RO106065B1 - Compusi macrolidici cu activitate insecticida si miticida si procedeu de preparare a lor - Google Patents

Description

Invenția de față se referă la o nouă grupă dc compuși macrolidici, cu activitate insecticidă și miticidă, un procedeu microbiologic de obținere a lor, noi compoziții cu efect insecticid sau miticid,- 5 care îi conțin și un nou procedeu de combatere a insectelor sau căpușilor prin utilizarea acestora, în domeniul agrozootehnicii.

Există o cerință serioasă pentru noi 10 insecticide și noi miticide, deoarece organismele prezintă o rezistență la insecticide și miticide, care se dezvoltă rapid, în utilizarea lor curentă. Rezistența la insecticide, în cazul artropodelor este 15 răspîndită pe scară largă, cel puțin 400 de specii fiind rezistente la unul sau mai multe insecticide. Dezvoltarea rezistenței la insecticidele nrai vechi ca, de exemplu DDT, carbamați §i organofosfați, este 20 bine cunoscută. Rezistența a fost dezvoltată chiar și în cazul unor insecticide și miticide, piretroide mai noi.

Controlul ectoparaziților ca, de exemplu puricii, căpușele, muștele care înțea- 25 pă și alte insecte asemănătoare, a fost recunoscut mult timp ca o problemă importantă, în domeniul creșterii animalelor. Tratamentele tradiționale pentru animalele domestice sînt insecticidele cu 30 aplicație tipică ca, de exemplu renumitele lumînări pentru oi. Intr-adevăr, astfel de tratamente au încă o utilizare largă.

Prezenta descriere de invenție se refe- 35 ră la noi compuși macrolidici, cu activitate insecticidă și miticidă, desemnați ca A83543 cuprinzînd componentele individuale: A 83543A, A 83543B,

A 83543C, A 83543D, A 83543E, 40

A 83543F, A 83543G, A 83543H și A 83543J. A 83543 și componentele individuale se obțin prin fermentație microbiologică, cu ajutorul speciei Succharopolyspora spinosu și sînt integrate în 45 diverse compoziții utilizate pentru con trolul insectelor, în special, pentru speciile de Lepidoptere, cum ar fi de exemplu viermele armat, sudic și specii de Diptera, cum sînt musca zgomotoasă, musca rezistentă și țînțarul.

Principalul avantaj a fost acela de a se descoperi compuși care pot fi administrați la animale, în special, pe cale orală și care vor fi utilizați pentru controlul ectqparaziților, prin otrăvirea parazitului, cînd acesta ingerează sîngele de la animalul tratat.

fig.l, spectrul IR (CHC1₃) a componentei A 83543A fig.2, spectrul IR (CHC1₃) a componentei A 83543D fig.3, spectrul pseudoagliconei A 83543A fig.4, spectrul de masă cu cîmp de desorbție a componentei A 83543A fig.5, spectrul de masă cu cîmp de desorbție a componentei A 83543C fig.6, spectrul de masă cu cîmp de desorbție a componentei A 83543D fig.7, spectrul de masă cu cîmp de desorbție a componentei pseudoaglieona A 83543A fig.8, spectrul de masă prin bombardare cu atomi a componentei A 83543A fig.9, spectrul de masă prin bombardare cu atomi a componentei A 83543B fig.10, masa spectrometică electron impact a componentei A 83543A fig. 11, masa pseudoazbiconei A 83543A fig.12, analiza componentei principale fig. 13, spectrul IR (KBr) a componentei A 83543E fig. 14, spectrul IR (KBr) a componentei

A 83543F fig. 15, spectrul IR (KBr) a componentei A 83543G fig.16, spectrul IR determinat pe un amestec A 83543H:J(58:42).

Compușii A 83543, conform prezentei invenții, sînt compușii cu formula 1:

I

R^l, R³, R³ și R⁶ sînt hidrogen sau metil §i

acidă a acestor compuși,. în care R este diferit de hidrogen.

Compușii preferați ai prezentei descrieri de invenție, din punct de vedere al ușurinței în preparare, sînt cei în care radicalii R, R¹, R³, R⁴, R³ și R⁶ sînt prezenți într106065

Tabelul 1 (continuare)

R	R1	R3	R4	R5	R6
H H	Me Me	H H	Et Et	H Me	Mc H

sau o sare acidă de' adiție a acestor compuși în care R este diferit de hidrogen.

Aminozaharul din A 83543A a fost dovedit a fi bera-D-forozamina și zaharul neutru din A 83543A este alfa-2,3,4-tri- 5

Nouă componente A83543 au fost caracterizate. Aceste componente reprezintă compușii cu formula 1, în care R este diferit de H. Acești compuși au structura următoare:

-O-metilramnoza.

Tabelul2

Component	R	R1	R3	R4	R5	R'1
A	(a)	Me	H	Et	Me	Me
B	(b)	Me	H	Et	Me	Me
C	(c)	Me	H	Et	Me	Me
D	(a)	Me	Me	Et	Me	Me
E	(a)	Me	H	Me	Me	Me
F	(a)	H	H	Et	Me	Me
G	(d)	Me	H	Et	Me	Me
H	. (a)	Me	H	Et	H	Me
J	(a)	Me	H	Et	Me	H

Aminozaharul poate fi îndepărtat dintre componentele A83543, pentru a se obține pseudoagliconele (compușii de formula 1 în care R este H). Componentele A,B,C, și G au o pseudoagliconă comună (pseudoagliconă A 83543A sau pseudo-A).

Pseudoaglicona A 83543A s-a găsit mai tîrziu că, este produsă ca un component natural A83543. Componentele D.E.F.H și 10 J au fiecare o pseudoagliconă unică. Pseudoagliconele A83543 au următoarea structură:

Tabelul 3

Pseudoaglicona4	R1	R3	R4	R5	R
A83543A	Me	H	Et	Me	Me
A83543D	Me	Me	Et	Me	Me
A83543E	Me	H	Me	Me	Me
A83543F	F	H	Et	Me	Mc
A83543H	Me	H	Et	H ’	Me
A83543J	Me	H	Et	Me	H

^aR=H nentele A83543.

Pseudoagliconele sînt utilizate ca pro- Următoarele paragralu însumează piopriduse intermediare, de exemplu, la compo- 15 etățile fizice și spectrale ale componunicloi

Α83543 și pseudoagliconelor. Se utilizează următoarele abreviațiuni:

EI-MS: masa spectrometrică electron-impact;

FAB-MS: spectrometria de masă prin bombardare fixă cu atomi;

FD-MS: spectrometrie de masă cu cîmp de desorbție;

HPLC: cromatrografie lichidă de înaltă performanță;

IR: infraroșu;

RMN: rezonanță magnetică nucleară; UV: ultraviolet.

Caracteristicile A83543A

Greutatea moleculară: 731

Formula empirică: c₄₁h₆₅no₁₀

FD-MS: vezi fig.4

FAB-MS(M+1): Găsit: 732.4706; calculat C₄₁H_W)NO_1U=732.4687 (vezi t'ig.8)

El-MS: găsit: 731.4612; calculat

731.4608 (vezi tig.10)

UV (EtOH) λ max: 243 nm (ε 8,920),

IR (CHC1₃): v (lactona) 1713; ((cetona conjugată) 1657; vîrturi multiple pentru vibrațiile C-H în jur de 2940 și pentru 10 vibrațiile C-0 circa 1060 cm¹ (vezi fig.l) [a}_D ⁵²⁹: - 121.8° (c 1.03, CHC1₃) [ajo³⁶⁵: + 6.8° (c 1.03, CHCI₃)

Tabelul 4 însumează datele 'H și ¹³C RMN observate cu A83543A (în acetonă ¹⁵ d₆).

Tabelul 4

Datele RMN ’H și ^IJC ale A83543A în acetonâ-d₆:

Poziția	13C	Ή'1
Γ	172,02	-
2	33,83	3,07/2,45
3	48,13	2.94
4	41,65	3,48
5	129,12	5,86
6	129,66	5,89
7	41,46	2,15
8	36,50	1,99/1,34
9	76,31+	4,31
10	37,65	2,36/1,36
11	46,42	0,93
12	49,74	2,87
13	147,78	7,01
14	144,27	-
15	202,46	-
16	47,74	3,30
17	80,41	3,53
18	30,33	1,51
19	21,85	1,78/1,17
20	34,45	1,50
21	76,24+	4,66
22	28,51	L,48
23	8,97	0,81
24	15,71	1.12

Tabebelul 4 (continuare)

Poziția	l3C	‘.Η11 ·
1'	96,34	4,81
2'	77,61	3,51
3'	81,87	3,37
4'	82,43	3,00
5’	68,03	3,48
6'	17,64	1,18
2' -OCH3	56,66*	3,37
3' -OCHj	58,39*	3,41
4' -OCH3	60,12	3,45
1	103,45	4,45
2	31,24	1,92/1,37
3	18,14	1,84/1,52
4	65,34	2,12
5	73,35	3,56
6	18,87	1,21
N(CH3)2	40,38	2,22

în acest tabel, ^a reprezintă măsurile luate din corelația ‘H/¹³C iar *, * reprezintă rezonanța cu aceeași superscripție care pot fi schimbate.

Caracteristicile A83543B

Greutatea moleculară: 717

Formula empirică: C^H^NO io

FAB-MS: (vezi fig.9)

Caracteristicile A83543C

Greutatea moleculară: 703

Formula empirică: C^H^NO^

FD-MS: (vezi fig.5)

Caracteristicile A83543D

Greutatea moleculară: 745

Formula empirică: C₄₃H₆₇NO|_U

UV (EtOH) λ max: 244 nm (e 9,910)

IR(CHC1₃): v (lactona) 1708; (cetonă conjugată) 1658; multiple vîrt'uri pentru vibrațiile C-H în jur de 2940 și pentru vibrațiile C-0 în jur de 1070 cm' (vezi figura 2) [ajo³⁸⁹: - 142,9° (c 1.02, CHC1₃) [a^o³⁶⁵: - 29,9° (c 1.02, CHC1₃)

FD-MS: vezi fig.6

Tabelul 5 însumează datele ^lH și ¹³C RMN observate cu A83543D (în aceionă-d₆).

Tabelul 5

Datele RMN 'H și ^/3C ale A83543D în acefonă-d^

Poziția	13C	lHa
1	172,68	-
2	34,38	3,08/2,43
3	49,01	2,90
4	42,83	3.47
5	123,27	.5,54
6	137,26	-

Tabelul 5 (continuare)

Poziția	13C
6 - CHj	20,81	1,74
7	44,41	2,18
8	35,61	2,01/1,45
9	’ 76,72	4,32
10	38,64	2,37/1,37
11	47,04	1,02
12	50,05	2,78
13	148,47	7,04
14	145,19	-
15	203,16	-
16	48,47	3,30
17	81,03	3,53
18	30,99	1,49
19	22,51	1,78/1,19
20	35,12	1,49
21	76,84	4,65
22	29,16	1,48
23	9,55	0,81
24	16,32	1,12
Γ	97,11	4,85
2'	78,33	3,54
3’	82,58	3,40
4'	83,15	3,03
5'	68,71	3,50
6'	18,26	1,18
• 2' -OCHy	57,31*	3,40
3' -OCHj	59,02*	3,43
4’ -OCH3	60,71	3,47
1	104,14	4,47
2	31,96	1,94/1,39
3	18,83	1,81/1,49
4	66,06.	2,12
5	74,12	3,55
6	19,42	1,20
N(CH3)2	40,99	2,21

în acest tabel, ’ reprezintă unele însemnări luate din corelația iar * reprezintă rezonanțele care pot fi schimbate.

Caracteristicile A83543E

Greutate moleculară: 717

Formula empirică: C^H^NOjo

FAB-MS: (M+l): găsit 718.4526; calcu lat C_wH₆₄NO_io=7 18.4530

UV (EtOH) λ max: 244 nm (ε 8.600)

IR (KBr) (vezi fig. 13)

Tabelul 6 însumează RMN ^lH și ^1JC observate cu A83543E (în acetonâ-d₆).

Tabelul 6

Datele RMN ’H și ^,3C pentru A83543E în acetonă-d₆

Poziția	l3C	LHa
1	172,46	-
2	34,95	3,06/2,40
3	48,88	2,95
4	42,11	3,43
5	129,78	5,86
6	130,39	5,90
7	42,11	2,14
8	37,18	• 1,96/1,39
9	77,06	4,33
10	38,31	2,36/1,36
11	47,18	0,93
12	50,40	2,86
13	148,37	7,06
14	144,84	-
15	203,09	-
16	48,05	3,34
17	81,35	3,55
18	34,98	1,62/1,48
19	22,25	1,77/1,13
20	33,73	1,50
21	72,97	4,68
22	21,61	1,12
23	/	--
24	16,52	1,13
Γ	97,11	4,83
2'	78,36	3,55
3'	82,55	3,37
4’	- 83,13	3,02
5’	68,72	3,50
6'	18,26	1,18
2' -OCHj	59,01	3,43
3' -OCHj	57,30	3,40
4' -OCH3	60,69	3,46
1	104,24	4,47
2	32,00	1,93/1,39
3	18,86	1,82/1,50
4	66,06	2,12
5	74,13	3,57
6	19,42	1,21
N(CH3)2	40,99	2,21

în acest tabel, ’ reprezintă unele măsuri care sînt luate din corelația ‘H/¹³C. Caracteristicile A83543F

Greutate moleculară: 717

Formula empirică: 5

FAB-MS: (M+l): găsit 718.4534; Calculat 0^^0,0=718.4530 (JV (ElOH) λ max: 2.43 nm (ε 10,500) și 282 nm (c 109)

IR (KBr) (vezi fig. 14)

Tabelul 7 însumează datele RMN ^lH și ¹³C observate cu A83543F (în acetonă-d₆).

Tabelul 7

Datele RMN 'H și ^I3C pentru A83543F în acetonâ-d,_}

Poziția	13C	‘Η'1
1	172,60	-
2	34,50	3,06/2,42
3	48,82	2,95
4	42,46	3,45
5	129,56	5,87
6	130,39	5,92
7	42,19	2,16
8	37,18	1,97/1,35
9	77,15	4,65
10	38,30	2,33/1,34
11	46,89	0,94
12	50,34	2,84
13	148,86	7,03
14	145,73	-
15	198,68	-
16	45,49	3,22/2,50
17	74,17	3,58
18	30,74	1,52
19	22,41	1,70/1,17
20	34,45	1,51
21	77,09	4,32
22	29,05	1,48
23	9,56	0,81
Γ	97,19	4,83
2'	78,38	3,53
3' -	82,58	3,38
4'	83,15	3,00
5'·	68,74	3,48
6'	18,25	1,18
2' -OCH3	59,02	3,43
3' -OCHj	57,31	3,40
4' -OCH3	60,69	3,47
1	100,19 ·	4,53
2	32,41	1,80/1,38

Tabelul 7 (continuare)

Poziția	13C	!Ha
3	18,86	1,83/1,53
4”	66,16	2,13
5	74,01	4,01
6	19,46	1 7? A > ——
N(CH3)2	41,01	2,22

^a reprezintă unele măsuri luate din corelația ^lH/°C.

