CS207397B2

CS207397B2 - Method of preparation of the new anthelmintic compounds

Info

Publication number: CS207397B2
Application number: CS772465A
Authority: CS
Inventors: Georg Albers-Schonberg; Richard W Burg; Thomas W Miller; Robert E Ormond; Hyman S Wallick
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1976-04-19
Filing date: 1977-04-14
Publication date: 1981-07-31
Also published as: IL51854A; JPS52151197A; NL950005I1; FI771124A; GR63128B; BG35900A3; IE44822L; SE7703592L; CY1114A; KE3141A; AT357503B; GT197746150A; RO71785A; NO148856B; PT66445A; NZ183847A; IT1106424B; PT66445B; NO148856C; NL971001I1

Description

(54) Způsob přípravy nových anthelmintíckých sloučenin

Předložený vynález se týká nových chemických sloučenin. Zejména se předložený vynález týká nových sloučenin dohromady označených jako C-076, které jsou produkovány feimentací kmenu mikroorganismu Streptomyces avennittlis na živném médiu. Tyto sloučeniny vyRíaztaJí význačné a široké spektrtm antiparazitického účinku. Dále se též popisují antiparazitické prostředky obsahující jednu nebo více C-076 sloučenin. ..

Podle předloženého vynálezu se skupina sloučenin označených obecně jako C-076 připraví tak, že se . za kontrolovaných podmínek pěstují dosud nepopsané kmeny mikroorganismů. Alespoň osm odlišných, ale blízce příbuzných, nových sloučenin je produkováno kmenem Streptomrces aveirmttiis. Tyto sloučeniny jsou zde popsány jako C-076 Ala, Alb, A2e, A2b, Bia, B1b, B2a a B2b. Všechny tyto sloučeniny maaí význačný antiparazitický účinek. Mohou se získat fermentací a izolovat v dostatečné čisté formě.

Předmětem předloženého vynálezu je způsob ' přípravy nových anthelmintických sloučenin označených C-076, který se vyznačuje tím, že se za aerobních podmínek ferraentuje kmen Streptomyces avernmtilis NRRL 8165 (ATCC 31267) ve vodném živném médiu, obsahujícím od asi 0,5 do 5 % hnoonostních asioilovaialnéUs zdroje uhlíku, od asi 0,2 do 6 % Umo0nostnícU asimilovatelného zdroje dusíku a anorganické soli, přičemž feimentace se provádí při teplotě oda20 do 40 °C, s výhodou od 24 do 30 °C při pH od 5,0 do 9,0, s výhodou od 6,0 do 7,5t po dobu 1 až 8 dnů a z feImentačníhs se izolují C-076 sloučeniny.

Na základě iaxooLomiiCýih studií oikrsorgaoimy schopné produkce těchto C-076 sloučenin jsou nové druhy rodu Streptomyces, které byly pojmenovány Streptomyces aveemitiiis. Jedna tato kultura, izolovaná z půdy, byla označena MA-4680 ve sbírce kil tur Merek& Co., Inc.,

Rahway, New Jersey. Vzorek této kultury produkuící C-076 je uložen ve stálé sbírce kultur

207397 '

Fermentatíon Šection of the Northem Utilization Researeh Branch, U.S. Department of Agricultura at Peoria, Illinois, a byl označen jako NRRL 8165. Vzorek NRRL 8165 byl také uložen a je volné dostupný ve stálé sbírce kultur Američan Type Culture Collection at 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, kde má označení ATCC 31 267.

Morfologické a kulturní charakteristiky Streptomyces avermitilis jsou následující: Morgologie: Sporofory tvoří spirály jako postranní větve vzduěného mycelia. Spirály jsou kompaktní, ale stávají se otevřenější stárnutím kultury. Spory jsou řetězce více než 15 spor a jsou běžně sférické až oválné při zvětšení 970x. Sporulace byla pozorována na agaru s ovesnou moukou, glycerol-asparaginovém agaru, soli-škrobovém agaru a vaječném albuminovém agaru. Povrch spor je hladký, jak bylo pozorováno elektronovou mikroskopií.

Agar 8 ovesnou moukou Vegetativní růst:	rub - velmi temně hnědý.
Vzdušné mycelium:	práškové, hnědošedé, (41i)^xx, smíšené s bílým.
Rozpustný pigment:	hnědý

i

Czapek Dox Agar (sacharosa, nitrát, agar)

Vegetativní růst:	špatný, bezbarvý.
Vzdušné mycelium:	sporé, šedivé.
Rozpustný pigment:	světle šedivoŽlutohnědý. ’

Agar 8 vaječným albuminem

Vegetativní růst:	Žlutohnědý.
Vzdušné mycelium:	mírné, světle šedivožlutohnědé (3ge)^xx smíšené s bílým.
Rozpustný pigment:	světle žlutohnědý.

Glycerolasparaginový agar

Vegetativní růst:	rub - Žlutohnědý.
Vzdušné mycelium:	práškové, hnědošedé (411)^xx smíšené s bílým.
Rozpustný pigment:	světle Žlutohnědý.

Anorganické soli - škrob agar

Vegetativní růst:	rub - Šedožlutohnědý.
Vzdušné mycelium:	práškové, světle hnědošedé (4ig)^xx okraje tmavohnědošedé (41i)^xx.
Rozpustný pigment:	světle žlutohnědý.

Extrakt z kvasnic-dextrosa+soli agar

Vegetativní růst:	rub - tmavohnědý. ^r
Vzdušné mycelium:	mírné, hnědobílé.
Rozpustný pigment:	hnědý

Extrakt z kvasnic-extrakt ze sladu agar

Vegetativní růst: Vzdušné mycelium:	rub - tmavohnědý, mírné, hnědobílé.
Rozpustný pigment:	hnědý.
Pepton-železo-extrakt z Vegetativní růst:	kvasnic agar * tmavohnědý.
Vzdušné mycelitun:	žádné
Rozpustný pigment: Melanin:	tmavohnědý až Černý pozitivní. 4
Produkce HgS:	pozitivní.

živný agar

Vegetativní růst: žlutohněčlý·

Vzdušné mycelium: řídké, Šedivé.

Rozpustný pigment: světle hnědý.

Živný škrobový agar

Vegetativní růst: žlutohnědý.

Vzdušné mycelium: řídký, Šedivobílý.

Rozpustný pigment: světle hnědý.

Hydrolýza škrobu: dobrá.

Bramborový řez

Vegetativní růst: žlutohnědý.

Vzdušné mycelium: hnědé smíšené se šedobílým.

Rozpustný pigment: Šedohnědý

Loefflerovo krevní sérum

Vegetativní růst: Šedožlutohnědý.

Vzdušné mycelium: žádné.

Rozpustný pigment; hnědnutí média.

Zkapalnění: žádné.

Živný tyrosinový agar

Vegetativní růst: rub tmavohnědý až černý

Vzdušné mycelium: řídké, Šedé.

Rozpustný pigment: tmavohnědý.

Rozklad tyrosinu: žádný.

Využití uhlíku

Pridham-Gottliebovo základní médium + 1 % zdroj uhlíku + = růst; žádný růst ve srovnání к negativní kontrole (žádný zdroj uhlíku).

glukosa	+
arabinosa	+
celulosa	-
fruktosa	+
inositol	+
laktosa	+
maltosa	+
mannitol	+
mannosa	+
raffinosa	+
rhamnosa	+
sacharosa	+
xylosa	+

Živný želatinový agar

Vegetativní růst: žlutohnědý.

Vzdušné mycelium: řídké, šedobílé.

Rozpustný pigment: světle hnědý. Zkapalnění želatiny:dobré.

želatinové vpichy

Vegetativní růst: hnědý kruh.

Vzdušné mycelium: žádné.

Rozpustný pigment: zelenohnědý.

Zkapalnění želatiny: úplné.

Agar s odstředěným mlékem

Vegetativní růst: tmavohnědý.

Vzdušné mycelium: žádné.

Rozpustný pigment: tmavohnědý.

Hydrolýza kaseinu: dobrá.

Lakmusové mléko

Vegetativní růst: tmavohnědé růstové kruhy.

Vzdušné mycelium: žádné.

Zbarvení: tmavohnědé.

Koagulace a/nebo peptonisace: úplná peptonisace, stává se alkalické (pH 8,1).

Odstředěné mléko

Vegetativní růst: tmavě hnědé růstové kruhy.

Vzdušné mycelium: žádné.

Rozpustný pigment: tmavě hnědý.

Koagulace a/nebo peptonisace: úplná peptonisace, stává se alkalické (pH 8,0).

Teplotní rozmezí: (extrakt z kvasnic-dextrosa+soli agar) °C - dobrý vegetativní růst a vzdušné mycelium °C - dobrý vegetativní růst a vzdušné mycelium °C - žádný růst

Požadavky kyslíku: (vpichovaná kultura v extraktu z kvasnic-dextrosa+soli agar) aerobní

Veškerá hodnocení byla provedena po třech týdnech při 28 °C, pokud není uvedeno jinak. Hodnoty pH veškerých médií byly přibližně neutrální (6,8 až 7,2).

Čísla barevných označení (XX) odpovídají Color Harmony Manual, 1958, 4th Edition Container Corporation of America, Chicago, Illinois.

Pečlivé srovnání předcházejících dat s publikovanými popisy, včetně Bergey*s Manual of Determinative Bacteriology (Eighth Edition) všech známých mikroorganismů, ukazuje, že uvedený mikroorganismus by měl být klasifikován jako nový druh. Na tomto podkladě byl označen jako Streptomyces avermitilis.

Výše popsaný popis se týká kmenu Streptomyces avermitilis, který se používá při produkci zde popsaných sloučenin C-076.

