JPH07505280A - ストレプトマイセス アベルミチリス株によりグリコシル化されたアベルメクチン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ストレプトマイセス　アベルミチリス株によりグリコジル化されたアベルメクチ ン化合物発明の背景 アベルメクチン化合物はＡｌｂｅｒｓ−８ｃｈｏｎｂｅｒｇらの米国特許第４， ３１０．５１９号に開示されていチン化合物は１３位に天然のα−Ｌ−オレアン ドロシルーα−Ｌ−オレアンドロシルオキシ基を有する。Ｆｉｓｃｈｅｒらの米 国特許第４．２０３．９７６号は、アベルメクチン化合物の４１−ヒドロキシを 含むが、１４ａ位は含まない、アベルメクチン分子の種々のヒドロキシ基をグリ コジル化するための所定の合成手順を開示している。Ａｏｋｉらの米国特許第３ ．９５０．３６０号はミルベマイシン化合物を開示しており、Ｒｕｄｄらの欧州 特許出願公開第２４２．０５２号は２３−ヒドロキシ基及び２５−不飽和アルキ ル基を有するネマデクチン化合物を開示している。

本発明は５−メトキシ基の形成を伴うことなく、アベルメクチン化合物の１３及 び１４ａ位をグリコジル基、特にオレアンドロシル基で置換したアベルメクチン 化合物の製造に係り、該化合物は新規ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉ ｔｉｌｉｓ株ＭＡ６９４１．ＡＴＣＣ５５２９２の培地中で、アベルメクチンア グリコン又は１４ａ−ヒドロキシアベルメクチン化合物を発酵させることにより 製造される。発酵により製造された化合物は強力な抗寄生虫及び駆虫剤である。

発明の説明 本発明は、オレアンドロシル基がアベルメクチン化合物の４’、１３及び１４ａ 位に位置するアベルメクチン化合物の製造に関する。製造方法は、微生物Ｓｔｒ ｅｐｔｏｍｙＣｅＳ　ａＶｅｒｍｉｔｉｌｉｓを培地中で培養し、アベルメクチ ン単糖、アグリコン又は１４ａ−ヒドロキシアベルメクチン出発物質を発酵ブロ スに加えることにより実ｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ　２０８５２に所在のＡｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣ Ｃ５５２９２で寄託された新規微生物である。５５２９２の寄託は特許手続上の 微生物の寄託に関するブダペスト条約に基づいて行われた。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ株ＭＡ　６９４１は、発酵 ブロスにアベルメクチン化合物を加えないとこの種化合物を産生じない新規突然 変異株である。該株はグリコジル化するが、Ｃ５−０−メチル化を行わない。該 株はＣ５−０−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と、アベルメクチ ンアグリコン構造の合成に必要なりＮＡの一部を欠失していた。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓＭＡ６９４１．ＡＴＣＣ５ ５２９２の形態的特徴は以下の通りである。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ株ＭＡ６９４１の一般性質 を以下に記載する。培養物はメチル化を伴わないアベルメクチン単糖、アグリコ ン又は１４ａ−ヒドロキシ誘導体のグリコジル化に使用される。ｓｈｉｒｌｉｎ ｇ及びＧｏｔｔｌｅｉｂの方法（Ｉｎｔｅｒｎａｔ、Ｊ、ｓｙｓｔｅｍ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、　１６：３１３−３４０）に従って生育、一般培養特徴及び炭素 源利用の観察を行った。Ｌｅｃｈｅｖａｌ　ｉｅｒ及びＬｅｃｈｅｖａ　１　ｉ 　ｅ　ｒの方法（ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅＴａｘｏｎｏｍｙ、Ａ、ＤｉｅｔＺ 及びり、Ｗ、Ｔｈａｙｅｒｌｌ、　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ ａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　１９８０）を使用して細胞の化学的組成を 決定した。Ｉｎｔｅｒ−８ｏｃｉｅｔｙ　Ｃｏ１ｏｒ　Ｃｏｕｎｃｉｌ−Ｎａｔ ｉｏｎａｌＢｕｒｅａｕ　ｏｆ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　Ｃｅｎｔｒ。

ｉｄ　Ｃｏ１ｏｒ　Ｃｈａｒｔｓ（米国商務省規格標準局５５３．１９８５補遺 ）に含まれる色標準との比較により培養物の着色を決定した。

細胞壁組成の分析−ペプチドグリカンはＬＬ−ジアミノピメリン酸を含む。

一般生育特徴一酵母麦芽エキス寒天（ＹＭＥ）　、グリセロールアスパラギン寒 天、無機塩澱粉寒天、オートミール、トリプチケース大豆寒天及びペプトン鉄寒 天上での生育良好。ツアペック寒天及びＮＺ−アミン（ＳｈｅｆｉｅｌｄＣｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を補充した水道水寒天上では生育不良。培養物はトリプト ン酵母エキスブロス中でも生育する。培養物は２７℃及び３７℃で生育する。

コロニー形態−（２１日目ＹＭＥ上）基土菌糸は薄茶色。

ラニン色素が生産される。コロニーは不透明で盛り上がり、完全な縁部を有して おり、コンシスチンシーはゴム状であり、光沢のない表面テクスチャーを有する 。

微小形態−気菌糸（０，５７〜０．７６μｍ）が基土菌糸から生じ、分岐し、短 （波状である。成熟培養物（７〜２８日　ｐ、ｉ、）では気菌糸は先端に胞子の 螺旋状連鎖を有し、該胞子は場合により先端に層状構造を有する。この特徴は高 密度気中発育領域で特に顕著である。胞子形成はＹＭＥ、無機塩−澱粉寒天、オ ートミール、グリセロールアスパラギン寒天、ＮＺ−アミンを補充した水道水寒 天及びツアペック寒天上で起こる。