Caracteristicile A83543G

Greutatea moleculară: 731

Formula empirică.· ^4ΐΗ₆₅ΝΟ₁₀

FAB-MS: (M+l): găsit 732,4661; Calculat C₄₁H₆₆NO₁₀=732,4687

UV (EtOH) λ max: 243 nm (ε 8,970) IR (KBr) (vezi fig. 15)

Tabelul 8 însumează RMN ^[Η și ^1JC 5 observate cu A83543G (în acetonă-d₆).

Tabelul 8

Datele RMN ^!H și ^,3C ale A83543G în acetonă-d₆

Poziția	13c	iHa
1	172,59	-
. 2	34,67	3,04/2,46
3	48,72	' 2,94
4	42,25	3,50
5	129,85	5,84
6	130,26	5,89
7	42,02
8	37,12	1,95/1,34
9	76,99	4,32
10	38,28	2,36/1,36
11	47,23	0,91
12	50,43	2,87
13	148,28	7,04
14	144,61	-
15	203,20	-
16	47,94	3,30
17	81,73	3,57
18	35,20	1,55
19	21,68	1,64/1,16
20	31,41	1,64/1,36
21	76,47	4,64
22	28,84	1,48
23	9,61	0,80
24	15,29	1J8

Tabebelul 8 (continuare)

Poziția	13c	• ’H
1'	96,98	4,81
2'	78,23	3,52
3’	82,46	3,37
4'	î 83,05	2,29
5'	68,64	3,49
6'	17,18	1,12
2' -OCH3	58,97	3,42
3' -OCHj	57,25	3,39
4' -OCHj	60,70	3,46
1	99,51	4,80
2	29,62	1,87/1,48
3	19,31	1,73
4	62,13	2,29
5	69,93	4,20
6	18,22	1,17
N(CH3)2	43,47	2,24

³ reprezintă măsurile luate din corelația Ή/¹³Ο

Caracteristicile pentru A83543H

Greutatea moleculară: 717

Formula empirică: C^H^NO^ 5

UV (EtOH) λ max: 243 nm (ε 10,100)’

IR (KBr): vezi fig.16* determinnat la un amestec A83543H:J (58:42)

Caracteristicile pentru A83543J 10

Greutatea moleculară: 717

Formula empirică: C^H^NO^

UV (EtOH) λ max: 243 nm (ε 10,100)*

IR (CHC1₃): vezi fig.16* determinat la un amestec de A83543H:J 15 (58:42)

A83543H și J se separă din A83543, sub forma unui amestec (raportul H:J fiind de 58:42), care poate fi separat, prin cromatografie lichidă, de înaltă perfor- 20 manță HPLC, așa cum s-a descris. Structurile însemnate pentru A83543 H și J se bazează pe studiile dc RMN ‘H și ^l3C efectuate pe amestecul A83543 H și J, în acetonâ-d₆. Spectrele RMN se unesc și se 25 compară cu cele pentru A83543A. Schimbările majore se află în spectrele centrale pentru H și J, în jurul ramnozei. Componentele H și J au numai două grupări OCH₃ în acest zahăr. In componentul H, H-Γ este transformat în aproximativ 1 ό în spectrul ^lH RMN și 3 δ în spectrul ^1JC RMN (4,81 și respectiv 99,68). Aceste treansformâri se datoresc absenței metilului pe gruparea metoxi în poziția 2'. Transformările în componentul J corespund unei absențe similare a grupării metil pe gruparea metoxi în poziția 3'.

Caracteristicile pseudoagliconei A83543A Greutatea moleculară: 590

Formula empirică: C3₅H₅₍jO_y

UV (EtOH) λ max: 243 nm (ε 10,300)

IR (CHC1₃): v (lactona) 1724; (cetona conjugată 1652; multiple pentru vibrațiile C-H înjur de 3017; multiple vîrfuri pentru vibrațiile C-0 în jur de 1140 cm'¹ (vezi fig.3)

FD-MS: vezi fig.7

EI-MS: vezi fig.l 1.

Caracteristicile pseudoagliconei A83543D

Greutatea moleculară: 604

Formula empirică: ΟμΗ₅₂0₉

Componentele A83543 pot fi separate unele de altele, utilizîndu-se unul din următoarele sisteme analitice, prin cromatografie lichidă de înaltă performanță HPLC:

SISTEMUL I

Coloana: ODS, 3 μ, 4,5 x 50 mm (IMB)

Solventul: CH₃OH:CH₃CN:H₂O (2:2:1)

Coeficientul de debit: 1,0 ml/min

Detecție: UV la 245 nm

Temperatura: Temperatura camerei Componentul Timp de retenție (min.)

A8,50

B6,15

C ’3,92

D11,47

SISTEMUL II

Coloana: 4,6 x 100 mm ODS (AQ-301, S-5; YMC, YMC, Inc., Mt.Freedom, NJ)

Solvenți: CH₃OH;CH₃CN:0,05% NH₄OAc(H₂O) (A) 35:35:30 - pH 7,8 (B) 45:45:10 - pH 6,7

Coeficientul de debit: 2,0 ml/min

Timp de curgere: 35 min

Detecție: UV la 255 nm

Gradient: 10% B pînă la 25% B în 20 minute, la 50% B în 30 de min.

Componentul Timp de retenție (min.)

A22,62

A-pseudoaglicona7,27

B12,65

C '10,62

D25,47

E19,22

F16,30

G18,92

H16,30

JL7.50

SISTEMUL III

Coloana: 4,6 x 100 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, Inc. Mt.

Freedom, NJ)

Solvenți: CH₃OH:CH₃CN:0,05% NH₄OAc(H₂O) 35:35:30 - pH 6,0

Coeficientul de debit: 2,0 ml/min

Timp de curgere: 10 min Detecție: UV, 250 nm

Componentul Timp de retenție (min.)

F4,32

H3,42

J3,42

Componentele A83543 nu sînt solubile în apa, dar sînt solubile în solvenți ca, de exemplu, metanol, etanol, dimelilformamidă, dimetilsulfoxid, acetonitril, acetonă și alți solvenți asemănători.

A83543 și componentele individuale ca, de exemplu, A83543A, , A83543B,

A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H și A83543J pot reacționa, pentru a se forma diferite săruri. Toate formele menționate ale acestor compuși fac parte din prezenta descriere de invenție. Sărurile de A83543 sînt utilizate, de exemplu, pentru separarea și purificarea A83543. In plus, unele săruri au o solubilitate îmbunătățită în apă.

Sărurile de A83543 sînt preparate, utilizîndu-se procedeele standard, pentru prepararea sărurilor. De exemplu, A83543 poate fi neutralizat cu un acid corespunzător pentru a forma o sare acidă de adiție. Sărurile acide de adiție sînt utilizate în special. Sărurile reprezentative corespunzătoare includ acele săruri formate prin reacțiile standard atît cu acizi organici, cît și acizi anorganici, ca de exemplu acizii sulfuric, hidrocloric, fosforic, acetic, succinic, citric, lactic, maleic, fumărie, cholic, pamoic, mucic, glutamic, camforic, glutaric, glicolic, ftalic, tartaric,' formic, lauric, stearic, alicilic, metansuifonic, benzensulfonic, sorbic, picric, bcnzoic. cinamic și alți acizi asemănători.

în ceea ce privește utilitatea, termenul de compus A83543 denotă dc preferință un membru selectat dintre componentele individuale ale A83543: A83543A,

A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H și

A83543J și sărurile acide de adiție ale acestor componente.

Produsul de fermentație A83543 Ieste produs prin cultivarea unui microorganism nou, Saccharopolyspora spinosa, selectat dintre NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 șl NRRL 18539 sau un mutant care produce A83543, în condiții aeerobe de submergentă într-un mediu de cultură corespunzător, pînă ce se produce o cantitate recuperabilă din componentul A83543. Așa cum este recunoscut în literatura de specialitate, raportul componentelor A83543 este variabil, dependent de condițiile de fermentație utilizate pentru producerea acestora. în general, A83543 conține aproximativ 85-90% A83543A, aproximativ 10-15% A83543D și cantități minore din A83543B, C, E, F, G, H și J și pseudoaglicona A83543A. Componentele individuale ca de exemplu A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H și A83543J și pseudoaglicona A83543A pot fi separate și izolate așa cum s-a descris.

Astfel, un’ alt aspect al prezentei descrieri de invenție, este procedeul pentru producerea compusului A83543 care 'cuprinde cultivarea speciei de Saccharopolispora spinosa, selectată dintre NRRL 18395, NRRL 18357, NRRL 18538 sau NRRL 18539 sau un mutant care produce A83543 într-un mediu de cultură care conține surse asimilabile de carbon, azot, și săruri anorganice în condiții de fermentație aerobică submersă, pînă ce se produce o cantitate recuperabilă de A83543. Componentele- individuale pot fi izolate prin tehnici cunoscute în literatura de specialitate.

Prezenta descriere de invenție se refera așadar la o cultură purificată din microorganismul Saccharopolyspora spinosa selectată dintre NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 sau NRRL 18539 sau un mutant care produce A83543. Aceste microorganisme sînt utilizate deoarece ele produc A83543.

Pentru conveniență în discuțiile care urmează, speciilor li s-au atribuit următoarele însemnări: A83543,!, A83543.3,

A83543,4 și A83543,5. Cultura A83543.1 a fost obținută prin mutația chimică a culturii (A83543) izolată dintr-un sol simplu colectat din Virginia Island. Culturile A83543,3, A83543,4 și A83543,5 sînt obținute din culturi A83543,l prin mutații chimice.

Culturile A83543,l, A83543,3, A83543,4 și A83543,5 au fost depozitate și au făcut parte din cultura stoc a colecției de la Centrul de Cercetări Regional zona Nordică Midwest, Serviciul de Cercetări Agricole, Departamentul Statelor Unite al Agriculturii, North University Street 1815, Peoria, Illinois 61604 din care se pot utiliza de către public avînd următoarele numere dc acces:

NRRL Nr. Specia Nr.

18395 A83543,!

18537 A83543,3

18538 A83543,4

18539 A83543.5

Studiile taxonomice ale culturii A83543,l au fost efectuate de către Frederick P.Mertz de la laboratoarele de Cercetări Lilly. Pe baza acestor studii, microorganismele A83543,l, A83543,3, A83543.4 și

A83543.5 sînt clasificate ca membri noi ai unor specii din genul S3charopolyspora, care este denumită Saccharopolyspora spinosa sp.nov. Această clasificare este bazată pe comparații de laborator directe și pc examinarea descrierilor publice ale unor specii similare.

Metoda utilizată. Metodele care urmează sînt cele recomandate dc către (ISP) Intern ational Streptomyces Proiect, pentru caracterizarea speciilor de Streptomyces, așa cum este menționat în E.B. Shirling și

D.Cottlieb, Methods for Characterization of Streptomyces Soecis, Int.J.Syst.Bacteriol 16:313-340 (1966) și cele recomandate pentru caracterizarea speciilor de Nocardia, așa cum este menționat în R.E.Gordon, D.A.Barnett, J.E.Handerhan și C.H.Pang, Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica și Nocardia Străin, Int.J. Syst.Bacteriol.24(l), 54-63(1974).

ISSC-NBS Ccntroid Color Charts, standard, numărul simplu 2106 (Național Bureanu of Standards, 1958, U.S. Departament of Commerce Washington D.C.) se utilizează pentru însemnarea colorată a denumirilor în faza reversă și în zona hyphae.

Morfologia a Cost studiată utilizîndu-se un microscop optic luminos și un microscop electronic scanning (SEM).

Izomerul acidului diaminopimelic (DAP) și carbohidrații în hidrolizatele celulelor întregi, sînt stabiliți prin metode cromatografice, așa cum se menționează în Backer șieolab Becker, M.P.Lechevalier, R.E.Gordon și H.E.Lechevalier Rapid Differentiation between Nocardia și Streptomyces, by Paper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates Appl.Microbiol. 12, 421-423 (1964) and of Lechevalier Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes Int.J.Syst. Bac(eriol.20, 435-443 (1970).

Fosl’olipidclc sînt determinate, prin procedee care sînt menționate în M.P. Lechevalier and H.Lechcvalier (in A Uni verși ty Laboratory Approach, Dietz and Thacr (eds.): Society for Industrial Microbiology Special Publication No.6, Arlingion, VA. pp. 227-233 (1980).

Cs>mpizitio Jc mcnachinonă este determinată. dc asemenea, prin procedeele menționate în R.M. Kroppenstcdt (in Cheli mical Methods in Bacterial Systematics, M.Goodfellow and D.E.Minnikin (eds, 1985, pp.173-196) and M.D.Collins (ibid.pp.267-285).

Rezistența la antibiotice este măsurată prin metoda discurilor de sensibilitate la antibiotice, aceste discuri fiind umplute cu agar ISP No.2 și fiind însămînțate la suprafață.

Hidroliza amidonului este determinată prin testarea prezenței amidonului cu iod pe discuri cu agar Nr.4 (săruri anorganice de amidon). Analiza acizilor grași este efectuată conform metodelor menționate în HP 5898 A Microbial Identification System (see.L.Miller and T.Berger Bacterial Identification by Gas Chromatography of Whole Cell Fatty Acids Hewletl-Packard Application Note 228-41, 8 pp.(1985).

Esterii metalici ai acizilor grași sînt obținuți din celulele întregi liofilizate, care se dezvoltă în condiții identice.

Analiza componentului principal este bidimensională și genetată de computer. Unitățile de măsurare, în zona componentului principal (așa cum se arată în fig.12), reprezintă derivații standard.

Acizii micolici sînt, de asemenea, determinați prin metode utilizate în Minnikin (D.E.Minnikin, l.G.Hutchinson și A.B. Caldicott Thin-Layer Chromatography of Methanolysates of Mycolic Acid-Containing Bateria, J.Chromatography 188, 21-233 (1980).

Caracteristicile culturale

Cultura A83543,l se dezvoltă bine atît pe medii complexe, cît și pe medii definite. Masa de spori, aeriană, este colorată predominam roz-gălbui deschis, dar este albă la un număr de medii.

Partea reversă este galbenă, pînă la brun-gălbui. Nici o pigmentare distinctivă nu este prezentă. Un pigment brirn solubil este eliberat în mediu, în unele medii.

Caracteristicile culturale sînt însumate în tabelul 9.