Předložený vynález také zahrnuje mutanty výše popsaného mikroorganismu. Například ty mutanty, produkující C-076, které se získají přirozenou selekcí,nebo ty, které vznikají působením mutačních činidel včetně ozářením X paprsky, ultrafialovým světlem, yperitem apod., « spadají také do rozsahu předloženého vynálezu.

Jedním takovým organismem je kmen Streptomyces avermitilis MA 4848, který byl izolován po ozáření ultrafialovým světlem Streptomyces avermitilis MA 4680. Lyofilisované zkumavka a zmražená lékovka této kultury byla uložena ve stálé sbírce kultur Američan Type Culture

Collection a byla označena čísly 31 272 a 31 271. Při použití této zmražené uložené kultury jako očka pro fermentaci byl získán mírně vyšší výtěžek C-076.

Sloučeniny C-076 se produkují během aerobní fermentace vhodného vodného živného média za podmínek popsaných výSe pro produkční kmen Streptomyces avvrrnm. tlils Vocdná méédeajako jsou ta používané pro produkci mnohých antibioticlých sloučenin_pjsou vhodná pro · použití při tomto postupu pro přípravu 0-076.

Tato živná média obsahují zdroje uhlíku a dusíku asimilovatelné mikroorganismem a obecně nízké hladiny anorganických soli. Kromě toho fexmentační média mohou obsahovat stopy kovů nutné pro růst mikroorganismů. Tyto kovy jsou běžně příoomné v dostatečné koncentraci v koinmpeemích · zdrojích uhlíku a dusíku používaných jako živné zdroje a mohou se samozřejmě - případně přidávat odděleně do média.

Obecně sacharidy, jako jsou cukry, například dextrosa. sacharosa, maltosa, laktosa, dextran, cerelosa apod., a škroby jsou vhodné·jako zdroje esimilovatelného uhlíku v živném médiu. Přesná množství zdroje uhlíku, která se pouužvají v mééiu,závisí částečně na ostatních přísadách média, ale běžně bylo nalezeno, že množiv! sacharidů mezi 0,5 a 5 % hmots noslními je dostatečné. Tyto zdroje se mohou použžt individuálně nebo se několik těchto zdrojů může smísit ve sterém rnmdiu.

Různé dusíkové zdroje, jako jsou hydrolysáty kvasnic, autolysáty kvasnic, sojová * mouka, kaseinové hydrolysáty, extrakty z kvasnic, kukuřičné výluhy, destilační zbytky, mouka z bavlníkových semen, extrakty z masa apod., jsou snadno aiisillvateltd Strepoomyces aveHnittlis při produkci C-076 sloučenin. Různé dusíkaté zdroje se mohou použít samo' statně nebo v komminaci v od asi 0,2 do 6 % hmolntltnϊch média.

Z živných anorganických solí, které se mohou přidávat do živného méáda, jsou soli, postytující todné, draselné, horečnaté, amonné, vápenaté, fosfátové, sulfátové, chlorddové a ionty. Zahrnuté jsou také stopové kovy, jako je kobbat, hořčík, železo apod

Rozumí se, že média popsaná níže a v příkladech jsou uvedena pro objasnění a žádným způsobem předložený vynález neumee^u!.

Nássedtuící příklady méáií jsou vhodné pro růst kmenů Streptomyces·avennitílis při

produkci sloučenin C-076.
Médium A
kukuřičná mouka	20,0 g
destilační výluhy	10,0 g
sójová mouka	^15,0 g
citrát sodný	4,0 g
CaCl?.2H₂O	0,5 g
polyglykol P2000	2,5 ml
MgSO₄.7H₂O	0,1 g
CoCl₂.6H₂0	0,01 g
FeS0₄.7H₂0	0,01 g
destilovaná voda pH 6,5	1 000 ml
Médium B
rozpustný škrob	20,0 g
kukuřičný výluh	15,0 g
cerel-osa	5,0 g
sojová mouka	4,0 g
<«H₄)2^S04	4,0 g
kukuřičná mouka	1,0 g
sójový olej	2,5 ml

0,3 g ⁶,° g

000 ml κη₂ρο₄

CaCO-j destilovaná voda pH 6,7

Médium C rajčatová pasta ovesná mouka destilovaná voda pH 6,0

Médium D ovesná mouka rajčatová pasta destilovaná voda

PH 5,5

40,0 g

15,0 g 1 000 ml

20,0 g

000 ml

Médium E dextrosa 10,0 g pepton (dostupný od Difeo LBbooatories, Deeroit, Michigan) 5,0 g autolysát z kvasnic (dostupný jako

Ardamine pH·od Yeast Products lne., Pateason, New Jeasey) NaCl

KC1

FeS0₄(NH₄)2S0₄.6H₂0

M^ ^.6^0

CaCl^^O destilovaná voda

3,0 g

12,7 g

0,72 g

0,035 g

5,32 g

0,73 g

000 ml pH 7,4

Fermentace za použití mikroorganismů produkujících C-076 se může provádět při teplotách od asi 20 do 40 °C. Pro optimální výsledky je nejvýhodnnjší provádět tyto fermentace při teplotě od asi 24 do asi 30 °C. Teploty kolem 17 ai 28 °C jsou nejvýhoddnjěí. Vhodné pH Živného média pro produkci sloučenin C-076 se pochybuje od asi 5,0 do 9,0, přičemž výhodné rozmezí je od asi 6,0 do 7,5.

Fermentace v malém se s výhodou provádějí tak, ie .se wníítí vhodná mnnžitví živného média do baňky za pouuití známých sterilních technik, tyto baňky se naočkují buň sporami nebo vegetativními buňkami kmenu Streptomyces aveinmtilis produkujícího C-076, hrdlo baňky se zazátkuje vatou a fermentace se provádí při konstantní teplotě 28 °C 3 ai 10 dnů na rotační třepačce. Pro práci ve velkém se fermentace s výhodou provádí ve vhodných tancích s míchadlem za pnžvzdušňžváňí fermentačního média.

iivné médium se připraví v tanku a po sterilizaci se naočkuje vhodným zdrojem vegetativních buněk kmenu Strepoomyces avvramttiis, produk^ícího C-076. Fermentace se provádí 1 ai 8 dnů, přičemi míchání a/nebo provzdu^ňoviání iivného média se provádí při teplotě od 24 do 37 °C. Stupeň paΌVzdušňovώní závisí na několika fakioaech,jako je velikost fermentačního tanku, rychl-coti míchání a podobně. Obecně větěí fermentační tanky se míchají asi 95 ai 150 otáčkami za minutu a zavádí se do nich 56,6 ai 566 litrů vzduchu za minutu.

Nové sloučeniny podle předloieného vynálezu, které byly obecně nazvány jako C-076, se hlavně nacházejí v myceěiu po skončení fermentace Strepoomyces тяпШИй a mohou se izolovat a vzájemně odděěit způsobem popsaným níie. Čtyři hlavní a čtyři minoortní sloiky

C-076 byly izolovány. Osm různých sloučenin bylo identifioováno jako C-076 Ala, Ab, A2a,

Ί

A2b, Ba, Blb, B2a, B2b. Hlavním sloučenině byl index a v této identifikační terminologii a minoritním sloučenině index b. Strukturní rozdíl mezi a a b sloučeninami je pro všechny čtyři páry stejný.

Jak se dalo očekávat,! hlavní sloučeniny C-076 se neprodukují při feimentaci podle předloženého vynálezu ve stejných mnostvích. Obecné bylo nalezeno, že AI sloučeniny jsou obsaženy v asi 20 až 30 % hmoUnnutnííh celkové váhy produkovaného komplexu 0-076, A2 sloučeniny asi v 1 až 20 % a B1 a B2 sloučeniny po 25 až 35 %. Váhový podíl ' série a sloučenin k sérii b je asi 82:15 až 99:1.

OOdělem série 0-076 sloučenin z celého fermentačniho média a izolace jednotlivých sloučenin se provádí extrakci rozpouštědly a chromatografováním frakcí různými typy chromatografických technik za použžti různých systémů rozpouštědel.

Sloučeniny 0-076 jsou mírně rozpustné ve vodě, ale jsou rozpustné v organických rozpouštědlech. Tato vlastnost se s výhodou používá pro jejich izolaci z fermentačniho média· * Tak podle jedné metody se veškeré feimentačni médium filtruje a vodnýfiltrát se vyleje. Vlhký koláč myyceia se pak extrahuje prisUuným organickým rozpouštědlem. I když se mohou použžt jakákoli organická rozpouštědla, je výhodné, jestliže se pouužjí rozpouštědla mísitelná ve vodě, jako je aceton, methanol, ethanol, apod. Obecně pro docílení izolace ma- * ximálniho mnižstaí je zapotrebi několika extrakcí. Rozpouutědly se odstrani C-076 aktivni sloučeniny, jakož i ostatni sloučeniny, které nemej antiparazitílCý účinek C-076.

Jestliže rozpouštědla jsou mísitelná s vodou, od straní se rovněž voda z vlhkého mycelia. Extrahované mcelí um se může vyhodit. Odpařením extraktů se odstraní organické rozpouštědlo a zbytek se nlkoUiirát extrahuje druhým rozpouštědlem. Jestliže se pro první extrakci pou^je rozpouštědlo misitelné s vodou, používá druhá extrakce s výhodou rozpouštědlo nemíiitelné s vodou, jako je chloroform, meehyyennhlorid, chlorid uhličitý, ethylacetát, míthhУethylietOi, methyУitobutylietoi apod. Posledně uvedené extrakty se suší a zahuštěním běžně známými způsoby se ziská odparek obsah^uící C-076 smíšený s ostatními maatriály. Tyto frakce se s výhodou chromíttur^fují tak, aby se odděěily aktivni C-076 sloučeniny od ostatních maateiálů a také aby se izolovaly individuální C-076 sloučeniny·’.

