DK146514B - Fremgangsmaade til fremstilling af antiparasitisk virksomme c-076-forbindelser - Google Patents

Description

148514 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte antiparasitisk virksomme forbindelser kaldet C-076-Ala, -Alb, -A2a, -A2b, -Bla, -Blb, -B2a og -B2b med formlen CK3 7~0 CVo «o -\_J~ 0 —W—0 '^VxAUjLr?

CK30^ Qll2° J

SV

Y

R? 2 3 hvori X-Y, R og R har følgende betydninger: 2 3

X-Y R R

Ala CH=CH butyl -0CH3

Alb CH=CH propyl -OCH^ A2a CH2-CH0H butyl -0CH3 A2b CH2CH0H propyl _0CH3

Bla CH=CH butyl -OH

Bib CH=CH propyl -OH

B2a CH2-CH0H butyl -OH

B2b CH2-CH0H propyl -OH

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Baseret på taxonomiske studier kan de mikroorganismer, som er i stand til at producere ae omhandlede C-076 forbindelser, karak-etriseres som tilhørende en hidtil ukendt art af slægten Strep-tomyces, betegnet Streptomyces avermitilis. En sådan kultur iso- 146514 2 leret fra en jordprøve er betegnet MA-4680 i kultursamlingen tilhørende Merck & Co., Inc. Rahway, New Jersey. En prøve heraf er optaget i den permanente kultursamling tilhørende Northern Utilization Research Branch, U.S. Department of Agriculture at Peoria, Illinois, hvor den er registreret under nummeret NRRL 8165. En prøve af NRRL 8165 er også uden begrænsninger med hensyn til tilgængelighed optaget i den permanente kultursamling tilhørende American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hvor den har fået registreringsnummeret ATCC 31267.

De morfologiske og kulturmæssige egenskaber for Streptomyces a-vermitilis fremgår af det efterfølgende: Morfologi: Sporoforer-ne danner spiraler som sidegrene på luftmyceliet. Spiralerne er kompakte, men bliver mere åbne med kulturens alder. Sporer findes i kæder på mere end 15 sporer og er sædvanligvis sfæriske til ovale ved en forstørrelse på 970 gange. Sporedannelse er blevet observeret på havremelagar, glycerol-asparginagar, salte-stivelsesagar og ægalbuminagar.. Sporeoverflade er glat ved betragtning i elektronmikroskop.

Hvedemelagar

Vegetativ vækst: Bagside - meget mørk brun

Luftmycelium: Pulveragtig, brunliggråt (41i)x blandet med hvidt

Opløseligt pigment: Brunt

Czapek Dox agar (saccharosenitratagar)

Vegetativ vækst: Dårlig, farveløs

Luftmycelium: Sparsom, gråligt

Opløseligt pigment: Lysegråt tanfarvet Ægalbuminagar

Vegetativ vækst: Tanfarvet

Luftmycelium: Moderat, lysegråt, gulligbrunt (3ge)x blandet med hvidt

Opløseligt pigment: Lysegulligt tanfarvet 146514 3

Glycerolasparaginagar

Vegetativ vækst: Bagside - gulligbrun

Luftmycelium: Pulveragtig, brunligggråt (41i)x blandet med hvidt

Opløseligt pigment: Lyst, gulligbrunt

Uorganiske salte-stivelseagar

Vegetativ vækst: Bagside - gråliggulligbrun

Luftmycelium: Pulveragtig, lysebrunlig gråt (4ig) kantet med

o X

mørkere brunliggråt (41i)

Opløseligt pigment: Lysegullig brunt Gærekstrakt-dextrose + salteagar

Vegetativ vækst: Bagside - mørkebrun

Luftmycelium: Moderat, brunlighvidt

Opløseligt pigment: Brunt Gærekstrakt-maltekstraktagar

Vegetativ vækst: Bagside - mørkebrun

Luftmycelium: Moderat, brunlighvidt

Opløseligt pigment: Brunt

Pepton-jern-gærekstraktagar Vegetativ vækst: Mørkebrun

Luftmycelium: Intet

Opløseligt pigment: Mørkebrunt til blåt

Melanin; Positiv produktion: Positiv Næringsagar

Vegetativ vækst: Tan

Luftmycelium: Sparsomt, gråligt

Opløseligt pigment: Lysebrunt Næringsstivelsesagar Vegetativ vækst: Tan

Luftmycelium: Sparsomt, grålighvidt

Opløseligt pigment: Lysebrunt

Hydrolyse af stivelse: God

Kartoffelstykker

Vegetativ vækst: Tan

Luftmycelium: Brunt blandet med grålighvidt

Opløseligt pigment: Gråligbrunt

Loeffler's blodserum

Vegetativ vækst: Gråligtan

Luftmycelium: Intet 146514 4

Opløseligt pigment: Nogen brunfarvning af mediet

Smeltning: Ingen Nær ings - ty r o s ihagar

Vegetativ vækst: Bagside - mørkebrun til sort

Luftmycelium: Sparsomt, gråligt

Opløseligt pigment: Mørkebrunt

Dekomponering af tyrosin: Ingen

Carb o nUdnyt t e1s e

Pridham-Gottlieb basalmedium +1¾ carbonkilde; + = vækst; - = ingen vækst i sammenligning med negativ kontrol (ingen carbonkilde)

Glucose +

Arabinose +

Cellulose

Fructose +

Inositol +

Lactose +

Maltose +

Mannitol +

Mannose +

Raffinose +

Rhamnose +

Saccharose +

Xylose + Næringsgelatineagar

Vegetativ vækst: Tan

Luftmycelium: Sparsomt grålighvidt

Opløseligt pigment: Lysebrunt

Smeltning af gelatine: God

Gelatine-stikkulturer

Vegetativ vækst: Brun ring

Luftmycelium: Intet

Opløseligt pigment: Grønligbrunt

Smeltning af gelatine: Komplet

Skummetmælkagar

Vegetativ vækst: Mørkebrun

Luftmycelium: Intet

Opløseligt pigment: Mørkebrunt 5 14651Λ

Hydrolyse af casein: God .Lakmusmælk

Vegetativ vækst: Mørkebrun vækstring

Luftmycelium: Intet

Farve: Mørkebrun

Koagulation og/eller peptonisation: Komplet peptonisation; bliver alkalisk (pH=8,l)

Skummetmælk

Vegetativ vækst: Mørkebrun vækstring

Luftmycelium: Intet

Opløseligt pigment: Mørkebrunt

Koagulation og/eller peptonisation: Komplet peptonisation; bliver alkalisk (pH=8,0)

Temperaturområde: (gærekstrakt-dextrose + salte-agar) 28°C - God vegetativ vækst og luftmycelium 37°C - God vegetativ vækst og luftmycelium 50°C - Ingen vækst

Oxygenbehov: (Stikkulturer i gærekstrakt-dextrose + salte-agar)

Aerob

Alle observationer er taget efter tre uger ved 28°C, med mindre andet er bemærket. pH-værdien af alle medier var tilnærmelsesvis neutral (6,8 - 7,2).

Farvetalsbetegnelserne (x) stammer fra Color Harmony Manual, 1958, 4. udgave Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

En omhyggelig sammenligning af de ovennævnte data med publicerede beskrivelser, herunder Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. udgave) af kendte mikroorganismer afslører betydelige forskellé herfra,, hvilket indicerer, at den omhandlede mikroorganisme må være en hidtil ukendt art. I overensstemmelse hermed har den fået betegnelsen Streptomyces avermitilis.

Ovennævnte beskrivelse er illustrerende for en stamme af Streptomyces avermitilis, der kan anvendes til fremstilling af C-076 146514 6 forbindelser. Sådanne mutanter af den ovenfor beskrevne mikroorganisme, som er opnået ved naturlig udvælgelse eller fremstillet ved hjælp af mutationsfremkaldende midler, såsom røntgenbestråling, ultraviolet bestråling, kvælstofholdig sennepsgas eller lignende behandling, og hvis egenskaber ikke afviger væsentligt fra ovennævnte beskrivelse kan også anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Et eksempel på en sådan organisme er Streptomyces avermitilis MA 4848, som blev isoleret efter bestråling med ultraviolet lys af Streptomyces avermitilis MA 4680. Et lyofiliseret prøverør og en frossen ampul af denne kultur er deponeret i den permanente kultursamling tilhørende American Type Culture Collection, hvor de er registreret under numrene henholdsvis 31272 og 31271. Et lidt højere gæringsudbytte af C-076 er opnået under anvendelse af den frosne prøve som podemateriale.

Forbindelserne C-076 produceres ved aerob fermentation af egnede vandige næringsmedier under de i det efterfølgende beskrevne betingelser med en aktiv stamme af Streptomyces avermitilis. Vandige medier af konventionel art til fremstilling af mange antibiotiske stoffer egner sig også ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af C-076.

Sådanne næringsmedier indeholder kilder for carbon og nitrogen, der kan assimileres af mikroorganismer, samt lave koncentrationer af uorganiske salte. Desuden kan gæringsmediet indeholde spor af metaller, som er nødvendige for væksten af mikroorganismerne. Disse findes sædvanligvis i tilstrækkelig koncentration i de komplekse kilder for carbon og nitrogen, som kan anvendes som næringskilde, men de kan selvfølgelig tilsættes separat til mediet, hvis der er behov herfor.