多面的生理的反応−培養物はペプトン−鉄寒天中でＨＩＳを産生する。ＴＹジブ ロス中、ＹＭＥ、）リプチケースー大豆及びペプトン鉄寒天斜面ではメラニン色 素が形成される。澱粉は培養後２１日で僅かに加水分解するが、培養後１４日で は加水分解しない。炭素源利用パターンは以下の通りである。Ｄ−フルクトース 、α−Ｄ−グルコース、α−Ｄ−ラクトース、β−Ｄ−ラクトース、Ｄ−マンニ トール、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロースの利用良好。Ｌ−ア ラビノース、イノシトール、Ｄ−マルトース、Ｄ−ラフィノースの利用は並。Ｄ −アラビノース、スクロースの利用不良。

要約したものである。

合致する。

表２ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｗｉｔｉｌｉｓ　１ＩＡ６９４１の２１日 目炭水化物利用パターン Ｄ−アラビノース　Ｉ Ｌ−アラビノース　２ Ｄ−フルクトース　３ イノシトール　２ α−Ｄ−ラクトース　３ β−Ｄ−ラクトース　３ Ｄ−マルトース　２ Ｄ−マンニトール　３ ３＝利用良好 ２＝利用並 １＝利用不良 ０＝利用なし 本発明の新規微生物の使用方法は下記反応図式で最良に実現される。

上記反応図式中、２２．２３位の破線は２２．２３位間の単結合又は二重結合を 示し； Ｒ１は破線が２２．２３位間の単結合を表す場合にのみ存在し、水素、ヒドロキ シ、オキソ又はヒドロキシイミノであり； Ｒ１はＣＩ−ＩＩアルキル、ＣＩ、アルケニル又はＣ３−８シクロアルキルであ り； Ｒ１はヒドロキシ、オキソ、メトキシ又はアセトキシでＲ４は水素、ヒドロキシ 又は ［式中、ｎはＯ又は１である］であり；ｍは１又は２であり； Ｒ６はヒドロキシ、アミノ、Ｃｌ−８アルキルアミノ、Ｃト８ジアルキルアミノ 又は（ＣＩ−Ｓアルキル）（ＣＩ−Ｍアルカノイル）アミノであり； Ｒ６は水素又はヒドロキシである。

式■及び■の上記化合物は活性な駆虫剤である。

上記反応図示中、下記化合物は新規化合物であり、活性の単結合又は二重結合を 表し； Ｒ，が、破線が２２．２３位間の単結合を表す場合のみに存在し、水素又はヒド ロキシであり；Ｒ８がＣｔ−Ｓアルキル、Ｃｌ−＠アルケニル又はＣＩ・シクロ アルキルであり； Ｒ３がヒドロキシ又はメトキシであり；Ｒ４が水素又はβ−ヒドロキシである場 合、本発明の化合物は新規であるとして定義される。

合物を加え、下記のように発酵させることにより実施される。式■の化合物は、 Ｒａがヒドロキシであるときに形成され、弐■の化合物はＲ３が水素であり且つ Ｒ４がヒドロキシであるときに形成される。Ｒ４及びＲ３が同時にヒドロキシで ある場合には、１３及び１４ａ位の両方にオレアンドロース置換を有する化合物 も可能である。

式Ｉの化合物は、通常の１４−メチル基を有するアベルメクチン化合物の存在下 でＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　１ａｖｅｎｄｕｌａｅ　ＭＡ６５５５ｍ　ＡＴＣ Ｃ１４１５９の培養物を発酵させることにより製造される。発酵の一般条件は本 発明発酵に使用されている条件と同様である。

本明細書はこのような化合物の製造に関する特定例を含む。

更に、所定の１４ａ−ヒドロキシ化合物は欧州特許第１４４２８５号に記載され ているように合成もされる。式■の化合物は発酵期間中の任意の時点で発酵ブロ スに加えることができるが、予め一部発酵を進行させた後に出発物質を加え、た だ発酵完了までに微生物が出発物質に作用する時間を十分与えると有利であるこ とが判明した。一般に、出発物質は発酵が少なくとも１０％終了した後で且つ７ ５％終了する以前に加えられる。好ましくは、発酵がその予定期間の２０〜５０ ％終了したときに出発物質を加える。

出発物質は発酵ブロス１ｍｌ当たり０．１〜１０ｍｇの割合で発酵ブロスに加え る。好ましくは、発酵ブロス１ｍ１当たり１〜８ｍｇの量の出発物質を加える。

本発明の好適化合物は、上記構造式■中、２２．２３位の破線が２２．２３二重 結合を示し、Ｒ。

が存在せず： Ｒ２がイソプロピル又は５ｅｃ−ブチルであり；Ｒ３がヒドロキシであり； Ｒ４が水素又はヒドロキシ、最適には水素又はβ−ヒドロキシである場合に実現 される。

物の製造に使用可能な株の１例である。一方、本発明は上記微生物の突然変異株 を包含する。例えば、自然淘汰により得られる突然変異株や、電離性放射線（例 えば紫外線）照射又は化学的突然変異誘発物質（例えばニトロソグアニジン等） の処理により生産される突然変異株も本発明の範囲に含まれる。