Tabelul 9

Caracteristici culturale ale Α83543.Γ

Mediu	Dezvoltare	Colorație reversă	Miceliu aerian	Pigment solubil
Dezvoltare	Colorație
0	1	2		4	5
ISP mediu 2	abundentă	76.brun-gălbui deschis	abundentă	92.alb-gălbui	nici unul
ISP mediu 3	bună	264.gri-deschis	bună	263.alb	nici unul
ISP mediu 4	bună	92.alb-gălbui	bună	263.alb	nici unul
ISP mediu 5	abundentă	73.galben-oranj pal	abundentă	31.roz-gălbui pal	brun-deschis
ISP mediu 7	abundentă	77.brun-gălbui . moderat	abundentă	3 l.roz-gălbui pal	brun-deschis
ĂIA Agar6	abundentă	89.galbcn-pal	abundentă	31.roz-gâlbui pal	brun
ATCC Nr.172	abundentă	92.alb-gălbui	abundentă	31.roz-gălbui pal	nici unul
Bennetts	abundentă	92.alb-gălbui	abundentă	3l.roz-gălbui pal	brun deschis
Calciu-malat	bună	73.galben oranj pal	corectă	9.alb-rozaliu	brun
Chitin	corectă	92.alb-gă Ibui	corectă	263.alb	nici unul
Czaapek	bună	92.a! b-gălbui	bună	263.alb	nici unul
Emerson	abundentă	76.brun-gălbui deschis	abundentă	3l.roz-gălbui pal	brun
Glucoz-asparagină	bună	9O.galben-gri	corectă	3i.roz-gălbui pal	brun deschis
Glicerol-glicină	abundentă	78.brun-gălbui închis	abundentă	SO.brun-gălbui gri	brun închis
Nutrient	abundentă	9O.galben-gri	abundentă	3i.roz-gălbui pal	brun deschis
TPOC	abundentă	9O.galben-gri	abundentă	31.roz-galben pal	nici unul
TWAd	corectă	93.gri-gălbui	săracă	263.alb	nici unul
YDAC	abundentă	77.brun-gălbui moderat	corectă	9.alb-rozaliu	brun închis

‘ Incuhat la 30°C timp de 21 zile

Izolar pe Agar. Difco a actinomicetelor ^c Pastă de tomate pe mediu de agar cu făină de ovăz

In 'The Actinomycetes. voi.2. S A WaKSMAN. The Wll.l.lAMS și WILKINS CO.. Baltimore. 1 voi ^J Agar in apă comună (Gordon. Barnetl. Ilanderlian .și l’ang. supra) ' Mediu agar dextrozâ dr<j|die (Gordon. Barnetl. Handerhan și Vane, supra)

Caracteristicile morfologice

Cultura A83543.1 este produsă, în substrat extensiv, miceliul fiind fragmentat în lichidul de fermentație. Nu s-a observat nici o fragmentare, cînd cultura a fost dezvoltată pe mediu de agar.

Cînd cultura a fost dezvoltată pe plăci conținînd mediul ISP 1, au fost observate colonii circulare albe, cu diametrul de 8 ... ... 10 mm, cu centrul mai ridicat, și de culoare reversă brun-gălbuie.

Hi fele aeriene, bine formate, sînt prezente pe majoritatea mediilor. Hifele aeriene sînt segmentate în lanțuri lungi de spori aranjate, sub formă de cîrlige și spirale deschise. Așadar spiralele sînt obsevate, dar ele sînt scurte și incomplete.

Morfologia generală este Rectus-fiexibilis (RA).

Hifele aeriene au o înfățișare distinctivă, sub formă de mărgele, cu multe spații goale în lanțul sporilor. Această caracteristică demonstrează că învelișul sporului înconjoară lanțul de spori. Acest înveliș de spori este acoperit cu creste foarte distinctive. Aceste creste sînt de aproximativ 1 pm lungime și sînt foarte rotunjite la capete.

Forma sporului este oblungă, avînd o mărime medie de aproximativ l,lxl,5pm. Lungimea lanțului de spori este mult peste 50 de spori nu s-a observat nici o caracteristică în zig-zag, sclerotia, sporangia sau celule motilice.

Caracteristicile fiziologice

Cultura A83543,l produce acizi din următorii carbonidrați: adonitol, D-arabinoză, eritrol, fructoză, glucoza, glicerol, manitol. manoză, ribozâ și trehaloză.

Cultura nu produce acizi din următorii compuși: L-arabinoză, celobioză, celuloză. dextrină. dulcitol, etanol, galactoză, glicogen. inozitol. inulină, lactoză, maltoză. mclizitozâ. mclebioză, melil-D-glicozidâ. rafinoză. L-ramnoză. salicină, sorbi toi. L-sorboză, sucroză, xilitol sau xiloză.

Dezvoltarea este observată cu galactoză, maltoză și melizitoză, dar nu se produce nici un acid din acești carbohidrați.

Cultura A83543.1 utilizează următorii acizi organici, ca săruri de sodiu: acetat, butirat, citrat, formiat, lactat, maleat, propionat, piruvat și succinat. Cultura nu utilizează benzoal, mucal, oxalat sau tartral.

A83543,l descompune alantoina, maleatul de calciu, caseina, elastina, hipuratul, hipoxantina, testosterona, L-tirozina și ureea. Este imposibil să se descompună adenina, esculina, guanina, amidonul sau xantina.

A83543.1 produce catalaza, fosfataza, ureaza și hidrogenul sulfurat. Aceasta lichefiază gelatina, reduce nitratul, nu este rezistentă la lizozimă și nu produce pigmenți melanoidici. De asemenea nu peptonizează și nu hidrolizeazâ smîntîna de lapte. A83543,l tolerează nivele de clorură de sodiu de peste și inclusiv 11%. Este imposibil de a supraviețui la temperatura de 50°C timp de 8 ore, dar se dezvoltă la temperaturi cuprinse între 15° și 37°C.

A83543,l este rezistentă la cefalotină (30 pg), penicilina G (10 unități) și rifampină (5 pg). Este sensibilă la bacitracină (10 unități), gentamicină (10 pg), lincomicină (2 pg), neomicină (30 pg), tobramicină (10 pg), oleandomicină (15 pg), streptomicină (10 pg), tetraciclină (30 pg) și vancomicină (30 pg).

Analiza pereților celulari

Celulele întregi hidrolizate de A83543,l conțin acidul mezo-diaminopimelic. Zaharurile din extractele celulelor întregi sînt galactoza și arabinoza. Astfel, A83543.1 are tipul IV de pereți celulari paterni și tipul A > de zahar patern (Lechevalier și Lechavalier supra). Celulele nu conțin acizii micolici.

Determinările fosL’olipi«Jicc pe celulele întregi indică prezența fosfatidil-colinei și cardiolipinei. Nu s-a detectat fosfalidil elanolamina. Astfel. A83543, l are t'osfoli106065 pidele paterne de tip P III, așa cum se menționează în M.P.Lechevalier, A.E. Sten și H.A.Lechevlier, Phospholipide în the Taxonomy of Actinomycetes în Actimomycetes, Zbl, Bakt. Suppl. 11, K.P.Schaal și G.Pulverer (eds.), Gustav Fischer Verlag, New York, 1981). '

Menachinona majoră detectată este MK-9(H4). O cantitate minoră de MK9(H6) este observată.

Fago placarea

Un număr de Streptomicete, Saccharopolyspora și Amycolatopsis fagi sînt placați pe A83543.1. Nu se observă plăci.

Identificarea A83543,1

Așa cum s-a discutat, cultura A83543.1 are tipul IV de pereți celulari paterni și tipul A de zaharuri paterne. Următoarele treisprezece genuri au acest fel de chimie celulară: Nocardia, Rhodococus, Corynebacterium, Caseobacter, Mycobacterium, Faenia (Miropolyspora), Pseudonocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Amycolata, Amycolatopsis și Kibdelosporangiu. Aceste genuri sînt deosebite prin prezența sau absența acizilor micolici, prin compoziția acizilor grași și prin tipurile de fosfolipide și menachinona. Faenia, Pseudonocardia și Saccharopolyspora au caracteristici chematoxonomice identice cu cele din A83543.1 dar aceste genuri diferă de A83543.1 privind proprietățile morfologice și culturale.

Genul Faenia (Micropolyspora') are spori netezi și lanțuri scurte de spori care sînt la marginea hifelor aeriene și celor din substrat. Hifele aeriene sînt rare și colorate în alb. Există o termofilă care se dezvoltă la temperatura de 60°C. A83543,l nu are niciuna din aceste proprietăți și astfel diferă de Faenia.

Genu’r Pseudonocardia arc spori atît la hifele aeriene, cît și la cele din substrat.

Se deosebesc prin înmulțire acropetală și blastospori. Există o morfologic în zig-zag caracteristica a hifelor. Hifele au fost descrise ca fiind articulate și nu septate, așa cum se descrie în A.Hanssen și D. Schacr Amcncs Description of a New Species Pseudonocardia spinosa Schacr Int.J.Syst. Bacteriol. 21:29-34 (1971). Acestea se dezvoltă foarte lent. Fragmentarea este absentă sau rar observată. A83543,l nu are nici una din aceste proprietăți.

Genul Saccharopolyspora este caracterizat prin învelișul sporilor și lanțul de spori aparent distinct asemănător mărgelelor. Această caracteristică este foarte proeminentă la A83543.1. Fragmentarea a fost așadar observată la genul Saccharopolyspora. Speciile de tipul S.hirsuta, sînt izolate din trestia dc zahât. Cultura din. care A83543, l este obținută are multe proprietăți din acest gen, fiind așadar considerată a fi o specie de Saccharopolyspora.

Speciile cu validitate publicată în genul Saccharopolyspora sînt numai S.erythreea și S.hirsuta. Subspeciile cunoscute sînt

S. hirsta subsp.taberi și S.hirsuta aubsp.kobensis. A83543,l diferă de aceste specii prin colorarea aeriană și reversâ sau prin producerea pigmenților soluibili.

Similaritatea biochimică este arătată printr-un tabel cu coeficienți similari bazați pe cît mai multe măsurători biochimice posibile. Se utilizează, așa cum se menționează în W.Kuryilowicz, A.Paszkiewicz, W.Woznicka, W.Kurzatkowski și

T. Szulga Numer ical Taxonomy of Streptomycetes Polish Medical Publishers, Warsaw, 1975. p.37). coeficientul Jaccard Sj si coeficientul simplu corespunzător S °snv

Tabelul următor însumează acești coeficienți de similaritate.

Coeficienții de similaritate pentru A83543, l fi speciile de Saccharopolyspora:

Cultura	s,m	Sj ’
A83543.1	100	100
S.hirsuta subsp.taberi	68	57
S.hirsuta subsp.kobensis	67	60
S.erythreea	63	54
S.hirsuta	55	50

Analiza acizilor grași ai A83543.1 și a speciilor cunoscute de Saccharopolyspora arată că fiecare conțin atît acizi grași cu catenă saturată cît și cu catenă ramificată. Compoziția de acizi grași ai compusu- 5 lui A83543,l este similară, dar nu identică cu cea a altor specii. Tabelul 10 compară compozițiile cu acizi grași A83543.1 și a speciilor cunoscute Saccharopolyspora.

Analiza componentului principal din compoziția de acizi grași prezentată în tabelul 10 arată o dispersare suficientă, ceea ce sugerează că culturile sînt toate specii distincte în cadrul aceluiași gen. Principalul component al plctului din datele din tabelul 10 este prezentat în fig.12.

Tabelul 10

Compoziția procentuală de acid gras a A83543,1 fi speciile Saccharopolyspora

Acid gras	A83543,l	S.erythraea	S.hirsuta	S.hirsuta subsp.kobensis
15:0 Iso	11,80	17,86	15,44	17,94
15:0 Anteiso	0,64	1,33	1,38	1,25
16:0 Iso	22,47	25,70	15,61	19,05
16:1 Trans 9	1,15	-	4,14	2,63
17:1 Iso F	7,22	7,97	-	-
17:1 Iso G	-	-	3,75	6,82
17:0 Iso	17,59	13,37	26,26	19,41
17:0 Anteiso	15,30	12,46	14,19	12,72
17:1 B	4,77	1,90	-	0,67
17:1 C	1,65	-	2,70	1,81
17:0	2,74	1,01	1,43	0,94
16:1 2OH	1,27	2,07	4,74	4,85
18:1 Iso F	7,57	11,31	6,83	7,47
TSBA lOMe 18:05	1,15	1,34	1,77	1,00

TSBA = Acid tuberculostexaric

Tabelul 11 compară caracteristicile fiziologice ale Iui A83543,! cu cele ale speciilor și subspeciiilor existente de Saccharopolyspora.

Compozițiile pot să indice că, A83543.1 diferă suficient de speciile descrise mai îninte, de Saccharopolyspora, ca să existe 10 noi specii de Saccharopolyspora pentru care numele de Saccharopolyspora spinosa a fost selectat. Numele de spinosa reflectă ornamentația de creastă a sporilor pentru această specie.

Tabelul 11

Caracteristici fiziologice diferențiale ale A83543,l fi speciile Saccharopolyspora

Caracteristici	A83543.1	S.erythraea	S.hirsuta	S.hirsuta subsp. taberi	S.hirusta subsp. kobensis
Descompunere de: adenina		+	+	+	+
eseu li na	-	+	+	+	+
amidon	-	+	+	+	+
xantină	-	+	+	+	+
alanotină	+	-	-	~ «	ND
producere de nitrat	+	+	-	+	+.
fosfotază	+	-	+	·-	ND
Utilizare.de:
benzoat	-	-	+	-	ND
mucat	-	-	+	-	ND
oxalat	-	-	+	-	ND
Interval de temperatură (°C)	15-37	20-42	25-50	20-42	20-42
Toleranță la Na Cl(%)	11	ND*	15	ND	12
Acid produs de la:
arabinoză	+	+	-	+	-
celobioză		+	+	+	+
dextrină		+	+	+	ND
galactoză		+	+	+	+
inositol		+	+	+	-
maltoză		+	+	+	+
melezitosă		+	-	+	ND
Acid produs din:
melibiosă		+	ND	-	ND
rafinosă		+	+	+	+
ramnosă		+	+	+	-
salicin		+	-	-	ND
sucrosă		+	+	+	+
xilosă		+	+	-	-
lactosă		-	+	+	ND
Me-D-glucosidă		-	+	+	ND
sorbi toi	-	-	+	-	-
insulină	-	ND .	+	ND	+

ND = ne făcut

Speciile A83543,3, A83543.4 și

A83543.5 sînt similare macroscopic cu specia A83543.1 care este clasificată ca Saccharopolyspora spinosa. Cele patru specii diferă prin cantitatea de A83543 pe care acestea o produc. Specia A83543.3 produce aproximativ de patru ori mai mult A83543 dccît specia A83543.1. iar speciile

A83543,4 și Α83543.5 produc aproximativ de opt pînă la nouă ori mai mult decît produce specia A83543.1.

Așa cum este in cazul altor organisme, caracteristicile culturilor care produc A83543 conform prezentei descrieri de invenție, Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL18538 și NRRL 18539, continuă să fie subiectul variațiilor. Astfel, mutanții acestor specii pot fi obținuți prin metode fizice și chimice cunoscute. De exemplu, alte specii pot fi obținute prin tratament cu substanțe chimice cum ar fi de exemplu N-metil-N'-nitro-N-nitrozoguanidină. Mutanții naturali și induși ai Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 și NRRL 18539, care au caracteristica producerii unei cantități recuperabile de A83543.

