PT637244E - Estirpe de spretomyces avermitilis glicosilante de compostos de avermectina - Google Patents

Description

-1 - DESCR1CÃO

Al h*.rfr n «-1 " ESTIRPE DE SPREPTOMYCES AVERMITILIS GLICOSILANTE DE COMPOSTOS DE AVERMECTINA "

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os compostos de avermectina são produtos naturais produzidos pela fermentação de Streptomyces avermitilis tal como descrito na U.S. 4,310,519 de Albers-Schonberg et al. Os compostos de avermectina têm um grupo natural a-L-oleandrosil-a-L-oleandrosiloxi na posição 13. Na Patente U.S. 4,203,976 de Fischer et al. são descritos certos procedimentos sintéticos para glicosilação de vários grupos hidroxilo ou da molécula de avermectina, incluindo o 4"-hidroxilo do grupo dissacárido da avermectina mas não a posição 14a. A patente U.S. 3,950,360 de Aoki et al. descreve compostos de milbemicina e o pedido de patente europeia 242,052 de Rudd et al. descreve compostos de nemadectina com um grupo 23-hidroxilo e um grupo 25-alquilo insaturado. A U.S. 5,192,671 descreve a glicosilação das posições 4' e 4" de compostos de avermectina por adição dos compostos ao meio de fermentação de Saccharapolyspora erythrea. O grupo açúcar oleandrose externo dos compostos de avermectina é glicosilado com uma unidade glicosilo, especifícamente um grupo glucose. Além disso, são efectuadas outras alterações na unidade de avermectina tais como hidroxilação selectiva, epimerização no carbono 2 e migração da ligação dupla D3 para uma posição D2.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com a preparação de compostos de -2- Aí n t___·" I ·Ί avermectina com um grupo glicosilo, especiflcamente um grupo oleandrosilo, substituído nas posições 13 e 14a dos compostos de avermectina sem formação de um grupo 5-metoxi que são preparados por fermentação de uma aglicona de avermectina ou de um composto de 14a-hidroxi avermectina num meio de cultura de uma nova estirpe de Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292. Os compostos produzidos pela fermentação são agentes antiparasíticos e antelmínticos potentes.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se com a preparação de compostos de avermectina em que um grupo oleandrosilo é colocado nas posições 4',13 e 14a de um composto de avermectina. O processo é realizado por cultura do microrganismo Streptomyces avermitilis num meio de cultura e adicionando o material de partida monossacárido de avermectina, aglicona ou 14a-hidroxi avermectina ao meio de fermentação. A cultura Streptomyces avermitilis é um novo microrganismo que foi depositado na American Type Culture Collection em 12301 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852 com o número de depósito ATCC 55292. O depósito foi realizado ao abrigo do Tratado de Budapeste para o depósito de microrganismos para efeitos de patentes em 55292. A estirpe de Spretomyces avermitilis MA 6941 é uma nova estirpe mutante que não produz quaisquer compostos de avermectina na ausência de adição desses compostos ao meio de fermentação. A estirpe glicosila mas não realiza a C5-0-metilação. A estirpe tem eliminados o gene para a C5-0-metil transferase e uma porção do ADN necessário para a síntese da estrutura da aglicona de avermectina.

As características morfológicas de Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, são as seguintes: A seguinte é uma descrição geral de estirpe de Streptomyces avermitilis MA 6941. A cultura é utilizada para a glicosilação de monossacáridos, agliconas ou derivados 14a-hidroxilo de avermectina sem metilação concomitante. As observações do crescimento, características de cultura gerais e utilização de fontes de carbono foram feitas de acordo com os métodos de Shirling e Gottleib (Intemat. J. System. Bacteriol. 16: 313-340). A composição química das células foi determinada utilizando os métodos de Lechevalier e Lechevalier (em Actinomycete Taxonomy, A. Dietz e D. W. Thayer, Ed. Society for Industrial Microbiology, 1980). A coloração da cultura foi determinada por comparação com os padrões de cores contidos em Inter-Society Color Council -National Bureau of Standards Centroid Color Charts (US Dept. of Commerce National Bureau of Standards, suplemeto da Circular NBS 553,1985).

Análise da Composição da Parede Celular - Peptidoglicano contendo ácido LL-diaminopimélico.

Características gerais de crescimento - Bom crescimento em agar com extracto de malte e leveduras (YME), agar com glicerol e asparagina, agar com amido e sais inorgânicos, farinha de aveia, agar com soja e tripticase e agar com peptona e ferro. Crescimento fraco em agar de Czapek e agar com água da torneira suplementado com NZ-amina (Shefield Chemical Co.). A cultura também cresce em meio de extracto de levedura e triptona. A cultura cresce a 27°C e 37°C.

Morfologia das colónias - (em YME ao dia 21) O substrato do micélio é -4- /^t l^rb n ( castanho claro. Micélio aéreo branco. A massa de esporos é abundante e de cor cinzenta esverdeada clara. É produzido pigmento melanóide. As colónias são opacas, sobrelevadas e têm bordos inteiros, com consistência de borracha com uma textura superficial mate.

Micromorfologia - Micélio aéreo (0,57-0,76 pm) surge do micélio do substrato e é ramificado, curto e sinuoso. Em culturas amadurecidas (7-28 dias p.i.) o micélio aéreo termina em cadeias em espiral de esporos que ocasionalmente terminam em estruturas semelhantes a botões. Esta característica é especialmente perceptível em áreas de desenvolvimento aéreo denso. A esporulação ocorre em YME, agar com sais inorgânicos-amido, farinha de aveia, agar com glicerol e asparagina, agar com água da torneira com NZ-amina e agar de Czapek.