本発明の化合物は、非産生５ｔｒｅ　ｔｏｍｙｃｅｓａＶｅｒｍｉｔｉｌｉｓ株 ＭＡ６９４１；　ＡＴＣＣ５５２９２と共に下記条件下で適切な水性栄養培地の 好気性発酵中に産生される。多数の抗生物質の製造に使用されるような水性培地 がこの大環式化合物のこの製造方法で使用するのに適切である。このような栄養 培地は微生物により資化可能な炭素及び窒素源と、一般に低レベルの無機塩とを 含む。更に、発酵培地は微生物の生育と所望の化合物の産生に必要な少量の無機 塩及び微量金属を含有し得る。これらの成分は通常は、栄養源として使用可能な 炭素及び窒素複合源中に十分な濃度で存在するが、当然のことながら、所望によ り培地に別々に加えてもよい。

一般に、糖類（例えばデキストロース、スクロース、マルトース、ラクトース、 デキストラン、セレローズ、コーンミール、エンバク粉等）及び澱粉のような炭 水化物が栄養培地中の適切な同化炭素源である。培地中で使用される炭素源の厳 密な量は、培地中の他の成分に一部依存するが、通常は培地の０．５〜５重量％ の炭水化物量で十分である。

これらの炭素源は個々に使用してもよいし、複数の炭素源を同一培地中で併用し てもよい。

酵母氷解物、酵母自己融解物、酵母細胞、トマトペースト、コーンミール、エン バク粉、大豆ミール、カゼイン氷解物、酵母エキス、コーンステイープリカー、 醸造可溶分、綿実油、肉エキス等のような種々の窒素源が本発明の化合物の産生 において５ｔｒｅ　ｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍ容易に同化可能である。種々の 窒素源は、培地の０．２〜６重量％の量を単独又は組み合わせて使用することが できる。

培地に配合可能な栄養無機塩は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシ ウムイオン、アンモニウムイオン、カルシウムイオン、リン酸イオン、硫酸イオ ン、塩化物イオン、炭酸イオン等を生成することが可能な慣用塩である。

コバルト、マンガン等のような微量金属も含まれる。

以下の説明及び実施例に記載する培地は使用可能な多種多様な培地のうちの単な る例に過ぎず、非限定的であるものと銘記されたい。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ株ＭＡ　６９４１．　ＡＴ ＣＣ５５２９２を生育させるために適切な培地の例を以下に挙げる。

市販赤砂糖　１０　ｇ トリプトン　５ｇ 酵母エキス　２．５ｇ ＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸）　３６　Ｂベタイン　１．２９ｇ プロピオン酸ナトリウム　０．１１ｇ 蒸留水　１１００■１ ｐＨ７，０〜ｐＨ７，２ 酵母エキス　２．５ｇ Ｌ−アルギニン　０．５ｇ 蒸留水　１０００■１ ＮａＣ１５，Ｏｇ （ＮＨ４）！ＳＯ４２，０ｇ ＣａＣＯ３６，０ｇ プロパツール　５ｇ 大豆粉　３０　ｇ 蒸留水　１００軸１ 培地４ 可溶性澱粉　１５　ｇ ソイトン（Ｓｏｙｔｏｎｅ）　２０　ｇＣｏＣｌｔ　０．１ｇ 酵母エキス　１．５ｇ 大豆油　５０１１ 蓋ＯＰＳ　１０　５■ｌ （モルホリノプロパンスルホン酸） 培地５ に！ｌＰＯ４４５０ｍｇ サッカロース　２．０ｇ カゼイン　１．５ｇ ＮａＣ１５０ｍｇ Ｌ−アルギニン　１５鵬ｇ 微量元素混合物＾　１．　Ｏ＋＊１ 蒸留水　１０００　■１ ｐＨ６，９ 微量元素混合物 クエン酸　４６．２■ｇ ＦｅＳ０４”７１１ｚ０　２．Ｏｍｇ ＺｎＳＯ４−７Ｈ１０１，Ｏｍｇ ＭｎＣｌｚ”４ＨｚＯｏ、ｓ　−ｇ ＣｏＣｌｔ−６Ｈ＊０　０．１　ｍｇ ＭｇＳＯ，・７Ｈ，０５０■ｌ アスコルビン酸　０．１２ｍｇ ｆｌ１０　１６（１ｍｌ 培地６ 綿実油　５．０ｇ 酵母エキス　０．５ｇ デキストロース　４．５ｇ 大豆油　０．５ｇ１ ＣａＣＯ３Ｇ、　６ｇ 微量元素混合物　１．０＠１ 蒸留水　１０００ｍｌ １００Ｏｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｔｔｔｔｔｓＭＡ　６９４１．　ＡＴＣＣ ５５２９２を使用する発酵は約２０〜約４０℃の温度で実施することができる。

最適結果のためには、約２４〜約３０℃の温度でこれらの発酵を実施すると最適 である。約２７〜２８℃の温度が最適である。本発明の化合物を製造するために 適切な栄養培地のｐＨは約５．０〜８．５であり、好適範囲は約６．０〜７゜５ である。

小規模発酵は、公知無菌法を使用してフラスコに適量の栄養培地を入れ、フラス コにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ　ＭＡ　６９４１．ＡＴ ＣＣ５５２９２の胞子又は栄養細胞増殖物を接種し、綿でフラスコを緩栓し、約 ３０℃の一定室温中、回転振盪機で９５〜３００ｒｐｍで約２〜１０日間発酵さ せることにより実施するとよい。大規模作業の場合には、撹拌機及び発酵培地の 曝気手段を備える適切な槽中で発酵を行うと好適である。

栄養培地は槽内で調製され、滅菌後、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｆ ｔｆｌｆｓ　ＭＡ８９４１．ＡＴＣＣ５５２９２の栄養細胞生育源を接種する。