Eksempler på egnede carbonhydrater er sukkerstoffer, f.eks. dextrose, saccharose, maltose, lactose, dextran, cerelose samt stivelse, der kan assimileres. Den nøjagtige mængde carbonkilde, som 7

14651A

kan udnyttes i mediet, vil delvis afhænge af de andre bestanddele i mediet, men sædvanligvis er det tilfredsstillende at benytte en mængde mellem 0,5 og 5 vægtprocent af mediet. Disse carbonkilder kan anvendes enkeltvis, eller flere sådanne carbonkilder kan kombineres i samme medium.

Forskellige nitrogenkilder, såsom gærhydrolysat, gærautolysat, sojabønnemel, caseinhydrblysat, gærekstrakter, majsstøbevæske, distillers solubles, bomuldsfrømel, kødekstrakt og lignende, kan let assimileres af Streptomyces avermitilis til fremstilling af C-076 forbindelser. De forskellige nitrogenkilder kan anvendes alene eller i kombination i mængder fra 0,2 til 6 procent efter vægt af mediet.

Blandt uorganiske salte, der kan inkorporeres i dyrkningsmediet, er de sædvanlige salte, som giver ioner af natrium, kalium, magnesium, ammonium, calcium, phosphat, sulfat, chlorid og carbonat. Også omfattet er spormetaller, såsom cobalt, mangan og jern.

I det efterfølgende er angivet eksempler på medier, der er egnede til dyrkning af stammer af Streptomyces avermitilis til fremstilling af C-076 forbindelser.

Medium A

Majsmel 20,0 g

Distiller's solubles 10,0 g

Sojabønnemel 15,0 g

Natriumcitrat 4,0 g

CaCl2.2H2O 0,5 g

Polyethylenglycol med gennemsnitsmolvægt på 2000 2,5 ml

MgSO4.7H20 0,1 g

CoCl2.6H20 0,01 g

FeS04.7H20 0,01 g

Destilleret vand . 1000 ml pH 6,5 146514 8

Medium B

Opløselig stivelse 20,0 g

Majsstøbevæske 15,0 g

Cerelose 5>0 g

Sojabønnemel 4,0 g (NH4)2S04 4,0 g

Maj siftel 1,0 g

Sojabønnemel 2,5 ml XH2P04 0,3 g

CaC03 6,0 g

Destilleret vand 1000 ml pH 6,7

Medium C

Tomatpasta 40,0 g * Havremel 15,0 g

Destilleret vand 1000 ml

Medium D

Havremel 20,0 g

Tomatpasta 20,0 g

Destilleret vand 1000 ml

Medium E

Dextrose 10,0 g

Pepton (fra Difco Laboratories,

Detroit, Michigan) Gærautolysat (Ardamine pH fra Yeast Products Inc., Paterson, New Jersey)

NaCl 12,7 g KC1 0,72 g

FeS04(NH4)2S04.6H20 0,035 g

MgCl .6H20 5,32 g

CaCl2.2H20 0,73 g

Destilleret vand 1000 ml pH 7,4

U65U

9 Gæringen ved hjælp af de C-076 producerende mikroorganismer kan udføres ved temperaturer mellem 20 og 40 °C. For opnåelse af optimale resultater er det hensigtsmæssigt at gennemføre gæringen ved temperaturer mellem 24 og 30 °C. Temperaturer på 27 - 28 °C er særlig foretrukket. pH-værdien af næringsmediet kan variere mellem 5,0 og 9,0, men fortrinsvis indstilles pH-værdien på 6,0 - 7,5. Gæring i lille målestok udføres hensigtsmæssigt ved at indføre en passende mængde næringsmedium i en kolbe under sterile betingelser, pode kolben med enten sporer eller vegetativ cellulær vækst af en C-076 producerende stamme af Streptomyces avermitilis, lukke kolbehalsen løst med en vatprop og gennemføre gæringen ved konstant temperatur på ca. 28 °C i et roterende rysteapparat i 3 - 10 dage. For produktion i større målestok foretrækkes det at udføre gæringen i egnede tanke, som er udstyret med omrører og midler til luftning af gæringsmediet. Næringsmediet oparbejdes i tanken, og efter sterilisation podes det med en egnet kilde af vegetativ cellevækst af C-076 producerende stamme af Streptomyces avermitilis.- Gæringen bringes til at forløbe i et tidsrum på 1 til 8 dage under omrøring og/eller luftning af næringsmediet ved en temperatur mellem 24 og 37 °C. Luftningsgraden afhænger af flere faktorer, såsom størrelsen af gæringsbeholderen, omrøringshastigheden og lignende. Sædvanligvis bliver gæringer i stor målestok udført ved omrøring ved 95-150 omdrejninger pr. minut og med 60 til 600 liter luft pr. minut.

De fremstillede hidtil ukendte forbindelser C-076 forekommer fortrinsvis i myceliet efter afslutning af gæringen med Streptomyces avermitilis, og de kan udvindes ved separation som angivet i det efterfølgende. Fire hovedkomponenter og fire mindre komponenter af C-076 er fremstillet af Streptomyces avermitilis og er isoleret hver for sig. De otte forskellige forbindelser er identificeret og er betegne't C-076 Ala, Alb, A2a, A2b, Bla, Blb, B2a og B2b. Hovedkomponenterne har fået suffixet "a", medens de mindre komponenter har fået suffixet "b". Strukturforskellen mellem forbindelserne a og b er de samme for hver af de fire par.

Ved den beskrevne gæring fås forbindelserne Al sædvanligvis i

U65U

ίο en mængde på 20 til 30 vægtprocent af den totale mængde aktive forbindelse, A2 forbindelserne fås i en mængde på 1 til 20 procent, og Bl og B2'forbindelserne fås hver i mængder på 25 til 35 procent. Vægtforholdet mellem forbindelserne af a-serien og b-se-rien ligger mellem 85:15 og 99:1.

Adskillelsen af c-076 forbindelserne fra gæringsvæsken og udvindingen af de enkelte komponenter udføres ved ekstraktion med opløsningsmiddel og anvendelse af kromatografiske fraktioneringer på i og for sig kendt måde.

Forbindelserne C-076 har en ringe opløselighed i vand, men de er opløselige i organiske opløsningsmidler. Denne egenskab kan hensigtsmæssigt anvendes til at udvinde dem fra gæringsvæsken. Ved en udvindingsmetode bliver således hele gæringsvæsken filtreret, og det vandige substrat bortkastet. Den våde kage af mycelium ekstraheres derefter med et passende organisk opløsningsmiddel. Selv om der kan anvendes et vilkårligt egnet opløsningsmiddel, foretrækkes det at anvende et med vand blandbart opløsningsmiddel, såsom acetone, methanol eller ethanol. Sædvanligvis udføres flere ekstraktioner for at opnå maksimalt udbytte. Opløsningsmidlerne udtrækker de aktive komponenter C-076 samt andre stoffer uden antiparasitisk aktivitet.

Hvis opløsningsmidlet er blandbart med vand, bliver også vandet udtrukket af det våde mycelium. Det ekstraherede mycelium bortkastes. Opløsningsmiddelekstrakterne inddampes til fjernelse af det organiske opløsningsmiddel og ekstraheres flere gange med endnu et opløsningsmiddel. Hvis der ved den første ekstraktion anvendes et med vand blandbart opløsningsmiddel, foretrækkes det ved den anden ekstraktion at anvende et med vand ublandbart opløsningsmiddel, såsom chloroform, methylenchlorid, carbontetrachlorid, ethylacetat, methylethylketon eller methylisobutylketon. De sidstnævnte ekstrakter tørres' og inddampes på i og for sig kendt måde til opnåelse af en remanens indeholdende C-076 blandet med andre stoffer. Denne fraktion kan derefter hensigtsmæssigt kromatograferes for at adskille de aktive komponenter C-076 fra andre stoffer samt for at adskille og isolere de enkelte C-076 komponenter. De kromatografiske metoder, som anvendes til at rense C-076 forbindelserne, er af i og 146514 11 for sig kendt art. Eksempler på sådanne metoder er kolonnekromatografi under anvendelse af sådanne medier som silica-gel, aluminiumoxid, dextrangeler og lignende, og eluering af sådanne kolonner med forskellige opløsningsmidler, og/eller en kombination af to eller flere opløsningsmidler i forskellige forhold. Væskekromatografi anvendes til påvisning af C-076 forbindelserne, og højtryksvæskekromatografi kan anvendes til at isolere rensede fraktioner indeholdende en eller flere sådanne forbindelser. Ligeledes kan tyndtlags-kromatografi anvendes til at påvise tilstedeværelsen af og at isolere de enkelte C-076 forbindelser. På denne måde er det muligt at udvinde C-076 forbindelserne i ren tilstand. Tilstedeværelsen af de aktive forbindelser bestemmes ved at analysere de forskellige kromatografiske fraktioner for antiparasitisk aktivitet samt ved bestemmelse af de spektrale egenskaber, såsom ved ultraviolet eller infrarød spektrografi, som det er beskrevet i det efterfølgende.

Spektrale og andre fysisk-kemiske egenskaber for de enkelte C-076 forbindelser fremgår af efterfølgende tabel I. Disse forbindelser er let opløselige i de sædvanlige organiske opløsningsmidler og har en minimal opløselighed i vand.