ChroIníttuгэf ické techniky, které se mohou pouužt pro čištěni C-076 sloučenin-jsou obecně známé odborníkům. Přiklady těchto technik jsou chromatocrafie na koloně za pouužti tilikagelu, kysličniku hlinitého, dextranových gelů apod. a eluce těchto kolon se provádi různými rozpouštědly a/nebo ko^t^inř^c^zf dvou nebo více rozpouštědel v různých porn^ech. Kapalná íhromatouгafie se používá pro detekci C-076 sloučenin a vysokotlaká kapalná chromatografie se může pouužt pro izolaci vyčištěných frakci obsahujícich jednu nebo vice těchto sloučenin.

Stejně tak chrumatocrafie na tenké vrstvě se může oθ^užSt pro jejich detekci a pro izolaci jednotlivých C-076 sloučenin. Použitím předcházeeícich technik, jakož i jirých technik běžně známých odbornikům, se získáji vyčištěné ^Ísí obsahnuící C-076 sloučeniny, jakož i individuální sloučeniny C-076. Rřitomnost aktivnich sloučenin C-076 se stanovuje analýzou různých chromatografických frakci na aήtioarazitický účinek a také spektrálními charakteristikami (jako je ultrafialové a infračervené spektrum) těchto sloučenin, jak , je popsáno niže.

Spokirálií a ostatni fyzikálně-chemické charakierittiiy individuálnich C-076 sloučenin jsou uvedeny v tabulce 1. Tyto sloučeniny jsou velmi rozpustné v převážné části běž* ných organických rozpouštědel a máji minimální rozpustnost ve vodě.

Ultrafialová spekt^álni data v tabulce 1 se získaji na Cary Model 15 ultrafaaUaéém spektrometru v methanolickém roztoku v 1 cm křemenné cele. Konncenrace sloučenin je přibližně 25^ug/ml. Ultrafialová absorpce sloučenin série a je skutečnou absorpcí a série, i když tyto obsahují minimální množství sloučenin série b. Séria a a b se odlišují pouze skupinou -CHg- v nižším alkylovém substituentu, přičemž tato diference nemá vliv na chromofor. Ultrafialová absorpce charakterizuje stupen nenasycennosi jednotlivých sloučenin. Optické rotace byly stanoveny běžnými technikami za použití polarimetru fiTray Karl Zeiss Kϋnoen0rační faktor (c) je uveden jako procenta sloučeniny v uvedeném rozpouštědle.

Molekulární vzorec ^C48^H72°14 ^C49^fí76°15 ^C48^H74°15 ^C47^70°14 ^C48^H74°15 ^C47^H72°15 o cu +1 Ό O o Г- J* irs и ifs и + o OS CO

CO

ITS

	o		o
o—	CO	r-·	0П	os	Ό	cd
	m			ίΛ	00	ΙΛ
Od			Cd		M·	Od
	0—			o
	(SJ	.-e		m

o KO o o Cd

Cd O m

	o		O		o
Cd	Γ-	Od	M-	СП	LOS	m	Cd		v—
Γ-	όη	·—	SO	*d·	OO	o	irs	trs	m
ΟΟ	CM		«4·	Cd	-	irs	см	*
					<—			o
		Cd			m			CM	'd-

os oo o

Cd — -И -d-

O SO	«4-	Γ-
co -	O	m
* —	o>	Od

II M- и

Cd

ΓΟΟ

O

CU
H	Γ-
o	Γ-	so	Γ-
m		CO	m
	ο	OO	cu
CO	II
k£>	o
+

o			O			trs
o	OS	m		r—	cu	CM	o
00	LTS	-rd	Γ-	o	LTS	-d-	*—
	«4-	OJ	•s	m	Od		on
co			—			O
cu			m			cu	’Φ

o			ir\			O
o	oo	m	Γ-	OS	CU	Os	Γ-
Γ-	LC\	«d-	CM	tn	LTS	CU	o
		Cd		d-	Od	r.
ΟΟ*			r—	л		o	Λ
CM	M·		cn	M-		CM	^d

_ ω	xs	ω	и		ьо
Xfl	<4	t*	•H		o
	5	o	*4	X	rd
O o-	-M	c:	05	co
•H OJ Q	0)	CQ	b	a	·№
л'Т?	rd o	P (Λ	P H	J	S4J
o jL*	a	'-s		*4

C^-NMR spektrální data pro C-076 A1a, A2a, B1a a Blb jsou uvedena v tabulce 2 nížeSpektra byla získána na Varian Nuclear Magnetic Spectrometer Model CFT-20 v deuterovaném chloroformovém roztoku za použití tetraměthylsilanu jako vnitřního standardu. Objem rozpouštědla a koncentrace vzorku jsou uvedeny pro každý případ a dále jsou uvedeny chemické posuny, vztažené na tetramethylsilan, pro jednotlivé sloučeniny v ppm. Chemické posuny jsou uvedeny pro jednotlivé uhlíkové atomy,pokud není jinak uvedeno v závorkách následujících za chemickým posunem.

Tabulka2

AI (0,6 ml 16 %)

12,0; 13,0; 15,1; 16,4 40,5; 45,7; 56,4 (20, 79,4; 80,6 (20; 82,0; 136,1; 137,6; 139,9; Г A2 (0,6 ml 16 %)	; 17,7; 18,4; 57,7; 67,3;	i 19,9 68,2 98,5;	; 20,3; 27,5; 30,6; 34,3 ( 30 ; 35,2; 36,6; 39,7;
(20; 68,4 (20; 74,9; 76,1; 77,0; 118,4 (20; 119,7: 124,9; 127,8;	77,5; 78,3; 135,2; 136,0;
95,0; 73,8.	95,8;
11,8; 12,4; 13,8; 15,1	9 i ⁷ 9 / i	i >8,4:	i 19,9	; 20,3; 37,3; 34,3 (30; 35,2: 35,	8; 36,5; 39,8;
40,8; 41,2; 45,7; 56,4	(2C),	57,7;	67,3;	67,7; 68,2 (30; 69,9; 70,8; 76,1	; 77,0; 77,6;
78,3; 79,4; 80,6 (2C);	81 ,8;	94,9;	98,6;	99,7; 117,7; 118,4; 119,7; 124,9;	135,7; 136,1;
137,6; 140,0; 173,7.
B1 (0,3 ml, 16 %)
12,0; 12,9; 15,1: 16,4	; 17,7:	; 18,4:	; 19,9	; 20,2; 27,5; 30,6; 34,3 ( 30 ; 35,	2; 36,6; 39,8;
40,5; 45,7; 56,4;(2C);	67,3;	67,8;	68,2	(20; 68,4 (20; 75,0; 76,1; 78,3;	79,4 (20;
80,5 (20; 82,0: 95,0;	95,8;	98,5;	118,1	; 118,4; 120,4; 124,8; 127,9; 135,	2; 136,2; 137,9
(20; 139,7; 173,6.
B2 (0,6 ml, 16

11,8; 12,4; 13,8; 15,1; 17,7; 18,4; 19,9; 20,2; 27,3; 34,4 (30; 35,2; 35,8; 36,5; 39,8; 40,8; 41,2; 45,8; 56,4 (2C); 67,3; 67,7 (2C0); 68,3 (3C); 69,9; 70,9; 76,1; 78,3; 79,4 (2C); 80,5 (2C); 8»,8; 94,9; 98,6; 99,7; 117,7; 118,0; 120,4; 124,8; 135,7; 138,0 (2C); 139,8; 173,5.

Charakteristické hmotově spektrální pásy osmi C-076 sloučenin jsou uvedeny v tabulce

3. První řádek tabulky 3 znamená poměr hmoty к náboji (m/e) molekulárního iontu každé z odpovídajících sloučenin a zbylá čísla znamenají poměr hmoty к náboji základních fragmentů pro každou sloučeninu. Poměry hmoty к náboji stejné horizontální hladiny udávají analogické fragmenty pro každou sloučeninu. Poměry hmoty к náboji jsou uvedeny jako celá čísla a byly získány na LKB Mass Spectrometr Model LKB-9000. Poměry hmoty к náboji, které Jsou uvedeny na Čtyři desetinná místa, se získají z High Resolution Varian Mass Spectrometer Model MAT-731.

1

Tabulka 3

Charakteristické hmotové spektrometrické píky

Ala	Ab	A2a	A2b	Bia	Blb	B2a	B2b
686.5072 ’	872	904	890	872	858	890	876
742.4229	728 .	760	746	728	- 714	746	732
580.3406	566.3265	598.	584	566	552	584	570
548.3136	534	566	558	548.3131	534	566	552
456.2886	442	456	442 .	456	442	456	442
305.2120	291.1962	323.2225	309.2070	305	291	323	309
		305	291			305	291
275.1292	275	275	275	261.1139	261	261	261
25T.1382	257	257	257	257	257	257	257
221.1527	207	239.1637	225	221	207	239	225
193.1587	179.1429	211.1691	197.1542	193	179	21 1	197
199.1101	199	199	199	199	199	1 99	199
169-1226	155	179.1076	179	169	155	179	179
145-0867	145	145	145	145	145	145	145
137.0954	137	1 37	137	137	137	i 37	137
127.0754	1 27	1 27	127	127	127	127	127
113.0604	1 i 3	1 13	1 13	113	113	113	113
95.0496	95	95	95	95	95	95	95
87.0444	87	87	87	87	87	87	87

Připojené obrázky . až 8 jsou přesnými reprodukcemi, infarčervených a ’ИЧШВ spekter čtyř C-076 sloučenin. Obrázky 1 až 4 jsou infračervená spektra C-076 Ar, A2a, Bia a B2a sloučenin. Obrázky 5 až 8 jsou 'H-NMR spektra pro C-076 A1a, A2a, Bia, B2a. Infračervená spektra se získají na Perkin-Elmer lnfaakevknném spektrometru model 421 v chloAcmrnovém roztoku. spektra se měří v ^utonovaném chlorofGríoovém roztoku na 'tartan Auclear

Meagneic Resonance Spedrometsr Mo<deX IHa100 a spektra uvádějí chemické posuny uvedené v ppm, vztažené na tktгemekhylsilan jako vnitřní standard.