約２４〜３７℃の温度で栄養培地を撹拌及び／又は曝気しながら発酵を１〜８日 間続ける。曝気の程度は発酵槽の寸法、撹拌速度等のような数種の因子に依存す る。一般に、より大規模の発酵は約９５〜５００ＲＰＭ及び空気約５０〜５００ リツトル／分の速度で撹拌する。

本発明の新規化合物は５ｔｒｅ　ｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｆｔｉｌｉｓ　Ｍ Ａ　６９４１．ＡＴＣＣ５５２９２発酵の終了後に発酵培地の水性部分及び菌糸 体の両方に見いだされ、下記のように取り出し、分離することができる。

全発酵ブロスから新規化合物を分離し、該化合物を回収するには、溶剤抽出並び に種々のクロマトグラフィー法及び溶剤系を用いてクロマトグラフィー分画を適 用する。

本発明の化合物は水に溶けにくいが、有機溶剤には可溶性である。この特性を利 用して化合物を発酵ブロスから回収する。即ち、１つの回収法では全発酵ブロス をほぼ等量の有機溶剤に加える。任意の有機溶剤を使用できるが、酢酸エチル、 塩化メチレン、クロロホルム、メチルエチルケトン等のような非水混和性溶剤を 使用すると好ましい。一般に、最大の回収に達するためには数回の抽出が望まし い。

溶剤は本発明の化合物と、本発明化合物のような抗寄生虫活性のない他の物質を 抽出する。溶剤が非水混和性である場合には、層を分離し、有機溶剤を減圧下に 蒸発させる。

溶剤が水混和性である場合には、非水混和性溶剤で抽出し、付随する水を分離す る。この溶剤をその後、減圧下に濃縮する。好ましくはシリカゲルを充填したク ロマトグラフィーカラムに残渣を加える。カラムは所望の生成物と一部の不純物 を保持するが、不純物の多（、特に非極性不純物は通過させる。カラムを塩化メ チレン、クロロホルム又はヘキサンのような並の極性の有機溶剤で洗った後、塩 化メチレン、クロロホルム又はヘキサンと有機溶剤（アセトン、酢酸エチル、メ タノール及びエタノール等が好適である）の混合物で洗う。溶剤を蒸発させ、ク ロマトグラフィー担体としてシリカゲル、酸化アルミニウム、デキストランゲル 等を使用し、溶離剤として種々の溶剤及び溶剤組み合わせを使用するカラムクロ マトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分取層クロマトグラフィー、高圧液 体クロマトグラフィー等により残渣を更にクロマトグラフィー処理する。薄層、 高圧、液体及び分取層クロマトグラフィーを使用して本発明の化合物の存在を検 出し、化合物を単離することができる。前記技術及び当業者に公知の他の技術を 使用し、本発明の化合物を含有する精製組成物を得る。所望の化合物の存在は、 選択寄生虫に対する生物活性又は物理化学的特徴について種々のクロマトグラフ ィーフラクションを分析することにより決定される。

本発明の化合物の種々のスペクトル特徴、特に核磁気共鳴、質量、紫外線及び赤 外線スペクトルの詳細な分析により該化合物の構造を決定した。

本発明の化合物はヒト、動物及び植物に寄生する寄生虫、特に嬬虫、外部寄生虫 、昆虫、及びダニに対する強力な内外抗寄生虫剤であり、従って家庭及び商用目 的のヒト及び動物の健康、農事並びに害虫駆除に有用である。

一般に嬬虫病と呼称される疾患又は疾患群は、嬬虫として知られる寄生虫による 動物宿主の感染に起因する。嬬虫病は家畜（例えばブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、 ヤギ、イヌ、ネコ、魚、スイギュウ、ラクダ、ラマ、トナカイ）、実験動物、毛 皮用動物、動物園用動物及び外国種並びに家禽に多発し、深刻な経済的問題であ る。嬬虫のうちで線虫と呼称される群は種々の動物種に広く頻発し、深刻な感染 をもたらす。上記動物に感染する最も一般的な線虫属は、■ｎｅｍａ１Ｄｉｃｔ ｙｏｃａｕｌｕｓ１Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ、Ｈａｂｒｏｎｅｍａ、Ｄｒｕｓｃｈ ｉａ、Ｈｅｔｅある。これらのうちでＮｅｍａｔｏｄ　ｉ　ｒｕｓ、Ｃｏｏｐ等 のような身体の他の組織器官には更に別の寄生虫が棲息する場合もある。嬬虫病 として知られる寄生虫感染ζま貧血、栄養不良、虚弱、体重低下、腸管及び他の 組織器官の壁の重度損傷を招き、処置しないでおくと感染宿主の死番二至る場合 がある。本発明の化合物はこれらの寄生主書二対して予想外の高活性を有してお り、更にイヌ及びネコにおける旦１ｒｏｆｉｌａｒｉａＳＩｉ歯動物にお１する Ｎｅｍａ　ｔ　ＯＳ（例えばマダニ、ダニ、シラミ、ノミ、クロノく工）、ウシ におけるＬｕｃｉｌｉａ種、刺す昆虫及び移動性双翅目幼虫（例えば）（ｙ　ｐ 　ｏ　ｄ　ｅ　ｒ　ｍ　ａ種）、ウマにおけるＧａ５ｔｒｏｐｈｉ　ｌｕｓ、Ｉ ！歯動物におけるＣｕｔｅｒｅｂｒ且種、更には有害ハエ（血液運搬ハエ及び不 潔ハエを含む）に対しても活性である。