De ultraviolette spektraldata,som findes i tabel I, blev opnået med en Cary model 15 ultraviolet spektrometer i methanolopløsninger i 1 cm kvartsceller. Koncentrationen af forbindelsen var cirka 25 pg/ml. Den ultraviolette absorption, som er anført for en forbindelse af a-serien, er i virkeligheden absorption af forbindelsen fra a-serien indeholdende en mindre mængde af en forbindelse fra b-se-rien. Forbindelserne fra a- og b-serierne afviger kun ved en -Cl^-del i en alkylsubstituent, hvilken forskel ikke er forbundet med den kromofore gruppe. Ultraviolet absorption karakteriserer primært graden og naturen af umættethed, som forekommer i den pågældende forbindelse. De optiske rotationer blev bestemt ved standardteknik med et Karl Zeiss-polarimeter. Koncentrationsfaktoren (c) er givet som en procent af forbindelsen i det angivne opløsningsmiddel.

12 146514

1J1 rH

o 42 cm \o CM t-~- c-~ pq -X oo t-- d

U

LO o * •'z—\ Λ t—\ * —\ ,_| CM ,-H OH O vo O CS| O +1 r-» oo^· cn co vo o

cd d O oo O ts LO d COO d CM O tO

CM C". to ^ CTl to · *d · *LO · k pq *>o oo n n >d co d-N o d·

00 oo II CM to CM

d to U WWW

U + s-' d

rW

o 42 O 00 H t to CQ OS oo C'- d u «s- O · »>/ \ ·» / v · *1—»

r—I CM r—1 O d O tO OH

o +IVO CM vO LO O i-H tO

cd CM O o CM t-· r-H d toe LO CM IO d i ts r- ·> t-s to · -'d· · *-to · ·· pq 22 «Η CO N crt d CMH dNOd

oo LO || CM to CM

d LOU WWW

U + s-'

LO

rH

tH O

40 d o ,j cm C" σι w < as «s P5 oo < -d-

H U

LO O "»/“S ·* HH ··>/—!

i—I CM t—i O Cl O iH LO O

o + I d O LO d O CM (—I

CtJvOOO d r~- oo d MS LO CM d LO

(M CH 00Λ O CO*sd#sLO«s

<ζ X <νγΗ σι CM 00 d CMH d CM O dial 00 II CM to - CM

d dU WWW

U + S_/ d

rH

o

42 CM CM

rH t" IH

- < as oo

00 d U

dl" O /—I · s,—> · ~ -—> · “/-s rH CM Ih O 00 LO LO O Is O +i t-~ o lo es- σι σι o

Cd d O ·> VO Nt^d tOM df CM CM to rH C·» LO O 00 to * sd· s LO · ·.

<; HS r l[ oo CM CO d CMH d CM o d σι oo u cm to cm \o '_> <—' W w u +

1—V

•H

id

Pf +j

O HH O

rH ·Η to S

O +-> rH dj O I

S cd O +-> 0 * -pen μ -p 3S oo>-p ø pj hh ~ o o u & 44 r—i o ft u/ m i-i s_/ > P 0 O-H S g (3, rH H gft •HP3'-/ “

>> 44 0 Μ > ft P

44 en IH 44 -P 0 cd f-ι P >4 Φ ·η nQ I) in vi 5-i O 44 cd -s rH -P ts rH 0 tf) -P tf) 0 g o p< ,cd’ o m cd rHjqfti'- 2 O ΉΙ 2 s_/ g ft cd vi o’,

13 14651A

I efterfølgende tabel II er anført 13C kernemagnetiske reso-nansspektrale data for C-076 Ala, A2a, Bla og B2a. Spektrene er opnået ved hjælp af et Varian kernemagnetisk spektrometer model CFT-20 i deutereret chloroformopløsning ved hjælp af tetramethylsilan som intern standard. Opløsningsrumfanget og koncentrationen af prøven er givet for hvert tilfælde, efterfulgt af kemisk skift i forhold til tetramethylsilan for hver forbindelse givet i dele pr. million (ppm). De kemiske skift er angivet for et enkelt carbonatom, med mindre andet er angivet i et parentetisk udtryk efter det kemiske skift.

TABEL II

Al (0,6 ml 16¾)___ 12.0, 13,0, 15,1, 16,4, 17,7, 18,4, 19,9, 20,3, 27,5. 30,6, 34.3 (3C), 35,2, 36,6, 39,7, 40,5, 45,7, 56,4 (2C), 57,7, 67.3, 68,2 (2C), 68,4 (2C), 74,9, 76,1, 77,0, 77,5, 78,3, 79,4, 80,6 (2C), 82,0, 95,0, 95,8, 98,5, 118,4 (2C), 119,7, 124,9, 127.8, 135,2, 136,0, 136,1, 137,6, 139,9, 173,8.

A2 (0,6 ml 16¾)_ 11.8, 12,4, 13,8, 15,1, 17,7, 18,4, 19,9 20,3, 27,3, 34,3 (3C), 35,2, 35,8, 36,5, 39,8, 40,8, 41,2, 45,7, 56,4 (2C), 57.7, 67,3, 67,7 68,2 (3C), 69,9, 70,8, 76,1,.77,0, 77,6, 78,3, 79.4, 80,6 (2C), 81,8, 94,9, 98,6, 99,7, 117,7, 118,4, 119,7, 124,9, 135.7, 136,1, 137,6, 140,0, 173,7.

Bl (0,3 ml 16¾)______ 12.0, 12,9, 15,1, 16,4, 17,7, 18,4, 19,9, 20,2, 27,5, 30,6, 34.3 (30, 35,2, 36,6, 39,8, 40,5, 45,7, 56,4 (2C), 67,3, 67.8, 68,2 (2C), 68,4 (2C), 75,0, 76,1, 78,3, 79,4 (2C), 80,5 (2C) , 82,0, 95,0, 95,8, 98,5, 118,1, 118,4, 120,4, 124,8, 127,9, 135,2, 136,2, 137,9 (2C), 139,7, 173,6.

B2 (0,6 ml 16¾)_ 11.8, 12,4, 13,8, 15,1, 17,7, 18,4, 19,9, 20,2, 27,3, 34,4 14 1465 ΙΑ (3C), 35,2, 35,8, 36,5, 39,8, 40,8, 41,2, 45,8, 56,4 (2C) , 67,3, 67,7 (2C) 68,3 (3C), 69,9, 70,9, 76,1, 78,3, 79,4 C2C), 80,5 (2C), 81,8, 94,9, 98,6, 99,7, 117,7, 118,0, 120,4, 124,8, 135,7, 138,0 (2C), 139,8, 173,5.

De karakteristiske massespektraltoppe for de otte C-076 forbindelser er angivet i tabel III. Den første linie af tabel III repræsenterer forholdet mellem masse og ladning (m/e) af mole-kylionen af hver af de respektive forbindelser, og de resterende tal angiver forholdet mellem masse og ladning af hovedfragmentet for hver forbindelse. Forholdene masse til ladning i samme horisontale række angiver analoge fragmenter i hver forbindelse. Forholdene masse til ladning, som er angivet som hele tal, blev opnået ved hjælp af et LKB-massespektrometer model LKB-9000. Forholdene masse til ladning, som er givet med fire decimaler, blev opnået med et massespektrometer med høj opløsningsevne af typen Varian model MAT-731.

15

U6BU

»Q \0CMOCNCMfti— Μ ΝΙΛΝ1Α^·θσΐ€1ΛΝ010>Ν'ίΙΊΝΗΟ>00 pq odnww^mnnnnhhhhhhh 0 ft ft o cd ovo-d-vOOtøtoi—it--o>rHOioiLor--t--tøLoi--

μ (Μ Ot«5j-OOVDLncMO\Oi0t0rHOit--^i-tOCMi-HO>OO

pq «ΙΝίηΐΛ^ιΛΜΝΝΝΝΗΗΗΗΗΗ 0

rH

Cd μ μ Ρ4 w eo ν ri- ν η i-Hr^t'-oiotLOLOt'-r'-t'Otot'·-

0 τ—ι ιο rH ιο to -3- σ> lomoNPici^KiNHcsM

HH ft Μ (β s LO ΙΛ Ν ΝΝΝΗΗΗΗΗΗΗ HH Cη ΗΗ 0 (Λ Η w γη σι

Wcd to to pq S γ-h i—t < to ft Hø '

cd CM OO VO OO Ό 10 HNHWqmiflNNMWN

ι/j H n n Ό d· w o voiocMOioivo^t-tocMi-iaioo

•H pq æ N ΙΛ ΙΛ d- M CMCMCMi-Hi-HrHi-IrHi-HrH

μ

CP

•H

μ ON

0 r- >3- μ O lo

P4 CM rH

cd *· * μ ,Q Ο\Ο·3·ΝΝΟ1ι-|ΐ0Γ··-ΐ0Ι--σΐσιΐ-Οί--[-.ίΟ<0Ρ~ cd cm mdcoifldOOiNuiNmaNd-fONHOii» & < 00C--lØIØ*d-tOCMCM(NlCMrH<-Hi-HtHi-li-li-l tø r·- η ό CM CM cn t--

CM vO Vø O

CM i—li—li—I

fa» *» fa.