Na základě experimentálních dat včetně zde popsaných studií a měření se předpokládá, že sloučeniny mají následující . planární strukturní vzorec

kdt R jt alfa-L-oltandrosyl-alfa-L-oltandrosid vzorct

2 a kde přerušovaná čára znamená jednoduchou nebo dvojnou vazbu, R, je hydroxyl, který je přítomen pouze v tom případě, kdy přerušovaná vazba znamená jednoduchou vazbu.

R₂ je propyl nebo butyl a je methoxy! nebo hydroxyl.

V předcházejícím strukturním vzorci mají individuální sloučeniny významy uvedené v tabulce 4.

Tabulka 4

R r₂ r₃

Aa	dvojná vazba	butyl	-och₃
Alb	dvojná vazba	paopyl	-OCH,
A2a	-OH	butyl	-oc.u₃
A2b	-OH	• propyl	-0CH₃
Ba	dvojná vazba	butyl	-OH
Blb	dvojná vazba	prtpyl	-OH
B2a	-OH	butyl	-OH
B2b	-OH	prtpyl	-OH

Jak se dalo očekávat, sloučeniny podle předloženého vynálezu, kde R₂ je butyl (série a sloučenin) a tdpoovddjící sloučeniny, kde R₂ je propyl (série b) se chovvjí obdobně v převážné části postupů,;jko .je extrakce rozpouštědlem. V každé dvorci a a b sloučenin sloučeniny a jsou přítomné ve větším mrnOžtví a obecně tvoří asi 85 až 99 % směsi sloučenin a a b. Přítomnost propylových sloučenin je prokázána hmotovými spektry sloučenin, kde hmotové píky tdpovvddjící butylovým skupinám jsou provázeny píky o 14 jednotek (nebo o jednu skupinu -C^-) nižšími. Kromě toho vysokotlaká kapalná chromajografie se použije pro oddělení Alb složky od A1a ktmpononty a hmotové spektrum této Alb sloučeniny bylo prokázáno hmotovou spektrommetií s vysokou rozlišovací schopnootí (viz tabulka 3).

Nové sloučeniny podle předloženého vynálezu vykazují ^^ϊΉ^οΙοΙ paraziticidoí účinek a jsou použitelné jako anthelmintická činidla, insekticidy a akaricidy jak v medicíně, tak veterinární praxi a v zemměděství.

Nemmoi nebo skupiny nemocí popsaných obecně jako helminthiasa jsou vyvolány infekcí živočichů parazitcklými červy, známými jako helminty. HelmanOhiasj způsobuje vážné . ekonomické problémy u dommáích živočichů,jako jsou prasata, ovce, koně, dobytek, kachny, psi, kočky a drůbež. Z hemintů skupina červů popsaná jako nemetody způsobuje rozšířené a často vážné infekce u různých druhů živočichů.

NeeběžnněŠÍ nematody infikující živočichy jsou Haemanohus1 Тг^Поз-гоогу!^, Ossertaria, Nemmjtddrus, Cooperia, Assaait1 Rimos-tonum, Oesophjrottomum1 ^^аега!;, ΤΓ^ΙηπΤα, Stronrylus, ^1011011^8, D^i^^tyo^i^T^JLus, СааН1аг1а, Hec^^s, Toxooara, As^a^to, Oxyuuis, Ancylostoma, U^cnna!;, Totajsaait a Paaascajit. Uačité z n^ch^ato jsou Nemmatodaus, Coopeaia, a Oθstphjrostomjm1 napadají primárně iotettioáSoí trakt, zatímco ostatní, jako je Haemonchus a OOsertaria, jsou převážně přítomné v žaludku, zatímco ostatní, jako je D^<ctytcamus, byly nalezeny v plicích.

Ještě jiní paraaiti mohou být umístěny v ostatních tkáních a orránech těla^a^ je srdce, krevní oběh, podkožní a lymfatické tkáně apod. Parazitické infekce známé jako helminthiasa vedou k anemii, nedostatečné výživě, slabostem, ztrátě váhy, vážným poruchám stěn iotettinálníht traktu a ostatních tkání a oaránů a jestliže se neléčí, mohou způsobit smú infkkovaného hossitele. Sloučeniny C-076 podle předloženého vynálezu mm jí neočekávaně vysoký účinek na ' parazity a kromě toho jsou také aktivní na Dirotilarij u psů, Нев^оо^го!des, . Syphmjia, Assi^u-uris u hlodavců, arthropodní ektopajajiti u živočichů a ptáků^jakt jsou klíšťata, roztoči, vsi, mouchy, masařky, u ovcí Lucilia sp, kousavý hmyz, jako jsou migrující larvy,jako je Hypodenna sp. u dobytka, Gastrophilus u koní a Cuterebrz sp.

u hlodavců.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu jsou také pouCitelné proti parazitím infikujícím lidi. Nejběžnější paraziti gastrointestinálního traktu u lidí jsou Annylostoma, Necator, Asscais, Strongyyoides, Trichineeiz, C^ziil^i^:Íz, TricOus a Enterobius. Jiné důležité rody parazitů, nalezené v krvi nebo jiných tkáních a orgánech kromj gastrointestinálníOo traktu jsou Μυ^θΓθΓΐθ, Brugiz, Onnhooerca a Loa, Dracunculus a extra intestinální stádia ^^з^п^п^О červů Strongyloides a Trichinellz. Sloučeniny jsou také cenné proti Arthropodtm parazitujícím u lidí, kousavému hmyzu a ostatním hmyzím škůdcům obtěžujícím lidi. Sloučeniny jsou také účinné proti doaácím škůdcůmjako jsou švábi Blatellz sp. , moli Tineola sp., Attagenus sp. a mouchám Musea dornaeSica.

Sloučeniny jsou také pouUžtelné proti hmyzím skladištním škůdcům, jako je' ΤΓίΙ:!^^ sp. , Tenebrio sp. , škůdcům zeměddlskýim jako je sviluška snovací (Tetranychus sp·), mšice (AccrtOiosipOon sp.), proti migrujícímu Omyzz,jako jsou kobylky,a nedospělým stadiím hmyzu žijícím v rost^nných tkáních. Sloučeniny jsou pouUžtelné jako nemmtocidy pro kontrolu půdních nematodů a rostinnýým pzrazitlm,jakl jsou Meeoidlgyne sp., které jsou důležité v zernOdděltví.

Tyto sloučeniny se mohou aplikovat orálně v jednotkové dávkové formě, jako jsou kapsle, pilulky nebo tablety, nebo jako vodné nálevy při pouUžtí jako anthelmintických činidel u savců.

Tyto jednotkové dávkové formy mohou být různé z hlediska · jejich celkové váhy a obsahu antiparazitcckýcO činidel, závisejících na faktorech, jako je typ OostiteSkkéOn živočicha, který má být léčen, vážnooti a Vpu infekce a váze Ooositele.

Jestliže aktivní sloučenina se aplikuje s potravou živočicha, dokonale se rozptýlí v potravě nebo se po^ž^e pro vrchní povrchovou úpravu nebo se aplikuje ve formě peletek, které se přidávají do hotové potravy nebo se případně zki^muj odděleně. Alternativně se zntiparazitické sloučeniny podle předloženého vynálezu mohou aplikovat živočiohťm parenterálně, například ШгатЫШ, intrmuskulárně, ittrztáacOeáltj nebo podkožními injekcemi v případech, kde aktivní složky jsou rozpuštěny nebo dispergovány v kapalném nosiči.

Při použití sloučenin podle předloženého vynálezu se jednotlivé složky C-076 mohou izolovat a čistit a o pouCit v této formě. Alternativně směsi dvou nebo více jedno tlivých C-076 klшmolltnt se mohou rovněž pouUžt. Není nutné úplně oddděit různé C-076 sloučeniny získané z čištěni fermentačního mOdda. Obecně se získají obsahnUící dvě nebo více sloučenin C-076, ale které mají ostatní nepříbuzné sloučeniny odstraněny a tyto směsi se ponUCt pro prevenci a léčení parzzitcckýcO onemocnění zde popsaných.

Tato směs obecně obsahuje nestejné poměry C-076 sloučenin, avšak veškeré sloučeniny mají značný účinek a zntipzrzzitický účinek směsi se může přesně stanovit. Zejména není nutné nlcdělt komponenty b od příbuzných komponent a. Tyto sloučeniny se oddišují pouze délkou postranního řetězce v poloze 25. OOčděení těchto blízce příbuzných sloučenin se obvykle neprovádí, jestliže sloučeniny b jsou příoomné pouze ve velmi malém hmoonostním procentu.

Kromě toho, jestliže sloučeniny C-076 se přidávají k potravě pro zvířata,· je možné používat sušených koláčů myzceia oddělených od fermentačníOo mO.dia. Myzedium obsahuje převážnou část aktivity s vzhledem k tomu, že hladina účinku myzceia se může stanovit, může se myzelirm přidávat přímo do živočišné potravy.