Mediul de cultură utilizat pentru dezvoltarea culturilor de Saccharopolyspora spinosa, poate fi oarecare. Pentru economia Γη producție, pentru un randament optim și pentru izolarea ușoară a produsului, se preferă totuși anumite medii de cultură. Astfel, de exemplu, sursele de carbon preferate pentru fermentarea pe scară largă sînt glucoza și maltoza, de asemenea riboza, xiloza, fructoza, galactoza, manoza, manitolul, amidonul solubil, dextina de cartof, oleatul de metil, uleiurile ca de exemplu uleiul de soia și alte produse asemănătoare.

Sursele preferate de azot sînt făina din semințele de bumbac, laptele peptonizat, făina de soia digerată, de asemenea făina dc pește, lichidul din teaca de porumb, extractul de drojdie, caseina hidrolizată, extractul de carne de vită și alte astfel de produse.

Printre sărurile anorganice nutritive care pot fi încorporate în mediul de cultură, sînt sărurile solubile obișnuite capa’bile să producă zinc, sodiu, magneziu, calciu, amoniu, clorură, carbonat, sulfat, .w nitrat și alți ioni asemănători.

Urme de elemente esențiale necesare pentru dezvoltarea și creșterea organismului vor fi așadar incluse în mediul de cultură. Urme de elemente se produc de obicei ca impurități la alți substituenți din mediu, în cantități suficiente pentru a corespunde cerințelor de dezvoltare a organismului.

In mod obișnuit, spumarea este o problemă și deci trebuie să se adauge la mediul de fermentație pe scară largă, cantități mici de exemplu 0,2 ml/1 de agenți antispumanți, cum ar fi de exemplu polipropilenglicolul. In cazul culturilor care produc A83543, unii antispumanți convenționali inhibă producerea de A83543. Spumarea poate fi controlată prin includerea uleiului de soia sau a compusului pluronic L-101 (BASF) în mediu (1-3%). O cantitate de ulei poate fi adăugată dacă se dezvoltă spuma.

Procentajul de component A83543 special poate varia prin schimbarea mediului. De exemplu, prin adăugarea acizilor izobutiric sau propionic sau a valinei, crește procentajul de compus A83543 produs. Pentru producerea unor cantități substanțiale de A83543, se preferă fermentația aerobă submersă în bioreactoare sub agitare. Pot fi obținute cantități mici de A83543, prin cultură de tip shake - flask. Deoarece înlocuirea unor bioreactoare mari cu spori duce la întîrzierea în timp a formării organismului, se preferă să se utilizeze un inocul vegetativ. Inocuiul vegetativ este preparat prin inocularea unui mic volum din mediul de cultură cu forme sporulate sau cu fragmente de micelii din organism, pentru a obține o cultură proaspătă, cu dezvoltare activă a organismului. ‘ Inocuiul vegetativ este apoi transferat în bioreactoare mai mari. Mediul de inocul vegetativ poate fi la fel cu cel utilizai peniru fermentații mai mari, dar în acuși caz sînt convenabile alte medii dc cultură.

A83543 este produs cînd organismul se .19 dezvoltă la temperaturi cuprinse între aproximativ 24°C și 33°C. Temperaturile optime pentru producția de A83543 par a fi de aproximativ 28-30°C.

Așa cum sc utilizează de obicei în procedeele cu culturi aerobe submersc, aerul steril este suflat în vas de la partea inferioară, în timp ce mediul de cultură este agitat cu turbine rotative convenționale. în general, gradul de aerare și gradul de agitare vor fi reglate pentru a se menține nivelul oxigenului dizolvat la sau la aproape 35% și de preferință la sau Ia aproape 50%, din aerul de, saturație cu o presiune internă a vasului de 0,34 atmosfere.

Producția componentelor de A83543 poate fi continuată în timpul fermentării prin testarea extractelor de bulion. Cromatografia lichidă de înaltă performanță, este utilizată ca analiză pentru acest scop.

Urmînd producerea lor în condiții aerobe de fermentație submersă, componentele A83543 pot fi recuperate din mediul de fermentație prin metodele precizate în literatura de specialitate. Compusul A83543 produs în timpul fermentației se regăsește atît în miceliu cît și în bulion. Compusul A83543 potc fi lipofilic. Astfel, dacă o cantitate substanțială de ulei este utilizată la fermentație, extracția totală de bulion este mult mai eficientă. Dacă se utilizează 'numai cantități mici de ulei, porțiunea majoră de A83543 este în miceliu. In acest caz, o recuperare eficientă A83543 este însoțită de filtrarea inițială a mediului, pentru separarea bulionului de masa micelară (biomasa).

A83543 poate fi recuperat din biomasă printr-o varietate de tehnici. O tehnică preferată cuprinde spălarea biomasei separate cu apă pentru îndepărtarea bulionului care a rămas, amestecarea biomasei cu un solvent polar în care compusul A83543 este solubil, de exemplu metanol sau acetonă, separarea și concentrarea

4(1 solventului, extracția concentratului cu un solvent nepolar și/sau adsorbția într-un absorbant pe bază de' silicagel în fază reversă, ca de exemplu RP-CS sau RP-C18 sau un polimer cu porozitate ridicată ca de de exemplu HP-20 și alți compuși asemănători.

Materialul activ este eluat din adsorbant cu un solvent corespunzător cum ar fi de exemplu un amestec de acetonitril și metanol care conține cantități mici de tetrahidrofuran (THF).

A83543 poate fi separat în componente individuale, ca de exemplu A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H și A83543J și pseudoaglicona A83543A prin procedee similare. Un procedeu de separare preferat cuprinde cromatrografia pe coloană de silicagel în fază reversă (C₁₈ sau C₈).

în mod alternativ, culturile solide incluzînd constituenți de mediu si miceliu, se pot utiliza fără extracție sau separare, dar de preferință după îndepărtarea apei, ca o sursă de A83543. De exemplu, după producerea de A83543, fermentația totală a bulionului duce la obținerea uni produs care se usucă prin liofilizare, prin uscare cu valțuri sau prin distilare azeotropă și uscare. Bulionul uscat poate fi apoi utilizat direct, ca de exemplu prin amestecare directă în premixuri hrănitoare.

Activitate insecticidă și miticidă

Compușii caonform prezentei invenții pot fi utilizați pentru controlul insectelor și căpușelor. Prezenta invenție este așadar direcțională spre un procedeu de inhibare a insectelor sau căpușelor care constă în aplicarea la locul lor de acțiune a unei cantități din compusul A83543.

Compușii A83543 prezintă o activitate îmotriva unui număr -mare de insecte și căpușe. Compușii prezintă o activitate specifică împotriva viermelui armat sudic care este un membru al ordinului Lepidoptera. Alți membri tipici ai acestui ordin sînt molia de măr, omida, molia de haine, molia de făină indiană, insectele frunzelor, viermele de porumb, viermele rotund de bumbac, insectele care perforează griul european, viermele verzei importate, maieza de varză, viermele rotund roz, viermele cu desagă, omida cu tentacule din est, viermele cu membrană de iarbă și viermele armat de toamnă.

Compușii prezintă așadar o activitate și împotriva afidei de bumbac care este un membru al ordinului Homoptera. Alți membri din ordinul Homoptera includ insectele de frunze, lăcustele de plante, psylla de păr, insectele care sug mărul, insectele cu crustă, muștele albe și ploșnițele, ca și un număr de alte specii de afide specifice toamnei.

în plus, compușii A83543 arată o activitate împotriva muștelor de grajd, muscuIițelor și țînțarilor care sînt membri ai ordinului Diptera. Un alt membru tipic al acestui ordin este musca comună de casă.

Compușii A83543 sînt utilizați pentru reducerea populației de insecte și căpușe printr-un procedeu de inhibare care cuprinde aplicarea la locul lor de acțiune din compusul A83543.

Locul de acțiune al insectelor sau căpușelor se referă la zona în care trăiesc insectele și căpușele sau zona în care sînt prezente ouăle acestora, incluzînd aerul din jurul lor, hrana pe care o mănîncă, sau obiectele cu care vin în contact. De exemplu insectele sau căpușele care îngerează planta pot ti controlate prin aplicarea compusului activ pe porțiunile plantei pe care insecta o mănîncă sau în care locuiește, în special frunzele.

Este de semnalat faptul că, compușii ar putea fi utilizați pentru protecția textilelor, a hîrtiei, a cerealelor stocate, sau a semințelor stocate, prin aplicarea compusului activ la aceste-substanțe.

Termenul de inhibare a insectei sau a căpușei” se referă la descreșterea numă42 rului de insecte sau căpușe care trăiesc sau la descreșterea numărului de ouă viabile de • Ia insecte și căpușe. Extinderea reducerii realizată de către compuși depinde desigur 5 de gradul de aplicare a compusului, de compusul utilizat în special și de speciile de , insecte sau căpușe testate. Se utilizează cel puțin .o cantitate care inactivează insectele sau căpușele.

Termenul de cantitate care inactivează insectele și de cantitate care inactivează căpușele se utilizează pentru a se descrie cantitatea care este suficientă pentru a determina o reducere măsurabilă la insec15 tele tratate sau la populația de căpușe tratate. în general, se utilizează o cantitate din compusul activ care este cuprinsă aproximativ între 1 și 1000 ppm. (sau 0,01 pînă la lkg/ha).

Prezenta descriere de invenție este direcționată către un procedeu de inhibare a insectei susceptibile din ordinul Lepidoptera care cuprinde aplicarea pe plantă a unei cantități efective din compusul A83543.

O altă direcție preferată a prezentei descrieri de invenție este un procedeu de inhibare a muștelor care înțeapă din ordinul Diptera la animale care cuprinde administrarea unei cantități efective din compusul 30 A83543, pe cale orală sau parenterală la animal.

Screeningul insectelor și căpușelor

Compușii A83543 sînt testați pentru activitatea lor mitică și insecticidă, prin 35 următorul screening mi ticid/insecticid: fiecare compus de testat este formulat prin dizolvarea într-un amestec de acetonă și alcool în părți egale care conține 23 de Toximul R (amestec de emulgator sulfo40 nat/neionic) și 13 g de Toximul S (amestec de sulfont și emulgator neionic) per litru. Aceste amestecuri sînt apoi diluate cu apă pentru a se obține concentrațiile indicate.

Păianjenul cu două pete (Tetranychus urticae Koch) și afidele de bumbac sau melon (Aphia gossypii Glover) se introduc în cotiledoanele zdrobite și sînt lăsate să se stabilizeze pe ambele suprafețe ale frunzei. Alte plante din același vas de tratament sînt îndepărtate neinfestate. 5

Frunzele sînt apoi pulverizate cu 5 ml din soluția de testat, utilizîndu-se un spray pulverizator de tip DeVilbiss la 10 psi. Ambele suprafețe ale frunzelor sînt acoperite pînă ce cad și apoi se lasă să se 10 usuce timp de o oră. Două frunze neinTermenul Insectă/căpușe testate sînt apoi tăiate și plaste pe o placă. Petri care conține viermele armat de sub (Spodoptera eridania Cramer).

Insectele adiționale sînt evaluate utilizîndu-se formulări similare și procedee de evaluare, cu excepția celor notate.

După perioadele standard de expunere, se evaluează procentele de mortalitate. Rezultatele sînt raportate în tabelele următoare. Se utilizează următoarele abreviațiuni:

Denumirea științifică

BW Gărgăriță (boli weevil) *CA Afida de bumbac (cotton aphis)

CBW Viermele de bumbac (cotton bollworm)

CLH Lăcusta frunzei de porumb (corn leafhopper)

CRW Viermele de rădăcină a porumbului sudic (Southern corn rootworm)

SAW Omida sudică (Southern armyworm)

SM Căpușa cu două pete încrucișate (twospotted spider mite)

Anthonomus grandis

Aphis gossypii

Heliothis zea

Dalbulus maidis

Diabrotica undecimpunctata howardi

Spodoptera eridania

Tetranychus urticae

Tabelul 12

Activitatea compusului A83543A împotriva larvei neonat CBW

Tratament	Zilea	Grad (ppm)	procente de inhibare15
Topic'	1	1,00	20,00
		5,00	100,00
		10,00	100,00
		50,00	100,00
		100,00	100,00
Dietad	4	1,00	30,00
		5,00	100,00
		10,00	100,00 ’
		50,00	100,00
		100,00	100,00
Ova'	6	10,00	0,00
		50,00	0,00
		100,00	30,00
Topical'	1	0,50	10,00
		1,00	40,00
		5,00	80,00

46

Tabelul 12 (continuare)

Tratament	Zile	Grad (ppm)	procente de inhibare15
		10,00	100,00
		50,00	100,00
Dieta	3	: 0,50	15,00
		1,00	45,00
		5,00	100,00
		10,00	100,00
	>	50,00	100,00

’ Reprezintă numărul de zile între tratament și observații ^b Reprezintă două replicatii testate ^c Reprezintă: tratat cu 1 ml din compusul formulat A83543A ^d Reprezintă dieta care este suprafața tratată cu compusul A83543A uscată și infestată ^e Reprezintă ouăle topic tratate cu compusul A83543A și care se mențin pînă ce ouăle de control sînt complet ciocnite.

Tabelul 13

Procentul de control al larvelor Neonat CBW cu componentele A83543¹

Component2	PPM
0,5	1	5	10
A	55 (d)	100 (a)	100 (a)	100 (a)
B	35 (e)	80 (c)	100 (a)	100 (a)
C	5 (g)	85 (bc)	93 (bc)	100 (a)
D	58 (d)	90 (ac)	100 (a)	100 (a)
E	28 (ef)	58 (d)	100 (a)	100 (a)
F	, 0(g)	0(g)	0(g)	95 (ab)
G	0(g)	0 (g)	20 (f)	80 (c)

^l) Tratamentele cu aceleași litere din paranteze sînt similare cu niveul 0,05 ²¹ Metoda topică cu pipetă cu 20 larve/replicație și 4 replicații o zi între tratament și observație.