Reacções fisiológicas diversas - A cultura produz H2S em agar com peptona-ferro. Formam-se pigmentos melanóides em meio TY, e em YME, e em culturas inclinadas em agar de tripticase-soja e peptona-ferro. O amido é fracamente hidrolizado aos 21 dias mas não aos 14 dias p.i.. O padrão de utilização da fonte de carbono é o seguinte: boa utilização de D-frutose, a-D-glucose, a-D-lactose, b-D-lactose, D-manitol, D-manose, L-ramnose, D-xilose; utilização moderada de L-arabinose, inositol, D-maltose, D-rafinose; utilização fraca de D-arabinose, sacarose.

As Tabelas 1 e 2 sumariam as características da cultura e a utilização de hidratos de carbono de Streptomyces avermitilis MA 6941.

Diagnóstico - Estes resultados comparam de forma favorável com a descrição publicada da estirpe-mãe Streptomyces avermitilis. >n

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Padrão de utilização de hidratos de carbono por Streptomyces avermitilis MA 6941 aos 21 dias

Fonte de carbono Utilização D-arabinose 1 L-arabinose 2 D-frutose 3 inositol 2 a-D-lactose 3 b-D-lactose 3 D-maltose 2 D-manitol 3 D-manose 3 D-rafinose 2 L-ramnose 3 sacarose 1 D-xilose 3 a-D-glucose (controlo) 3 3 = boa utilização 2 = utilização moderada 1 = utilização fraca 0 = não utilização O processo que utiliza o novo microrganismo da presente invenção é melhor realizado no seguinte esquema reaccional:

5.. b

-8-

No esquema reaccional acima a linha a tracejado na posição 22,23 indica uma ligação simples ou dupla na posição 22,23;

Ri só está presente quando a linha a tracejado representa uma ligação simples na posição 22,23 e é hidrogénio, hidroxilo, oxo, ou hidroximino; R2 é alquilo com 1 até 8 átomos de carbono, alcenilo com 2 até 8 átomos de carbono ou cicloalquilo com 3 até 8 átomos de carbono; R3 é hidroxilo, oxo, metoxi ou acetoxi; e R4 é hidrogénio, b-hidroxilo ou

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C-~J em que n é 0 ou 1; m é 1 ou 2; Ré é hidroxilo, amina, alquilo com 1 até 8 átomos de carbono, dialquilo com 1 até 8 átomos de carbono ou (alquil com 1 até 8 átomos de carbono)(alcanoíl com 1 até 8 átomos de carbono)amino; e R5 hidrogénio ou hidroxilo.

Os compostos acima de Fórmulas II e III são agentes antelmínticos activos.

No esquema reaccional acima os compostos seguintes são compostos novos e agentes antelmínticos activos.

No esquema reaccional acima os novos compostos da presente invenção ficam definidos quando a linha a tracejado na posição 22,23 indica uma ligação simples ou dupla na posição 22,23;

Ri só está presente quando a linha a tracejado representa uma ligação simples na posição 22,23 e é hidrogénio ou hidroxilo; R2 é alquilo com 1 até 8 átomos de carbono, alcenilo com 2 até 8 átomos de carbono ou cicloalquilo com 3 até 8 átomos de carbono; R3 é hidroxilo ou metoxi; e R4 é hidrogénio ou b-hidroxilo. O presente processo é realizado por adição de um composto de Fórmula I ao meio de fermentação de Streptomyces avermitilis MA 6941 e realizando a fermentação tal como descrito adiante. Os compostos de Fórmula II são formados quando R5 é hidroxilo e os compostos de Fórmula III são formados quando R5 é hidrogénio e R» é hidroxilo. Também são possíveis compostos com substituição por oleandrose em ambas as posições 13 e 14a se ambos R4 e R5 forem hidroxilo.

Os compostos de Fórmula I são preparados por fermentação de uma cultura de Streptomyces lavendulae MA 6555m ATCC 14159, na presença de um composto de avermectina com o grupo 14-metilo normal. As condições gerais utilizadas para a fermentação são semelhantes às utilizadas para a presente fermentação. Nesta especificação estão incluídos exemplos específicos descrevendo a preparação desses compostos. Além disso, certos compostos 14a-hidroxi são preparados sinteticamente tal como descrito na EP 144285. O composto de Fórmula I pode ser adicionado ao meio de fermentação em qualquer altura durante o período de fermentação embora se tenha verificado ser vantajoso adicionar o material de partida após deixar que a fermentação decorra durante um período, para permitir ao microrganismo tempo suficiente para actuar sobre o material de partida, mas antes do período de fermentação estar completo. Geralmente, o material de partida é adicionado após o período de fermentação estar pelo menos 10% completo mas antes de estar 75% completo. Preferencialmente o material de partida é adicionado quando a fermentação completou desde 20% até 50% do seu período de duração. O material de partida é adicionado ao caldo de fermentação em quantidades desde 0,1 até 10 mg por mL de caldo de fermentação. Preferencialmente o material de partida é adicionado em quantidades desde 1 até 8 mg por mL de caldo de fermentação. -11-

Os compostos preferidos da presente invenção são realizados quando na Fórmula estrutural II acima: a linha a tracejado na posição 22,23 indica uma ligação dupla 22,23 e Rj não está presente; R2 é isopropilo ou sec-butilo; R3 é hidroxilo; e R4 é hidrogénio ou hidroxilo, mais preferencialmente hidrogénio ou b-hidroxilo. A estirpe acima descrita de Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292 é ilustrativa de uma estirpe que pode ser utilizada na produção dos presentes compostos. Contudo, a presente invenção também abrange mutantes do microrganismo acima descrito. Por exemplo, os mutantes que são obtidos por selecção natural ou os produzidos por agentes mutagénicos incluindo radiação ionizante tal como irradiação ultravioleta, ou mutagéneos químicos tais como nitrosoguanidina ou outros tratamentos semelhantes também estão incluídos no âmbito desta invenção.