本発明の化合物は更に、ヒトに感染する寄生虫に対して器官に見いだされる医療 上重要な他の寄生主属は、糸状虫に寄生する節足動物、刺す昆虫及びヒトに迷惑 な他の双翅目害虫に対しても有用である。

うな家庭害虫や、ノミ、イエホコリダニ、シロアリ及びアリに対しても活性であ る。

本発明の化合物は更に、貯穀の昆虫害虫（例えばＴｒｉｂｏｌｉｕｍ種、Ｔｅｎ ｅｂｒｉｏ種）、農業用植物の昆虫害虫（例えばアブラムシＡｃｙｒｔｈｉｏｓ 　１ｐｈｏｎ種）、移動性直翅目（例えばイナゴ）や、植物上で棲息する未成熟 段階の昆虫に対しても有用である。該化合物は農業において重要であり得る土壌 線虫及び植物寄生虫（例えばＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ種）の駆除用殺線虫剤とし て有用である。該化合物は更に、火災や巣の被害を受けた土地の処置にも極めて 有用である。本発明の化合物は巣に戻される低レベルの餌調合物として被災区域 の上から散布される。ハリアリ類に対する直接ではあるが遅効性の毒性効果以外 に、該化合物は女工を断種して巣を有効に破壊することにより、巣に対して長期 的な効果を有する。

本発明の化合物は、活性化合物を１種以上の不活性成分と混和し、任意に１種以 上の付加的な活性成分を含有する組成物として投与することができる。該化合物 はヒト及び動物への投与、植物施用並びに居住又は商用環境において家庭害虫を 駆除するための構内及び区域施用に関して当業者に公知の任意組成物で使用され 得る。内部及び外部寄生虫を駆除するためにヒト及び動物に投与するには、固体 もしくは液体の経口組成物又は非経口液体のインブラントもしくはデボ−注射剤 形態を使用することができる。局所投与には、浸液、スプレー、散剤、粉剤、注 入液、スボ・ットオン剤、噴射流体、シャンプー、首輪、タッグ又は革帯を使用 することができる。農業用構内又は区域施用には、液体スプレー、散剤、粉剤又 は餌形態を使用することができる。更に、動物排泄物中で増長又は繁殖する有害 ノ１工を駆除するためには「フィードスルー」形態を使用する。カプセル封入に より化合物を製剤化し、動物排泄物中に活性物質の残渣を供給し、不潔ハエ又は 他の節足動物害虫を駆除する。

これらの化合物を哺乳動物で駆虫剤として使用する場合にはカプセル、丸環もし くはタブレットのような単位用量形態又は液体飲薬として経口投与する。飲薬は 一般に、通常は懸濁剤（例えばベントナイト）及び湿潤剤又は同様の賦形剤と共 に水中に活性成分を含有する溶液、懸濁液又は分散液である。一般に、飲薬は更 に消泡剤を含有する。飲薬製剤は一般に約０．００１〜０．５重量％の活性化合 物を含有する。好適飲薬製剤は０．０１〜０．１重量％の活性化合物を含有する 。カプセル及び丸環は、澱粉、タルク、ステアリン酸マグネシウム又はリン酸二 カルシウムのようなキャリヤーベヒクルと混合した活性成分を含有する。

乾燥した固体単位用量形態で本発明の化合物を投与することが望ましい場合には 、通常は所望量の活性化合物を含有するカプセル、丸環又はタブレットを使用す る。これらの用量形態は活性成分を適切な微粉砕希釈剤、充填剤、崩壊剤及び／ 又は結合剤（例えば澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植 物ガム等）と均質に混和することにより製造される。このような単位用量製剤は 、治療すべき宿主動物の種類、感染重度及び種類並びに宿主の体重のような因子 に依存して抗寄生虫剤の合計重量及び含有率を考慮して広い範囲をとり得る。

動物飼料原料を介して活性化合物を投与すべき場合には、該化合物を飼料に均一 に分散してもよいし、肥料又はペレットもしくは液体形態として最終飼料に添加 してもよいし、場合によっては別々に供給してもよい。あるいは、かみ砕くこと が可能な嗜好品のような飼料ペースの独立用量形態を使用してもよい。あるいは 、例えば活性成分を液体キャリヤーベヒクルに溶解又は分散した腔内、筋肉内、 血管内、気管内又は皮下注射により本発明の抗寄生虫化合物を動物に非経口投与 してもよい。非経口投与では、活性物質を好ましくはピーナツ油、綿実油等のよ うな植物油種の許容可能なベヒクルと混合すると適切である。ゾルケタール、グ リセロールホルマール、プロピレングリコール及び水性非経口組成物を使用した 有機調製物のような、他の非経ロペヒクルも使用される。活性化合物を投与用非 経口製剤に溶解又は懸濁し、このような製剤は一般に０．０００５〜５重量％の 活性化合物を含有する。

本発明の抗寄生虫剤はまず第１に嬬虫病の治療及び／又は予防に適用されるが、 家畜及び家禽における他の寄生虫（例えば節足動物寄生虫、例えばマダニ、シラ ミ、ノミ、ダニ及び他の刺す節足動物）に起因する疾患の予防及び治療にも有用 である。該抗寄生虫剤は更に、ヒトを含む他の動物に発生する寄生虫病の治療に も有効である。最良結果を得るために最適な使用量は当然のことながら使用する 特定化合物、処置すべき動物種並びに寄生虫感染又は侵入の種類及び重度に依存 する。一般に、本発明の新規化合物約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ動物体重を１ 〜５日間といった比較的短期間に一度に又は数回に分けて経口投与することによ り良好な結果が得られる。本・発明の好適化合物を使用すると、約０．０２５〜 ０．５ｍｇ／ｋｇ体重を一度に投与することにより動物でこのよう：な優れた寄 生虫の駆除が得られる。所望により再感染を防ぐために寄生虫種及び使用される 農業法に依存して繰り返、し投与する。動物にこれらの物質を投与するための方 法は獄医学分野で当業者に公知である。