Tabelul 14

Activitatea compusului A83543A împotriva larvelor SAW

Stadiul	Tratament	Zile	Grad (ppm)	procente inhibiție15
Neonat	Foliar/tufă de fasole15	3	1,00 5,00 10,00 50,00 100,00	10,00 40,00 100,00 100,00 100,00
Neonat	Topicd	-v 0	1,00 5.00	0,00 60,00

' 47

Tabelul 14 (continuare)

Stadiul	Tratament	Zile’	Grad (ppm)	procente inhibiție6
			10,00 50,00 100,00	100,00 100,00 100,00
Neonat	Foliar/Tufă de fasole'	4	0,50 ' 1,00 5,00 10,00 50,00	0,00 66,67 100,op 100,00 100,00
Instar Secundar	Topicd	1	1,00 5,00 10,00 50,00 100,00	0,00 0,00 0,00 80,00 100,00
Instar Secundar	Foliar/Tufă de fasole0	4	1,00 5,00 10,00 50,00 100,00	0,00 0,00 80,00 80,00 100,00
Al treilea Instar	Topic'	2	1,00 5,00 10,00 50,00	0,00 0,00 13.33 73.33
Al treilea Instar	Foliar/Tufă de fasole'	4	0,50 1,00 5,00 . 10,00 50,00	0,00 0,00 40,00 100,00 100,00
AI cincilea Instar	Topic'	2	10,00 50,00	0,00 0,00
Al cincilea Instar	Foliar/Tufă de fasole'	4	10,00 50,00	0,00 0,00

‘ Reprezintă zile între tratament și observație ^h Reprezintă repiicații testate

O jeplicație ⁴ Două repiicații ' Trei repiicații ' Tratament topic cu 1 ml din compusul formulat Λ83543Α

Tabelul 15

Activitatea compusului A83543A împotriva BW adult:

Tratament	Grad (ppm)	Procente de inhibiție3
Topic6	1,00	0,00
	5,00	20,00
	10,00	20,00
	50,00	100,00
	100,00	100,00

In acest tabel: * reprezintă o replicajie, observată la trei zile după tratament;

^b reprezintă 1 ml din compusul formulat A83543A turnat peste insectele adulte pe o placă Petri

Tabelul 16

Activitatea compusului A83543A în seră: Teste Împotriva pestelor din diferite culturi

Cultura	Dăunătorul	Grad (ppm)	Inhibiție3
Porumb	CRW	30 15 7,5 3,75	100 50 10 0
Dovleac	SAW	250	100
		125	100
		62,5	100
		31,25	55
		15,63	40
		7,8	20
		3,9	20
		1,9	0
Dovleac	SM	250	70
		125	40
		62,5	20
		31,25	0
Dovleac	CA	100	0
		50	0
Porumb	CLH	200	90
		100	30
		50	0
Fasole	SAW	100 50 25 12,5	100 80 40 0

Tabelul 16 (continuare)

Cultura	Dăunătorul	Grad (ppm)	Inhibiție'1
Fasole	SM	100	100
		50	80
		25	30
		12,5	10
		6,25	0
Dovleac	CA	100	80
		50	40
		25	0
Porumb	CRW	6 3	30 0

în tabelul 17 se compară eficacitatea și vasul exterior de testare împotriva dăunăpersistența tratamentului cu compusul torului viermele armat sudic.

A83543A cu tratamentul cu metomil în

Tabelul 17

Eficiența compusului A83543 împotriva Spodopterei eridania în vasele de testare exterioare

Tratament	Grad (ppm)	Zile după tratament-1
1	5	7	14
A83543A	63	100	88	90	5
A83543A	125	100	88	95	90
A83543A	250	100	95	100	100
A83543A	500	100	100	100	100
metomil	63	100	20	15	0
metomil	125	100	35	40	20
metomil	250	100	85	45	40
metomil	500	100	90	85	60
nici unul	0	0	0	0	0
nici unul	0	0	0	0	0

' Reprezintă rezultatele date ca procente de mortalitate

Tabelul 18 însumează LC 50's, concentrațiile letale la care compusul de testat 5 inhibă 50% din insectele și căpușele testate, exhibitate de compusul A83543A, în comparație cu cele exhibitate de cunoscutul insecticid metomil.

Tabelul 18

LC 50's pentru compusul A83543

Dăunătorul	LC 50 (ppm)
A83543	metomil
CRW	15	6

Tabelul 18 (continuare)

Dăunătorul	LC 50 (ppm)
A83543	metomil
Afidele semințelor	250	5,4
SM	150	71,4
SAW/foliar	1,3	11,4
CBW/contact	0,6	14,5

Coeficientul dăunătorului viermele rădăcinii de porumb în sol, în greutate: toate celelalte sub formă de concentrație spray.

Componentele A83543 sînt active împotriva țînțarului de febră galbenă (Aedes aegypti) sub formă de larve în testul standard in vitro. Tabelele 19 și 20 însumează activitatea componentelor din aceste teste.

Tabelul 19

Activitatea in vitro a compusului A83543B și A83543C împotriva Larvelor de [âqar-primul instar

A83543	Inhibiție minimă
Component	Concentrație (mcg/ml)a
A	0,016 0,031B
B	0,016
C	0,031

în care ‘ reprezintă concentrația minimă care arată o inhibiție de 100% după 24 de ore (pe discuri microtitrate) ^b reprezintă teste pe două loturi.

Tabelul 20

Activitatea componentelor A83543 vs. Al patrulea instar larve de țînțaf

Component	Procente de control a
A	60,70b
B	60
C	60
D	30
E	80
F	0
G	0

‘ La 24 ore cînd se tratează la 0,312 ppm Rezultatele a două teste

Cercetări în domeniu

Compusul A83543 este evaluat prin cercetări în domeniu. Componentul A83543A arată activitatea împotriva viermelui dc varză și a gîndacului de varză care acțio5 nează pe lăstarul broccoli și împotriva unui amestec de gîndaci de soia (75%) și viermele armat de soia (25%).

Compoziții insecticide

Compușii conform prezentei invenții sînt aplicați sub formă de compoziții. Aceste compoziții cuprind o cantitate care inactivcază o insectă sau o căpușă, din compusul A83543 și un vehicul inert, acceptabil din punct dc vedere filologic. Compnentul activ, ca exemplu, compusul A83543, poate fi prezent ca 1) component simplu A83543 2) un amestec de două sau mai multe componente 3) amestecul separat de A83543 sau 4) compusul A83543 la un loc cu porțiunea uscată din mediul de fermentație, în care acesta este produs, de exemplu, un terci de fermentație uscat, brut.

Compozițiile sînt fie formule de concentrate, care sînt dispersate în apă, pentru aplicație dau formule de prafuri sau granule, care sînt aplicate fără un tratament ulterior.

Compozițiile sînt preparate conform procedeelor .și formulelor, care sînt convenabile pentru substanțele chimice utilizate în agricultură, dar care sînt noi și importante, deoarece are prezent unul sau mai mulți compuși conform prezentei descrieri de invenție.

Dispersiile în care compușii sau materialul uscat, brut sc aplică, sînt adesea, în majoritate, suspensii apoase sau emulsii apoase preparate din formule de concentrate de compuși sau din material brut. Astfel de formule emulsifiabile solubile în apă, suspendabile în apă, sînt fie produse solide (cunoscute ca pulberi umectabile) sau lichide (cunoscute de obicei ca concentrate emulsifiabile sau suspensii apoase).

Pulberile umectabile pot fi compactate, pentru a se forma granule dispersabile în apă și cuprind un amestec intim din compusul activ, un vehicul inert și surfactanți. Concentrația compusului activ este, de obicei, dc la aproximativ 1% dc preferință 10%, la aproximativ 90% în greutate.

Vehiculul inert este ales, de obicei, dintre argilele attapulgite. argilele montmorillonite, pănînlurile de diatomcc sau silicații purificați.

Surfactanlii efectivi, sînt dc la aproximativ 0,5% pînă la aproximativ 10% de pulbere umeclabilă și aceștia se găsesc printre ligninele sulfoniate, naftalensulfonații condensați, nafalensullbnații, alchilbenzensulfonații, alchil sulfații și surfactanții neionici ce de exemplu aducții de oxid de etilen ai alchil-fenol i I or.

Concentratele emulsifiabile ale compușilor conțin o concentrație convenabilă din compus, ca de exemplu de la aproximativ 50 pînă la aproximativ 500 grame per litru de lichid, echivalent cu aproximativ 10% pînă la aproximativ 50%, dizolvat într-un suport inert, care este fie un solvent miscibil cu apa sau un amestec de solvent organic nemiscibil cu apa și emulgatori.

Solvcnții organici utilizați includ compuși aromatici în special xileni și fracțiun' de petrol, în special, porțiuni olefinice și naftalenice cu punct dc fierbere ridicat ca, de exemplu, compuși aromatici, cu greutate moleculară mare, cum ar fi nalta. Alți solvenți organici se pot, de asemenea, utiliza, incluzînd derivații de colofoniu, cetone alifatice cum este ciclohexanona și alcooli complecși ca de exemplu 2-etoxietanolul.

Emulgatorii convenabili pentru concentratele emulsifiabile sînt aleși dintre surfaclanții neionici convenționali, ca, de exemplu, cei menționați mai sus.

Suspensiile apoase cuprind suspensiile de compușii insolubili în apă, conform prezentei descrieri de invenție, dispersate într-un vehicul apos, la o concentrație cuprinsă de la aproximativ 5% pînă la aproximativ 50% în greutate. Suspensiile sînt preparate prin măcinarea fină a compusului și amestecarea viguroasă a acestuia într-un vehicul care conține apă și surfactanții aleși dintre aceleași tipuri discutate mai sus. Ingredicnții inciți ca. de exemplu, sărurile anorga nice și sintetice sau gumele naturale, pot fi așadar adăugate pentru creșterea densității și viscozității vehiculului apos. Este preferat, de obicei, să se macine și să se amestece compusul în același timp, cu prepararea amestecului apos și omogenizarea acestuia, într-o moară de nisip, o moară cu bile sau un omogenizator de tip piston.

Compușii pot fi astfel aplicați ca compoziții granulare, care sînt utilizate în special pentru aplicare în sol. Compozițiile granulare conțin de obicei de la aproximativ 0,5% pînă la aproximativ 10% în greutate din compusul respectiv, dispersat într-un vehicul inert care constă în întregime sau într-o niare parte din argilă sau o substanță similară necostisitoare.

Astfel de compoziții sînt utilizate pentru prepararea prin dizolvare a compusului într-un solvent convenabil și aplicarea acestuia, într-un vehicul granular, care a fost preformat, la o mărime a particulelor de la aproximativ 0,5 pînă la 3 mm. Astfel de compoziții pot fi, așadar, formulate prin obținerea unui aluat sau a unei paste din vehicul și compus și apoi măcinarea și uscarea, pentru obținerea mărimii dorite a particulei granulare.

Prafurile care conțin compușii se prepară simplu, prin amestecarea intimă a compusului cu un vehicul sub formă de pulbere, convenabil în agricultură ca, de exemplu, argila caolinică, rocile vulcanice, măcinate și alți compuși asemănători. Prafurile pot conține în mod convenabil de la aproximativ 1% pînă la aproximativ 10% din compusul respectiv.

Este practic să se aplice compusul sub formă de soluție cu un solvent corespunzător, organic, de obicei, o fracțiune petrolieră ușoară ca, de exemplu, uleiurile sub formă dc spray, care se utilizează pe scară largă, în agricultură.

Insecticidele si milicidele sînt. în general, aplicate sub formă dc dispersie for mată din compusul activ și un vehicul lichid. Convențional gradele de aplicare se apreciază în termenii concentrației ingredientului activ în vehicul. Cel mai utilizat vehicul este apa.

Compușii conform prezentei invenții pot fi așadar aplicați, sub formă de compoziție aerosol. In astfel de compoziții, compusul activ este dizolvat sau dispersat într-un vehicul inert, care este un amestec propulsiv, generator de presiune. Compoziția aerosol este ambalată într-un conteiner din care amestecul este dispensat prin valva atomizorului. Amestecurile propulsate cuprind fie hidrocarburi cu punctul de fierbere scăzut care pot fi amestecate cu solvenții organici sau suspensiile apoase presurizate cu gaze inerte sau hidrocarburi gazoase.

Cantitatea de compus care trebuie aplicată la locul de acțiune al insectelor sau căpușelor nu este critică și poate fi, în mod real, determinată, așa cum este menționat în literatura de specialitate, în vederea exemplificării invenției. In general, concentrațiile de la 10 la 5000 ppm din compus se așteaptă a avea un control bun. La mulți dintre compuși, concentrațiile de la .100 la 1000 ppm vor fi suficiente. Pentru culturile de teren ca, de exemplu, soia și bumbacul, un grad de aplicare convenabil pentru compuși este de aproximativ 0,01 pînă la 1 kg/ha, în mod tipic aplicat în 5-50 gal/A din formularea spray.

Locul la care un compus este aplicat poate fi orice foc locuit de insecte sau căpușe, dc exemplu culturile vegetale, fructele și alunele de copaci, vinurile de grape și plantele ornamentale.

Deoarece abilitatea unică a ouălor de căpușe de a rezista la acțiunea substanței toxice, la aplicații repetate poate fi dorită la controlul noilor larve emergente, aceasta sc crede că aparține și altor acaricide cunoscute.

Aciiviiiiiea ecioparuziiicidă:

Compușii A83543 sînt așadar activi împotriva membrilor din ordinul Diptera.

Tabelele 21-22 însumează studiile in vitro privind produsele A83543A și A83543D.

Tabelul 21

Eficacitatea in vitro a compusului A83543A împotriva larvelor musculiței negre

Nivelul de dozare (ppm)	Activitate1
100 '	100
50	100
25	100
10	100
, 5	100
2	100
1	95
0,5	60
0,25	25

Activitatea ¹ reprezintă procente de mortalitate

Tabelul 22

Eficiența in vitro a compusului A83543A împotriva muștei de grajd adultă

Nivelul de dozare (ppm)	Activitate1 la 24 ore	Activitate1 la 48 ore
100	100	100
50	100	100
25	100	100
10	100	90
5	80	100
2	70	90
1	10	60
0,5	0	10

¹ Activitatea reprezintă procente de mortalitate

Tabelul 23

Eficacitatea in vitro a compușilor A83543A și A83543D

ppm	A83543A	A83543D
ASF	LBF	ASF	LBF
24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	48 h
10	80	100	100	100	50	100	100	100
5	50	100	100	100	20	90	90	100
2,5	30	100	100	100	20	100	90	100
1,25	20	100	100	100	10	90	80	-90

Tabelul 23 (continuare)

ppm	A83543A	A83543D
ASF	LBF	ASF	LBF
24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	48 h	24 h	48 h
0,625	0	70	60	90	0	60	50	75
0,312	0	50	25	50	0	0	25	25

¹ Procente de mortalitate a insectelor in 24 și 48 de ore. Expunerea la produse chimice a mostrelor de ser ² ASF = musca de grajd adultă (adult stable fly)

LBF = larvele de musculițe (blow fly larvae) ppm = părți pe milion

Testele in vitro sînt cele în care compușii A83543 arată o activitate insecticidă sistemică la cobai și oi, împotriva larvelor de musculițe și de muște de grajd adulte cu niciun semn clar de toxicitate. 5 Compușii reprezentativi A83543A și A83543D au fost, testați în laborator la animalele menționate pentru determinarea activității. Următoarele teste sini ilustrative.

Testul sistemic, la cobai

Se utilizează cobai adulți în acest sistem de testare. Compușii care se testează se dizolvă în polivinilpirolidonă apoasă sau în polietilenglicol 200 și o cantitate corespunzătoare de soluție este administrată fie oral, fie prin injecție intraperitonală. Se utilizează diferite doze de produs, așa cum se menționează în tabele.