Os presentes compostos são produzidos durante a fermentação aeróbia de meios nutrientes aquosos adequados em condições aqui descritas adiante, com uma estirpe não-produtora de Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292. São adequados para utilização neste processo para a produção deste composto macrocíclico meios aquosos tais como os utilizados para a produção de muitas substâncias antibióticas. Esses meios nutrientes contêm fontes de carbono e azoto assimiláveis pelo microrganismo e geralmente níveis baixos de sais inorgânicos. Além disso, os meios de fermentação podem conter pequenas quantidades de sais inorgânicos e vestígios de metais necessários para o crescimento dos microrganismos, e produção dos compostos desejados. Estes estão geralmente presentes em concentrações suficientes nas fontes complexas de carbono e azoto, que podem ser utilizadas como fontes nutrientes, mas podem, é claro, ser adicionados separadamente ao meio se desejado.

Em geral, hidratos de carbono tais como açúcares por exemplo dextrose, sacarose, maltose, lactose, dextrana, cerelose, farinha de milho, farinha de aveia, e outros semelhantes, e amidos são fontes adequadas de carbono assimilável nos meios nutrientes. A quantidade exacta da fonte de carbono que é utilizada no meio dependerá, em parte, de outros componentes no meio, mas normalmente verifica-se que é satisfatória uma quantidade de hidrato de carbono entre 0,5 e 5% em peso do meio. Estas fontes de carbono podem ser utilizadas individualmente ou podem ser combinadas várias fontes de carbono no mesmo meio. Várias fontes de azoto tais como hidrolizados de leveduras, autolisados de leveduras, células de leveduras, pasta de tomate, farinha de milho, farinha de aveia, farinha de soja, hidrolizados de caseína, extractos de leveduras, água de maceração do milho, solúveis de destilarias, farinha de sementes de algodão, extracto de carne e outras semelhantes, são prontamente assimiláveis por Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292 na produção dos presentes compostos. As várias fontes de azoto podem ser utilizadas sós ou em combinação em quantidades na gama desde 0,2 até 6% em peso do meio.

De entre os sais inorgânicos nutrientes, que podem ser incorporados nos meios de cultura estão os sais habituais capazes de produzir iões sódio, potássio, magnésio, amónio, cálcio, fosfato, sulfato, cloreto, carbonato, e outros semelhantes. Também estão incluídos vestígios de metais tais como cobalto, manganês, e outros semelhantes.

Deve notar-se que os meios aqui descritos adiante e nos Exemplos são meramente ilustrativos da grande variedade de meios que podem ser utilizados, e não têm a intenção de ser limitativos.

Os seguintes são Exemplos de meios adequados para o crescimento de estirpes de Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292. MEIO 1

Glucose 5 g Açúcar Amarelo Comercial 10 g Triptona 5 g Extracto de Leveduras 2,5 g EDTA (ácido etileno diamino tetraacético) 36 mg betaína 1,29 g propionato de sódio 0,11 g H20 destilada 1100 mL pH 7,0 - pH 7,2 MEIO 2

Sacarose 15 g Peptona 5,0 g Extracto de leveduras 2,5 g L-arginina 0,5 mg H20 destilada 1000 mL - 14- Át rh t-i MEIO 3

Glucose 50 g NaCl 5,0 g (NH4)2S04 2,0 g CaC03 6,0 g propanol 5 g farinha de soja 30 g H20 destilada 1000 mL MEIO 4 Amido solúvel 15 g Soitona 20 g CaCl2 0,1 g Extracto de Leveduras 1,5 g Óleo de soja 50 mL MOPS (ácido morfolino 105 mL propano sulfónico)

MEIO 5 k2hpo4 450 mg sacarose 2,0 g caseína 1,5 g NaCl 50 mg L-arginina 15 mg Mistura A de elementos vestigiais 1,0 mL água destilada 1000 mL pH 6,9

MISTURA DF- ELEMENTOS VESTIGIAIS

Ácido cítrico 46,2 mg FeS04.7H20 2,0 mg ZnS04.7H20 1,0 mg MnCl2.4H20 0,8 mg CoC12.6H20 0,1 mg MgS04.7H20 50 mL Ácido ascórbico 0,12 mg h2o 160 mL MEIO 6

Óleo de sementes de algodão 5,0 g extracto de leveduras 0,5 g dextrose 4,5 g óleo de soja 0,5 pL CaC03 0,6 g Mistura de elementos vestigiais 1,0 mL H20 destilada 1000 mL A fermentação utilizando Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292 pode ser realizada a temperaturas na gama desde cerca de 20°C até cerca de 40°C. Para resultados optimizados, é mais conveniente realizar estas fermentações a uma temperatura na gama desde cerca de 24°C até cerca de 30°C. São mais preferidas temperaturas de cerca de 27°-28°C. O pH do meio nutriente adequado para a produção dos presentes compostos pode variar desde cerca de 5,0 até 8,5 com uma gama preferida desde cerca de 6,0 até 7,5.