Sloučeniny C-076 podle předloženého vynálezu jsou též pouUžtelné pro boj se zemOdělský mi škůdci, kteří způsobují škody na úrodě během růstu a skladování. Sloučeniny se aplikují přímo použitím známých technik,jako jsou postřiky, popraše, emulse apod._; a to jednak na rostoucí a skladované plodiny a tyto se tak chrání před zemědělskými škůdci.

Athelmintický účinek sloučenin 0-076 se může stanovil orálně aplikací s potravou vzorku jednotlivých C-076 sloučenin, směsi 0-076 sloučenin, koncentrovaného extraktu apod. myším, které byly 3 dny předem infikovány Neeatospiroides dubius. Jedenáctý den, dvanáctý den a třináctý den po počátku léčení se ve výkalech myších hodnotí vajíčka N.·dubius, načež se následující den m^i zabijí a sioSííají se červi přítomní na začátku tenkého střeva. Sloučeniny se považují za aktivní, jestliže doje k značnému snížení počtu vajíček a červů ve srovnání s infikovanou a neošetřenou kontrolou.

NNsl.eduuící příklady vynález blíže objasňuje. Příklady předložený vynález žádným způsobem neomez^í.

Přikladl

LyšSilisovatS zkumavka Streptomyces avčernitiiis MA-4680 se aseitickš otevře a obsah se suspenduje v 50 ml média v 250 ml Erlenmeyerově baňce s přepážkám.. Tato baňka se tři dny třepe při 28 °C na rotační třepačce s 220 otáčkami za minutu s posunem 5 cm. 0,2 ml tohoto očkovacího média se použije pro naočkování šikmé kultury média 3. Naočkovaná šikmá kultura se inkubuje 10 dnů. při 28 °C a pak se při 4 °C skladuje před použitím pro naočkování 4 dalších šikmých půd s médiem 3. Tyto šikmé kuiuury se inkubuji 8 dnů v temnotě.

Jedna z těchto šikmých kult-ur se. pou^je pro naočkování tří 250 ml Erlenrneyerových. baněk, obsearnuících po 50 ml očkovacího média 4. Naočkované baňky/ se třepou dva dny při 27 až 28 °C na rotační třepačce s 220 otáčkami za minutu a posunem 5 cm. Obsah těchto baněk se spojí a pou^je se pro naočkování (5 % očko) 250 ml Erlenmeyerových baněk s přepážkami, obsahuuících po 40 ml různých produkčních médií.

Baňky obsahnuicí média 2,5 a 6 se inkubi^;jí 4 dny při 28 °C na rotační třepačce s 220 otáčkami za minutu a posunem 5 cm. Vzniklé Per^entované médium obsahhjící C-076 se pak sklidí a testuje se na anthelaintický účinek. Ve všech případech je 6,2 ml celkového mmdia a pevné podíly získané centrifugací -25 ml celkového média jsou plně aktivní proti N. dubius infekci u myší.

Složení· ^ddí

Médium 1 dextrosa 20g pepton 5g extrakt z masa 5g kvasnice 3g

NaCl 5g

CaCO^ (po pH úpravě) 3g destilovaná voda 1 000 ml , pH 7,0

Médium 2 .rajčatová pasta20 g aadUfLkovaný škrob (CPC)20 g kvasnice19 g

CoC^·6H20 ^л,005 g destilovaná voda 1 000 ml' pH 7,2 až 7,4

Médium 3 (šikmá půda)

dextrosa	10 g
Bakto asparafin	0,5 g
k₂hpo₄	0,5 g
Bakto agar	15,0 g
destilovaná voda	1 000 ml
pH 7,0
Médium 4 (očkovací médium)
rozpustný škrob	10,0 g
Ardamin pH	5,0 g
NZ amin E	5,0 g
hovězí extrakt	3,0 g
MgSO₄.7H₂O	0,5 g
cerelosa	1,0 g
NagHPO^	0,190 g
^ΚΗ2·Ρ0₄	0,182 g
CaCO-j	0,5 g
destilovaná voda	1 000 ml
pH 7,0 až 7.2
Médium 5
pasta z rajčat	40,0 g
ovesná mouka	10,0 g
cereloss	10,0 g
kukuřičný výluh	5,0 g
směs stopových prvků	10,0 ml
destilovaná voda	1 000 ml
pH 6,8
Směs stopových prvků
FeSO_r7H₂O	1 000 mg
MnSO₄.4H_?O	1 000 mg
CuCl^oZHpO	25,0 mg
CaCl ₂	100,0 mg
^H2^B03	56,0 mg
(NH₄)₂Mo0₄.4H₂0	19,0 mg
ZnSO^.7HpO	200,0 mg
destilované voda	1 000 ml
pH
Médium 6
CPC průmyslový škrob
modifikovaný (dostupný od CPC Corp.)	40,0 g

rozpustné destilační podíly 7,0 g autolysované kvasnice (Ar/Rmin pH do-

stupně od Yeast Products lne.)	5,0 g
CoCl₂.6H₂0	50,0 mg
destilovaná voda	1 000 ml

PH 7,3

Příklad 2

0,5 x 1,0 cm očkovací klička jedné ze čtyř šikmých kultur na médiu 3, připravených jako v příkladu 1, se použije pro naočkování 250 ml Erlenmeyerovy baňky s přepážkami, obsahující 50 ml očkovacího média 4. Očkovací baňka se třepe jeden den při 27 až 28 °C na

207397 16 rotační třepačce s 220 otáčkami za minutu a posunem 5 cm. Očkovací baňka se pak skladuje v klidu při 4 °C až do t<oožSt:í.

Obsah této baňky se pak p^i^2^i.je pro naočkování (5 % očko) dvaceti 250 ml vých baněk bez přepážek, obsahujících po 40 ml média 2. Po 4 dnech inkubace při 28 °C na rotační třepačce s 220 otáčkami za minutu a posunem 5 cm se obsah 19 baněk sklidí a spojí. Spojená fermentovaná média, obsel™Jící C-076, se filtrují a získá se 500 ml filtrátu a 84 g mycceHa. 78 g mycceia se extrahuje 150 ml acetonu 30 minut za mícHiání, načež se směs filtruje. Filtrační koláč se promyje 50 ml acetonu a filtrát a promývací roztoky sc spojí a zahuutí na 46,5 ml.

ml koncennrátu se upraví na pH 4 zředěnou kyselinou chlorovodíkovou a třikrát se extrahuje po 30 ml chlorofoímu. Extrakty se vysuší a filtrují přes suchou křemelinu (Supercel), spojí a zahustí v suchu ve vakuu. Olejovitý zbytek C-076 vážící 91,4 mg se rozpustí v chloroformu tak, že se získá 3 ml roztoku, který representuje 1 % objemu média. Sloučeniny 'C-076, získané tímto izolačním postupem,jsou účinné proti N. dubius infekci u myd. Kromě toho extrakcí chlorformiem se docílí 70oásjboé přečištění C-076 z celého média.

Příklad 3

Stupeň A

250 ml Erlnomeynržva baňka s přepážkami, obsah^uící 50 ml média 7 se naočkuje ze zmražené lékovky jbsaCluUjící Streptomyces aveiriitilis MA-4680. Baňky se . inkubují při 28 °C na rotační třepačce s 160 otáčkami za minutu a posunem 5 cm po dobu .24 hodin.

Médium 7 dextrosa .1 m

CPS průmyslový modifikovaný škrob 10 gm extrakt z mase3 m

NS Amin E5 m cuiolysoec01é kvasnice (Ardamin pH) 3 m MgSO4.7H2O 0,55 gm

Na₂HPO₄ 0,1901

KH2PO4 OJ 82 m

CaCOj 0,5 m destilovaná voda 1 000 ml pH 7,0 až 7,2

Stupeň B

Dvě dvo ové Erleomeynržvy baňky s přepážkami, obsahnuí-cí po 500 ml média 7, se naočkuj]! po 10 ml z obsahu baněk stupně A. se inkubuuí při .28 °C na rotační třepačce s 160 otáčkami a 5 cm posunem po 24 hodin.

Stupeň C

Do 7561itrového nerezového fnlmentcČníUo tanku obsahnuícího 467 litrů média 8 se přidá 1 litr celého fnlmentcčoího média ze stupně B. Fermerrtační tenk se míchá při 28 °C s 130 otáčkami za minutu po 96 hodin za provzdušňování 283 litrů za minutu.

Médium 8 rajčatová pasta kvasnice N. F.

škrob, mooífikovaný CPC gm/1 gm/1 gm/1

CoClg.óHgO 5 . mg/1 polyglykol 2000 0,321 ml/i destilovená voda q.s.

pH 7,2 až 7,4

Ke konci této doby se 15,5 litrů celkového média filtruje a mycelium obsahující C-076 se promyje vodou. Vlhké ^celium (2,268 g) se extrahuje 3 litry acetonu za míchání. Smés se filtruje a filtrát se zahustí na 1 550 ml a upraví zředěnou kyselinou chlorovodíkovou na pH 4,0. Tento roztok se extrahuje třikrát stejrýfai objemy chloroformu. Chloroformové extrakty se suší filtrací přes bezvodou Wemelinu (Superrce), spojí se a zahustí ve vakuu k suchu. Zbylý olej C-076 váží 5,12 g. 3,3 mg je plně . aktivní proti N ' dubius u myyí.