Se scoate sîngele de la cobai la 30 min 20 cu excepția celor notate și probele de sînge sînt centrifugate-Capilarele dentale sînt saturate cu aerul sanguin și apoi sînt expuse pe plăci Petri cu muștele de grajd adulte; larvele de musculițe sîni expuse în 25 tuburile de testat. După 24 și 48 h, insectele sînt examinate și se numără insectele moarte. Rezultatele teslelor sînt prezentate procentual ca număr de insecte moarte.

Testul sistemic, pe oi 30

Testele sînt efectuate pe oi utilizîndu-se metoda de testare pe cobai descrisă anterior. Compusul de testat este administrat prin injectare intraperitoneală, sau intravenoasă sau intraruminală; probele cu sînge se prevalează la 24 h, în aceste teste.

Rezultatele testelor sistemice pe cobai și pe oi utilizînd compușii A83543A și A83543D sînt prezentate în tabelele 24 și 25.

Compusul A83543A nu arată o activitate antihelmintică la oile tratate cu o doză simplă intraperitoneală sau intraruminală de 50 mg/kg greutate corporală sau la șoareci prin experimentare, infectîndu-i cu nematode intestinale Nematospiroides dubi15 us, cînd se administrează oral printr-un simplu gavage la 500 mg/kg.

Testele efectuate in vitro împotriva nematodei intestinale la oi Haemonchus contortus, utilizîndu-se compusul A83543A duc la un procent de 30% viermi morți la o concentrație de 100 ppm.

Procecdee ectoparaziticide

Această invenție se referă la un procedeu de control al populației insectelor ectoparazite care consumă sînge de la animalul gazdă, care constă în administrarea la animalul gazdă a unei cantități efective din compusul A83543. Insectele ectoparazite includ insecte și paraziți acarinici. Administrarea la animal poate li efectuată pe cale dermală, orală sau parcntcrală.

Insectele parazite și acarinice includ specii care sug sîngele și mănîncă carne și sînt parazitare în tot timpul ciclului lor de viață, sau numai într-o parte din ciclul lor de viață, fie în stadiu de larvă, fie în stadiul de adult. Speciile reprezentative includ următoarele specii:

Musca de cal - horse fly - Tabanus species

Musca de grajd - stable fly - Stomoxis calcitrans

Musca neagră - black fly - Simulium species

Păduchele de cal - horse sucking louse Haematopinus asini

Căpușa sau insecta dc scabie - mange miteSarcoptes scabiei

Insecta de scabie - scab mite - Psoroptes equi

Musca dc corn - horn fly - Haematobia irritans

Păduchele de vite - cattle biting louse Bovicola bovis

Păduchele de vite cu botul scurt - short10 nosed cattle louse - Haematopinus eurysternus

Păduchele vitelor cu botul lung - longnosed cattle louse tsetse fly - Linognathus vituli

Tabelul 24

Activitatea insecticidă - in vivo - a compusului A83543A

Testul sistemic la cobai	Testul sistemic la oi
mg/kg	LBF	ASF	Tox	mg/kg	LBF	ASF	Tox
10 (IP)	0	0	N	10 (IP)	0	0	0
20 (IP)	0	0	N	10 (IR)	0	0	N
30 (IP)	90	50	N	30 (IP)	80	0	N
50 (IP)	100	100	N	30 (IR)	100	30	N
50 (OR)	100	60*	N	50 (IP)	20	30	N
				50 (IR)	100	70	N
				2 x 25 (IR)	100	90	N
				1,0 (IV)	25	10	N

' Activitate măsurată ca mortalitate %

ASF = musca de grajd adultă (adult stable fly) LBF = larvele de musculiță (blow fly larvae) Tox = toxicitatea la animalul gazdă (N = netoxice)

IP = intraperitoneal IR = intraruminal IV = intravenos OR = oral

Tabelul 25

Activitatea sistemică insecticidă la cobai cu produsele A83543A și A83543D

Doza (mg/kg)	Calea	Timp de sîngerare	A83543A Activitate %	A83543D Activitate %
LBF	ASF	LBF	ASF
10	IP	30 min	0	0	0	0
		5 h	0	0	0	0
		24 h	0	0	0	10
20	IP	30 min	0	0
		5 h	0	0

⁶⁶

Tabelul 25 (continuare)

Doza (mg/kg)	Calea	Timp de sîngerare	A83543A Activitate %	A83543D Activitate %
LBF	ASF	LBF	ASF
		24 h	, 0	0
30	IP	30 min	90	50	0	0
		5 h	50	0	0	0
		24 h	30	0	0	0
50	IP	30 min	100	100	75	0
		5 h	95	40	0	0
		24 h	25	30	25	0
50	Oral	5 h	100	60
		24 h	0	0

*LBF = larve de musculije - blow fly larvae ASF = musca de grajd adultă - adult stable fly IP = intraperitoneal

Tabelul. 26

Teste insecticide cu A83543A la sînge infectat cu Haemonchus contortus

-h, in vitro

Tratament15	Inițial (kg)	Procente de mortalitate'
Ziua 0	35 min	5 h	Ziua 1	Ziua 2	Ziua 3	Ziua 4	Ziua 5
L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A
50x1 (IP)	38,6	0	0	0	0	10	0	10	0	20	10	20	0	10	10	10	0
50x1 (IR)	31,8	0	0	0	10	40	10	90	0	90	20	80	0	40	0	20	0
25x2 (IR)	34,1	0	0	0	20	25	10	100	10	90	20	90	0	60	0	50	0
lxl (IV)	25,9	0	0	25	10	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Vehicule	44,5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Control
Netratat	30,9	0	0	0	0	0	0	0	0	0	10	0	0	0	0	0	0
50x1 (IP)	38,6	0	0	0	0	10	0	10	0	20	10	20	0	10	10	10	0
50xL (IR)	31,8	0	0	0	10	40	10	90	0	90	20	80	0	40	0	20	0
25x2 (IR)	34.1	0	0	0	20	25	10	100	10	90	20	90	0	60	0	50	0
lxl (IV)	25,9	0	0	25	10	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Vehicule	44,5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Control
Netratat	30,9	0	0	0	0	0	0	0	0	0	10	0	0	0	0	0	0

‘1. = larvă

A = adult

IP = intraperitoneal ]R = intruruminal

IV = intravenos ^H (mg/kg) doze administrate ^c Timpul după administrare

6Χ

Tabelul 27

Teste insecticide în sîngele de oaie intoxicat cu Haemonchus contortits li - in vitro - expunere insecte în probele de ser -

Tratament6	Inițial (kg)	Procent de mortalitate	a insecticide
Ziua 0	35 min	5 h	Ziua 1	Zii	a 2	Ziua 3	Ziua 4	Ziua 5
L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A	L	A
50x1 (IP)	38,6	0	20	10	0	10	10	10	0	20	30	20	10	20	20	25	0
50x1 (IR)	31,8	0	0	0	10	75	30	100	60	100	70	100	20	40	20	25	0
25x2 (IR)	34,1	0	10	0	30	50	10	100	90	100	90	100	70	90	30	75	30
lxl (IV)	25,9	0	0	25	10	10	20	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Vehicule	44,5	0	10	0	0	0	20	0	10	0	0	0	20	0	0	0	0
Control Netratat	30,9	0	40	0	0	0	0	0	0	0	10	0	0	0	0	0	0

‘L = larve de musculiță

A = musca de grajd adultă 1P = intraperitoneal

IR = intraruminal

IV = intravenos ^b Cantitatea ca număr de doze administrate in timp ‘ Timpii de post administrare Ia care este extras sîngele

Musca țețe - tsetse fly - Glossina species Căpușa vitelor - Cattle follicle mite Demodex bovis

Căpușă vitelor - Cattle tick - Boopliilus microplus și Boopliilus decoloratus

Căpușa de volbură de coastă - gulf Coast tick - Amblyomma maculatum

Căpușa Lone Star. - Amblyomma americanum

Căpușă dc ureche - ear tick - Otobius megnini

Căpușă de lemn de rocă montană Rocky Mountain wood tick - Dermacentor andersoni

Musca de vierme spirlat - screwworm fly - Cochliomyia hominivorax

Ploșnița asasin - assassin bug - Reduvius species

Țânțarul - mosquito - Culiseta inornata Căpușa de ureche, brună -brown ear tick - Rhipicephalus evertsi

Căpușă rotundă - bonl tick - Amblyomma species

Căpușa rotundă cu picioare - bont-lcgged tick - Hyalomma species

Păduchele porcului - hong lousc - Haematopinus suis

Purecele de nisip - chigoe - Tungs penetrans

Păduchele dc corp - body louse - Haemato5 pinus ovillus

Păduchele cu picioare - foot louse - Linognathus pedalis

Insecta de oaie - sheep ked - Melophagus ovinus

Căpușa oii - sheep acab mite - Psoroptes ovis

Musca verde de borcan - greenbottle fly Phaenicia sericata

Musculița neagră - blck blow fly 15 Phormia regina

Viermele cu coajă, secundar - secondary screew-worm - Cochliomyia macellaria Musculița dc oaie - sheep blow fly - Phaenicia caprina

Ploșnița de pat - bed-bug - Cimex lectularius

Puricelc păsărilor sudice - Southern chiekcn Oca - Echidnophaga gallinacea Păduchele păsărilor dc curte lowl lick 25 Argas persicus

Căpușa păsărilor dc curte - chiekcn mite 106065 «9

- Dermanyssus gallinae

Căpușa cu solzi - scalyleg mite - Knemidokuptes mutans

Căpușa găinii - depluming mite - Knemidokoptes gallinae

Căpușa de cîine - dog follicle mite Demodex caniș

Puricele de cîine - dog flea - Ctenocephalis caniș

Păduchele cîinelui american - American dog tick - Dermacentor variabilis

Păduchele brun de cîine - brown dog tick

- Rhipicephalus sanguineus

Procedeul conform prezentei invenții poate fi utilizat, pentru protecția economică a animalelor însoțitoare, de ectoparaziți. De exemplu, compușii pot beneficia de administrare la cai, vite, oi, porci, capre, cîini, pisici și alte animale asemănătoare, ca și pentru protecția animalelor exotice ca, de exemplu, cămila, lama, căprioara și alte specii de animale sălbatice. Compușii pot fi, așadar, administrați la păsări de curte ca, de exemplu, curcani, găini, rațe și alte păsări asemănătoare. De preferință, procedeul este aplicat la animale, economic, ca de exemplu la vite și oi.

Gradul de aplicare, distribuția și modul de aplicare efectiv sînt foarte variabile, dependent de identitatea parazită, gradul de atac parazicid și alți factori. Aplicațiile pot fi făcute periodic, pe întreaga perioadă de viață a gazdei sau numai în sezo-_i nul de vîrf al atacului paraziticid. în general, controlul ectoparaziților este obținut cu aplicarea topică a formulelor de lichide, care conțin de la aproximativ 0,00005 pînă la 95% din compusul de testat, de preferință peste 5% și mult mai preferabil poate aproximativ 1% din compus. Controlul efectiv al paraziților este obținut la o administrare care conține un coeficient dc la aproximativ 5 pînă la aproximativ 100 ntg/kg.

Compușii sînt aplicați la animelelc gaz dă, prin practici convenționale veterinare. In mod obișnuit, compușii sînt formulați ca compoziții ectoparaziticide, care cuprind compusul și un vehicul acceptabil din punct de vedere fiziologic. De exemplu, compozițiile de lichid pot fi pulverizate, în mod simplu, pe animalele pentru care se dorește a se efectua controlul paraziticid. Animalele pot fi așadar tratate ele însele cu ajutorul unor dispozitive ca, de exemplu, dispozitive de cauciuc care pot conține compusul toxic într-un material textil, de exemplu cu care animalul poate veni în contact în timpul deplasării. Se utilizează vase cu soluții deparazitare, pentru administrarea compusului activ la animalul gazdă.

Compușii conform prezentei descrieri de invenție arată o activitate ectoparaziticidă sistemică. Compușii au abilitatea de a pătrunde în țesuturile animalului gazdă la care unul din acești compuși este administrat. Insectele parazite care consumă sînge sau alte țesuturi vii din animalul gazdă sînt astfel omorîte. Compușii sînt administrați pe cale dermală, orală sau percutantă.

Prezenta descriere de invenție se referă, așadar, la compozițiile ectoparaziticide, care conțin un vehicul inert acceptabil din punct de vedere fiziologic și compusul A83543. Aceste compoziții pot fi preparate prin metode cunoscute în literatura de specialitate, de exemplu prin dizolvarea compusului într-unul din mai mulți adjuvanți acceptabili din punct de vedere fiziologic, inerți sau în diluanti. Administrarea orală poate fi realizată prin amestecarea compusului în hrana sau apa de băut a animalelor sau prin administrarea formelor de dozare ca de exemplu tablete, capsule, boluri, sau împlânte. Administrarea percutantă este convenabilă și se realizează prin injecții subcutanate, intraperitoncalc și intravenoase aceste injecții fiind obținute cu formule ijectabi le.

Compușii pot fi formulați pentru administrare egală în forme obișnuite ca, de exemplu, paste, tablete, sau capsule. Astfel de compoziții pot fi, așadar, formulate sub forma de soluție injectabilă sau suspensie pentru injecții subcutanate, dermalc, intraruminale, intraperitonealc, intramuscularc sau intravenoasc. In unele aplicații, compușii sînt în mod convenabil formulați ca un component al hranei standard pentru animale. In acest fel, este uzual să se formuleze compusul prezent mai întîi sub formă de premix care cuprinde compusul sub formă dispersată într-un lichid sau o substanță acidă macroparticulă cu rol de vehicul. Premixurilc pot conține de la aproximativ 2 pînă la 250 grame din compus per pound. Premixul este la rîndul lui formulat ca produs finit prin amestecare convențională.

Deoarece atacul ectoparazitic general are loc în timpul cît durează perioada de viață a unei porțiuni substanțiale din animalul gazdă, este de preferat să se administreze compușii conform prezentei descrieri de invenție, într-o astfel de formă, ca să se obțină o eliberare susținută într-o anumită perioadă de timp. Procedeele convenționale includ utilizarea unei matrițe care, din punct de vedere fizic, inhibă dizolvarea, atunci cînd matrița este ceară semisolidă ca de exemplu cerurile vegetale sau polietilen-glicolul care are o greutate moleculară ridicată. O cale bună de administrare a compușilor este cu ajutorul bolusului cu acțiune susținută, așa cum este menționat în Laby, Patent american nr. 4.251.506 și Simpson, British Patent nr. 2.059.767. Pentru acest bolus, compusul va fi încapsulat într-o matrice polimcrică așa cum este menționat în Ncvin, Patent american nr. 4.273.920. Eliberarea susținută a compușilor conform prezentei descrieri de invenție poate fi așadar obținută prin utilizarea unui implant ca. de exemplu, cauciuc care conține silicon.

