die Säule (9,5 x 122 cm) wird mit acht 3800 ml-Teilen Chloroform (Fraktionen 1 bis 8) und dann mit acht 3800 ml-Teilen Chloroform/Methanol (49:1, Fraktionen 9 bis 16) entwickelt. Die einzelnen Fraktionen werden dünnschichtchro-matographisch (Silikagelplatten, Quanta/Gram QIF) analysiert und mit Chloroform/Methanol (19:1) entwickelt. Die Fraktionen 9 bis 11,12 bis 13und 14 werden jeweils zur Trok-kene eingedampft; man erhält 6,63 g Feststoffe, die die C-076 A-Komponenten in den Fraktionen 9 bis 11 enthalten,

12

24,91 g Feststoffe, die die C-076 B-Komponenten in den Fraktionen 12 bis 13 enthalten, und 4,71 g Feststoffe, die auch die C-076 B-Komponenten in der Fraktion 14 enthalten.

Das Material aus den Fraktionen 12 bis 14 wird vereinigt s (29,62 g), in 100 ml Methylenchlorid gelöst und an 400 g Silikagel (Davidson Grade 62) in Methylenchlorid chromatographiert. Die Säule wird mit 1500 ml Methylenchlorid/2-Propa-nol (99:1); 1500 ml Methylenchlorid/2-Propanol (49:1); 2000 ml Methylenchlorid/2-Propanol (19:1); und 1000 ml io Methylenchlorid/2-Propanol (9:1) eluiert. Die eluierten Volumina zwischen 5500 bis 6000 ml (2,56 g) und 6000 bis 6500 ml (5,03 g) werden in 25 ml Methylenchlorid vereinigt und an 60 g Silikagel in Hexan chromatographiert. Ein Vorlauf von 70 ml Hexan und 100 ml Hexan/Diäthyläther (4:1) wird ent-15 nommen und die Säule wird dann mit 600 ml Hexan/Diäthyläther (1:4) entwickelt, wobei 200 ml Fraktionen aufgefangen werden. Sie wird schliesslich mit 700 ml Äther eluiert, wobei 100 ml-Fraktionen entnommen werden. Eluierungsvolumina der Säule von 400 bis 600 ml ergeben 2,035 g Feststoffe, die 20 die C-076 Bl-Komponenten enthalten; die Volumina 600 bis 1100 ergeben 0,881 g Feststoffe, die gemischte C-076 B1/B2-Komponenten enthalten; und die Volumina 1100 bis 1500 ml ergeben Feststoffe, die die C-076 B2-Komponenten enthalten.

25 Die gemischten C-076 B1 /B2-Komponenten werden dann in 4,2 ml Methylalkohol/Wasser (4:1) gelöst und an C18 Po-rasil (Bondapak-37-75 Mikron Grösse) in dem gleichen Lösungsmittel chromatographiert. Die Umkehrphasenhoch-drucksäule (die stärker polaren Komponenten werden zuerst 30 eluiert) misst 1,2 m x 16 mm und wird in einer Rate von 800 ml/h eluiert, wobei 21,3 ml-Fraktionen entnommen werden. Die Anwesenheit der C-076-Komponenten wird verfolgt, indem man die Ultraviolettabsorption der Fraktionen misst. C-076 B2 wird in den Fraktionen 24 bis 37 gewonnen 35 und C-076 B1 wird in den Fraktionen 51 bis 70 gewonnen; man isoliert 195,4 mg C-076 B2 und 137 mg C-076 B1.

Jede Probe wird dann getrennt an 4 g Säulen aus Silikagel (Davidson Grade 62) in Methylenchlorid chromatographiert. Die Säulen werden mit 35 ml Methylenchlorid/Methanol 40 (9:1) eluiert. Die letzten 20 ml des Eluats von jeder Säule werden gesammelt und zur Trockene eingedampft; man erhält 155,3 mg C-076 B2 und 90 mg C-076 B1.