4,69 g tohoto oleje se rozpustí v 142 ml chloroformu a chromatografuje se na koloně, obsah^ící 90 g silkktgrlp v chloroformu. Kolona se eluuje sm^s^zí chloroformu a et^hanolu 49:1 a jímá se 145 frakcí po 5 ml. Pak se kolona eluuje směsí chloroformu a ethanolu (19:1) a jímá se 146 až 226 frakcí po 5 ml. Frakce 49 až 72 se spojí a odpařením k suchu se získá 200 mg oleje (A). Frakce 79 až 184 se rovněž spojí a odpařením se získá 291 mg oleje (B). 400 fig každé frakce je plně aktivní proti N. dubius u myd. Tyto dvě frakce (A a B) se analyzují odděleně na зННмдек v tenké vrstvě (Quanta/Gram QIF pLates, available from Quanta/Gram lne., Faarfield, New Jersey). Desky se vyvolávaj směsí chloroformu a methanolu (19:1). Skvrny se analyzují v pltraftiloéém světle a jedna skvrna každé frakce má charakteristické ultrafialové absorpce sloučenin C-076 (viz tabulku 1). Z frakce A skvrna s Rf = 0,83 a z frakce B skvrna s Rf = 0,57 vykazuuí tuto absorpci. Tyto skvrny reprezentují C-076 A sloučeniny a C-076 B sloučeniny.

198 mg oleje (A) výše se cUrlmatografpjr na 80 g siliktgrlp v chloroformu a eluuje se ve smmsi chloroformu a methanolu (199:1) a ' jímá se 520 pak se eluce provádí sm^í^zí chlorlfomu a methanolu (99:1) a jímají se frakce po 10 ml. Frakce 630 až 720 ml poskytly 30,4 mg a frakce 730 až 950 ml poskytly 78,4 mg a frakce 950 až 1 · ' 040 ml poskytly 20 mg ИгЛуИс^ Frakce 1 a 2 obsahují C-076 A sloučeniny a při testování u myší p^<^tti N. dubius a mnnožtví 1,0; 0,5 a 0,25 mg jsou plně aktivní.

Příklad 4

Stupeň A

250 ml Erleimeyenva baňka s přepážkami ^δβΐι^ίοί 50 ml média 8 se naočkuje ze zmražené lékovky Strep^^es aveiriittlis MA·4680. Baňka se inkubuje při 28 °C na rotační třepačce s 160 otáčkami s posunem 5 cm po dobu 24 hodin.

Stupeň B

Dvoouitrová Erlermeyerova· baňka, obsahnuící 500 ml ^é^ddLa 8 se naočkuje 10 ml obsahu baňky stupně A. Médium se inkubuje při 28 · °C na rotační třepačce s 160 otáčkami za minutu a. posunem 5 cm po dobu 24 hodin.

Stupeň C

Do ^O^trového nerezového fermentačního tanku, obsahnuícího 160 litrů média 9 se přidá 500 ml očka ze stupně B. F^me^noi° se inkubuje při 28 °C za míchání 150 otáček za minutu po dobu 24 hodin a za provzdušňování 84,9 litrů za minutu.

Médium 9 dextrosa kukuřičný škrob extrakt z masa gm/1 gm/1 gm/1 autolysované VvasnCce (Adarnii n pH ) 5 gm/1

Mg.SO4.7H2O 0,05 gm/i

Na₂PPO4 О1Ю gm/1·

KH2PO4 0J82 g/1

CaCOj 05 gm/i destilovaná voda q.s.

pH 7,θ' až 7,2

Stupeň D

Do 1766it.irového icrczového ftrraentačního tanku obalujícího 467 litrů média 6 st přidá 43 litrů očka zt stupně C. tank st inkubujt při 28 °C za míchání 130 otáček za minutu po dobu 144 hodin a za provzdušňování 283 litrů vzduchu za minutu.

Stuptň E

Kc konci této doby st veškeré médium přefiltruje a filtrační koláč obsahující C-076 st promyjc vodou. Filtrační koláč sc suspenduje v 129 litrech · acetonu po 30 minut, přefiltruje sc a pevné podíly st promyjí 30 litry acetonu. · Acetonové promývací roztoky sc spojí a odpařením za sníženého tlaku sc zahuutí na 40 litrů. Κοι^^Γέ! sc upraví na pH · 4,0 zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Κοιμ^Ι se · třikrát extrahuje stejnými objemy chloroformu.

Chloroformové extrakty sc suší filtrací přes sloupeček křemeliny (superctl). Extrakty prošlé supercelem se spo;jí. Spojené extrakty se zahuutí za sníženého tlaku na objem 4 litrů. Chloroformový se filtruje přtu kolonu 2,4 kg silikagelu v chloroformu. Kolona se eluujt chl^or^oOrm^í^m a jímá se osm frakcí po 3,5 litrech. Kolona se pak eluujt směsí chloroformu a methanolu (49:1) a jímá se dalších osm frakcí po 3,5 litrech (frakce 9 až 16). Frakce 3 sc zahnutí k suchu a získá se 76 g nlejovitého materiálu, obsahujícího převážně sloučeniny C-076.

% tohoto mat^r^iálu se rozpuutí v 685 ml methhlenchhoriíu a cUrηmarografujr sc na 800 g kyseliny křemičité (MarliiCkrηdt Co. 100 mesh, přesáté přes síta 80 mesh).

Kolona (7,62 cm průměr, 36 cm délka) sc vyvvjí směsí m^e^l^j^]^l^r^(^c^]^<^rridu a benzenu (7:3) a 7,5 1 a pak sc rluujr 5 % isopropanolu vc směsi methulenchhoriíu a benzenu ·(7:3), 2,25 1. Frakce eluované 5 % isopropanolu vc směsi metthlenchloridu a· benzenu, které obsahují silně zbarvený pás obsahují veškerý C-076 materiál, jak bylo stanoveno cUromθreηгarií na tenké vrstvě (jak jr popsáno v příkladu 2).

Tato frakce (500 ml) st odpaří a znovu chrηmmrograЮu·jt na 105 g · kyseliny křemiiité (kolona 3,7 cm průměr a 18 cm délka) v methylenchloridu. Kolona se vyvvjí 100 ml dávkami metthlenchloridu, obsáhli Jící 5, 10 a 20 % etheru. Daaší rlucí 20 % etheru v methylenchloridu se získají 2 barevné pásy. Frakce obsažené mezi dvěma pásy obsahuj veškerý C-076 matecrál, jak bylo stanoveno chrom matoval. í na tenké vrstvě.

Frakce obsahtiuící C-076 se na 59 g kyseliny křemiiité (kolona · 3,7 cm průměr, 11 cm délka) v methhlenchhoridu. Kolona se vyyvjí 10 % etheru v methylenchloridu. Jakmile se tluujr první materiál, odebere sc 70 ml frakce a pak 26 frakcí po 5 až 6 · ml. Frakce 3 až 26 sc spoj a získá sc 1,35 g materiálu, který se analyzuje cUrommreηrraií na tenké vrstvě (sil-k^i^g^e^l^c^v^é desky (ínatech GF 254, eluční činidlo 5 % isopropanolu 'v·methuleniCUoridu). Látka s Rf 0,28 v tomto systému je C-076 AI.

Kolona se pak rluujr 20 % etheru v methylenchloridu (200 ml) a pak 50 % etheru v metUlltnchloiidu (800 ml). Eluuje sc tak malé mnnOžtví C-076 A1/A2 směsi a pak veškerý podíl látky A2. Celkový odparek C-076 A2 frakce je 800 mg.

Daaší eluci 5 % isopropanolu v methylenchloridu . se získá látka C-076 B1 (135 mg). Oddělení se sleduje ultrafaaoovou absorpcí eluátu. C-076 B1 a A2 mají velmi obdobné Rf hodr noty při chromaaooгrlii na tenké vrstvi silikagelu (Annatech GF 254) ve směsi 5 ® isopropanolu v meehhyenchloridu. Tyto dvl sloučeniny jsou jasni oddčlitelné na stejné desce vyvíjené 15 % isopropanolu v hexanu.

Veškerá C-076 A1 frakce se nanese na 14 silikagelových desek (Anatech HF 254 20x20 centimetrů, silni 500 /u)_e Desky se vyvíjí 10 % isopropanolu v hexanu. Pás obsahující C-076 A1 se vyjme z desek, extrahuje se etherem, odpsaří a znovu nanese na 6 dalších desek a pětkrát se vyvvjí 5 % isopropanolu v hexanu. C-076 AI se vymyje z desek a znovu chromatografuje, vyvvjí se čistým etherem a získá se 270 mg v podstati čisté sloučeniny C-076 AI. Infračervené a NMR spektra tohoto vzorku jsou uvedeny jako obrázky 1 a 5 a v tabulce 2.

Frakce C-076 A2 se chгojlalogrrlují na 10 silkkagelovtch deskách (Anatech HF 254) a pětkrát se vyvvjí 15 % islprlplnolu v hexanu a získá se 265 mg v poddtati Čisté C-076 A2. Infračervené a NMR spektra tohoto vzorku jsou uvedeny jako obrázky 2 a 6 a v tabulce 2.

Frakce C-076 B1 se chromaaoo.ralují na dvou deskách (jak uvedeno výše) v 15 % isopropanolu v hexanu a získé ' se 55 mg v poddla^ čisté sloučeniny 0-076 B1. NMR spektrim tohoto vzorku je uvedeno na obr. 7 a v tabulce 2.