In vederea ilustrării mai complete a operației conform prezentei descrieri de invenție, sînt prezentate următoarele exemple:

Exemplul I. Metodă de analiză a compusului A83543 prin cromatografie lichidă de înaltă performanță.

Metoda analitică de cromatografie lichidă, de înltă performanță, este utilizată pentru monitorizarea fermentației de producere a compusului A83543:

Se centrifughează o probă care conține întreaga cantitate de mediu de cultură după care se decantează și se separă supernatantul. Se adaugă metanol la biomasă în cantitate suficientă pentru a readuce proba la volumul original, după care se amestecă și se lasă amestecul să rămînă cel puțin 15 minute în repaos. Se centrifughează și se filtrează supernaiantul printr-un filtru de 0,45 μ.

Alternativ, cantitatea totală de terci se poate extrage cu acetonitril (1:4 tercirsolvent) sau cu acetonă.

Sistemul de cromatografie lichidă de Înaltă performanță:

Coloana suport: 8-X 100-mm, silicagel -4 μ sferic C_1S (Nova C18m ape).

Faza mobilă: CH₃CN/MeOh/H_;O (45/ /45/10) care conține acetat de amoniu 0,05%.

Coeficientul debitului: 4 ml/min Detecție: UV la 250 nm

Timpi de retenție: A83543A- 3,6-3,7 min și A83543D- 4,4-4,5 min.

Exemplul 2. Prepararea lui A83543 cu cultura A83543, l

Λ. Fermentarea prin agitare în flacon

Cultura de Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, ca pelete liofilizate sau ca suspensie care se menține în azot lichid, se utilizează pentru inocularea mediului vegetativ avînd compoziția A sau B (mediul B este preferat pentru producție pe scară largă):

Mediul vegetativ A

Ingredient Procent (%)

Pastă de tripticase soia3,0

Extract de drojdie0,3

MgSO₄-7H₂O0,2

Glucoza0,5

Maltoză0,4

Apă deionizată pînă la 1 I

Nu se face nici o ajustare de pH.

’Pasta de tripticase soia este produsă de Laboratoarele Biologice Baltimore

Mediul vegetativ B

Ingredient Procent (%) ‘

Caseină hidrolizată3,0

Extract de drojdie0,3

MgSO₄-7H₂O0,2

Glucoza1,0

Apă deionizată pînă la 1 1 /;H-ul este 6,2 ajustat la 6,5 cu NaOH Caseina hidrolizată NZ amina A este produs de Sheffield' Products, P.O.Box 638 Norwich, NY 13815.

Culturi pe discuri sau tăvi pot fi preparate prin adăugarea a 2,5% agar la mediul vegetativ însămînțat A sau B. Culturile inoculate sînt incubate la temperatura de 30°C de la aproximativ 10 pînă la aproximativ 14 zile. Cultura maximă cu mediul de cultură este răzuită cu un instrument steril pentru îndepărtarea sporilor care se separă și masa miceliană se macerează. Aproximativ o pătrime din sporii îndepărtați din cultura astfel obținută se utilizează pentru inocularea 50 ml din mediu însămînțat din primul stadiu vegetativ. în mod alternativ, mediul din primul stadiu poate fi inoculat dintr-o fiolă conținînd azot lichid.

Cînd cultura este menținută în azot lichid, fiolele sînt preparate utilizîndu-se volume egale de cultură vegetativă (incubarc timp de 48 ... 72 h, la temperatura de 30^eC) și mediu de suspendare. Mediul de suspendare conține lactoză 100 g, gliccrol 200 ml si apa deionizată pînă la 1 litru.

O fiola care conține azot lichid este utilizată pentru inocularea a 100 ml de mediu vegetativ în flaconae de tip Erlenmeyer (sau cîte 50 ml de mediu în flacoane de 250 mililitri capacitate). Cultura este incubată la temperatura de 30°C timp de 48 de ore într-un vas menținut sub agitare circulară de 2 inchi (5,08 centimetri) avînd 250 rpm.

Cultura incubată (inoculare 5% vol./vol.) este utilizată pentru inocularea a 100 ml din mediul de producție care are următoarea compoziție:

Mediul de producție 1

Ingredient Procent (%)

Glucoză4

Proteină vegetală parțial hidrolizată* 1,5-3 Făină din semințe de bumbac*’1,0

CaCO₃ (reactiv sau grad tehnic)0,3

Ulei de soia1,0

Apă pînă la 1 I (//H-uI de presterilizare este ajustat la 7,0 cu NaOH) ‘Proteina vegetală este fabricată de Sheftone H.Sheffield Products, iar făina de semințe de bumbac este fabricată de **Proflo, Traders Protein, P.O.Box 8407, Memphis, TN 38108

Mediul dc producție inoculat este incubat în flacoane de tip Erlenmeyer de 500 ml capacitate, la temperatura de 28-30°C, timp de pînă la 8 zile, într-un vas cu agitare circulară de doi inchi, la 250 rpm.

B. Fermentarea în bioreactor, sub agitare:

în vederea obținerii unui volum mai mare de inocul se utilizează 10 mi de mediu inocubat în prima fază, preparat așa cum s-a descris în Secțiunea A, pentru a inocula 400 ml de mediu din faza a doua, avînd aceeași compoziție ca și cea a mediului vegetativ din prima fază. Acest mediu din faza a doua este incubat într-un vas tip Erlenmeyer, cu gură largă, de 2 l capacitate, timp de 48 h, la temperatura de 3()°C. sub agitare circulară dc doi inchi, la 250 rpm.

Mediul vegetativ incubat în faza a doua, 2 I, astfel preparat, este utilizat pentru inocularea a 80 pînă la 115 1 de mediu de producție steril, preparat așa cum s-a descris în Secțiunea A, Uleiul de 5 soia adițional se adaugă dacă este necesar pentru controlul spumării. Mediul de producție inoculat este lăsat să fermenteze într-un bioreactor menținut sub agitare dc 165 1 timp dc 5 pînă la 8 zile, la 10 o temperatură de 28°C. Viteza agitatorului și a curentului de aer în vasul menținut sub agitare sînt controlate cu ajutorul computerului, pentru menținerea unui nivel al oxigenului dizolvat la sau la 15 aproximativ 50% de saturare cu aer.

Exemplul 3. Izolarea compușilor A83543A, B, C fi D

Terciul dc fermentare, 225 1, preparat așa cum s-a descris, este filtrat, utilizîndu- 20 sem o glugă dc filtrare (1% Hyflo) și biomasa separată este spălată cu (- 50 I) de apă. Biomasa este apoi agitată cu (- 100 I) dc metanol, timp dc aproximativ o oră și apoi se filtrează. 25

Filtratul dc metanol este concentrat Ia un volum de aproximativ 1 I. Concentratul este extras apoi de trei ori cu cîte 1 I de dietil-eter. Extractele eterice combinate sînt concentrate apoi la un volum de 30 aproximativ 200 ml.

O porțiune dc (8 ml) de concentrat este cromalografiatâ pe o coloană dc silicagel (RP-8 Lobar, size B..E.M.Science, a Division of E.M.Industries, Inc.). 35

Acest procedeu este repetat în total de 12 ori (cicluri). Instrumentele utilizate și procedeu] dc execuție pentru realizarea cromatografiei preparative într-un mod de autoprcpararc sînt descrise după cum 40 urmează:

Un sistem complet dc cromatografie lichidă de înaltă performanță dc autoprcpararc este compus din trei pompe Rainin Rabbit HPX. un modul dc presiu- 45 ne. un colector fracționat dc cromatogra fie lichidă de înaltă performanță de tip Gilson 20 1 B, un detector de obsorbanțâ ISCO-V4 și un computer Apple Mecintosh Plus. Sistemul complet este aranjat conform instrucțiunilor dale dc manualul Dynamax HPLC Method Manage de la Rainin Instrument Company, Inc. Configurația de cromatografie lichidă de înaltă performanță de autopreparare prezintă avantajul unui sistem automat pentru a permite separările preparative care se efectuează repetitiv în condiții identice virtuale cu rezultate identice virtuale. Fracțiunile corespunzătoare de colectare și adunare de la procedee multiple determină o capacitate cromatografică fără ajutorul unei coloane mari.

Amestecurile de solvenți (A) și (B) sînt utilizate într-un mod izocratic avînd un coeficient de debit de 8,0 ml/min.

Sistemele de solveați

Cantitatea fml)

Solventul______________AB

CH₃OH 95100

CHjCN 95100

H_;O10

Amestecul izocratic utilizat conține 60% din solventul B.

Durata de timp, pentru fiecare ciclu, este de 28 min. Amestecurile de eluare, după fiecare perioadă de primele 16 min ale fiecărui ciclu sînt îndepărtate din vasul de reacție. Amestecurile de elulare, care urmează, sînt colectate în fracțiuni de 6 timpi a cîte 2 min (16 ml) fiecare.

Fracțiunile combinate automat, din fiecare serie de cicluri, rezultă ca 6 fracțiuni finale (porțiuni cromatografice).

Prezența compușilor activi A83543 este determinată prin analizarea fiecărei fracțiuni finale pentru activitatea larvelor de țînțar și prin cromatografie lichidă de înaltă performanță.

Fracțiunile active sînt apoi combinate conform activității lor și profilurilor dc cromatografie lichidă dc înaltă performanță și sînt purificate în continuare, utilizîn106065 du-sc aceeași cromatografie lichidă de înaltă performanță de autopreparare și același sistem de solvenți, dar cu o rezolvare superioară, utilizîndu-se o coloană preparativă de 21,4 mm x 25 cm (Rainin Dyna max), preambalată cu silicagel în fază reversă 8 μ C-18, pentru a se obține compușii A83543A, A83543B, A83543C și A83543D. Factorii A și D cristalizează dintr-un amestec CH₃OH/H₂O.

FD-MS pentru A83543C este prezentat în figura 5; și FAB-MS pentru A83543B este prezentat în figura 9.

Exemplul 4. Purificarea compușilor A83543A și A83543D

Un volum de 10 1 de terci de fermentare este preparat, așa cum s-a descris în secțiunea A, cu excepția faptului că, 1) 200 ml din mediul de producție se utilizează în flacoane de 1 1. 2) uleiul de soia este omis din mediul de producție și 3) incubarea are loc la temperatura de 30°C, timp de 4 pînă la 6 zile. Terciul este filtrat. Filtratul care conține 4 mg de A83543A/ml și cantități nedetectabile de A835432B, A83543C sau A83543D, se îndepărtează.

Biomasa se spală cu apă și se extrage, timp de o oră, cu metanol. 7 1 de extract conțin 72 meg de A83543A/mI și 7 meg de A83543D/ml.

Extractul de metanol este concentrat la un volum de 5 1 și apoi se adaugă la 150 ml de rășină HP-20 preparată de Mitsubischi Chemical Industries, Ltd.Japan, în 2 1 de apă. Acest amestec este agitat timp de o oră.

Amestecul de rășină HP-20 este apoi adus într-o coloană de sticlă. Efluentul inițial și eluatui care este format din părți egale de metanol' și apă (1:1) nu sînt activi. Al doilea eluat, 1 I dc amestec metanol și apă (7:3) conține urme de cantități de A83543A. Următorul eluat care utilizează 1 I dc metanol, conține activitate A83543A și A83543D.

Eluatui mctanolic este concentrat și combinat cu două fracțiuni similare din alte porțiuni și concentrat la sicitate. Reziduul este dizolvat în 75 ml dc amestec metanol: tctrahidrol’uran (4:1) și precipitat, prin adiție în 10 volume de acetonitril. Amestecul este filtrat și filtratul este concentrat la sec.

Reziduul este dizolvat în 25 ml de meta- noi și aplicat ia o coloană de 5,5 - x 90 cm de Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB Biotechnology USA) preparat în metanol, după care se colectează și se analizează 125 fracțiuni de cîte 25 ml utilizîndu-se procedeul cromatografie lichidă de înaltă performanță descris.

Fracțiunile care conțin compușii doriți sînt combinate și concentrate. Reziduul este dizolvat în 10 ml de metanol și aplicat pe o coloană preparativă de 4,1 mm x 25 cm preambalată cu silicagel, în fază reversă C-18 8 μ (Rainin Dynamax).

Coloana este condiționată în metanol, utilizîndu-se un amestec din 37,5 părți de acetonitril, 37,5 părți metanol și 25 părți apă. După aplicarea probei, coloana este developată utilizîndu-se un gradient linear de 180-min al următorilor solvenți:

Sistemul de solvenți

Cantitatea (ml)

Solventul	A	B
CH3OH	37,5	45
CH3CN	37,5	45
H2O	25	10
Gradientul se	desfășoară de la	100% A

pînă la 100% B, colectînd fracțiunile de 25 ml.

Fracțiunile care conțin A83543A sînt adunate, concentrate la scc, dizolvate în 5 ml de t-BuOH și liofilizate pentru a se obține 778 mg dc A83543A.

Spectrul în infraroșu al A83543A în cloroform este arătat în fig. 1. Spectrul FD-MS al A83543A este arătat în figura 4; spectrul FAB-MS al A83543 A este arătat în fig. 8 (FAB-ditio) critriol dispersanl;

ditiocritritoi (5:1) și spectrul El-MS al A83543A este arătat in fig. 10.

Fracțiunile care conțin A83543D sînt combinate cu fracțiunile care conțin compusul D, din șase separări similare și sînt concentrate și cromatografiate așa cum s-a descris, utilizîndu-se aceeași coloană,' dar solvenți diferiți. Coloana este condiționată într-un amestec format din 40 părți metanol, 40 părți acetonitril și 20 părți apă. Sistemele dc solvenți utilizate pentru developarea coloanei într-o operație gradient linear de 180 min, sînt următoarele:

Sistemele de solvenți

Cantitatea (ml)

Solvent	A	B
CHjOH	40	95
CH-CN'	40	95
H-.0	20	10

Fracțiunile care conțin A83543D sînt combinate și concentrate. Reziduul este dizolvat în 5 ml de t-BuOH și liofilizat, pentru a se obține 212 mg dc A83543D.

Spectrul de infraroșu al A83543D în cloroform este arătat în fig.2 și spectrul FD-MS al A83543D este arătat în tig.6.

Exemplul 5. Izolarea componentelor A 83543E, F, G, H și J și Pseudoaglicona componentei A

S 1 de iiicdiu de fermentație preparat, utilizîndu-sc procedee similare cu cele descrise se tratează așa cum s-a descris. Fracțiunile de pc coloana de Scphadex LH-20, care conțin compușii doriți sînt combinate cu fracțiunile corespunzătoare de la fermentațiile similare. Deoarece componentele E,F,G,H.J și pseudoagliconelc componentei A sînt produse în cantități foarte mici, sînt necesare numeroase fermentații pentru a sc obține cantități suficiente pentru o purificare ulterioară.