Dann werden 50 mg C-076 B1 und 100 mg C-076 B2 an präparativen Dünnschichtgelplatten (Analtech HF 254) chro-45 matographiert, mit 12%igem Isopropanol in Hexan und anschliessend mit Äther entwickelt. Man gewinnt C-076 B1 und C-076 B2, die im wesentlichen rein sind. Die Infrarotabsorptionsspektren der so gewonnen C-076 B1 und B2 sind in den Fig. 3 bzw. 4 dargestellt. Das kernmagnetische Resonanz-50 spektrum des so gewonnenen C-076 B2 ist in Fig. 8 dargestellt.

Beispiel 6

Ein 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen, der 55 50 ml des folgenden Mediums enthält,

Lactose 2,0%

lösliche Stoffe von der

Branntweinherstellung bzw. Schlempe 2,5% autolysierte Hefe, Ardamine pH 0,5%

so pH-vor der Sterilisation 7,0%

wird mit dem Inhalt von einer gefrorenen Ampulle von Streptomyces avermitilis MA 4848 inokuliert und auf einer Rotationsschüttelmaschine 24 h bei 28 °C und 150 U/min in-65 kubiert.

10 ml der obigen Fermentationsmedien werden zur Inokulation von 500 ml des gleichen Mediums wie oben in einem 21 Erlenmeyer-Kolben mit Umlenkorganen verwendet.

13

639 422

Die Fermentationsmedien werden bei 150 U/min auf einer Rotationsschüttelmaschine 24 h bei 28 °C inkubiert.

Das gesamte, zuvor beschriebene Medium wird zur Inokulation von 4671 des folgenden Mediums in einem 7561 rostfreien Stahlfermenter verwendet:

Lactose 2,0%

lösliche Stoffe von der

Branntweinherstellung bzw. Schlempe 1,5%

autolysierte Hefe, Ardamine pH 0,5%

Polyglykol 2000 0,32 ml/1

PH - vor der Sterilisation 7,0.

Das Fermentationsmedium wird 40 h bei 28 °C mit einer Luftströmung von 2831 (10 cft.)/min und einer Rührrate von 130 U/min inkubiert.

2301 des obigen Mediums werden zur Inokulation von 43101 des folgenden Mediums in einem 56701 rostfreien Stahlfermenter verwendet.

Dextrose peptonisierte Milch autolysierte Hefe, Ardamine pH Polyglykol 2000 pH - vor der Sterilisation

4,5% 2,4% 0,25% 2,5 ml/1 7,0

Die Fermentation wird 144 h bei 26 °C mit einer Luftströmung von 15371 (54,3 cft.)/min und einer Rührrate von 120 U/min weitergeführt.

Das Fermentationsmedium wird filtriert und der Myzeliumfilterkuchen wird mit etwa 5501 Wasser gewaschen, das Filtrat und die Waschlösungen werden verworfen. Der Filterkuchen wird mit etwa 15001 Aceton während etwa 1 h gerührt und filtriert. Der Filterkuchen wird in einem Gemisch von etwa 1501 Aceton und 401 entionisiertem Wasser gewaschen; man erhält etwa 20001 Extrakt.

Die zuvor beschriebene Fermentation und Extraktion wird in gleichem Massstab wiederholt; man erhält weitere 20001 Acetonextrakt, der mit dem ersten Extrakt vereinigt wird und auf ein Volumen von etwa 8001 eingedampft wird. Der pH-Wert des Konzentrats wird mit konz. Chlorwasserstoffsäure auf etwa 4,7 eingestellt und mit etwa 8001 Methylenchlorid vereinigt. Die vereinigten Lösungsmittel werden etwa 4 h gerührt und getrennt. Die wässrige Schicht wird mit weiteren 8001 Methylenchlorid vereinigt und weitere 4 h gerührt. Die Schichten werden getrennt und jeder Methylenchloridextrakt wird getrennt mit etwa 10 kg Super-Cel behandelt und filtriert. Beide Extrakte werden auf ein gemeinsames Volumen von etwa 601 eingedampft.