本発明の化合物を動物飼料の成分として投与するか又は飲料水に分散もしくは懸 濁する場合゛には、活性化合物を不活性キャリヤー又は希釈剤に均一に分散した 組成物を提供する。不活性キャリヤーなる用語は、抗寄生虫剤と反応せず、動物 に安全に投与することが可・能なキャリヤーを意味する。好ましくは、飼料投与 用キャリヤーは、動物飼料の成分であり得る。

適切な組成物は、活性成分を比較的多量に含有し且つ動物に直接供給するため、 あるいは飼、料に直接添加するため、あるいは中間希釈又はブレンド段階後に添 加するため適切な飼料プレミックス又は補給剤を含む。このような組成物に適切 な典型的なキャリヤー又は希貰剤としては、例えば醸造乾燥麦芽かす、コーンミ ール、柑橘類荒粉、発酵残渣、砕いた牡蛎殻、ふすま、糖みっ可溶分、トウモロ コシ穂軸荒粉、食用豆粉砕飼料、粗砿大豆、破砕石灰等がある。活性化合物は粉 砕、撹拌、磨砕又はタンプリングのような方法によりキャリヤー全体に均一に分 散する。約０．００５〜２．０重量％の活性化合物を含有する組成物が飼料プレ ミックスとして特に適切である。動物に直接供給される飼料補給剤は、約０．０ ００２〜０．３重量％の活性化合物を含有する。

このような補給剤は寄生虫病の治療及び防除に必要な活性化合物濃度を最終飼料 に与えるような量で動物飼料に添加する。所望の活性化合物濃度は上記因子及び 使用する特定化合物により異なるが、本発明の化合物・は通常、所望の抗寄生虫 結果を得るために飼料中に０．００００１〜０゜００２％の濃度で供給される。

本発明の化合物を使用するには、個々の化合物を調製してその形態で使用し得る 。あるいは、個々の化合物の混合物を使用してもよいし、本発明の化合物とは無 関係の他の活性化合物との混合物を使用してもよい。

本発明の化合物は、生育中又は貯蔵中に作物に損傷を与える農業害虫の駆除にも 有用である。このような農業害虫から保護するためには、スプレー、粉剤、エマ ルジョン等のような公知技術を使用して生育中又は貯蔵中の作物に化合物を施用 する。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明す゛るが、これらの実施例は本発明 を限定するものではない。

Ａ６５５５　ＡＴＣＣ１４１５９）のＬ−チューブ（凍結乾燥培養物）を２００ ０ｍ１容バッフル付き三角フラスコ中の培地Ａ２５０ｍ１に無菌的に移し、フラ スコを２７℃及び湿度８５％で回転式振盪培養機（２２Ｏｒｐｍ）で４８時間イ ンキュベートする。培養物の２ｍｌアリコートを一８０℃で凍結保存し、凍結培 養物源として使用した。

２、種子培養物 凍結培養物バイアル（２ｍｌ）を使用して、培地Ａ３０ｍ１を収容する２５０ｍ １容バッフル付き三角フラスコに接種した。フラスコを２７℃及び湿度８５％で 回転式振盪培養機（２２０ｍｌ）で２４時間インキュベートした。

３、変換培養物 種子培養物５ｍｌを使用して２５０ｍ１容三角フラスコ中の培地８５０ｍ１に接 種した。ＤＭＳＯ中の１３−デオキシアベルメクチンＢａａ　（１〜５ｍｇ）又 は１３−デオキシアベルメクチンＢ　Ｉｂ　（０、２〜１　、０　ｍ　ｇ　）を ０時に加えた。変換フラスコを２７℃（２２Ｏｒｐｍ）湿度８５％で７日間イン キュベートした。

培地Ａ デキストロース　１ｇ デキストリン　１０ｇ 牛肉エキス　３ｇ アルダミンｐＨ５ｇ ＮＺアミンタイプＥ　５ｇ Ｍｇ５０４・７１，０　０．０５ｇ Ｋ、ｌｌＰＯ４０，３ｇ ＣａＣＯ５Ｏ，５ｇ 蒸留水　１０００＋ｓｌ 可溶性澱粉　３０ｇ Ｈｙｃａｓｅ　ＳＦ　２ｇ 牛肉エキス　１ｇ コーンステイープリカー　３ｇ モルホリンプロパンスルホン酸　３０ｇｐｔ１７．　Ｏに調整。

１４ａ−ヒドロキシアベルメクチンの単離フラスコをＣＨ＊Ｃｌ　！３　Ｘ　５ ０ｍ　ｌ　テ抽出シタ。ＣＨ。

ＣＩ、抽出物を合わせて濃縮した。移動相としてＣＨ，ＯＨ：　ＨｚＯ（８５： ’　１５．８０　：　２０又は７０　：　３０）を使用してＤｕｐｏｎｔ　Ｚｏ ｒｂａｘ　ＯＤＳカラム上でＨＰＬＣによりヒドロキシル化生成物を単離した。