Příklad 5

Fermentace popsaná v příkladu 6 se opakuje dvakrát a veškeré médium se spo^Jí. Fermentované médium se zpracuje postupem popsaným v příkladu 6 a získá se 3,3 litru ehllгof osového ' extraktu, který obsahuje 60 mg/ml celkových pevných látek a podle analýzy chromatografií na tenké vrstvi obsahuje 0,5 % C-076.

litry tohoto cHorof Drnového roztoku se chromalolrraují na 2 400 g silikagelu (Davidson Grade 62) v ehlor^í^í^t^-.mu. Kolona (9,5x122 cm) se eluuje osmi 3 800 ml dávkami chloroformu (frakce 10 až 8) a pak osmi 3 800 dávkami směsi chloroformu a methanolu (49:1) (frakce 9 až 16). Jednotlivé frakce se analyzují ch:ro^aat^^raf2.í na tenké vrstvi (silkkagelové desky, Quanta/Gram O1F), eluce směsí chloroformu a methanolu 19:1. Frakce 9' až 11, 12 až 13 a 14 se odpaří a získá se 6,63 g pevného poddlu obsahnuícího 0-076 A složky ve frakcích 9 až 11, 24,91 g pevných látek obsah^uících C-076 B složky ve frakcích 12 až 13 a 4,71 g pevných látek také obsah^uících C-076 B komponenty ve frakcích 14.

Maateiál z frakcí 12 až 14 se spojí (29,62 g), rozpustí se v 100 ml methylenchloridu i clrlmaaografuje se na 400 g silikagelu (Davidem Grade 62) v ^ee^i^h^l^l^ϊ^c^^l^<^2ri.Su. Κ^^^ι se eluuje 1 500 ml směsi meehlУenaeloriS/2-orlpaaol (99:1), 1 500 ml meehlУenaClooiS/2-prlpaall (49:1), 2 000 ml meehllenaelorid/2-proplnll (19:1) a 1 000 ml meehlУenahloliS/2-propaall (9:1). Objemy eluátu mezi 5 500 až 6 000 ml (2,56 g) a 6 000 až 6 500 ml (5,03 g) se spo^í, rozpětí se v 25 ml meehyУenchloriSu a Απι^Ιο^’^^! se na 60 g silikagelu v hexanu.

Předek, 70 ml hexanu a 100 ml směsi hexan diet^^^e!’ (4:1) se odeberou a kolona se pak eluuje 600 ml směsi lexaaadSethyУether (1:4), jímají se tři . . 200 ml frakce a nakonec se eluuje 700 ml etheru a jímají se 100 ml frakce. Eluáty kolony objemů 400 až 600 ml poskytly 2,035 g pevných látek obsah^uících C-076 B1 sloučeniny, objemy 600 až 1 100 poskytly 0,881 g pevných látek obsah^ících směs C-076 B1/B2 sloučenin a objemy 1 100 až 1 500 ml poskytly 0,381 g pevných látek obsah^uících C-076 B2 sloučeniny.

Směs sloučenin C-076 B1/B2 se rozpustí v 4,2 ml smmsi metllУlalklholu a vody (4:1) i elaomaaografuje se na C18 Porasil (Bondapak 37-75 mikronů) ve stejném rozpon! tidle.

Revvrsní fáze vysokotlaké kolony (p^o^l^r^i^(^;jší složky se eluují nejprve) je 1,2 metru 16 mm i eluce se provádí rychlostí 800 ml za hodinu a jímají se 21,3 ml frakce. Příoomnost C-076 komponent se sleduje ultrafialovou absorpci frakci. C-076 B2 se izoluje z frakcí 24 až 37 a C-076 B1 se izoluje z frakcí 51 až 70 a získá se 195,4 mg C-076 B2 a ' 137 mg C-076 B.

Každý ozorek se pak odděleně chromatografuje na 4 g kolonách silikagelu (Davidson Grade 62) o methylenchloridu. Kolony se eluují 35 ml směsi meetylenchloridu a methanolu (9:1). Poslední 20 ml eluátu z každé kolony se jímá a odpařením k suchu se získá 155,3 mg C-076 B2 a 90 mg C-076 B1.

mg C-076 Bl a 100 mg C-076 B2 se cUrlmalografuje na preparationích silikagelových deskách (Analtech HF 254), eluci nejproe 12 % is^r^ano^ o hexanu a pak etherem. Izolují se tak C-076 B1 a C-076 B2, které jsou o podstatě čisté. Infračeroená absorpční spektra takto izolovaných sloučenin C-076 Bl a B2 jsou uoedeny o obrázcích 3 a 4. NMR spektrtm takto izolDoané sloučeniny C-076 B2 je uoedem na obrázku 8.

Příklad 6

250 ml Erlenmeyerooa baňka obsahující 50 ml média složení:

lak^sa ‘ 2,0 · % rozpustné destilační zbytky 1,5% autolysooané· konsnice Ardamine pH 0,5 % pH přes sterilislcí 7,0 % se naočkuje obsahem zmražené lékooky Streptomyces aveirnitilis MA 4848 a inkubuje se na rotační třepačce 24 hodin při 28 °C s 150 otáčkami·za minutu.

ml oýše připraveného fermentačního mmdia se pouužje pro naočkování 500 ml stejného média připraveného oýše o dvou^tn^ Erlermeyerlvё baňce s přepážkami. Fermentační médium se inkubuje na rotační třepačce 24 hodin při 28 °C s 150 otáčkami za minutu.

Všechna přeSchUzzjící média se pouuijí pro naočkování 467 litrů následujícího mmá^a o 7561itrovém nerezovém feraentačaíl tanku složení:

l^tisa rozpustné destilační zbytky lutllyslvlaé kvasnice Ará^ine pH polyglykol 2 000 pH před sterilisací

2,0 % 1 ,5 % 0,5 % 0,32 ml/l 7,0·

Fermanaačaí média se inkubují při 28 °C 40 hodin za orlvzdušňlvání 283 litry ozduchu za minutu a za míchání rychlostí 130 otáček za minutu.

230 litrů oýše připraveaéUo média se použije pro naočkování 4 310 litrů následujícího mmá^ obsaženého o nerezovém feimentučním tanku

dextrlsl pep^nis!^^ mléko autilysioané kvasnice Andami pH pilyglykil 2000 pH před sterilisací .

4,5 % 2.4 % 0,25 % 2.5 ml/1 7,0.

Fermíntlce se prooádí 144 hodin při 26 °C za provzdušňování 1 536,7 litrů ozduchu za minutu i za míchání 120·otáček za minutu.

Fermentační médium se filtruje a koláč myyelia se promyje asi 550 litry oidy, filtrát i primývací oidy oe oyyeei. Filtrační koláč se pak míchá s 1 550 litry acetonu asi 60 minut, načež se filtruje. Filtrační koláč se promyje směsí asi 150 litrů acetonu a 40 litry deionisované vody a získá se asi 2 000 litrů extraktu.

Předcházeejcí fermentace a extrakce se opakuje ve stejném měřítku a získá se dalších 2 000 litrů acetonového extraktu, který se spojí s prvním extraktem a odpaří se na objem asi 800 litrů. Hodnota pH konncenrátu se upraví na asi 4,7 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové a se s 800 litry meehyyenchhoridu. Spojená rozpouštědla se míchají asi 4 hodiny a oddělí se. Vodná fáze se smísí s dalšími 800 litry methhyencháoridu a míchá se asi 4 hodiny. Fáze se oddělí a každý meehylenchloridový . extrakt se odděleně smísí s 10 kg Supercelu a filtruje se. Oba extrakty se odpaří na společný objem asi 60 librů.

Příklad 7 litrů roztoku C-076 v methyУencháoridu, připraveného v předchzáejícím příkladu, se zahuutí ve vakuu k súchu a odparek se třikrát smísí s 60 litry methanolu a odpaří k suchu tak, že se odstraní zbytky meehyyenchloridu. Konečný methanolický konjenjrát je asi 36 litrů. Meehannoický roztok se skladuje přes noc a filtruje se. Filtrační koláč se promyje 40 litry čerstvého methanolu a meehanolické filtráty a promývací roztoky se spojí. MeUhaiolický roztok se smísí s ‘95 litry ethylenglykolu a 130 litry heptanu. D^c^oufázový roztok se míchá 5 minut a spodní fáze (ethyle^ly^! a meehanol) se oddělí. Heptanový roztok se promyje směsí 20 litrů ethylenglykolu a 6,3 litrů methanolu.

Po pěti minutách míchání se spodní vrstva a smísí s prvním ethylenglykol-methanolickým extrakeem a přidá se k němu stejný objem vody (asi 150 litrů) obsahující 79 g soli na litr. Tento roztok se extrahuje 150 litry ttáylttátru a směs se míchá 5 minut. Etherické fáze se promyje 75 litry vody (1/2 objemu) a·míchá se 5 · minut, · načež se fáze oddálí. Tento postup se opakuje ještě dvakrát (konečný vodný roztok obsahuje 20 g soli na litr) a získá se konečná etherická fáze 110 litrů. Etherická fáze se zahustí ve vakuu na minimální objem, přičemž teplota se udržuje nižší než 25 °C. 40 litrů methylenchloridu se přidá ke zbytku a roztok se odpaří k suchu. Tento postup se opakuje a konečný zbytek se zahubí ve vakuu při 50 °C k suchu.

Příklad 8

Připraví se kolona o průměru 30 cm, obsahhudící 34 kg aktivovaného kysličníku hlinitého a pak 34 kg aktivního uhlí · v methyltjchloridovém roztoku. Odparek připravený v předcházejícím příkladu se rozp^s^stí v methylencháoridu na objem 34 litrů a nanese se na kolonu a eluuje se 34 litry methálencháoridu. Tyto frakce se vy^eí. 3% roztok isopropajjlu v methylenchloridu (20,8 litrů isjerjpanjlu a 660 litrů methylencháoridu) se pak použije pro eluci kolony a jímají se asi 2001itrjvt frakce.