O sumă de factori minori, preparați în acest Ici și care conține aproximativ 1,6 dc material solid, sc aplică pc o coloană dc cromatogral’ie lichidă dc înaltă performanță iRainin Dvna max) prcambalată cu

Sil silicagel în fază reversă 8 μ C-18 (ODS), așa cum s-a descris. Coloana este condiționată într-un amestec format din 75 părți alcool metilic 75 părți cianură dc metil și 50 părți apă și gradientul se desfășoară de la 100% solvent (A) pînă la 50% solvent (B), cu următoarele sisteme de solvenți: Sistemele de solvenți

Cantitatea (%)

Solvent AB

CH,OH	75	95
CH,CN	75	95
H:O	50	10

colectîndu-se fracțiuni de 25 ml. Se înregistrează următoarele fracțiuni:

înreu. Fracțiuni

131-44

245-63

364-69

470-80

81-130

131-160

O porținue dc 100 ml conținînd fracțiunea cinci, sc concentrează pînă la reziduu, sc dizolvă într-un milimetru de metanol și se aplică pe o coloană de cromatografie lichidă, de înaltă performanță de 21,4 mm x 250 mm (Rainin Dynamax), așa cum s-a descris în exemplul 3. Coloana este condiționată utilizîndu-se un sistem de solvenți (A) din următorul sistem de solvenți:

Sistemele de solvenți

Cantitatea (%)

Solventul	A	B
CH3OH	30	95
CH,CN	30	95
H2O(1N NH40AC, pH 5,0)	40	-
H2O	-	10

și se dezvoltă utilizîndu-se un gradient linear de 120 minute de la 100% solvent (A) pînă la 50% solvent (B), colectînd fracțiuni dc 15 ml cîlc 7.5 ml/min. Eluarea este continuată la 50% (B) pentru un timp adițional dc 60 min. Următoarele fracțiuni sînt înregistrate:

8’

Numărul Fracțiunea Componentul

37 F

38-48

B, G H, J

52-63

65-70 fracțiuni' sînt combinate cu cele analize cromatografice Cantitatea

249

104

288

Aceste obținute din alte

Componentul

E

F

G

H,J

Pseudo A * prin spectrometrie de.masă ” Disc KBr

FD-MS și EI-NÎS spectrometria pseudoagliconei A83543A este arătată în fig. 7 și respectiv în fig.l 1.

Exemplul 6. Prepararea A83543 cu cultura A83543A

Fermentarea în flacoane sub agitare

Se utilizează procedeele din secțiunea A. Cultura Saccharopolyspora spinosa NRRL 18337 este cultivată în flacoane sub agitare, dar _se utilizează mediul vegetativ C după cum urmează:

Mediul vegetativ C

Ingredient Cantitatea ,» — ' ' “

Caseină hidrolizată enzimatic 30,0 g

Extract de drojdie 3,0 g

MgSO₄-7H₂O 0,2 g

Glucoza 10,0 g

Glicerol 20 ml

Apă deionizată pînă la 1 litru de soluție Se ajustează pH₇ul 6,6 la valoarea 7,0 cu hidroxid de sodiu * reprezintă NZ amină A

B. Fermentarea în bioreactor sub agitare

Fiolele cu azot lichid și cultură sînt preparate așa cum s-a descris în exemplul 2 utilizîndu-se procedeele generale din secțiunea B.O. fiola este utilizată pentru, inocularea culturii vegetative în'primul stadiu (50 ml de mediu C în flacoane de 250 ml), care este incubată timp aproxiutilizîndu-se materiale de start similare. Fracțiunile combinate sînt apoi purificate utilizîndu-se o cromatografie pe coloană așa cum s-a descris mai sus; urmează de5 salinizarea pe rășini HP-20, utilizîndu-se tehnici standard, concentrarea și liofilizarea pentru a se obține următoarele componente:

Greutatea moleculară*	IR”
717	Fig. 13
717	Fig. 14
731	Fig. 15
717	Fig. 16
590	Fig. 3

mativ 48-72 ore. Cultura incubată în primul stadiu este utilizată pentru inocularea (10 ml de inocul) unei culturi în faza a doua (400 ml de mediu C în flacoane de 2 1), care este incubată timp de 48 de ore. Cinci litri din cultura incubată faza a doua se utilizează pentru inocularea a 115 litri de mediu de producție avînd următoarea compoziție:

Mediul de producție II Ingredient Cantitatea (g/L)

Glucoza80

Lapte peptonizat* *20

Făină din semințe de bumbac*' 20 CaCOj5

Oleat de metil 30 ml/1

Apă pînă la 1 litru de soluție.

In această formulă * reprezintă lapte nutritiv peptonizat, Sheffield Products; hrană adițională continuă, care începe în cea de-a patra zi, fiind utilizată în doză de

5 mg/ml/zi

Reprezintă Proflo (pH de presterilizare ajustat la valoarea 7,0 cu hidroxid de sodiu).

Mediul de producție inoculat este lăsat să fermenteze într-un bioreactor sub agitare, de 165 litri, timp de aproximativ 8 pînă la 10 zile sau mai mult, la o temperatură de 30°C. Nivelele dc oxigen dizolvat prin

Χ3 sisteme de computerizare sînt prevăzute pentru menținerea unui nivel de oxigen dizolvat de aproximativ 50% dc aer saturat, așa cum s-a descris Γη secțiunea B.

Exemplul 7. Prepararea componentei A83543 cm cultura A83543,5

A. Fermentarea în flacoane sub agitar,e

Se utilizează procedeele generale din secțiunea A, cultura de Saccharopolyspora spinosa NRRL 18339 se cultivă în flacoane sub agitare, utilizîndu-se mediul vegetativ B.

B. Fermentarea în bioreactor sub agitare

Cultura în fiole cu azot lichid se prepară, așa cum s-a descris utilizîndu-se procedeele generale din secțiunea B. O fiolă este utilizată pentru inocularea culturii vegetative în’prima fază 50 ml de mediu B în flacoane de 250 ml), care se incubează timp de 48 pînă la 72 ore. Incubarea culturii în faza întîi este utilizată pentru inocularea (10 ml de inocul) culturii în faza a doua (400 ml de mediu B în flacoane de doi litri), care este inoculată timp de aproximativ 48 ore. Se utilizează 2 1 de cultură incubată în faza întîi, pentru inocularea a 115 litri din mediul de producție avînd următoarea compoziție: Mediul de producție III

Ingredient Cantitatea (g/1)

Glucoză80

Proteină vegetală, parțial hidrolizată enzimatic*20

Făină din semințe de bumbac’ 10 CaCO₃5

Oleat de metil 30 ml/l

Apă pînă la 1 litru de soluție reprezintă Sheftonc H și reprezintă Proflo (pH-ui de presterilizarc este ajustat la valoarea 7,0 cu hidroxid dc amoniu).

Mediul de producție IV

Ingredient Cantitatea (Procent)

Glucoză8·

Făină din semințe dc bumbac3

Lapte peptonizat”2

X4

Lichid din tulpini de cereale1

CaCO₃ (grad tehnic)0,5

Oleat de metil3,0

Apă pînă la 1 litru soluție

Reprezintă Proflo

Reprezintă lapte nutritiv peptonizat (pH-ul de presterilizare este ajustat la 7,0 cu hidroxid de sodiu)

Mediul de producție inoculat este lăsat să fermenteze într-un bioreactor de 165 litri menținut sub agitare timp de aproximativ 8 pînă la 10 zile sau mai mult, la o temperatură de 30°C. Nivelele de oxigen sînt reglate așa cum s-a descris în exemplul 6.

Exemplul 8. Prepararea componentei A83543 cu cultura A83543,4

Se utilizează procedee asemănătoare cu cele prezentate în exemplele 2 și 7, dar cultura Saccharropolyspora spinosa NRRL 18538 este cultivată prin utilizarea mediului vegetativ B și a mediului de producție

III.

Exemplul 9. Terciul de fermentare este preparat așa cum s-a descris mai sus în exemplul 8. Componenta A83543 este separată din acest terci, după cum urmează:

1. Se adaugă un volum egal de acetonă, la acest terci de fermentație și se filtrează, utilizîndu-se un filtru de ceramică sau un filtru textil cu o presă filtru.

2. Se ajustează ^H-ul terciului de filtrare la valoarea pH 10.

3. Se adaugă acetat de etil (1/4 pînă la 1/2 din volumul terciului).

4. Se îndepărtează extractul de acetat de etil prin decantarea porțiunii nemiscibile cu apa și se concentrează extractul de acetat dc etil la o jumătate din volum, prin vacuum.

5. Se extrage soluția concentrată de acetat de etil cu o jumătate volum acid tartaric 0,1 M și se separă fazele.

6. Sc îndepărtează acetalul dc etil solubil din faza apoasă prin evaporare în vacuum (aproximativ 5%). Sc concentrează soluția apoasă utilizîndu-se operația de osmoză inversă.

7. Se ajustează soluția apoasă concentrată la pH-10-11, cu hidroxid de sodiu.

8. Se separă precipitatul prin filtrare, se 5 spală cu apă și se usucă în vacuum pentru a se obține componenta A83543.

Exemplul 10· Pseudoaglycona A83543A

O probă de A83543 care conține în majoritate componenta A (circa 100 mg) 10 se dizolvă în 50 ml de metanol, în 2 ml de apă și în 3 mi de HCI concentrat. Această soluție este concentrată la sec la temperatura de 50°C. Reziduul este tratat de două ori cu cîte 200 ml de eterdietilic 15 și materialul insolubil este îndepărtat. Soluțiile eterice combinate conținînd pseudoaglicona brută, sînt concentrate la sec. Reziduul este dizolvat în 20 ml de metanol și purificat, utilizîndu-se un 20 sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță - Autopreparare HLPC - așa cum s-a descris în exemplul 3, pentru a se obține 20 mg de pseudoaglicona A83543A, pură. 25

Exemplul 11. Pseudoaglicona A83543D este preparată din componenta A83543D, utilizîndu-se un procedeu similar cu cel descris mai sus.

Exemplul 12. Următoarele formule, 30 reprezintă compoziții insecticide tipice utilizate conform prezentei descrieri de invenție.

A. Suspensie apoasă

Componenta A83543A	12,5%
Tergitol TMN-6
(surfactantul neionic)	1,0%
Zeosyl 200 (silice.	1,0%
Silicon bazat pe agent antispumant
AF-100	0,2%
Soluție de Xanthan .
(2%) concentrație	10,0%
10% Makon 10-(zece moli surfac-
tant etilcnoxid nonilfenol)	9,0%
și Apă	66,3%

B. Concentratul emulsifîabil

Componenta A83543D 12,4%

Exxon 200 (solvent naftalen) 83,6%

Toximul H (amestec de surfactant neionic și anionic) 2,0%

Toximul D (amestec de surt'actant anionic și surfactant neionic) 2,0%

Exemplul 13. Următoarele exemple de compoziții ilustrează sortimentele de formule utilizate pentru practicarea procedeu lui conform prezentei invenții:

A. Premtx nutritiv

A83543A (componentă) 10%

Coji de orez 85%

Ulei mineral ușor 5%

B. Premix nutritiv

Componenta A83543E 25%

Făină de Alfalfa 60%

Argilă pulbere 5%

Molasses 10%

C. Suspensie

Componenta A83543A 30%

Sare de naftalcnsulfonat 5%

Surfactant neionic 5%

Silice turnantă 1%

Apă 59%

D. Soluție sub formă de picături

Componenta A83543A 20 %

Surfactant neionic 0,8%

Propilen glicol 15 %

Apă 64,2%

E. Suspensie sub formă de picături

Componenta A83543B 10%

Surfactant neionic 1%

Ulei mineral 89%

F. Soluție injectabilă

A83543A (componentă) 15%

Propilen-glicol 85%

G. Suspensie injectabilă

Componenta A83543C 25%

Propilen glicol 15%

Apă 60%

H. Suspensie injectabilă

Componenta A83543D 30%

Polivinilpirolidona 2%

Apă 68%

Claims (8)

1. Compușii macrolidici cu activitate insecticidă și miticidă, caracterizați prin aceea că prezintă următoarea formulă:

în care R este H sau o grupare selectată dintre următoarele:

(c) CHj (d)

R² este o grupare avînd următoarea formulă:

R¹, R³, R⁵ și R⁶ sînt hidrogen sau metil;

R⁴ este metil sau etil;

2. Compuși mecrolidici cu activitate insecticidă și miticidă conform revendicării 1, caracterizați prin aceea că radicalii R, R^l, R³, R⁴, R⁵ și R⁶ sînt prezenți întruna din următoarele combinații:

sau o sare acidă, de adiție a acestor compuși, în care radicalul R este diferit de hidrogen.

3. Compuși mocrolidici cu activitate insecticidă și miticidă, conform revendicării 1 sau 2, caracterizați prin aceea că radicalul R este o grupare (a); radicalii R¹,

20 R⁵ și R⁶ sînt metil; radicalul R³ este hidrogen și radicalul R⁴ este etil.

4. Compuși macrolidici, cu activitate insecticidă sau/și miticidă, conform revendicării 1 sau 2, caracterizați prin aceea 25 că R este o grupare (a); radicalii R¹, R', R' și R⁶ sînt metil .și R⁴ este etil.

5. Procedeu microbiologic de obținere a compușilor macrolidici cu activitate insecticidă și miticidă, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că specia Saccharopolyspora spinosa selectată dintre NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 sau NRRL 18539 sau un mutant natural sau indus al acestora se cultivă pe un mediu cu o compoziție, în sine cunoscută, care cuprinde surse asimilabile de carbon, azot, săruri anorganice și eventual 0,2 ml/1 agent antispumant cum ar fi uleiul de soia, la un pH de

6,5...

7,0, o temperatură de 24 ... 33°C, de preferință 28 ... 30°C, menținîndu-se un nivel al concentrației de O₂ dizolvat de 35 ... 50% și o presiune internă a vasului de fermentație submersă de 0,34 at. după care compusul se separă din biomasă prin tehnici convenționale.

6. Cultură purificată biologic, dc Sac charopolyspora spinosa, caracterizată prin aceea că produce în lichidul de fermentație cantități recuperabile de compuși macrolidici, conform revendicării 1.

5 7. Compoziție în efect insecticid sau miticid, caracterizată prin aceea că conține 0,00005 ... 95% unul dintre compușii conform revendicării 1, sau o sare acidă de adiție a acestora, în asociere cu unul sau 10 mai multe vehicule sau diluanți inerți și eventual 0,5 ... 10% agenți tcnsioactivi.

8. Procedeu de combatere a insectelor sau căpușelor, caracterizat prin aceea că, la locul de acțiune al insectelor sau căpușe15 lor, se apică 1 ... 1000 ppm sau 0,01 ... 1 kg/ha dintr-unul din compușii conform revendicării 1 sau se administrează la animalul gazdă o doză de 5 ... 500 mg/kg greutate corp, ceea ce duce la otrăvirea 20 paraziților cînd ingerează sîngele de la animalul tratat.

Președintele comisiei de invenții: biolog Nicola Nicolin Examinator: biochim. Alina Crețu