精製アベルメクチンの構造をＮＭＲ及び質量スペクトル分析により決定した。

特定例 上記手順により以下の化合物を調製した。

１３−デオキシアベルメクチン　１３−デオキシ−１４ａ−ヒドロキシ８１ａア グリコン　アベルメクチンＢｌａアグリコン製造例２ １３−デオキシアベルメクチン　１３β−ヒドロキシ−１４ａ−ヒドロキシ８１ ａアグリコン　アベルメクチンＢｌａアグリコン製造例３ １３−デオキシアベルメクチン　１３−デオキシ−１４ａ−ヒドロキシＢ、ｂア グリコン　アベルメクチンＢ、ｂアグリコン製造例４ １３−デオキシアベルメクチン　１３β−ヒドロキシ−１４ａ−ヒドロキシＢ、 ｂアグリコン　アベルメクチンＢ、ｂアグリコン１４ａ−０−オレアンドロシル アベルメクチン／ミルベマ２リットル容３バッフル付きフラスコ内の種子培地２ ５０ｍ１に凍結乾燥培養物を接種し、２７℃、相対湿度８５％及び２０Ｏｒｐｍ で１６時間インキュベートすることにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅ ｒｍｉｔｉｌｉ糸（ＦＶＭ）を調製した。培養物の充填細胞量は１０〜１５％で あり、ｐＨ５，７〜６．８であった。培養物のアリコートを凍結し、将来の実験 の接種材料源とする。

２、種子培養物 ２５０ｍ１容３バッフル付きフラスコ中の種子培養物２５ｍ１にＦＶＭｌ、Ｏｍ ｌを加え、フラスコを２７℃、相対湿度８５％及び２０Ｏｒｐｍで１６時間イン キュベートした。

３、生物変換及び単離 生物変換培地２２．５ｍｌに種子培養物１．Ｏｍｌを加え、フラスコを２７℃、 相対湿度８５％及び２０Ｏｒｐｍで４８時間インキュベートした。ジメチルスル ホキシド０゜０５ｍ１中の１４ａ−ヒドロキシアベルメクチンＢｌａｌ。

Ｏｍｇを加え、フラスコを２７℃、相対湿度８５％及び２２０ｒｐｍで８日間イ ンキュベートした。各フラスコを塩化メチレン５０ｍ１ずつで抽出した。塩化メ チレン抽出物を合わせて濃縮した。移動相としてメタノール：水（８５：１５． ８０　：　２０．７０：３０）を使用してＤｕｐｏｎｔ　Ｚｏｒｂｏｘ　ＯＤＳ カラム上でＨＰＬＣによりアベルメクチン単糖を単離した。精製アベルメクチン の構造を質量及びＮＭＲスペクトロスコピーにより決定した。

種子培地 Ｄｉｒｃｏ酵母エキス　２０ｇ／Ｉ Ｈｙｃａｓｅ　Ｓ、Ｆ、　２０ｇ／ｌ デキストロース　２０ｇ／Ｉ ＫＮ０．　２．０ ＮａＣ１０，５ ＭｎＳＯ４・ｌ１１０　０．００５ ＺｎＳ０４”７Ｂ＊０　０．０１ ＣａＣ１ｔ・２ＨｚＯｏ、　０２ ＦｅＳＯ４４ＨｔＯＯ，０２５ ペプトン化乳　１７．５ｇ／ｌ ＾ｒｄａｍｉｎｅ　ｐＨ２，７ｇ／ｌ デキストロース　７５ｇ／ｌ ＣｕＳＯ４’５ＨｔＯｏ、　００００６ｇ／ｌＺｎＳＯ４・７Ｈｔ０　０．００ １ｇ／１ＣＯＣＩ！−６１１１０　０．０００１ｇ／ｌＦｅＣ１５４１１ｚ０　 ０．００３ｇ／ｌＭｇＳＯ４−７Ｈｔ０　０．５ｇ／１ ｐＨ＝　７．２ 以下の化合物を調製した。