o} ^tooovovotOLOLor^c^THCJicnLor^r^tOLnt^ (NI ΟνΟζΛ^ηΝΟΝ^^Η^Ν^ΚίΝΗσίΟΟ < 0)Ν1Λ10^Κ)Κ)ΝΝ(Ν(ΝΗΗΗΗΗΗ LO CM cr>

vO Ό CM

cm cn h·

CO rH rH

4D CM CO Ό H" CM rH LOC^I^CDCriLOLnr^r^tOLOt^

rH t^CMOlO^-Ci SWONO^in^tONHOiOO

< CO N ΙΛ ΙΛ ^ M CMCMCMrHrHrHrHrHrHrH

CMCTivOvOvOO CMCMr^t^rHOt^-^'^i-'^-vO^' N N O ΙΛ CO (M O^OOCMOOOCMVOLOLOOO^ O CM rH CO H NtOlOiOHNCOQNO^^·

LO ro to CM CM rHrHtHrHHiHOOOOOO

* * * * »* *· rt vo cm o co o lo Loc*v.^-iroa^a^Lor>-r^tOLor^

iH CO ^ 00 ^ lO O h^MQ^vO^tOCMrlO^CO

< Μ N ΙΛ ΙΛ ^ tO CMCMCMrHrHrHrHrHrHiH

146514 16

Vedlagte figurer 1 til 8 er nøjagtige reproduktioner af de infrarøde og proton-kernemagnetiske resonansspektre for fire af C-076 forbindelserne. Figurerne 1-4 er infrarøde spektre fra C-076 Ala, A2a, Bla og B2a, respektivt. Figur 5 til 8 er proton-kernemagnetiske spektre for.C-076 Ala, A2a, Bla og B2a, respektivt. De infrarøde spektre er opnået ved hjælp af et Perkin-Elmer infrarødt spektrometer model 421 i chloroformopløsning. De proton-kernemagnetiske resonansspektre blev opnået i deutereret chloroformopløsning i et kernemagnetisk resonansspektometer af typen Varian model HA-100, og spektrene viser kemiske skift angivet i dele pr. million (ppm) i forhold til tetramethylsilan som intern standard.

Baseret på eksperimentelle data, herunder de beskrevne studier og målinger, må den sandsynlige planære strukturformel for C-076 forbindelserne antages at være følgende: ®3>-0 . CK3>-0 % ^>«3 ^ ° -O”0

Cil.O' ; ·

3 3 i 1 J

.1 . o«j I oh i

Cj- CH3 R? hvori X-Y, R^ og R3 har følgende betydninger: 17

14651A

TABEL IV

2 3

X-Y R RJ

Ala CH=CH butyl -OCH^

Alb CH=CH propyl -OCH^ A2a CH2-CHOH butyl _0CH3 A2b CH2CHOH propyl “0CH3

Bla CH=CH butyl -OH

Bib CH=CH propyl -OH

B2a CH2-CHOH butyl -OH

B2b CH2-CHOH propyl -OH

Som det kunne ventes, vil forbindelserne der fås ved fremgangsmå- 2 den ifølge opfindelsen, hvor R er butyl (a-serierne af forbindel- 2 serne) og den tilsvarende forbindelse, hvor R er propyl (b-se-rierne), opføre sig på samme måde ved de fleste udvindingsprocedurer, såsom ved opløsningsmiddelekstraktion. I hvert par af a-og b-forbindelserne findes a-forbindelsen i en større mængde og udgør sædvanligvis op til 85 til 99% af en blanding af a- og b-forbindelser. Tilstedeværelsen af propylforbindelserne er påvist ved massespektrene af forbindelserne, hvor toppene, som repræsenterer fragmenter indeholdende butylgruppen, har ledsagende toppe med en masse 14 enheder lavere svarende til en CH2~gruppe. Endvidere er højtryksvæskekromatografi anvendt til at adskille Alb-komponenten fra Aia-komponenten, og massespektret af en sådan Alb-komponent er verificeret ved massespektrometri med høj resolution (se tabel III).

De omhandlede forbindelser har en betydelig antiparisitisk aktivitet som anthelmintisk middel, insecticid og acaricid, på mennesker og dyr og i landbruget.

Sygdommen eller gruppen af sygdomme, som benævnes helminthiasis, skyldes infektion på dyr eller mennesker med parasitiske orm ved navn helminthier. Helminthiasis er et dominerende og alvorligt 146514 18 økonomisk problem ved opdrætning a£ husdyr, såsom svin, får, heste, kvæg, geder, hunde, katte og fjerkræ. Blandt helmin-thier er især den gruppe af orme, som kaldes nematoder, årsag til omfattende og ofte alvorlige infektioner af forskellige arter dyr. De mest almindelige slægter af nematoder, der inficerer de nævnte dyr, er Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum,

Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus,

Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylosto-ma, Uncinaria, Toxascaris og Parascaris. Visse af disse, såsom Nematodirus, Cooperia og Oesophagostomum, angriber primært indvoldene, medens andre, såsom Haemonchus og Ostertagia, primært angriber maven, og atter andre, såsom Dictyocaulus, findes i lungerne. Atter andre parasitter kan lokaliseres i andre væv og organer i kroppen, såsom i hjertet og blodkarrene, subcu-tant og lymfatisk væv og lignende. Helminthiasis fører til anæmi, underernæring, svaghed, vægttab, alvorlig beskadigelse af væggene i indvoldene og andre væv og organer, og i ubehandlet tilstand kan der forekomme død af det inficerede dyr. De omhandlede forbindelser C-076 har en uventet høj aktivitet over for disse parasitter, og desuden er de aktive over for Dirofi-laria hos hunde, Nomatospiroides, Syphacia, Aspiculuris hos gnavere, arthropod ectoparasiter på dyr og fugle, såsom blodmider, mider, lus, fluer, spyfluer, på får Lucilia sp., bidende insekter og sådanne vandrende dipterous larver som Hypoderma sp. hos kvæg, Gastrophilus hos heste og Cuterebra sp. hos gnavere.

De véd fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er også velegnede til bekæmpelse af parasitter, som inficerer mennesker. De mest almindelige slægter af parasitter, som kan angribe fordøjelsesorganerne på mennesker, er Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris og En-terobius. Andre medicinsk vigtige slægter af parasitter, der findes i blodet eller andre væv af organerne uden for fordøjelsesorganerne, er trådorme, såsom Wuchereria, Brugia, Onchocerca og Loa, Dracunculus og extra-intestinale trin af indvoldsormene Strongy- 146514 19 loides og Trichinella. Forbindelserne har også værdi mod ar-thropoder, som inficerer mennesker, bidende insekter og andre dipterous skadedyr hos mennesker.

Forbindelserne er også aktive over for hus-skadedyr, såsom kakerlakker, Blatella sp., klæde-møl, Tincola sp., tæppe-biller, Attagenus sp. og husfluen Musca domestica.

Endvidere er forbindelserne egnede mod insekter, der angriber opbevarede korn, såsom Tribolium sp., Tenebrio sp. og landbrugsplanter, såsom edderkopmider (Tetranychus sp.), afider (Acyrthio-siphon sp.); mod vandrende orthopteraner, såsom græshopper og forstadier til insekter, der lever på plantevæv. Forbindelserne er egnede som nematocider til bekæmpelse af nematoder i jord og parasitter på planter, såsom Meloidogyne sp., som har betydning i landbruget.

Forbindelserne kan indgives oralt i enhedsdoser i form af kapsler, piller eller tabletter, eller som flydende medikamenter, når de anvendes som anthelmintier på pattedyr.

Sådanne doser kan variere i henseende til deres totalvægt og indhold af antiparasitisk middel i afhængighed af dyrets art og vægt og infektionens styrke.

Hvis den aktive forbindelse skal indgives sammen med dyrets foder, dispergeres den grundigt i foderet eller anbringes ovenpå dette i form af piller, som kan indgå i det færdige foder eller i et separat fodertilskud. I stedet kan de antiparasitiske forbindelser indgives dyret parenteralt, for eksempel ved intraruminal, intramusculær, intratracheal eller subcutan injektion, i hvilket tilfælde den aktive bestanddel opløses eller dispergeres i et flydende bæremedium.

De enkelte forbindelser kan isoleres og renses og anvendes hver for sig. I stedet kan anvendes blandinger af to eller flere af de enkelte komponenter. Det er ikke nødvendigt fuldstændigt at 146514 20 adskille de forskellige C-076 forbindelser, som er opnået ved rensning af gæringsvæskeri. Sædvanligvis opnås en blanding indeholdende to eller flere af forbindelserne, men uden fremmede forbindelser, og sådanne blandinger kan anvendes til behandling af de beskrevne parasitiske sygdomme. En sådan blanding indeholder sædvanligvis forskellige mængdeforhold af C-076 forbindelserne, men alle forbindelserne har en væsentlig aktivitet, og den anti-parasitiske aktivitet af blandingen kan bestemmes nøjagtigt. Det er især ikke nødvendigt at adskille b-komponenterne fra de beslægtede a-komponenter. Sådanne forbindelser afviger kun i længden af 25-sidekæden. Fraskillelsen af disse nært beslægtede forbindelser gennemføres sædvanligvis ikke, da b-forbindelsen kun findes i meget lille mængde.

Hvis C-076 forbindelserne skal sættes til dyrefoderet, er det muligt at udnytte den tørre kage af mycelium for gæringsvæsken. Myceliet indeholder hovedparten af aktiviteten, og da størrelsen af aktiviteten i myceliet kan bestemmes, kan dette sættes direkte til dyrefoderet.

C-076 forbindelserne er også egnede til bekæmpelse af skadedyr på afgrøder, når disse vokser på marken eller opbevares. Forbindelserne anvendes på i og for sig kendt måde ved på-sprøjtning, forstøvning, som emulsioner eller lignende, på afgrøderne under væksten eller opbevaringen til bekæmpelse af skadedyrene.