As fermentações em pequena escala são convenientemente realiza- -16- das colocando quantidades adequadas de meio nutriente num frasco utilizando técnicas estéreis conhecidas, inoculando o frasco ou com esporos ou com crescimento celular vegetativo de Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, tapando ligeiramente o frasco com algodão e deixando que a fermentação se desenrole a uma temperatura ambiente constante de cerca de 30°C num agitador rotativo a desde 95 até 300 rpm durante cerca de 2 até 10 dias. Para trabalho em maior escala, é preferível realizar a fermentação em tanques adequados equipados com um agitador e um meio de arejamento do meio de fermentação. O meio nutriente é preparado no tanque e após esterilização é inoculado com uma fonte de crescimento celular vegetativo de Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292. Deixa-se prosseguir a fermentação desde 1 até 8 dias enquanto se agita e/ou areja o meio nutriente a uma temperatura na gama desde cerca de 24° até 37°C. O grau de arejamento dependente de vários factores tais como as dimensões do fermentador, a velocidade de agitação, e outros semelhantes. Geralmente as fermentações em maior escala são agitadas a cerca de 95 até 500 rpm e cerca de 50 a 500 litros de ar por minuto.

Os novos compostos desta invenção encontram-se tanto na porção aquosa como no micélio do meio de fermentação quando está terminada a fermentação de Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292 e podem ser retirados e separados destes como descrito adiante. A separação dos novos compostos do caldo total de fermentação e a recuperação dos referidos compostos é realizada por extracção com solvente e aplicação de fraccionamentos cromatográficos com várias técnicas cromato-gráficas e sistemas de solventes.

Os presentes compostos têm ligeira solubilidade em água, mas são solúveis em solventes orgânicos. Esta propriedade pode ser convenientemente -17-utilizada para recuperar ο composto do caldo de fermentação. Assim, num método de recuperação, o caldo total de fermentação é combinado com aproxima-damente um volume igual de um solvente orgânico. Embora possa ser utilizado qualquer solvente orgânico, é preferível utilizar um solvente imiscível com água tal como acetato de etilo, cloreto de metileno, clorofórmio, metil etil cetona e outros semelhantes. Geralmente são desejáveis várias extracções para conseguir uma recuperação maximizada. O solvente remove os presentes compostos bem como outras substâncias sem a actividade antiparasítica dos presentes compostos. Se o solvente for imiscível com água, as camadas são separadas e o solvente orgânico é evaporado a pressão reduzida. Se o solvente for miscível com água, pode ser extraído com um solvente imiscível com água para separar a água arrastada. Este solvente pode então ser concentrado a pressão reduzida. O resíduo é colocado numa coluna cromatográfíca contendo preferencialmente, sílica gel. A coluna retém os produtos desejados e algumas impurezas, mas deixa passar muitas das impurezas, particularmente as impurezas não polares. A coluna é lavada com um solvente orgânico moderadamente polar tal como cloreto de metileno, clorofórmio ou hexano para remover mais impurezas, e é então lavada com uma mistura de cloreto de metileno, clorofórmio ou hexano e um solvente orgânico de que são preferidos acetona, acetato de etilo, metanol e etanol e outros semelhantes. O solvente é evaporado e o resíduo é adicionalmente cromatografado utilizando cromatografia em coluna, cromatografia em camada fina, cromatografia em camada preparativa, cromatografia líquida de alta pressão e outras semelhantes, com sílica gel, óxido de alumínio, geles de dextrano e outros semelhantes, como o meio cromatográfico, com vários solventes e combinações de solventes como o eluente. A cromatografia em camada fina, líquida de alta pressão e em camada preparativa podem ser utilizadas para detectar a presença de, e isolar os presentes compostos. A utilização das técnicas anteriores bem como de outras conhecidas pelos especialistas na matéria, produzirá composições purificadas contendo os presentes compostos. A presença dos compostos desejados é determinada por análise das várias fracções cromatográfícas quanto à actividade biológica contra parasitas seleccionados, ou características físico-químicas. As estruturas dos presentes compostos foram determinadas por análise pormenorizada das várias características espectrais dos compostos, em particular os seus espectros de ressonância magnética nuclear, de massa, no ultravioleta e no infravermelho.