Spojené isopropanolové a methyltnchljridjvt frakce se odpaří ve vakuu na lázni teploty asi 60 °C na objem 20 litrů, načež se teplota lázně sníží na asi 45 °C a extrakt se odpejří ve vakuu k suchu. Odparek se rozpučí v 10 dílech me^h^n nCh oridu, 10 dílech hexanu a jednom dílu methanolu na konečný objem 15 litrů. Tento roztok se přímo nanese na kolonu s Steáadtxem LH-20 podle následujícího příkladu.

příklad 9

Kolona o průměru 30 cm se připraví z 36 kg Steáadexu LH-20 (dostupný od Pharmmcis

Fine ChámiccCs, 800 Ceeneunnal Avenue, Piscataway, New Jersey 08854) v a promyje se rozpouštědlem, sestávajícím z 10 dílů meehyyenchloridu, 10 dílů hexanu a jednoho dílu methanolu. Jedna čtvrtina C-076 roztoku podle příkladu 10 se nanese na kolonu a eluuje se rychlostí 250 ml za minutu. Jímají se dva 201itгjvé předky, které se vyfojí a pak se jímá 20 dvouuitrových frakcí (1 až 20) a pak jedna 201itrová frakce, která se vyleje.

Frakce 1 až 8 · C-076 A sloučeniny a frakce 9 ·až 20 obsahuj C-076 B sloučeniny.

Příklad 10

Postup podle příkladu 9 se opakuje ve stejním měřítku ještě třikrát a veškeré frakce obsahující C-076 B sloučeniny (frakce 9 až 20) se spojí a odpaaří k suchu a získá se 818 g surové směsi C-076 komponent. Vzorek obsahuje 55 % C-076 B1 a 39 % C-076 B2 sloučenin. 6305 g tohoto roztoku se rozpuutí ve 2 litrech methylenchloridu a místí se v 22lirrové tříhrdlé kulaté baňce a přidá se 13,6 litrů methrnolu. MeehulenehUorid se odstraní destilací s 13,6 litrů. ttUyLtngllkolu se pak přidá a methanol se oddestilovává za sníženého tlaku. Rychhost destilace se udržuje taková, že teplota roztoku neklesne pod 65 °C.

Jakmile je přidávání ethylenglikolu úplné, roztok se nechá 16 hodin při 5 °C. Krystaly se odfiltrují a promyj 1 lírem studeného et^hilenglikoLu. Krystaly se pak znovu rozpustí v 2 litrech meehyienchloridu a roztok se unístí v 221itrové tříhrdlé kulaté baňce. Postup popsaný výše se dvakrát opakuje. Nejprve se pobije 12,5 litrů jak methanolu, tak tthlLtngLykolu a podruhé se pobije 13,6 litrů jak methanolu, tak etUlLengLlkrlu. Konečné krystaly se promyj 1 litrem studeného ttUlLtngLlktLu a 1 limem vody. Kryitaly se rozpuutS v 4 limech benzenu a vysuší se filtrací přes síran sodný. Benzenový roztok se z-ahuutí na objem 2 litrů a liofilisacS se získá 241,2 g bílého prášku, obsahujícího 98 % C-076 B1 a 1 % C-076 B2.

Matečné louhy (22 litrů) z prvých dvou krystalizací se spojí a zředí 22 litry vody. Vodný roztok se extrahuje 60 litry v toluenu a znovu 15 litry toluenu. Toluenový extrakt se pak promyje 48 litry vody. Organická fáze se filtruje přes supercel, aby se odstranila zbylá voda a odpařením se získá 336 g pevného maatriálu, sestávajícího z 79 % C-076 B2 a C-076 B1 sloučenin.

Příklad 11

Sloučeniny C-076 A, získané ze čtyř Seplia^ LH 20 kolon jako frakce 1 až 8 při postupu podle příkladu 9, se spoj Podle vysokotlaké kapalné chrrInalorrafit bylo nalezeno, že obsahují 252 g C-076 A2a sloučeniny, 16 g A2b, 96 g Aa a 24 g A1b sloučeniny. Látku se rozpustí v systému rozpouštědel sestávajícím z hexanu, toluenu a methanolu v poměru 6:1:1 a nanesou se na kolonu Seohadexu LH-20 stejrých rozměrů^jako bylo použito v příkladu 9 ve výše uvedených rozpouštědlech.

Eluce se provádí rychlostí 25C ml za minutu a předek 20 litrů se vyieje. Další eluci se získají 2 další 2Clitrové frakce, které se také vviejS a pak. se jímá 5C BiíMittových frakcí, které obsah^uí C-076 A sloučeniny. Frakce 3 až 8 obsahují převážně C-076 AI sloučeniny (40,2 g Aa, a 6,7 g Ab), frakce 29 až 36 obsáhlí C-076 A2 sloučeniny (117,2 g A2a a 7,35 g A2b). Frakce 9 až 28 obsahují směs C-076 A1 a A2 sloučenin.

Příklad 12

Vzorek 150 g C-076 Bl z příkladu 10 se rozpustí v 3 limech směsi rozpouštědel hexan: :tol.uen:methinol v poměru 3:H. Roztok se proleje kolonou Stphadtxu LH-20· (stejných rozměrů jako v příkladu 9) ve výše uvedených rozpouštědlech rid^h^<^í^'ts 290 n;l za minutu, Jímají se dvě 201itrové frakce smčsi rozponutědel, které se vyiejs a pak předek 10 litrů, který ae'také ,vyieje. Pak se jímají frakce po 2 1ϊ^*θο1. Frakce 1 až 13 e ' i až 30 se vyiejí. Frakce 14 až 16 se sp^í^^S a obsahuj 80 g převážně sloučeniny C-076 B1a. Frakce 22 až 24 se spojí a obsahuj 6,7 g převážně sloučeniny C-076 Bb. Frakce 17 až 21 obsahuj směs C-076 Ba a Blb.

Frakce 17 až 21 výše se spojí a zal^i^s^ltí a pak se pron-js kolonou Seohaftxu LH-20 v systému rozpouštědel uvedených výše. JímftjS se tři 201imové frakce, které se vyieeí*

Pak se jímá pět frakcí po 2 limech (frakce 1 až 5), 20 frakcí po 1 litru (frakce 6 až

25) a 10 frakcí po 2 litrech (frakce 26 až 35). Frakce 1 až I5 se vyiejí, frakce 16 až 21 obsahují 13,5 g C-076 Bia a 0,4 g C-07.6 Blb, frakce 22 až 26 obsahují 44 g C-076 B1a a

0,13 g C-076 Bb. Frakce 27 až 30 obsaHuJí 10,2 g C-076 Ba a 0,8 g ' C-076 B1b.

Naklad 13

Směs všech osmi C-076 složek se chromatografuje na vysokotlaké kapalné chromatograf li, kolona 4 mm x 30 cm naplněné 10 mikronovýfo Bondapak C^ silikageeem (firay Mers Associates lne., Maple Street, Milford, Maassahihusets 01757), eluce směsí 85:15 (obj/obj) methanolu a vody při konntantní teplotě 40 °C. Průtokem rychlostí 1,2 ml za minutu seoddělí všech osm komponent a eluění objemy, které jsou za předcházzjících konntantních podmínek iharakieristicié pro jednotlivé sloučeniny, jsou následnici:

eluční objem (Ve) Ml

C-076 B2b	5,90
C-076 B2a	6,52
C-076 A₂b	7,12
C-076 Apa	7,88
C-076 B*b	8,36
C-076 B1a	9,60
C-076 Ab	10,24
C-076 A,a	11 ,88

Odddlení C-076 b komppnent od odpc)oíddaících a komponent se provádí použitím vysokotlaké kapalné chromaatogaaie. AAssoutní methanolický rotok 30 mikkOoitiůi směsi C-076 AI a a A1b obsahující 30 <ug C-076 Ab se udítí na 3x250 mm vysokotlakou kapalnou chrdnaaografickou kolonu, obsahující jako náplň Spherisorb 5 mikron ODS (dostupný od Spectra Phhsscs). Kolona se eluuje směsí 85:15 methanolu a vody rychlostí 0,15 ml/min. Eluce produktů se sleduje ultrafaaoovou absorpcí eluátu podle UV moontoru a jímají se jedno divé složky. Izoluje se 30 wg C-076 Alb a analyzuje se hmotovým spektrometrem. Hnmoové spektrum tohoto vzorku je uvedeno ve druhém' sloupci tabulky 3.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob přípravy nových antUelaintiiiýcU sloučenin označených C-076, vyznačený tím, že se za aerobních podmínek fermentuje kmen Streptomyces aveiriittlis NRRL 8165 ve vodném živném rnmdiu, obsahujícím od 0,5 do 5 % UmoCnnctnícU asiοilcíatjlnéUc zdrojeuhlíku, od 0,2 do 6 % ^πο^ο^η!^ asiailcíatelnéUc zdroje dusíku a anorganické sod, přičemž feiOentace se provádí při teplotě od 20 do 40 °C, s výhodou od 24 do 30 °C, při pH od 5,0 do 9,0, s výhodou od 6,0 do 7,5, po dobu 1 až 8 dnů a z feimentačního mmá^a se izolují C-076 sloučeniny.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se s kmenem Streptomyces avej^nittiis, produkujícím C-076 sloučeniny, feimentuje vodné živné médium obsahující esiοilcíjtjlný zdroj uhlíku, asiοilcíatelný zdroj dusíku a anorganické soli za aerobních podmínek, C-076 sloučeniny se izolují filrací fermentačního mmá^a, extrakcí m^ceia s vodou mísiteným organickým rozpouštědlem, odpařením organického rozpouštědla a extrakcí zbytku s vodou nemísiteným organickém rozpouštědlem.