Den anthelmintiske aktivitet af C-076 forbindelserne kan bestemmes ved oral indgift via foderet af en prøve af den enkelte C-076 forbindelse , en blanding af disse forbindelser eller en koncentreret ekstrakt, som indgives på en mus, der er inficeret tre dage tidligere med Nematospiroides dubius. Efter 11, 12, og 13 dages forløb efter lægemiddelbehandlingen undersøges musenes afføring for N.dubius-æg, og den næste dag slagtes musen, og antallet af orme, som findes i den nærmeste del af de små indvolde, bestemmes. En aktiv forbindelse iagttages, når der er en væsentlig reduktion af tælletallene for æg og orme i sammenligning med den inficerede, ikke behandlede kontrolgruppe.

U65U

21 I det efterfølgende skal opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af nogle udførelsesekesempler.

Sammensætning af medier

Medium 1

Dextrose 20 g

Pepton 5 g Kødekstrakt 5 g

Primær gær 3 g

NaCl 5 g

CaCQj (efter pH-indstilling) 3 g

Destilleret vand 1000 ml pH = 7,0

Medium 2

Tomatpasta 20 g

Modificeret stivelse (CPC) 20 g

Primær gær 10 g

CoC12,6H20 0,005 g

Destilleret vand 1000 ml pH = 7,2 - 7,4 EKSEMPEL 1

Et lyofiliseret prøverør af Streptomyces avermilitis MA-4680, NRRL 8165 åbnes aseptisk, og indholdet suspenderes i 50 ml medium 1 i en luftet 250 ml konisk kolbe. Denne rystes i tre dage ved 28 °C i en roterende rystemaskine med 220 omdrejninger pr. minut med en slaglængde på 50 mm. En 0,2 mm portion af dette podemedium anvendes til podning af en skråkultur af medium 3. Det podede skråkulturmedium dyrkes ved 28 °C i 10 dage og opbevare^ ved 4 °C indtil anvendelsen til podning af yderligere fire skråkulturer af medium 3. Disse skråkulturer dyrkes i mørket i otte dage. En af de nævnte skråkulturer anvendes til podning af 3 luftede 250 146514 22 ml koniske kolber indeholdende 50 ml pr. nr. 4 podemedium. Podekolberne rystes i 2 dage ved 27 - 28 °C i en roterende rystemaskine ved 220 omdrejninger pr. minut med en slaglængde på 50 mm. Indholdet af disse kolber samles og anvendes til podning (5% podemateriale) af beluftede 250 ml koniske kolber indeholdende 40 ml af forskellige produktionsmedier. Kolberne indeholder medierne 2, 5 og 6 og dyrkes i 4 dage ved 28 °C i en roterende rystemaskine ved 220 omdrejninger pr. minut med en slaglængde på 50 mm. Den dannede væske indeholdende C-076 indhøstes derefter og prøves for anthelmintisk aktivitet. I alle tilfælde er 6,2 ml af væsken og faste stoffer opnået ved centrifugering af 25 ml væske fuldt aktiv over for N. Dubius helmintiske infektioner på mus.

Medium 5 (skråkultur)

Dextrose 10,0 g

Bacto Asparagin 0,5 g K2HP04 0,5 g

Bacto Agar 15,0 g

Destilleret vand 1000 ml pH = 7,0

Medium 4 (Podemedium)

Opløselig stivelse 10,0 g

Ardamine pH (autolysat) 5,0 g NZ Amine E (enzymhydrolyseret casein) 5,0 g Kødekstrakt 3,0 g

MgS04,7H20 0,5 g

Cerelose 1,0 g

Na2HP04 0,190 g KH2P04 0,182 g

CaC03 0,5 g

Destilleret vand 1000 ml pH = 7,0 - 7,2

U65U

23

Medium 5

Tomatpasta 40,0 g

Havremel 10,0 g

Cerelose 10,0 g

Majsstøbevæske 5,0 g

Sporelement-blanding 10,0 ml

Destilleret vand 1000 ml pH = 6,8

Sporelement-blanding

FeS04>7H20 1000 mg

MnS04.4H20 1000 mg

CuC12.2H20 25,0 mg

CaCl2 100,0 mg H2B03 56,0 mg (NH4)2Mo04.4H20 19,0 mg

ZnS04.7H20 200,0 mg

Destilleret vand 1000 ml

Medium 6 CPC Industriel stivelse 40,0 g

Modificeret (fra CPC Corp.)

Distiller's Solubles 7,0 g

Autolyseret gær (Ardamine pH fra Yeast Products Inc.)

CoCl2.6H20 50,0 g

Destilleret vand 1000 ml pH = 7,3 EKSEMPEL 2

En 0,5 x 1,0 cm podenål fra en af de fire skråkulturer af medium 3, fremstillet som angivet i eksempel 1, anvendes til podning af en luftet 250 ml konisk kolbe indeholdende 50 ml podemedium nr.

4. Podekolben rystes i 1 dag ved 27 til 28°C i en roterende rystemaskine ved 220 omdrejninger pr. minut med en slaglængde på 1465 η 24 50 nun. Podekolben opbevares derefter stationært ved 4°C, indtil den er parat til anvendelse. Indholdet af denne kolbe anvendes til podning (5¾ podemateriale) af 20 ikke-luftede 250 ml koniske kolber indeholdende 40 ml medium nr. 2. Efter fire dages dyrkning ved 28°C i en roterende rystemaskine ved 220 omdrejninger pr. minut og en slaglængde på 50 mm indhøstes 19 af kolberne, hvis indhold samles. De forenede gæringsvæsker indeholdende C-076 filtreres, hvorved opnås 500 ml filtrat og 84 g mycelium.

78 g mycelium ekstraheres med 150 ml acetone i en halv time under omrøring, og blandingen filtreres. Filterkagen vaskes med 50 ml acetone, og filtratet og vaskevæskerne forenes og inddampes til 46,5 ml. 50 ml af koncentratatet indstilles på en pH-værdi på 4 med fortyndet saltsyre og ekstraheres tre gange med 30 ml portioner chloroform. Ekstrakterne tørres ved filtrering gennem tør infusoriejord (Super-Cel), forenes og inddampes til tørhed i vakuum. Den olieagtige remanens af C-076 med en vægt på 91,4 mg opløses i chloroform til opnåelse af 3 ml opløsning, som repræsenterer 1% af rumfanget af dyrkningsvæsken . Det opnåede C-076 ved denne udvindingsprocedure er fuldt aktivt over for N.dubius injektioner på mus. Desuden opnåedes ved chloroformekstrakten en 70 x rensning af C-076 fra den totale væske.

EKSEMPEL 3

Trin A

En 250 ml luftet konisk kolbe indeholdende 50 ml medium 7 podes med frosset ampulindhold af Streptomyces avermitilis MA-4680, NRRL 8165. Kolben dyrkes ved 28°C i et roterende rysteapparat med en omdrejningshastighed på 160 omdrejninger pr. minut med en slaglængde på 50 mm i 24 timer.

1465 14 25

Medium 7

Dextrose 1 g CPC Industriel modificeret stivelse 10 g Kødekstrakt 3 g NZ Amine E 5 g

Autolyseret gær (Ardamine pH) 5 g

MgS04.7H20 0,05 g

Na2HP04 0,19 g KH2P04 0,182 g

CaC03 0,5 g

Destilleret vand 1000 ml pH = 7,0 - 7,2

Trin B

To 2 liter luftede koniske kolber indeholdende hver 500 ml af Medium 7 podes med 10 ml af kolbeindholdet fra trin A. Medierne dyrkes ved 28°C i et roterende rysteapparat ved 160 omdrejninger pr. minut og en slaglængde på 50 mm.

Trin C

Til en 756 liter gæringsbeholder af rustfrit stål indeholdende 467 liter medium 8 sættes 1 liter af det totale gaeringsmedium fra trin B. Gæringsbeholderen omrøres ved 28°C og 130 omdrejninger pr. minut i 96 timer og under luftning med en luftstrøm på 280 liter pr. minut.

Medium 8

Tomatpasta 20 g/1

Primær gær N.F. 10 g/1

Stivelse, modificeret, CPC 20 g/1

CoCl2.6H20 5 g/1

Polyglycol 2000 0,321 ml/1

Destilleret vand q.s.

pH = 7,2 - 7,4

Efter dette tidsrum filtreres 15,5 liter af gæringsvæsken, og myceliet indeholdende C-076 vaskes med vand. Det våde mycelium 146514 26 (2268 g) ekstraheres med 3 liter acetone under omrøring. Blandingen filtreres, og filtratet inddampes til 1550 ml og indstilles på en pH-værdi på 4,0 med fortyndet saltsyre. Denne opløsning ekstraheres tre gange med samme rumfang chloroform. Chloroformekstrakterne tørres ved filtrering gennem kiselgur (Super-Cel), forenes og inddampes til tørhed i vakuum. Den resulterende olie bestående af C-076 vejer 5,12 g. 3-,3 mg er fuldt aktivt over for N.dubius på mus.