Beispiel 7

Die 601 Lösung von C-076 in Methylenchlorid des vorherigen Beispiels werden zur Trockene im Vakuum eingedampft und der Rückstand wird dreimal mit 601 Teilen Methanol vereinigt und dann wird zur Trockene eingedampft, um restliches Methylenchlorid zu entfernen. Das letzte Volumen des Methanolkonzentrats beträgt etwa 361. Die Methanollösung wird über Nacht gelagert und filtriert. Der Filterkuchen wird mit 401 frischem Methanol gewaschen, und die Methanolfil-trate und Waschlösungen werden vereinigt. Die Methanollösung wird mit 951 Äthylenglykol und 1301 Heptan vermischt. Die Lösung aus zwei Schichten wird 5 min gerührt und dann wird die untere Schicht (Äthylenglykol und Methanol) abgetrennt. Die Heptanlösung wird mit einem Gemisch aus 201 Äthylenglykol und 6,3 1 Methanol gewaschen. Nachdem man 5 min gerührt hat, wird die untere Schicht abgetrennt und mit dem ersten Äthylenglykol/Methanol-Extrakt vereinigt. Ein gleiches Volumen Wasser (etwa 1501), das 79 g

Salz/1 enthält, wird zu den Äthylenglykol/Methanol-Extrak-ten zugegeben. Diese Lösung wird mit 1501 Äthyläther unter Rühren während 5 min extrahiert. Die Ätherschicht wird mit 751 Wasser (1/2 Vol.) gewaschen und 5 min gerührt, dann 5 werden die Schichten getrennt. Dieses Verfahren wird weiter zweimal wiederholt (das letzte Wasser enthält 20 g Salz/1); man erhält ein Volumen aus der letzten Ätherschicht von 1101. Die Ätherschicht wird im Vakuum auf ein minimales Volumen konzentriert, wobei man die Temperatur unter io 25 °C hält. 40 ml Methylenchlorid werden zu dem Rückstand zugegeben und die Lösung wird zur Trockene eingedampft. Dieses Verfahren wird wiederholt, und der letzte Rückstand wird im Vakuum bei 50 °C zur Trockene eingedampft.

i5 Beispiel 8

Eine Säule mit einem Durchmesser von 30 cm wird mit einer Schicht aus 34 kg aktiviertem Aluminiumoxid und einer Schicht aus 34 kg aktiviertem Kohlenstoff in einer Lösung aus Methylenchlorid hergestellt. Der Rückstand aus dem vor-20 herigen Beispiel wird in Methylenchlorid bis zu einem Volumen von 341 gelöst und auf die Säule aufgebracht. Man eluiert mit 341 Methylenchlorid, wobei diese Fraktionen verworfen werden. Eine 3%ige Lösung von Isopropanol und Methylenchlorid (20,81 Isopropanol und 6601 Methylenchlo-25 rid) wird auf die Säule aufgebracht und in etwa 2001 Fraktionen eluiert. Die vereinigten Isopropanol- und Methylenchloridfraktionen werden im Vakuum bei einer Badtemperatur von etwa 60 °C auf ein Volumen von etwa 201 eingedampft. Die Badtemperatur wird auf etwa 45 °C vermindert und der 30 Extrakt wird im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 10 Teilen Methylenchlorid, 10 Teilen Hexan und 1 Teil Methanol so gelöst, dass man ein Endvolumen von 151 erhält. Die Lösung wird direkt auf eine Sephadex LH-20-Säule des nächsten Beispiels aufgebracht.