Os presentes compostos são agentes endo- e ecto-antiparasíticos potentes contra parasitas particularmente helmintos, ectoparasitas, insectos, e acarídeos, infectando o homem, animais e plantas, pelo que têm utilidade em saúde humana e animal, agricultura e controlo de pragas em áreas residenciais e comerciais. A doença ou grupo de doenças descrita geralmente como helmintíase é devida a infecção de um animal hospedeiro com vermes parasitas conhecidos como helmintos. A helmintíase é um problema prevalecente e económico grave em animais domesticados tais como porcos, ovelhas, cavalos, gado bovino, cabras, cães, gatos, peixes, búfalos, camelos, lamas, renas, animais de laboratório, animais de pelo, animais de jardins zoológicos e espécies exóticas e aves. Entre os helmintos, o grupo de vermes descrito como nemátodos provoca infecção generalizada e frequentes vezes grave em várias espécies de animais. Os géneros mais comuns de nemátodos infectantes dos animais descritos acima são Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Habronema, Druschia, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris e Parascaris. Certos destes, tais como Nematodirus, Cooperia, e Oesophagostomum atacam principalmente o tracto intestinal enquanto outros, tais como Haemonchus e Ostertagia, são mais prevalecentes no estômago enquanto outros tais como Dictyocaulus se encontram nos pulmões. Outros parasitas ainda podem estar localizados noutros tecidos e orgãos do corpo tais como o coração e vasos sanguíneos, tecido subcutâneo e linfático e outros semelhantes. As infecções parasíticas conhecidas como helmintíases conduzem a anemia, malnutrição, fraqueza, perda de peso, lesões graves das paredes do tracto intestinal e outros tecidos e orgãos e, se não forem tratadas, podem resultar na morte do hospedeiro infectado. Os compostos desta invenção têm actividade inesperadamente elevada contra estes parasitas, e além disso são também activos contra Dirofilaria em cães e gatos, Nematospiroides, Syphacia, Aspiculuris em roedores, ectoparasitas artrópodes de animais e aves tais como carraças, ácaros, piolhos, pulgas, moscas varejas, em ovelhas Lucilia sp., insectos que picam e larvas de dípteros migrantes tais como Hypoderma sp. em gado bovino, Gastrophilus em cavalos, e Cuterebra sp. em roedores e moscas incómodas incluindo moscas que se alimentam de sangue e moscas da imundície.

Os presentes compostos também são úteis contra parasitas que infectam seres humanos. Os géneros mais comum de parasitas do tracto gastrointestinal do homem são Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, e Enterobius. Outros géneros de parasitas importantes do ponto de vista médico que se encontram no sangue ou outros tecidos e orgãos foram do tracto gastrointestinal são os vermes filiformes tais como Wuchereria, Brugia, Onchocerca e Loa, Dracunuculus e fases extra intestinais dos vermes intestinais Strongyloides e Trichinella. Os compostos também têm valor contra artrópodes parasitantes do homem, insectos que picam e outras pragas de dípteros que incomodam o homem.

Os compostos também são activos contra pragas domésticas tais como a barata, Blatella sp., a traça da roupa, Tineola sp., a traça das tapeçarias, Attagenus sp, a mosca doméstica Musca domestica bem como pulgas, ácaros domésticos, térmites e formigas. -20-

Os compostos também são úteis contra pragas de insectos de cereais armazenados tais como Tribolium sp., Tenebrio sp. e de plantas agrícolas tais como afídeos, (Acyrthiosiphon sp.); contra ortópteros migratórios tais como gafanhotos e estádios imaturos de insectos que vivem em tecidos de plantas. Os compostos são úteis como nematocidas para o controlo de nemátodos do solo e parasitas de plantas tais como Meloidogyne sp. que podem ser de importância em agricultura. Os compostos também são muito úteis no tratamento de florestas de acer infestadas com ninhos de formiga vermelha. Os compostos são espalhados sobre a área infestada a baixos níveis em formulações de isco que são levadas para o ninho. Além do efeito tóxico directo mas de desenvolvimento lento sobre pirilampos, o composto tem um efeito de longa duração no ninho por esterilização da rainha o qual efectivamente destrói o ninho.

Os compostos desta invenção podem ser administrados em formulações em que o princípio activo é intimamente misturado com um ou mais componentes e opcionalmente incluindo um ou mais princípios activos adicionais. Os compostos podem ser utilizados em qualquer composição conhecida pelos peritos na arte para administração a seres humanos e animais, para aplicação em plantas e para aplicação em instalações e áreas para controlo de pragas domésticas em zonas residenciais ou comerciais. Para aplicação em seres humanos e animais para controlo de parasitas internos e externos, podem ser utilizadas formulações orais, formas sólidas ou líquidas ou líquidas parentéticas, de implante ou injecção de "depot". Para aplicação tópica pode utilizar-se um banho, "spray", pó, pó fino, "pour-on", "spot-on", fluido para esguichar, champôs, coleira, etiqueta ou arnês. Para aplicações em instalações ou áreas agrícolas, pode utilizar-se formas de "sprays" líquidos, pós, pó fino, ou iscos. Além disso podem ser utilizadas formas "feed through" para controlar moscas incómodas que se alimentam ou procriam em dejectos de animais. Os compostos são formulados, tal «*1 -21 -

como por encapsulamento, para libertar um resíduo do agente aetivo nos dejeotos de animais que controla as moscas de imundície ou outras pragas de artrópodes.

Estes compostos podem ser administrados oralmente numa forma de dosagem unitária tal como uma cápsula, bolus ou comprimido, ou como uma poção líquida quando utilizados como antelmínticos em mamíferos. A poção é normalmente uma solução, suspensão ou dispersão do princípio aetivo geralmente em água conjuntamente com um agente de suspensão tal como bentonite e um agente molhante ou excipiente semelhante. Geralmente, as poções também contêm um agente anti-espuma. As formulações em poção geralmente contêm desde cerca de 0,001 até 0,5% em peso do composto aetivo. As formulações em poção preferidas podem conter desde 0,01 a té 0,1% em peso. As cápsulas e bolus compreendem o princípio aetivo em mistura com um veículo tal como amido, talco, estearato de magnésio, ou fosfato di-cálcico.