4,69 g af denne olie opløses i 142 ml chloroform og kromatogra-feres på en kolonne indeholdende 90 g silica-gel pakket i chloroform. Kolonnen udvikles med 1400 ml chloroform. Kolonnen elue-res derefter med chloroform/ethanol (40:1), idet der opsamles 145 fraktioner på hver 5 ml. Derefter elueres kolonnen med chloroform/ethanol (19:1), idet der opsamles fraktioner 146-226 på hver 5 ml. Fraktionerne 49-72 forenes og inddampes til tørhed, hvorved opnås 200 mg af en olie (A). Fraktionerne 79-184 forenes ligeledes og inddampes til opnåelse af 291 mg af en olie (B). 400 jig af hver fraktion er fuldt aktiv over for N.dubius på mus. Disse to fraktioner (A og B) analyseres separat på silica-gel tyndtlagskromatografiske plader£QUanta/Gram OlF-plader, fra Quanta/Gram Inc., Fairfield, New Jersey). Pladerne udvikles med chloroform/methanol (19:1). Pletterne analyseres for deres ultraviolette aktivitet, og en plet af hver fraktion har den karakteristiske ultraviolette absorption for C-076 forbindelserne (se tabel I). Fra fraktion A har pletten med et Rf på 0,83 og fra fraktion B har pletten med et Rf på 0,57 en sådan absorption. Disse pletter repræsenterer henholdsvis C-076 A-forbindelserne og C-076 B-forbindelserne.

198 mg af olien (A) kromatograferes på 80 g silica-gel pakket i chloroform, elueres med chloroform/methanol (199:1), indtil 520 ml er opsamlet, efterfulgt af chloroform/methanol (99:1), idet der opsamles fraktioner på hver 10 ml. Fraktionerne fra 630 til 720 ml giver 30,4 mg; fraktionerne fra 730 til 950 ml giver 78,4 mg, og fraktionerne fra 950 til 1040 ml giver 20 mg af et olieagtigt materiale. Fraktionerne 1 og 2 indeholdende C-076 A-komponenter viste sig ved afprøvning på mus over for N.dubius i mængder på 1,0, 0,5 og 0,25 mg fuldt aktive.

146514 27 EKSEMPEL 4

Trin A

En 250 ml luftet konisk kolbe indeholde 50 ml medium 8 podes med indholdet af en frossen ampul af Streptomyces avermitilis MA 4680, NRRL 8165. Kolben dyrkes 28 °C i en roterende rystemaskine ved 160 omdrejninger pr. minut og en slaglængde på 50 mm i 24 timer.

Trin B

En 2 liter luftet konisk kolbe indeholdende 500 ml medium 8 podes med 10 ml kolbeindhold fra trin A. Mediet dyrkes ved 28°C i et roterende rysteapparat ved 160 omdrejninger pr. minut og 50 mm slaglængde i 24 timer.

Trin C

Til en 189 liter gæringsbeholder af rustfrit stål indeholdende 160 liter medium 9 sættes 500 ml podemateriale fra trin B. Gæringsbeholderen dyrkes ved 28°C under omrøring ved 150 omdrejninger pr. minut i 24 timer under luftning med en hastighed på 90 liter pr. minut.

Medium 9

Dextrose 1 g/1

Majsstivelse 10 g/1 Kødekstrakt 3 g/1

Autolyseret gær (Ardamine pH) 5 g/1

MgS04.7H20 0,05 g/1

Na2HP04 0,10 g/1 KH2P04 0,182 g/1

CaCOj 0,5 g/1

Destilleret vand q.s.

pH = 7,0 - 7,2

Trin D

Til en 756 liter gæringsbeholder af rustfrit stål indeholdende 146514 28 467 liter medium 6 sættes 43 liter podemateriale fra trin C. Gæringsbeholderen dyrkes ved 28°C under omrøring med 130 omdrejninger pr. minut i 144 timer og under luftning med en luftstrøm på 280 liter pr. minut.

Trin E

Efter dette tidspunkt filtreres hele gæringsvæsken, og filterkagen indeholdende C-076 vaskes med vand. Filterkagen opslæmmes i 120 liter acetone i 30 minutter, filtreres, og det faste stof vaskes med 30 liter acetone. Acetonevaskevæskerne forenes og inddampes under reduceret tryk til et rumfang på 40 liter. Koncentratet indstilles til pH = 4,0 med fortyndet saltsyre. Koncentratet ekstraheres tre gange med samme rumfang chloroform. Chloroformekstrakterne tørres ved filtrering gennem et lag kisel-gur (Super-Cel). Ekstrakterne føres gennem laget og forenes derefter. De forenede ekstrakter inddampes under reduceret tryk til et rumfang på 4 liter. Chloroformkoncentratet filtreres og føres gennem en kolonne med 2,4 kg silica-gel i chloroform. Kolonnen elueres med chloroform, og der opsamles otte 3,5 liter fraktioner. Kolonnen elueres derefter med chloroform/methanol (49:1), idet der opsamles yderligere otte 3,5 liter fraktioner (fraktionerne 9-16). Fraktion nr. 3 inddampes til tørhed, hvorved opnås 76 g af et olieagtigt stof indeholdende hovedparten af C-076 stofferne.

97 pct. af dette produkt opløses i 685 ml methylenchlorid os kromatograferes gennem 800 g kiselsyre (Mallinckrodt Chemical Co. 100 mesh sigtet igen gennem en 80 mesh sigte). Kolonnen med en diamter på 7,62 cm og en længde på 600 cm udvikles med methy-lenchlorid/benzen (7:3), cirka 7,5 liter, efterfulgt af 5 pct. iso-propanol i methylenchlorid/benzen (7:3), 2,25 liter. Fraktionen elueres med 5 pct. isopropanol i methylenchlorid/benzen, som indeholder et stærkt farvet bånd , indeholder praktisk taget al C-076 stof, bestemt ved tyndtlagskromatografi (beskrevet i eksempel 5).

Denne fraktion (500 ml) inddampes og igen kromatograferes på 105 g kiselsyre (kolonne 3,7 cm diameter og 18 cm længde) i methylenchlorid. Kolonnen udvikles med 100 ml portioner methy-lenchlorid indeholdende 5, 10 og 20 pct. ether. Yderligere eluering med 20 pct. ether i methylenchlorid giver to farvede 1465 ΙΑ 29 bånd. Fraktionerne mellem de to bånd indeholdt praktisk taget al C-076 materialet, bestemt ved tyndtlagskromatografi.

Fraktionen indeholdende C-076 kromatograferes på 59 g kiselsyre (kolonne 3,7 cm i diameter og 11 cm i længde) i methylen-chlorid. Kolonnen udvikles med 10 pet. ether i methylenchlorid.

Efter at det første materiale begynder at eluere tages en fraktion på 70 ml efterfulgt af 26 fraktioner på hver 5-6 ml. Fraktionerne 3-26 forenes, hvorved opnås 1,35 g materiale, og det analyseres ved tyndtlagskromatografi (silica-gel-plader-Analtech GF 254, udvikles med 5 pet. isopropanol i methylenchlorid).

Materialet med et Rf på 0,28 i dette system er C-076 Al.

Kolonnen elueres derefter med 20 pet. ether i methylenchlorid (200 ml) efterfulgt af 50 pet. ether i methylenchlorid (800 ml).

En lille mængde C-076 A1/A2 blanding eluerer efterfulgt af alt C-076 A2. Den totale remanens af C-076 A2-fraktioner er 800 mg. Yderligere eluering med 5 pct. isopropanol i methylenchlorid giver C-076 Bl (135 mg). Separationen følges ved at observere den ultraviolette absorption af det eluerede materiale. C-076 Bl og A2 har tilnærmelsesvis samme Rf-værdier på silica-gel tyndt-lagskromatografiske plader (Analtech GF 254) i 5 % isopropanol i methylenchlorid. De to komponenter er dog klart adskillelige på samme plader, udviklet med 15 pct. isopropanol i hexan. Hele fraktionen C-076 Al påføres 14 silica-gel plader (Analtech HF 254, 20x20 cm 500 ji tykkelse). Pladerne udvikles i 10 pct. isopropanol i hexan. Båndet indeholdende C-076 Al fjernes fra pladerne, ekstraheres med ether, inddampes og genpåføres seks yderligere plader, som udvikles fem gange med 5 pct. isopropanol i hexan. C-076 Al fjernes fra pladerne og kromatograferes igen, idet der udvikles med rent ether til opnåelse af 270 mg hovedsageligt rent C-076 Al. De infrarøde og kernemagnetiske resonansspektre for denne prøve er reproduceret som henholdsvis fig. 1 og 5 og i tabel II.

C-076 A2 fraktionen kromatograferes på 10 silica-gel (Analtech HF 254) plader, idet der udvikles 5 gange med 15 pct. isopropanol 146514 30 i hexan til opnåelse af 265 mg hovedsageligt rent C-076 A2. De infrarøde og kernemagnetiske resonansspektre for denne prøve reproduceres i henholdsvis fig. 2 og 6 og tabel II. C-076 Bl fraktionen kromatograferes på 2 plader (som ovenfor) i 15 pct. isopropanol i hexan, hvorved opnås 65 mg hovedsageligt rent C-076 Bl. Det kernemagnetiske resonansspektrum for denne prøve er reproduceret i fig. 7 og tabel II.

EKSEMPEL 5 Gæringen beskrevet i eksempel 4 gentages to gange, og den totale væskemængde forenes. Gæringsvæsken oparbejdes som beskrevet i eksempel 4, idet der udvindes 3,3 liter af en chloroformekstrakt, som indeholder 60 mg/ml totalt faststof, bedømt som 0,5 pct. C-076 ved tyndtlagskromatografisk analyse.