35

Beispiel 9

Eine Säule mit einem Durchmesser von 30 cm in Methanol mit 36 kg Sephadex LH-20 (erhältlich von Pharmacia Fine Chemicals, 800 Centennial Avenue, Piscataway, New 40 Jersey 08854) wird hergestellt und mit einem Lösungsmittel gewaschen, das 10 Teile Methylenchlorid, 10 Teile Hexan und 1 Teil Methanol enthält. 1/4 der C-076 Lösung des Beispiels 10 wird auf die Säule aufgebracht und die Säule wird mit einer Rate von 250 ml/min eluiert. Zwei 201 Vorfraktionen werden 45 gesammelt und verworfen. Anschliessend werden zwanzig 21 reiche Fraktionen (die als Fraktionen 1 bis 20 bezeichnet werden) und dann eine einzige 201 Endfraktion gesammelt, die verworfen wird. Man stellt fest, dass die Fraktionen 1 bis 8 die C-076 A-Verbindungen und die Fraktionen 9 bis 20 die C-076 so B-Verbindungen enthalten.

Beispiel 10

Das Verfahren von Beispiel 11 wird im gleichen Massstab drei weitere Male wiederholt und alle Fraktionen, die die 55 C-076 B -Komponenten (Fraktionen 9 bis 20) enthalten, werden vereinigt und zur Trockene eingedampft; man erhält 818g einer rohen Mischung der C-076 B-Komponenten. Man stellt fest, dass die Probe 55% C-076 B1 und 39% C-076 B2 enthält. 680 g dieser Probe werden in 21 Methylenchlorid ge-60 löst und in einen 221 Dreihalsrundkolben gegeben. Anschliessend werden 13,61 Methanol zugegeben. Das Methylenchlorid wird durch Destillation entfernt. 13,61 Äthylenglykol werden zugegeben, so, wie das Methanol bei vermindertem Druck entfernt wird. Die Destillationsrate wird so eingestellt, 65 dass die Temperatur der Lösung nicht unter 65 °C fällt. Nach Beendigung der Äthylenglykolzugabe kann die Lösung 16 h bei 5 °C abkühlen. Die Kristalle werden abfiltriert und mit 11 kaltem Äthylenglykol gewaschen. Die Kristalle werden dann

639422

14

erneut in 21 Methylenchlorid gelöst und die Lösung wird in einen 221 Dreihalsrundkolben gegeben. Das beschriebene Verfahren wird zweimal wiederholt. Das erste Mal werden je 12,51 Methanol und Äthylenglykol verwendet, und das zweite Mal werden je 13,61 Methanol und Äthylenglykol verwendet. Die Endkristalle werden mit 11 kaltem Äthylenglykol und 11 Wasser gewaschen. Die Kristalle werden in 41 Wasser gelöst und durch Filtrieren durch Natriumsulfat getrocknet. Die Benzollösung wird auf ein Volumen von 21 konzentriert und lyophilisiert; man erhält 241,2 g eines weissen Pulvers, das 98% C-076 B1 und 1% C-076 B2 enthält.

Die Mutterlaugen (221) von den ersten beiden Kristallisationen wie oben werden vereinigt und mit 221 Wasser verdünnt. Die wässrige Lösung wird mit 601 Toluol und erneut mit 151 Toluol extrahiert. Der Toluolextrakt wird dann mit 48 1 Wasser gewaschen. Die organische Phase wird durch Su-per-Cel zur Entfernung von restlichem Wasser filtriert und eingedampft; man erhält 336 g festes Material, das aus 79% C-076 B2- und 16% C-076 B1-Verbindungen besteht.

Beispiel 11

Von den vier Sephadex LH-20-Säulen des Verfahrens von Beispiel 11 enthalten die Fraktionen 1 bis 8 die C-076 A-Ver-bindungen und werden vereinigt. Durch HPLC-Analyse stellt man fest, dass das Gemisch 252 g C-076 A2a, 16 g A2b, 94 g Ala und 24 g Alb enthält. Das Material wird in einem Lösungsmittelsystem gelöst, das aus Hexan/Toluol/Methanol in einem Verhältnis von 6:1:1 besteht, und auf eine Sephadex LH-20-Säule der gleichen Dimensionen wie die, die in Beispiel 11 verwendet wurde, in dem obigen Lösungsmittel aufgebracht. Die Fraktionen werden in einer Rate von 250 ml/ min gesammelt und ein 201 Vorlauf wird gesammelt und verworfen. Weitere Elution ergibt zwei weitere 201 Vorläufe, die ebenfalls verworfen werden, und fünfzig 41 reiche Fraktionen, die die C-076 A-Verbindungen enthalten. Die Fraktionen 3 bis 8 enthalten hauptsächlich C-076 AI-Komponenten (40,2 g Ala und 6,7 g Alb), und die Fraktionen 29 bis 36 enthalten C-076 A2-Verbindungen (117,2 g A2a und 7,35 g A2b). Die Fraktionen 9 bis 28 enthalten ein Gemisch aus C-076 AI- und A2-Verbindungen.