Quando se deseja administrar os presentes compostos numa forma de dosagem unitária sólida, seca, são geralmente utilizadas cápsulas, bolus ou comprimidos contendo a quantidade desejada de composto aetivo. Estas formas de dosagem são preparadas misturando intimamente e uniformemente o princípio aetivo com diluentes, enchimentos, agentes desintegrantes, e/ou ligantes adequados finamente divididos, tais como amido, lactose, talco, estearato de magnésio, gomas vegetais e outros semelhantes. Essas formulações de dosagem unitária podem variar muito em relação ao seu peso total e teor de agente antiparasítico dependendo de factores tais como o tipo de animal hospedeiro a ser tratado, a gravidade e o tipo de infecção e o peso do hospedeiro.

Quando o composto aetivo se destina a ser administrado através de uma ração para animais, é intimamente disperso na ração ou utilizado como revestimento de superfície ou na forma de pastilhas ou líquido que pode então ser

adicionado à ração acabada ou opcionalmente administrado separadamente. Altemativamente, podem ser utilizadas formas de dosagem individuais com base em rações tais como uma guloseima mastigável. Altemativamente, os compostos antiparasíticos desta invenção podem ser administrados a animais parentericamente, por exemplo, por injecção intra-ruminal, intramuscular, intravascular, intratraqueana, ou subcutânea em que o princípio activo é dissolvido ou disperso num veículo líquido. Para administração parentérica, o material activo é adequadamente misturado com um veículo aceitável, preferencialmente da variedade óleo vegetal tal como óleo de amendoim, óleo de sementes de algodão e outros semelhantes. Também são utilizados outros veículos parentéricos tais como uma preparação orgânica utilizando solcetal, glicerol formal, propileno glicol, e formulações parentéticas aquosas. O composto ou compostos activos são dissolvidos ou suspensos na formulação parentérica para administração; essas formulações geralmente contêm desde 0,0005 até 5% em peso do composto activo.

Embora os agentes antiparasíticos desta invenção encontrem a sua utilização principal no tratamento e/ou prevenção da helmintíase, também são úteis na prevenção e tratamento de doenças provocadas por outros parasitas, por exemplo, parasitas artrópodes tais como carraças, piolhos, pulgas, ácaros e outros artrópodes mordedores em animais domesticados e aves. Também são eficazes no tratamento de doenças parasíticas que ocorrem noutros animais incluindo seres humanos. A quantidade óptima a ser utilizada para os melhores resultados dependerá, é claro, do composto particular utilizado, da espécie de animal a ser tratado e do tipo e gravidade da infecção ou infestação parasítica. Geralmente são obtidos bons resultados com os nossos compostos novos pela administração oral de desde cerca de 0,001 até 10 mg por kg de peso corporal do animal, sendo essa dose total administrada de uma só vez ou em doses divididas ao longo de um -23- h’.- id-~— período de tempo relativamente curto taal como 1-5 dias. Com os compostos preferidos da invenção, obtém-se controlo excelente desses parasitas em animais por administração desde cerca de 0,025 até 0,5 mg por kg de peso corporal numa dose única. São administrados tratamentos repetidos à medida que for necessário para combater re-infecções e dependem da espécie de parasita e das técnicas de criação de gado que estão a ser utilizadas. As técnicas para administração destes materiais a animais são conhecidas pelos especialistas no campo veterinário.

Quando os compostos aqui descritos são administrados como um componente da ração para animais, ou dissolvidos ou suspensos na água para beber, são proporcionadas composições em que o composto ou compostos activos estão intimamente dispersos num veículo ou diluente inerte. Por veículo inerte entende-se que não reagirá com o agente antiparasítico e que pode ser administrado com segurança a animais. Preferencialmente, um veículo para administração na ração é um que, ou pode ser, um componente da ração para animais.

Composições adequadas incluem pré-misturas ou suplementos para rações em que o pincípio activo está presente em quantidades relativamente grandes e que são adequados para alimentação directa ao animal ou para adição à ração ou directamene ou após uma diluição intermédia ou passo de mistura. Veículos ou diluentes típicos adequados para essas composições incluem, por exemplo, engaço seco, farinha de milho, farinha de citrinos, resíduos de fermentação, cascas de ostras moídas, farelo de trigo, solúveis de melaço, farinha de sabugo de milho, ração de forragem de feijão comestível, grãos de soja, calcário triturado e outros semelhantes. Os compostos activos são intimamente dispersos no veículo por métodos tais como trituração, agitação, moagem ou rotação. As composições contendo desde cerca de 0,005 até 0,2% em peso do composto activo são particularmente adequadas como pré-misturas para rações. Os suplementos para rações, que são administrados directamente ao animal, contêm desde cerca de 0,0002 até 0,3% em peso dos compostos activos.

Esses suplementos são adicionados à ração para animais numa quantidade para conferir à ração acabada a concentração desejada de composto activo para tratamento e controlo de doenças parasíticas. Embora a concentração desejada de composto activo varie dependendo dos factores anteriormente referidos bem como do composto particular utilizado, os compostos desta invenção são normalmente administrados a concentrações entre 0,00001 até 0,002% na ração de forma a atingir o resultado antiparasítico desejado.

Na utilização dos compostos desta invenção, os compostos individuais podem ser preparados e utilizados nessa forma. Altemativamente, podem ser utilizadas misturas dos compostos individuais, ou outros compostos activos não relacionados com os compostos desta invenção.