Tre liter af denne chloroformopløsning kromatograferes på 2400 g silica-gel (Davidson Grade 62) pakket i chloroform. Kolonnen (9,5 x 122 cm) udvikles med otte 3800 ml portioner chloroform (fraktioner 1-8) efterfulgt af otte 3800 ml portioner chloro-form/methanol (49:1 fraktioner 9-16). De enkelte fraktioner analyseres ved tyndtlagskromatografi (silica-gel plader, Quanta/

Gram QIF) udviklet med chloroform/methanol 19:1. Fraktioner 9-11, 12-13 og 14 inddampes hver for sig til tørhed, hvorved opnås 6,63 g faste stoffer indeholdende C-076 A komponenter i fraktionerne 9-11, 24,91 g faste stoffer indeholdende C-076 B komponenter i fraktionerne 12-13 og 4,71 g faste stoffer ligeledes indeholdende C-076 B komponenter i fraktion 14.

Materialet fra fraktionerne 12-14 forenes (29,62 g), opløses i 100 ml methylenchlorid og kromatograferes på 400 g silica-gel (Davidson Grade 62) i methylenchlorid. Kolonnen elueres med 1500 ml methylenchlorid/2-propanol (99:1); 1500 ml methylenchlo- rid/2-propanol (49:1); 2000 ml methylenchlorid/2-propanol (19:1) og 1000 ml methylenchlorid/2-propanol (9:1). Eluantrum-fang mellem 500 og 6000 ml (2,56 g) og 6000-6500 ml (5,03 g) forenes i 25 ml methylenchlorid og kromatograferes på 60 g silica-gel i hexan. Et forløb på 70 ml hexan og 100 ml hexan/diethyl- 31 14851Λ ether (4:1) optages, og kolonnen udvikles derefter med 600 ml hexan/diethylether (1:4), idet der tages 200 ml fraktioner, og til slut elueres med 700 ml ether, idet der tages 100 ml fraktioner. Elueringsrumfang fra kolonnen på 400-600 ml giver 2,035 g faste stoffer indeholdende 0076 Bl komponenterne; rumfangene 600-1100 indeholdt 0,881 g faste stoffer bestående af 0076 B1/B2 komponenter, og rumfang 1100 - 1500 ml indeholdt 0,381 g faste stoffer bestående af 0076 B2 komponenter.

De blandede 0076 B1/B2 komponenter opløses derefter i 4,2 ml methylalkohol/vand (4:1) og kromatograferes på C18 Porasil (Bon-dapak-37-75 mikron størrelse) i samme opløsningsmiddel. Omvendt fasehøjtrykskolonne (mest polære komponent elueres først) er 1,2 meter ved 16 mm og elueres med en hastighed på 800 ml pr. time, idet der optages fraktioner på hver 21,3 ml. Tilstedeværelsen af 0076 komponenter styres ved iagttagelse af den ultraviolette absorption af fraktionerne. 0076 B2 udvindes i fraktioner 24-37, og 0076 Bl udvindes i fraktioner 51-70, idet der opnås 195,4 mg 0076 B2 og 137 mg 0 076 Bl.

Hver prøve kromatograferes derefter separat på 4 g kolonner af silica-gel (Davidson Grade 62) i methylenchlorid. Kolonnerne elueres med 35 ml methylenchlorid/methanol (9:1). De sidste 20 ml eluent fra hver kolonne opsamles og inddampes til tørhed, hvorved opnås 155,3 mg 0076 B2 og 90 mg 0076 Bl, respektivt. Derpå kromatograferes 50 mg 0076 Bl og 100 mg 0076 B2 ved præparative silica-gel-plader (Analtech HF 254), udviklet med 12 pct. iso-propanol i hexan efterfulgt af udvikling med ether, udvinding af 0076 Bl og 0076 B2, som er i hovedsagelig ren tilstand. Det infrarøde absorptionsspektrum af de således udvundne 0076 Bl og B2 er vist i henholdsvis figurerne 3 og 4. Det kernemagnetiske spektrum af det således udvundne 0076 B2 er vist i fig. 8.

EKSEMPEL 6

En 250 ml luftet konisk kolbe indeholdende 50 ml af følgende medium: 146$14 32

Lactose 2,0¾

Distiller’s solubles 1,5¾

Autolyseret gær, Ardamine pH 0,5¾ pH - før sterilisation 7,0 podes med indholdet af en frossen ampul af Streptomyces avermiti-lis MA 4848, ATCC 31271, og dyrkes på en roterende ryster ved 28 °C i 24 timer ved 150 omdrejninger pr. minut.

10 ml af ovennævnte gæringsmedium anvendes til podning af 500 ml af samme medium som ovenfor i en to liter luftet konisk kolbe. Gæringsmediet dyrkes ved 150 omdrejninger pr. minut i et roterende rysteapparat ved 28°C i 24 timer.

Hele det foregående medium anvendes til at pode 467 liter af følgende medium i en 756 liter gæringsbeholder af rustfrit stål:

Lactose 2,0¾

Distiller's solubles 1,5¾

Autolyseret gær, Ardamine pH 0,5¾

Polyglycol 2000 0,32 ml/liter pH - før sterilisation 7,0 Gæringsmediet dyrkes ved 28 °C i 40 timer under en luftstrøm på 280 liter og en omrøringshastighed på 130 omdrejninger pr. minut.

230 liter af ovennævnte medium anvendes til podning af 4310 liter af følgende medium i en 5670 liter gæringsbeholder af rustfrit stål:

Dextrose 4,5¾

Peptoniseret mælk 2,4¾

Autolyseret gær, Ardamine pH 0,25¾

Polyglycol 2,5 ml/liter pH - før sterilisation 7,0 146514 33 Gæringen fortsættes i 144 timer ved 26°C med en luftstrømshastighed på 540 liter pr. minut og en omrøring på 120 omdrejninger pr. minut.

Gæringsmediet filtreres, og filterkagen af mycelium vaskes med cirka 550 liter vand, filtratet og vaskevæskerne bortkastes. Filterkagen omrøres med cirka 1500 liter acetone i cirka 1 time og filtreres. Filterkagen vaskes med en blanding af 150 liter acetone og 40 liter afioniseret vand, hvorved opnås 2000 liter ekstrakt.

Den ovennævnte gæring og ekstraktion gentages i samme skala, således at der fås yderligere 2000 liter acetoneekstrakt, som forenes med den første ekstrakt, og blandingen inddampes til et rumfang på cirka 800 liter. Koncentratet indstilles på en pH-værdi på cirka 4,7 med koncentreret saltsyre og forenes med cirka 800 liter methylenchlorid. De forenede opløsningsmidler omrøres i cirka 4 timer og adskilles. Det vandige lag forenes med yderligere 800 liter methylenchlorid og omrøres i cirka 4 timer. Lagene adskilles, og hver methylenchloridekstrakt behandles separat med 10 kg Super-Cel og filtreres. Begge ekstrakter inddampes til et samlet rumfang på 60 liter.

EKSEMPEL 7

De 60 liter opløsning af 0076 i methylenchlorid fra det foregående eksempel inddampes til tørhed i vakuum, og remanensen forenes tre gange med 60 liter portioner methanol og inddampes til tørhed til fjernelse af resterende methylenchlorid. Det endelige methanolholdige koncentrat har et rumfang på tilnærmelsesvis 36 liter. Methanolopløsningen opbevares i 18 timer og filtreres. Filterkagen vaskes med 40 liter frisk methanol, og methanol-filtraterne og vaskevæskerne forenes. Methanolopløsningen forenes med 95 liter ethylenglycol og 130 liter heptan. De to lag omrystes i 5 minutter, og det nedre lag (ethylenglycol og methanol) fraskilles. Heptanopløsningen vaskes med en blanding af 20 liter ethylenglycol og 6,3 liter methanol. Efter omrøring i 146514 34 5 minutter fraskilles det nedre lag, som forenes med den første ekstrakt af ethylenglycol/methanol. Samme rumfang vand (cirka 150 liter) indeholdende 79 g salt pr. liter sættes til ekstrakterne af ethylenglycol/methanol. Denne opløsning ekstraheres med 150 liter ethylether under omrøring i 5 minutter. Etherlaget vaskes med 75 liter vand (et halvt rumfang) og omrøres i 5 minutter, og lagene adskilles. Denne procedure gentages yderligere to gange (slutvandet indeholdt 20 g salt pr. liter) til opnåelse af et rumfang etheropløsning på 110 liter. Etherlaget inddampes i vakuum til et minimalt rumfang, idet temperaturen holdes under 25°C. 40 liter methylenchlorid sættes til remanensen, og op løsningen inddampes til tørhed. Denne procedure gentages, og den endelige remanens inddampes i vakuum ved 50°C til tørhed.

EKSEMPEL 8

En kolonne med en diameter på 30 cm fremstilles med et lag på 34 kg aktivt aluminiumoxid, efterfulgt af et lag på 34 kg aktiv carbon i en opløsning af methylenchlorid. Remanensen fra det foregående eksempel opløses i methylenchlorid til et rumfang på 34 liter og påføres kolonnen og elueres med 34 liter methylenchlo-rid. Disse fraktioner bortkastes. En 3¾ opløsning af isopro-panol og methylenchlorid (20,8 liter isopropanol og 660 liter methylenchlorid) påføres kolonnen, der elueres med cirka 200 liter fraktioner. De forenede isopropanol- og methylenchloridfraktio-ner inddampes i vakuum ved en badtemperatur på cirka 60°C til et rumfang på cirka 20 liter. Badtemperaturen reduceres til cirka 45°C, og ekstrakten inddampes til tørhed i vakuum. Remanensen opløses i 10 dele methylenchlorid, 10 dele hexan og 1 del methanol til et slutrumfang på 15 liter. Denne opløsning påføres direkte Sephadex LH-20 kolonnen i det næste eksempel.