Beispiel 12

Eine Probe aus 150 g C-076 B1 von Beispiel 12 wird in 31 einer Lösungsmittelmischung aus Hexan/Toluol/Methanol in einem Verhältnis von 3:1:1 gelöst. Die Lösung wird durch eine Sephadex LH-20-Säule (mit den gleichen Abmessungen wie die in Beispiel 11 verwendete) in dem obien Lösungsmittel geleitet, wobei man Fraktionen in einer Rate von 250 ml/min entnimmt. Zwei 201 Teile des Lösungsmittelgemisches werden gesammelt und verworfen und dann wird ein Vorlauf von 101 entnommen und verworfen. Dann werden dreissig reiche Fraktionen von je 21 genommen. Die Fraktionen 1 bis 13 und 25 bis 30 werden verworfen. Die Fraktionen 14 bis 16 werden vereinigt und enthalten 80 g hauptsächlich C-076 Bla. Die

Fraktionen 22 bis 24 werden vereinigt und sie enthalten 6,7 g hauptsächlich C-076 Blb. Die Fraktionen 17 bis 21 enthalten ein Gemisch von C-076 Bla und Blb.

Die obigen Fraktionen 17 bis 21 werden vereinigt und 5konzentriert und durch eine Sephadex LH-20-Säule mit dem gleichen Lösungsmittelsystem wie oben geleitet. Drei 201 Vorläufe werden entnommen und verworfen. Die reichen Fraktionen werden dann folgendermassen genommen: 5 Fraktionen von je 21 (Fraktionen 1 bis 5); 20 Fraktionen von ìoje 11 (Fraktionen 6 bis 25) und 10 Fraktionen von je 21 (Fraktionen 26 bis 35). Die Fraktionen 1 bis 15 werden verworfen; die Fraktionen 16 bis 21 enthalten 13,5 g (C-076 Bla und 0,4 g C-076 Blb; die Fraktionen 22 bis 26 enthalten 44 g C-076 Bla und 0,13 g C-076 Blb; die Fraktionen 27 bis 30 i5enthalten 10,2 g C-076 Bla und 0,8 g C-076 Blb.

Beispiel 13

Ein Gemisch aus allen acht C-076-Komponenten wird an einer Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule 2o 4 mm x 30 cm, die mit 10 Mikron ji Bondapack C|8 Silikagel (erhältlich von Waters Associates Inc., Maple Street, Milford, Massachusetts 01757) gepackt ist, chromatographiert und mit 85:15 (Vol/Vol) Methanol/Wasser bei konstant 40 °C eluiert. Bei einer Strömungsrate von 1,2 ml/min werden alle acht Ver-25 bindungen getrennt und die Elutionsvolumina, die unter den zuvor beschriebenen konstanten Bedingungen für die einzelnen Verbindungen charakteristisch sind, sind die folgenden.

Elutionsvolumen (Ve), ml

C-076B2b

5,90

C-076 B2a

6,52

C-076 A2b

7,12

C-076 A2a

7,88

C-076Blb

8,36

C-076 Bla

9,60

C-076Alb

10,24

C-076 Ala

11,88.