Os compostos desta invenção também são úteis para combater pragas agrícolas que infligem danos sobre as culturas enquanto estão em crescimento ou enquanto armazenadas. Os compostos são aplicados utilizando técnicas conhecidas como "sprays", pós finos, emulsões e outros semelhantes, às culturas em crescimento ou às colheitas armazenadas para efectuar a protecção contra essas pragas agrícolas.

Os exemplos seguintes são proporcionados para que esta invenção seja mais completamente compreendida; não são para serem tomados como limitativos da invenção.

PROCEDIMENTOS E EXEMPLOS DE PREPARAÇÃO DE 14a H1DROXI AVERMECTINA/MIBEMICINAS

CONDIÇÕES DE CULTURA 1. Preparação de Culturas Congeladas

Um tubo L (cultura liofilizada) de Streptomyces lavendulae (MA 6555, ATCC 14159) é transferida assepticamente para 250 mL de meio A num frasco erlenmeyer de 2000 mL com deflector e o frasco é incubado num agitador rotativo (220 rpm) a 27°C a 85% de humidade relativa durante 48 horas. Alíquotas de dois mL da cultura foram congeladas e armazenadas a -80°C e serviram como uma fonte de culturas congeladas. 2. Culturas de Inoculação

Um frasco de cultura congelada (2 mL) foi utilizado para inocular um frasco erlenmeyer de 250 mL com deflector contendo 50 mL de meio A. Os frascos foram incubados num agitador rotativo (220 ml) a 27°C a 85% de humidade durante 48 horas. 3. Culturas para Transformação

Utilizou-se cinco mL de de cultura de inoculação desenvolvida para inocular 50 mL de meio B num frasco erlenmeyer de 250 mL; adicionou-se 13-desoxi avermectina Bja (1-5 mg) ou 13-desoxi avermectina Bxb (0,2-1,0 mg) em DMSO às 0 horas. Os frascos de transformação foram incubados durante 7 dias a 27°C (220 rpm) a 85% de humidade relativa.

Meio A Meio B Dextrose 1 g Amido Solúvel 30 g Dextrina 10 g Hycase SF 2 g Extracto de Carne 3 g Extracto de carne 1 g Ardamina pH 5 g Água de Maceração NZ Amina Tipo E 5 g de Milho 3 g MgS04.7H20 0,05 g Ácido morfolino- K2HPO4 0,3 g propanossulfónico 30 g CaC03 0,5 g Ajustar para pH 7,0 H20 destilada 1000 mL

ISOLAMENTO DE 14a-HIDROXI AVERMECTINAS

Os frascos foram exfraídos com três porções de 50 mL de CH2CI2. Os extractos de CH2CI2 foram combinados e concentrados. Os produtos hidroxilados foram isolados por HPLC numa coluna Dupont Zorbax ODS usando CH20H:H20 (85:15, 80:20, ou 70:30) como a fase móvel. As estruturas das avermectinas purificadas foram determinadas por RMN e espectrometria de massa.

EXEMPLOS ESPECÍFICOS

Os compostos seguintes foram preparados pelo procedimento acima:

Material de partida Produto

Preparação 1 aglicona de 13-desoxi-14a--bidroxi avermectina E^a aglicona de 13 desoxi avermectina Bia

Preparação 2 aglicona de 13b-hidroxi-14a--hidroxi avermectina Bia aglicona de 13-desoxi-14a--hidroxi avermectina B)b aglicona de 13b-hidroxi-14a--hidroxi avermectina Bja aglicona de 13 desoxi avermectina Bja

Preparação 3 aglicona de 13 desoxi avermectina B,b

Preparação 4 aglicona de 13 desoxi avermectina Bjb

PROCEDIMENTOS E EXEMPLOS DE PREPARAÇÃO DE 14a-Q-OLEANDROSIL AVERMECTINAS/MILBEMICINAS

Condições de Cultura 1. Preparação do Inoculo

Preparou-se micélios vegetativos congelados (FVM) de Streptomyces avermitilis MA 6941 ATCC 55292 por inoculação de 250 mL de meio de inoculação num frasco de 2 litros com 3 deflectores com uma cultura liofilizada e incubação a 27°C, 85% de humidade relativa e 200 rpm durante 16 horas. O volume celular compactado da cultura era de 10-15% e o pll 5,7-6,8. Alíquotas da cultura foram congeladas e utilizadas como uma fonte de inoculo para experiências futuras. 2. Culturas de Inoculação A 25 mL de cultura de inoculação num frasco de 250 mL com 3 h'·-

-28- deflectores, adicionou-se 1,0 mL de FVM e os frascos foram incubados a 27°C, 85% de humidade relativa e 200 rpm durante 16 horas. 3. Biotransformacão e Isolamento A 22,5 mL de meio de biotransformação, adicionou-se 1,0 mL de cultura de inoculação e os frascos foram incubados a 27°C, 85% de humidade relativa a 200 rpm durante 48 horas. Adicionou-se 1,0 mg de 14a-hidroxi avermectina em 0,05 mL de sulfóxido de dimetilo e os frascos foram incubados durante 8 dias a 27°C, 85% de humidade relativa e 220 rpm. Cada frasco foi extraído com porções de 50 mL de cloreto de metileno. Os extractos de cloreto de metileno foram combinados e concentrados. Os monossacáridos de avermectina foram isolados por HPLC numa coluna Dupont Zorbax ODS usando metanohágua (85:15, 80:20, 70:30) como a fase móvel. As estruturas das avermectinas purificadas foram determinadas por espectroscopia de massa e RMN.