EKSEMPEL 9

En kolonne med en diameter på 30 cm fremstilles i methanol med 36

U65U

35 kg Sephadex LH-20 (fra Pharmacia Fine Chemicals, 800 Centennial Avenue, Piscataway, New Jersey 08854) og vaskes med et opløsningsmiddel bestående af 10 dele methylenchlorid, 10 dele hexan og 1 del methanol. En fjerdedel af C-076 opløsningen fra eksempel 8 påføres kolonnen, og denne elueres med en hastighed på 250 ml pr. minut. To 20 liter forløb opsamles og bortkastes efterfulgt af 20 liter berigede fraktioner (identificeret som fraktioner 1- 20) efterfulgt af en enkelt 20 liter afsluttende fraktion, som bortkastes. Fraktionerne 1-8 viser sig at indeholde C-076 A forbindelserne, og fraktionerne 9-20 indeholder C-076 B forbindelserne.

EKSEMPEL 10

Fremgangsmåden ifølge eksempel 9 gentages i samme skala yderligere tre gange, og alle fraktioner indeholdende C-076 B komponenterne (fraktioner 9-20) forenes og inddampes til tørhed, hvorved opnås 818 g uren blanding af C-076 B komponenter. Prøven viser sig at indeholde 55 pct. C-076 Bl og 39 pet. C-076 B2. 680,5 g af denne prøve opløses i 2 liter methylenchlorid og indføres i en 22 liter trehalset rundbundet kolbe, efterfulgt af tilsætning af 13.6 liter methanol. Methylenchloridet afdestilleres. 13,6 liter ethylenglycol tilsættes, og methanolen destilleres under reduceret tryk. Destillationshastigheden opretholdes således, at temperaturen af opløsningen ikke gik ned under 35°C. Efter at tilsætningen af ethylenglycolen er afsluttet, henstilles opløsningen til afkøling til 5°C i 16 timer. Krystallerne filtreres og vaskes med 1 liter kold ethylenglycol. Krystallerne genopløses derefter i 2 liter methylenchlorid, og opløsningen indføres i en 22 liter trehalset rundbundet kolbe. Den ovenfor beskrevne procedure gentages to gange. Den første gang anvendes 12,5 liter methanol og samme rumfang ethylenglycol, og den anden gang 13.6 liter methanol og samme rumfang ethylenglycol. De endelige krystaller vaskes med en liter kold ethylenglycol og en liter vand. Krystallerne opløses i 4 liter benzen og tørres ved filtrering gennem natriumsulfat. Benzenopløsningen inddampes til et rumfang på 2 liter og lyofiliseres, hvorved opnås 241,2 g af et hvidt pulver bestående af 98 pct. C-076 Bl og 1 pct. C-076 B2.

146514 36

Modervæskerne (22 liter) fra de ovennævnte første to krystallisationer forenes og fortyndes med 22 liter vand. Den vandige opløsning ekstraheres med 60 liter toluen og atter med 15 liter toluen. Toluenekstrakten vaskes derefter med 48 liter vand. Den organiske fase filtreres gennem Super-Cel til fjernelse af resterende vand og inddampes til opnåelse af 336 g fast stof bestående af 79 pet. C-076 B2 og 16 pet. C-076 Bl forbindelser.

EKSEMPEL 11

Fra de fire Sephadex LH-20 kolonner fra eksemplerne 9 og 10 forenes fraktionerne 1-8 indeholdende C-076 A forbindelserne. Ved HPLC-analyse af blandingen fandtes 252 g C-076 A2a, 16 g A2b, 94 g Ala og 24 g Alb. Materialet opløses i et opløsningsmiddelsystem bestående af hexan:toluen:methanol i forholdet 6:1:1 og påføres Sephadex LH-20 kolonnen med samme dimensioner som den i eksempel 9 anvendte. Fraktioner opsamles med en hastighed på 250 ml pr. minut, og et 20 liter forløb opsamles og bortkastes. Ved yderligere eluering fås endnu to 20 liter forløb, som ligeledes bortkastes, og 50 fire liter berigede fraktioner, indeholdende C-076 A forbindelserne. Fraktionerne 3-8 indeholder hovedsageligt C-076 Al komponenterne (40,2 .g Ala og 6,7 g.Alb), og fraktionerne 29-36 indeholder C-076 A2 forbindelser (117,2 g A2a og 7,35 g A2b). Fraktioner 9-28 indeholder en blanding af C-076 Al og A2 forbindelser.

EKSEMPEL 12

En prøve af 150 g C-076 Bl fra eksempel 10 opløses i 3 liter af en opløsningsmiddelblanding af hexan:toluen :methanol i forholdet 3:1:1. Opløsningen føres gennem en kolonne af Sephadex LH-20 (af samme dimensioner som anvendt i eksempel 9) i ovennævnte opløsningsmiddel, idet der tages fraktioner med en hastighed på 250 ml pr. minut. Efter at to 2 liter portioner af opløsningsmiddelblandingen er opsamlet og bortkastet, optages et forløb på 10 liter, der bortkastes. Derpå tages 30 berigede fraktioner på 2 liter hver. Fraktionerne 1-13 og 25-30 bortkastes. Fraktionerne

U65U

37 14-16 forenes og indeholder 80 g hovedsagelig C-076 Bla. Fraktionerne 22-24 forenes og indeholder 6,7 g fortrinsvis C-076 Blb. Fraktionerne 17-21 indeholder en blanding af C-076 Bla og Blb.

Fraktionerne 17-21 forenes og inddampes og føres gennem en Sepha-dex LH-20 kolonne med samme opløsningsmiddelsystem som ovenfor anført. Tre 20 liter forløb optages og bortkastes. Berigede fraktioner optages derefter på følgende måde: Fem fraktioner på hver to liter (fraktioner 1-5); 20 fraktioner på hver 1 liter (fraktioner 6-25) og ti fraktioner på hver 2 liter (fraktioner 26-35). Fraktionerne 1-15 bortkastes, fraktionerne 16-21 indeholder 13,5 g C-076 Bla og 0,4 g C-076 Blb, fraktionerne 22-26 indeholder 44 g C-076 Bla og 0,13 g C-076 Blb, fraktionerne 27-30 indeholder 10,2 g C-076 Bla og 0,8 g C-076 Blb.

EKSEMPEL 13

En blanding af alle otte C-076 komponenter kromatograferes på en højtryksvæskekromatografisk kolonne 4 mm x 30 cm, pakket med 10 mikron μ Bondapak C18 silica-gel (fra Waters Associates Inc.,

Maple Street, Milford, Massachusetts 01757), idet der elueres med 85:15 (v/v) methanol:vand ved en konstant temperatur på 40°C.

Ved en strømningshastighed på 1,2 ml pr. minut skilles alle otte komponenter, og elueringsrumfangene, som under de foregående konstante betingelser er karakteristiske for de enkelte komponenter, er følgende: f46514 38

Elutionsvolumen fyei røi C-076 B2b 5,90 C-076 B2a 6,52 C-076 A2b 7,12 C-076 A2a 7,88 C-076 Blb 8,36 C-076 Bla 9,60 C-076 Alb 10,24 C-076 Ala 11,88

Adskillelsen af C-076 B-komponenterne fra de respektive A-komponenter udføres ved højtryksvæskekromatografi. En absolut metha-nolopløsning af 30 mikroliter af en blanding af C-076 Ala og Alb, vurderet til at indeholde 30 mikrogram C-076 Alb, indføres i en 3 x 250 mm højtryksvæskekromatografisk kolonne indeholdende Spheri-sorb 5 mikron ODS (fra Spectra Physics) som pakning. Kolonnen elueres med 85:15 methanol/vand med en hastighed på 0,15 ml/min.

Elueringen af produkterne følges ved observering af den ultravio-lette absorption af elueringsmidlet og opsamling af de enkelte komponenter ved hjælp af en UV-monitor. 30 mikrogram C-076 Alb udvindes og analyseres i et massespektrometer. Massespektre af denne prøve er angivet i anden kolonne af tabel III.

Claims (2)

146514

1. Fremgangsmåde til fremstilling af antiparasit isk virksomme forbindelser kaldet C-076-Ala, -Alb, -A2a, -A2b, -Bla, -Blb, -B2a og -B2b med formlen C,l3 ~7—Cl CV« T3 fcY2>C"3 CH_0' CH O/ J CK3\ L o J I °H T i—-_)-CH3 2 3 hvori X-Y, R og R har følgende betydninger 2 3 X-Y R R Ala CH=CH butyl _0CH3 Alb CH=CH propyl “0CH3 A2a CH2CHOH butyl _0CH3 A2b CH2CHOH propyl "0CH3 Bla CH=CH butyl -OH Bib CH=CH propyl -OH B2a CH2CHOH butyl -OH B2b CH2CHOH propyl -OH kendetegnet ved, at en stamme af Streptomyces aver-mitilis dyrkes i et vandigt næringsmedium indeholdende en assimi-lerbar kilde for carbon, en assimilerbar kilde for nitrogen og uorganiske salte under aerobe betingelser ved en temperatur mellem 20 og 40 °C og ved en pH-værdi mellem 5,0 og 9,0, hvorefter de dannede C-076 forbindelser udvindes af gæringsvæsken.