40 Die Trennung der C-076 «b»-Komponenten von den entsprechenden «a»-Komponenten erfolgt unter Verwendung solcher Verfahren, wie der Hochdruckflüssigkeitschromatographie. Eine absolute Methanollösung von 30 jj.1 eines Gemisches aus C-076 Ala und Alb, das geschätzt 30 Hg C-076 Alb enthält, wird auf 45 eine 3 x 250 mm Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule gegeben, die Spherisorb 5 micron ODS (erhältlich von Spectra Phy-sics) als Packung enthält. Die Säule wird mit 85:15 Methanol/ Wasser in einer Rate von 0,15 ml/min eluiert. Die Elution der Produkte wird verfolgt, indem man die Ultraviolettabsorption 50 des eluierten Materials beobachtet und die einzelnen Komponenten am Ausgang des UV-Messgeräts sammelt. 30 |xg C-076 Alb werden gewonnen und in einem Massenspektrometer analysiert. Das Massenspektrum dieser Probe ist in der zweiten Spalte von Tabelle III aufgeführt.

C

4 Blatt Zeichnungen

Claims (20)

1. 639 422

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen C-076 der Formel

   R-0

   CH,

   in der

   R

   30

   35

   bedeutet, die gestrichelte Linie eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet, 40

   R.! Hydroxy bedeutet und nur vorhanden ist, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet,

   R2 Isopropyl oder sek. Butyl ist und

   R3 Methoxy oder Hydroxy bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man einen C-076 erzeugenden Stamm von « Streptomyces avermitilis in einem wässrigen, eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, eine assimilierbare Stickstoffquelle und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen fermentiert und C-076 aus der Fermentationsbrühe gewinnt. 50
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   dass man als C-076 erzeugenden Stamm Streptomyces avermitilis (NRRL 8165; ATCC 31267) verwendet.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   dass die Fermentation bei einer Temperatur von 20 bis 40 "C ss und einem pH-Wert von 5,0 bis 9,0 durchgeführt wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

   dass die Temperatur 24 bis 30 °C beträgt und der pH-Wert 6,0 bis 7,5 beträgt.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, 60 dass das Nährmedium 0,5 bis 5 Gew.-% Kohlenstoffquellen und 0,2 bis 6 Gew.-% Stickstoffquellen enthält.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,

   dass die Fermentation während 1 bis 8 Tagen durchgeführt wird. 65
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,

   dass man als C-076 erzeugenden Stamm Streptomyces avermitilis (NRRL 8165; ATCC 31267) verwendet.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Fermentationsmedium filtriert.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man C-076 durch Filtration des Fermentationsmediums, Extraktion des Myzeliums mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, Verdampfen des organischen Lösungsmittels und Extraktion des Rückstands mit einem mit Wasser unmischbaren organischen Lösungsmittel gewinnt.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in erhaltenen Verbindungen der Formel I die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet, R2 Isopropyl und R3 Methoxy sind.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in erhaltenen Verbindungen der Formel I die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet, R2 Isopropyl und R3 Hydroxy sind.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in erhaltenen Verbindungen der Formel I die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet, R2 sek. Butyl und R3 Methoxy sind.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in erhaltenen Verbindungen der Formel I die gestrichelte Linie eine Doppelbindung bedeutet, R2 sek. Butyl und R3 Hydroxy sind.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in erhaltenen Verbindungen der Formel I die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet, R) Hydroxy, R2 Isopropyl und R3 Methoxy sind.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in erhaltenen Verbindungen der Formel I die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet, R] Hydroxy, R2 Isopropyl und R3 Hydroxy sind.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in erhaltenen Verbindungen der Formel I die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet, R, Hydroxy, R2 sek. Butyl und R3 Methoxy bedeuten.
17. 17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in erhaltenen Verbindungen der Formel I die gestrichelte Linie eine Einfachbindung bedeutet, R] Hydroxy, R2 sek. Butyl und R3 Hydroxy sind.
18. 18. Verwendung der nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 erhaltenen Verbindungen als Wirkstoffkomponente in Schädlingsbekämpfungsmitteln.
19. 19. Verwendung nach Anspruch 18 in Schädlingsbekämpfungsmitteln des Haushalts.
20. 20. Verwendung nach Anspruch 18 in Schädlingsbekämpfungsmitteln der Landwirtschaft.