１３−デオキシ−１４ａ−ヒドロキシアベルメクチンＢｌａアグリコン→１３− デオキシ−１４ａ−０−オレアン・ドルシルオキシアベルメクチンＢｌａアグリ コン １３−デオキシ−１４ａ−ヒドロキシアベルメクチンＢｉｂアグリコン→１３− デオキシ−１４ａ−０−オレアンドルシルオキシアペルメクチンＢｉｂアグリコ ン １３−デオキシ−１４ａ−ヒドロキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン８ １ａアグリコン→１３−デオキシ−１４ａ−０−オレアンドルシルオキシ−２２ ，２３−ジヒドロアベルメクチン８１ａアグリコン１３−デオキシ−１４ａ−ヒ ドロキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢｉｂアグリコン→１３−デオ キシ−１４ａ−０−オレアンドルシルオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメク チンＢｉｂアグリコン１３β−１４ａ−ヒドロキシアベルメクチンＢｌａアグリ コン→１３β−１４ａ−０−オレアンドルシルオキシアベルメクチンＢｌａアグ リコン １３β−１４ａ−ヒドロキシアベルメクチンＢｌａアグリコン→１３β−１４ａ −ヒドロキシアベルメクチンＢｌａ単糖１３β−１４ａ−ヒドロキシアベルメク チンＢｉｂアグリコン→１３β−１４ａ−０−オシアンドルシルオキシアベルメ クチンＢｉｂアグリコン １３β−１４８−ヒドロキシアベルメクチンＢｉｂアグリコン→１３β−１４８ −ヒドロキシアベルメクチンＢｉｂ単糖１３β−１４ａ−ヒドロキシ−２２，２ ３−ジヒドロアベルメクチン８１ａアグリコン→１３β−１４ａ−０−オレアン ドルシルオキシ−２２，２３＝ジヒドロアベルメクチンＢｌａアグリコン１３β −１４ａ−ヒドロキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン８１ａアグリコン →１３β−１４ａ−ヒドロキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢｌａ単 糖 １３β−１４ａ−ヒドロキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチンＢｉｂアグ リコン→１３β−１４ａ−０−オレアンドルシルオキシ−２２，２３−ジヒドロ アベルメクチンＢｌｂアグリコンアベルメクチンＢｌａ／Ｂｉｂアグリコン→ア ベルメクチンＢｌａ／Ｂｌｂ（三糖） アベルメクチンＢ２ａアグリコン→アベルメクチン８２ａ　（二側 ２２、２３−ジヒドロアベルメクチンＢｌａ／Ｂｉｂアグリコン→２２゜２３− ジヒドロアベルメクチンＢｌａ／Ｂｌｂ（三糖）１３β−２２，２３−ジヒドロ アベルメクチンＢｌａ／Ｂｌｂアグリコン→１３β−２２，２３−ジヒドロアベ ルメクチンＢｌａ／Ｂｉｂ単糖１３β−１４８−ヒドロキシアベルメクチンＢｌ ａアグリコン→１３β−１４ａ−ヒドロキシアベルメクチンＢｌａ単糖１３β− アベルメクチンＢｌａ／Ｂｉｂアグリコン→１３β−アベルメクチンＢｌａ／Ｂ ｉｂ単糖 １３β−ヒドロキシミルベマイシン３→１３β−０−オレアンドロシルオキシミ ルベマイシン３ １３β−ヒドロキシミルベマイシン４→１３β−０−オレアンドロシルオキシミ ルベマイシン４ １３β−ヒドロキシネマデクチン→１３β−Ｏ−オレアンドロシルネマデクチン 。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年９月２１ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アベルメクチンアグリコン、ミルベマイシン又はネマデクチン又はその１４ ａヒドロキシ誘導体を、Ｃ５−ヒドロキシ位でメチル化することなく、４′位、 １３位、１４ａ位、又は１４ａ位と４′位もしくは１３位の一方とでグリコシル 化する、アベルメクチン非産生株であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍ ｉｔｉｌｉｓの生物学的に純粋な培養株。 ２．Ｃ５−Ｏ−メチル化及びアベルメクチンアグリコン構造合成のための遺伝子 を含むＤＮＡを欠失する請求項１に記載の培養株。 ３．式： ▲数式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、、 Ｒ１は破線が２２，２３位間の単結合を表す場合にのみ存在し、水素、ヒドロキ シ又はヒドロキシイミノであり；Ｒ２はＣ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル 又はＣ３−８シクロアルキルであり； Ｒ３はヒドキシ、メトキシ、オキソ又はアセトキシであり； Ｒ４は水素、β−ヒドロキシ又は ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｎは０又は１である］であり；ｍは１又は２であり： Ｒ６はヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−８アルキアミノ、Ｃ１−８ジアルキルアミノ 又は（Ｃ１−８アルキル）（Ｃ１−８アルカノイル）アミノであり； Ｒ５は水素又はヒドロキシである］ を有する化合物を産生することが可能であり、微生物の発酵が、炭素、窒素及び 無機塩の同化源と、式▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記と同義である）を有する化合物 との水性培地中で実施される、微生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉ ｔｉｉｉｓの生物学的に純粋な培養株ＭＡ６９４１又はその突然変異株。 ４．炭素、窒素及び無機塩の同化源と、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍ ｉｔｉｉｉｓ培養株ＭＡ６９４１を含む発酵培地。 ５．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 及び ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、 Ｒ１は破線が２２，２３位間の単結合を表す場合にのみ存在し、水素、ヒドロキ シ又はヒドロキシイミノであり；Ｒ２はＣ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル 又はＣ３−８シクロアルキルであり； Ｒ３はヒドロキシ、メトキシ、オキソ又はアセトキシであり； Ｒ４は水素、ヒドロキシ又は ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｎは０又は１である］であり；ｍは１又は２であり； Ｒ６はヒドロキシ、アミノ、Ｃ１−８アルキルアミノ、Ｃ１−８ジアルキルアミ ノ又は（Ｃ１−８アルキル）（Ｃ１−８アルカノイル）アミノであり； Ｒ５は水素又はヒドロキシである］ を有する化合物の製造方法であり、 微生物の発酵が、炭素、窒素及び無機塩の同化源と、式：▲数式、化学式、表等 があります▼ （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は上記と同義である）を有する化合物 との水性培地中で実施される方法。 ６．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 及び ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 ２２．２３位の破線は２２，２３位間の単結合又は二重結合を表し； Ｒ１は破線が２２，２３位の単結合を表す場合にのみ存在し、水素又はヒドロキ シであり； Ｒ２はＣ１−８アルキル、Ｃ２−８アルケニル又はＣ３−８シクロアルキルであ り； Ｒ３はヒドロキシ又はメトキシであり；Ｒ４は水素又はβ−ヒドロキシである） を有する化合物。 ７．不活性キャリヤーと有効量の請求項６に記載の化合物を含有する、動物の寄 生虫病又は植物もしくは作物の寄生虫感染の治療に有用な組成物。 ８．有効量の請求項６に記載の化合物を動物に投与することからなる、動物の寄 生虫病の治療方法。 ９．植物、該植物が生育する土壌又は植物の作物に有効量の請求項６に記載の化 合物を施用することからなる、植物又は作物の寄生虫感染の処置方法。