Meio de Inoculação

Extracto de leveduras Difco 20 g/L Hycase S.F. 20 g/L Dextrose 20 g/L KN03 2,0 NaCl 0,5 MnSO^.HaO 0,005 ZnS04.7H20 0,01 CaCl2.2H20 0,02 FeS04.7H20 0,025 pH = 7,0

Meio de Biotransformacao

Leite peptonizado 17,5 g/L Ardamina pH 2,7 g/L Dextrose 75 g/L CuS04.5H20 0,00006 g/L ZnS04.7H20 0,001 g/L CoC12.6H20 0,0001 g/L FeCl3.6H20 0,003 g/L MgS04.7H20 0,5 g/L pH = 7,2 m pó «t í>a'h C—

03 03I I O O g B £ > cd cd '3 *H o O 03

03I

I

I 0 1o

0 1O o Ò V o -8 | ’5SI9 JU õ cO. •85 0 cd íΛ m 1 ca n-> 1 υ 1¾

o CO

Foram preparados os compostos seguintes: 03 03 Jcd 5

03 A a 'ao o *8 *8 3 3 ca ca m m § 3 3 3 3 60 60 00 60 60 bi) 00 η m

Λ .9 1 '53 I 3 A*. b- i'*'1

-32-Lisboa, 26 de Janeiro de 2001

.‘-'J

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (6)

1. -1 - Μ

   REIVINDICAÇÕES 1. Cultura biologicamente pura do microrganismo Strepto-myces avermitilis, ATCC 55292, ou um seu mutante, que é capaz de preparar compostos de fórmula:

   -2-

   em que: Ri só está presente quando a linha a tracejado representa uma ligação simples na posição 22,23 e é hidrogénio, hidroxilo, oxo, ou hidroximino; R.2 é alquilo com 1 até 8 átomos de carbono, alcenilo com 2 até 8 átomos de carbono ou cicloalquilo com 3 até 8 átomos de carbono; R-3 é hidroxilo, oxo, metoxi ou acetoxi; e R4 é hidrogénio, b-hidroxilo ou

   em que n é 0 ou 1; m é 1 ou 2; R6 é hidroxilo, amina, alquilo com 1 até 8 átomos de carbono, dialquilo com 1 até 8 átomos de carbono ou (alquil com 1 até 8 átomos de carbono)(alcanoíl com 1 até 8 átomos de carbonojamino; e R5 hidrogénio ou hidroxilo, e em que a fermentação do microrganismo é realizada num meio aquoso de fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos e um composto de fórmula: η

   em que Rj, R2, R3, R4 e R5 são como definidos acima.
2. 2. Cultura de acordo com a reivindicação 1 que está isenta de ADN que inclui o gene para C5-0-metilação e para a síntese da estrutura da aglicona de avermectina.
3. 3. Processo para a preparação de compostos de fórmula:

   O : H -4- vy~ ’h

   Ri só está presente quando a linha a tracejado representa uma ligação simples na posição 22,23 e é hidrogénio, hidroxilo, oxo, ou hidroximino; R2 é alquilo com 1 até 8 átomos de carbono, alcenilo com 2 até 8 átomos de carbono ou cicloalquilo com 3 até 8 átomos de carbono; R3 é hidroxilo, oxo, metoxi ou acetoxi; e R4 é hidrogénio, b-hidroxilo ou

   em que néOou 1; m é 1 ou 2; Rô é hidroxilo, amina, alquilo com 1 até 8 átomos de carbono, dialquilo com 1 até 8 átomos de carbono ou (alquil com 1 até 8 átomos de carbono)(alcanoíl com 1 até 8 átomos de carbono)amino; e R5 hidrogénio ou hidroxilo,

   -5- b.,?„

   que compreende a fermentação de uma cultura de Streptomyces avermitilis ATCC 55292, num meio aquoso de fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos e um composto de fórmula:

   em que Rls R2, R3, R4 e R5 são como definidos acima.

   -6- em que a linha a tracejado na posição 22,23 indica uma ligação simples ou dupla na posição 22,23; Ri só está presente quando a linha a tracejado representa uma ligação simples na posição 22,23 e é hidrogénio ou hidroxilo; R2 é alquilo com 1 até 8 átomos de carbono, alcenilo com 2 até 8 átomos de carbono ou cicloalquilo com 3 até 8 átomos de carbono; R3 é hidroxilo ou metoxi; e R4 é hidrogénio, b-hidroxilo ou

   em que n é 0 ou 1; e R6 é hidroxilo, amina, alquilo com 1 até 8 átomos de carbono, dialquilo com 1 até 8 átomos de carbono ou (alquil com 1 até 8 átomos de carbono)(alcanoíl com 1 até 8 átomos de carbono)amino.
4. 5. Composição compreendendo um veículo inerte e uma quantidade eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 4.
5. 6. Método para 0 tratamento de infecções parasíticas de plantas ou colheitas de plantas que compreende a administração a essas plantas, ao solo em que crescem essas plantas ou às colheitas dessas plantas, uma quantidade eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 4. -7-
6. 7. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 4 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças parasíticas de animais. Lisboa, 26 de Janeiro de 2001 ALBERTO CANELAS Agente Oficia! da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA