DE69329821T2

DE69329821T2 - Ein streptomyces avermitilis-stamm glykosyliert avermectin-verbindungen

Info

Publication number: DE69329821T2
Application number: DE69329821T
Authority: DE
Inventors: Byron H. Arison; Douglas J. Macneil; Tanya Macneil; Marvin D. Schulman
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1992-03-23
Filing date: 1993-03-16
Publication date: 2001-07-19
Anticipated expiration: 2013-03-17
Also published as: ES2152947T3; EP0637244A1; DE69329821D1; AU3809393A; ATE198493T1; WO1993018779A1; EP0637244A4; PT637244E; JPH07505280A; GR3035187T3; DK0637244T3; EP0637244B1; JP3263076B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Avermectinverbindungen sind Naturprodukte, die durch die Fermentation von Streptomyces avermitilis erzeugt werden, wie es in der US 4 310 519 von Albers-Schonberg et al. offenbart ist. Die Avermectinverbindungen besitzen eine natürliche α-L-Oleandrosyl-α-L-oleandrosyloxy- Gruppe in der 13-Stellung. In dem US-Patent 4 203 976 von Fischer et al. werden bestimmte synthetische Verfahren zur Glycosylierung verschiedener Hydroxygruppen des Avermectinmoleküls, einschließlich der 4"-Hydroxy- Gruppe der Avermectindisaccharidgruppe, nicht jedoch der 14a-Stellung, offenbart. Das US-Patent 3 950 360 von Aoki et al. offenbart Milbemycin- Verbindungen, und die Europäische Patentanmeldung 242 052 von Rudd et al. offenbart Nemadectin-Verbindungen mit einer 23-Hydroxygruppe und einer 25- ungesättigten Alkylgruppe. Die US 5 192 671 offenbart die Glycosylierung der 4'- und 4"-Stellungen von Avermectinverbindungen, indem die Verbindungen zu dem Fermentationsmedium Saccharapolyspora erythrea hinzugegeben werden. Die äußere Oleandrose-Zuckergruppe der Avermectinverbindungen wird mit einem Glycosylrest, insbesondere einer Glucosegruppe, glycosyliert. Zusätzlich werden andere Änderungen im Avermectinrest bewirkt, wie z. B. die selektive Hydroxylierung, die Epimerisierung am 2-Kohlenstoff und die Migration der Δ3-Doppelbindung in eine Δ2-Stellung.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Herstellung von Avermectinverbindungen mit einer Glycosylgruppe, insbesondere einer Oleandrosylgruppe, als Substitution in den 13- und 14a-Stellungen der Avermectinverbindungen, ohne Bildung einer 5-Methoxygruppe, wobei die Avermectinverbindungen hergestellt werden durch Fermentation eines Avermectin-Aglykons oder einer 14a-Hydroxyavermectinverbindung in einem Kulturmedium eines neuen Stammes von Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292. Die durch Fermentation erzeugten Verbindungen sind wirksame Antiparasitika und Anthelmintika.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Herstellung von Avermectinverbindungen, wobei eine Oleandrosylgruppe in die 4', 13- und 14a-Stellungen einer Avermectinverbindung gesetzt wird. Das Verfahren wird durch Kultivierung des Mikroorganismus Strentomyces avermitilis in einem Kulturmedium und Zugabe des Avermectin-Monosaccharids, -Aglycons oder des -14a-Hydroxyavermectin-Ausgangsmaterials zu der Fermentationsbrühe durchgeführt. Die Streptomyces avermitilis-Kultur ist ein neuer Mikroorganismus, der bei der American Type Culture Collection in 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, unter der Zugangsnummer ATCC 55292 hinterlegt wurde. Die Hinterlegung geschah unter 55292 unter dem Budapester Vertrag über die Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke.
Der Stamm Streptomyces avermitilis MA 6941 ist ein neuer Mutantenstamm, der in Abwesenheit von irgendwelchen dieser zu der Fermentationsbrühe hinzugegebenen Verbindungen keinerlei Avermectinverbindungen produziert. Der Stamm glycosyliert, er führt jedoch keine C5-O-Methylierung durch. Dem Stamm wurde das Gen für die C5-O-Methyltransferase und ein Teil der für die Synthese der Avermectinaglyconstruktur erforderlichen DNA entzogen.
Die morphologischen Eigenschaften von Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, sind wie folgt:
Es folgt eine allgemeine Beschreibung des Streptomyces avermitilis- Stammes MA6941. Die Kultur wird zur Glycosylierung von Avermectin-Monosacchariden, -Aglykonen oder -14a-Hydroxyderivaten ohne nebenhergehende Methylierung verwendet. Die Wachstumsbeobachtungen, allgemeinen Kultureigenschaften und Kohlenstoffquellenverwertung wurden gemäß den Verfahren von Shirling und Gottleib (Internat. J. System. Bacteriol. 16: 313-340) durchgeführt. Die chemische Zusammensetzung der Zellen wurde durch Anwendung der Verfahren von Lechevalier und Lechevalier (in Actinomycete Taxonomy, A. Dietz und D. W. Thayer, Hrgs., Society for Industrial Microbiology, 1980) ermittelt. Die Färbung der Kultur wurde durch Vergleich mit Farbstandards, die in den Inter-Society Color Council-National Bureau of Standards Centroid Color Charts (US Dept. of Commerce National Bureau of Standards, Ergänzung zu NBS Circular 553, 1985) enthalten sind, ermittelt.
Analyse der Zellwandzusammensetzung - Peptidoglycan enthält LL-Diaminopimelinsäure.
Allgemeine Wachstumseigenschaften - Guter Wuchs auf Hefe-Malzextrakt-Agar (YME), Glycerin-Asparaginsäure-Agar, Anorg.-Salz-Stärke-Agar, Hafermehl, Trypticase-Soja-Agar und Pepton-Eisen-Agar. Schlechter Wuchs auf Czapek- Agar und Leitungswasser-Agar, das mit NZ-Amin (Shefield Chemical Co.) angereichert ist. Die Kultur wächst auch in Trypton-Hefeextaktbrühe. Die Kultur wächst bei 27ºC und bei 37ºC.
Kolonie-Morphologie - (auf YME bei 21 Tagen) Das Substrat-Myzel ist hellbraun. Das Luftmyzel weiß. Sporenmasse reichlich und mit heller grünlich-grauer Färbung. Melanoid-Pigment wird produziert. Die Kolonien sind opak, angehoben und haben ganze Ränder mit gummiartiger Konsistenz mit matter Oberflächentextur.
Mikromorphologie - Luftmyzelien (0,57 - 0,76 um) erheben sich aus den Substratmyzelien und sind verzweigt, kurz und biegsam. Bei reifen Kulturen (7-28 Tage nach der Beimpfung) endet das Luftmyzel in spiralförmigen Sporenketten, die gelegentlich in knopfartigen Strukturen enden. Diese Eigenschaft ist besonders in Bereichen mit dichter Luftmyzelentwicklung beobachtbar. Sporenbildung tritt auf YME, Anorg.-Salz-Stärke-Agar, Hafermehl, Glycerin-Asparaginsäure-Agar, Leitungswasseragar mit NZ-Amin und Czapek-Agar auf.
Verschiedene physiologische Reaktionen - Die Kultur erzeugt in Pepton- Eisen-Agar H&sub2;S. Melanoid-Pigmente werden in TY-Brühe und auf YME, Trypticase-Soja- und Pepton-Eisen-Agar-Schrägröhrchen gebildet. Stärke ist nach 21 Tagen schwach hydrolysiert, nicht jedoch 14 Tage nach der Beimpfung. Das Kohlenstoffverwertungsmuster ist wie folgt: Gute Verwertung von D-Fructose, α-D-Glucose, α-D-Lactose, β-D-Lactose, D-Mannit, D-Mannose, L- Rhamnose, D-Xylose; mäßige Verwertung von L-Arabinose, Inositol, D- Maltose, D-Raffinose; schlechte Verwertung von D-Arabinose, Saccharose.
Die Tabellen 1 und 2 fassen die Kultureigenschaften und die Kohlenhydratverwertung von Streptomyces avermitilis MA6941 zusammen.
Diagnose - Diese Ergebnisse sind besser als die veröffentlichte Beschreibung des Streptomyces-avermitilis-Mutterstamms. TABELLE 1 Kultureigenschaften von Streptomyces avermitilis MA6941 bei 21 Tagen

TABELLE 2

Kohlenhydratverwertungsmuster von Streptomyces avermitilis MA6941 bei 21 Tagen

Kohlenstoffquelle Verwertung

D-Arabinose 1
L-Arabinose 2
D-Fruktose 3
Inositol 2
α-D-Lactos 3
β-D-Lactose 3
D-Maltose 2
D-Mannit 3
D-Mannose 3
D-Raffinose 2
L-Rhamnose 3
Saccharose 1
D-Xylose
a-D-Glucose (Kontrolle) 3
3 = gute Verwertung
2 = mäßige Verwertung
1 = geringe Verwertung
0 = keine Verwertung
Das Verfahren, das den neuen Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung verwendet, wird am besten durch das folgende Reaktionsschema veranschaulicht:
In dem obigen Reaktionsschema bedeutet die gestrichelte Linie in der 22,23-Stellung eine Einfach- oder Doppelbindung in der 22,23-Stellung;
R&sub1; liegt nur vor, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung in der 22,23-Stellung bedeutet, und ist Wasserstoff, Hydroxy oder Hydroximino,
R&sub2; ist Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen,
R&sub3; ist Hydroxy, Oxo, Methoxy oder Acetoxy, und
R&sub4; ist Wasserstoff, β-Hydroxy oder
worin n 0 oder 1 ist,
m ist 1 oder 2,
R&sub6; ist Hydroxy, Amino, Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Dialkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder (Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen)- (Alkanoyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen)-Amino, und
R&sub5; ist Wasserstoff oder Hydroxy.
Die obigen Verbindungen der Formeln II und III sind aktive Anthelmintika.
In dem obigen Reaktionsschema sind die folgenden Verbindungen neue Verbindungen und wirksame Anthelmintika.
In dem obigen Reaktionsschema sind die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung definiert, wenn die gestrichelte Linie in der 22,23-Stellung eine Einfach- oder eine Doppelbindung in der 22,23-Stellung bedeutet,
R&sub1; nur vorliegt, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung in der 22,23-Stellung bedeutet, und Wasserstoff oder Hydroxy ist,
R&sub2; Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen ist,
R&sub3; Hydroxy oder Methoxy ist, und
R&sub4; Wasserstoff oder β-Hydroxy ist.
Das vorliegende Verfahren wird durchgeführt, indem eine Verbindung der Formel I zu der Streptomyces-avermitilis-MA6941-Fermentationsbrühe hinzugegeben und die Fermentation wie nachstehend beschrieben durchgeführt wird. Die Verbindungen der Formel II werden gebildet, wenn R&sub5; Hydroxy ist, und die Verbindungen der Formel III werden gebildet, wenn R&sub5; Wasserstoff ist und R&sub4; Hydroxy ist. Ebenfalls möglich sind Verbindungen mit einer Oleandrose-Substitution sowohl in den 13- als auch 14a-Stellungen, wenn beide Reste R&sub4; und R&sub5; Hydroxy sind.
Die Verbindungen der Formel I werden durch Fermentation einer Kultur von Streotomyces lavendulae MA 6555 m ATCC 14159 in Gegenwart einer Avermectinverbindung mit der normalen 14-Methylgruppe hergestellt. Die allgemeinen Bedingungen für die Fermentation sind denen ähnlich, die für die vorliegende Fermentation eingesetzt werden. Spezielle Beispiele, welche die Herstellung von solchen Verbindungen beschreiben, sind in dieser Beschreibung enthalten. Zusätzlich werden bestimmte 14a-Hydroxyverbindungen wie in der EP144285 beschrieben synthetisch hergestellt. Die Verbindung der Formel I kann zu einer beliebigen Zeit während der Fermentationsperiode zu der Fermentationsbrühe zugegeben werden, es hat sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, das Ausgangsmaterial zuzugeben, nachdem man die Fermentation eine Zeit lang hat ablaufen lassen, wobei man dem Mikroorganismus genügend Zeit läßt, um auf das Ausgangsmaterial einzuwirken, bevor die Fermentationszeit abgelaufen ist. Im allgemeinen wird das Ausgangsmaterial zugegeben, nachdem die Fermentationszeit zu wenigstens 10% abgelaufen ist, jedoch bevor sie zu 75% abgelaufen ist. Vorzugsweise wird das Ausgangsmaterial zugegeben, wenn 20% bis 50% der angesetzten Fermentationszeit abgelaufen sind.
Das Ausgangsmaterial wird in Mengen von 0,1 bis 10 mg pro ml Fermentationsbrühe zu der Fermentationsbrühe hinzugegeben. Vorzugsweise wird das Ausgangsmaterial in Mengen von 1 bis 8 mg pro ml Fermenationsbrühe zugegeben.
Die bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich, wenn in der obigen Strukturformel II:
die gestrichelte Linie in der 22,23-Stellung eine 22,23-Doppelbindung bedeutet und R&sub1; nicht vorhanden ist,
R&sub2; Isopropyl oder sek.-Butyl ist,
R&sub3; Hydroxy ist und
R&sub4; Wasserstoff oder Hydroxy ist, besonders bevorzugt Wasserstoff oder β-Hydroxy.
Der oben beschriebene Stamm Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, ist ein Beispiel für einen Stamm, der zur Herstellung der vorliegenden Verbindungen eingesetzt werden kann. Die vorliegende Erfindung umfaßt jedoch auch Mutanten des oben beschriebenen Mikroorganismus. Zum Beispiel sind diejenigen Mutanten, die durch natürliche Auswahl erhalten werden, oder diejenigen, die durch Mutationsmittel, einschließlich ionisierender Strahlung, wie z. B. Ultraviolettbestrahlung, oder chemischer Mutagene, wie z. B. Nitrosoguanidin, oder durch ähnliche Behandlungen hergestellt werden, ebenfalls vom Umfang dieser Erfindung umfaßt.
Die vorliegenden Verbindungen werden während der aeroben Fermentation geeigneter wäßriger Nährmedien unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen mit einem nichtproduzierenden Stamm Strentomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292 erzeugt. Wäßrige Medien, wie z. B. diejenigen, die zur Herstellung vieler antibiotischer Substanzen verwendet werden, eignen sich für dieses Verfahren zur Herstellung dieser macrocyclischen Verbindung. Solche Nährmedien enthalten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die von dem Mikroorganismus assimiliert werden können, und im allgemeinen geringe Mengen an anorganischen Salzen. Zusätzlich können die Fermentationsmedien kleine Mengen anorganischer Salze und Spurenmengen von Metallen enthalten, die für das Wachstum der Mikroorganismen und zur Herstellung der erwünschten Verbindungen notwendig sind. Diese liegen im allgemeinen in ausreichenden Konzentrationen in den komplexen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die als Nährquellen verwendet werden können, vor, falls erwünscht können sie aber natürlich auch separat zu dem Medium hinzugegeben werden.
Im allgemeinen sind Kohlenhydrate, wie z. B. Zucker, zum Beispiel Dextrose, Saccharose, Maltose, Lactose, Dextran, Cerelose, Maismehl, Hafermehl und dergleichen, und Stärken geeignete Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in den Nährmedien. Die genaue Menge der Kohlenstoffquelle, die in dem Medium verwendet wird, wird zum Teil von den anderen Bestandteilen in dem Medium abhängen, üblicherweise erweist sich jedoch eine Kohlenhydratmenge zwischen 0,5 und 5 Gew.-% des Mediums als zufriedenstellend. Diese Kohlenstoffquellen können einzeln verwendet werden, oder es können mehrere solcher Kohlenstoffquellen in demselben Medium kombiniert werden.
Verschiedene Stickstoffquellen, wie z. B. Hefehydrolysate, Hefeautolysate, Hefezellen, Tomatenpaste, Maismehl, Hafermehl, Sojabohnenmehl, Caseinhydrolysate, Hefeextrakte, Maisquellwasser, lösliche Schlempeanteile, Baumwollsamenöl, Fleischextrakt und dergleichen, sind von Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, bei der Herstellung der vorliegenden Verbindungen leicht assimilierbar. Die verschiedenen Stickstoffquellen können alleine oder in Kombination in Mengen, die von 0,2 bis 6 Gew.-% des Mediums reichen, verwendet werden.
Unter den anorganischen Nährsalzen, die in die Kulturmedien eingebracht werden können, sind die herkömmlichen Salze, die in der Lage sind, Natrium, Kalium, Magnesium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Carbonat und ähnliche Ionen bereitzustellen. Ebenfalls umfaßt sind Spurenmetalle, wie z. B. Kobalt, Mangan und dergleichen.
Es sollte beachtet werden, daß die nachstehend und in den Beispielen beschriebenen Medien nur beispielhaft für die große Vielfalt an einsetzbaren Medien und nicht als Beschränkung gedacht sind.
Es folgen Beispiele für Medien, die zur Kultivierung von Stämmen von Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, geeignet sind.

MEDIUM 1

Glucose 5 g
Handelsüblicher brauner Zucker 10 g
Trypton 5 g
Hefeextrakt 2,5 g
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 36 mg
Betain 1,29 g
Natriumpropionat 0,11 g
Destilliertes WO 1100 ml
pH 7,0-pH 7,2

MEDIUM 2

Saccharose 15 g
Pepton 5,0 g
Hefeextrakt 2,5 g
L-Arginin 0,5 g
Destilliertes H&sub2;O 1000 ml
pH 7,0

MEDIUM 3

Glucose 50 g
NaCl 5,0 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 2,0 g
CaCO&sub3; 6,0 g
Propanol 5 g
Sojamehl 30 g
Destilliertes Wasser 1000 ml

MEDIUM 4

Lösliche Stärke 15 g
Soytone 20 g
CaCl&sub2; 0,1 g
Hefeextrakt 1,5 g
Sojaöl 50 ml
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) 10 5 ml

MEDIUM 5

K&sub2;HPO&sub4; 450 mg
Saccharose 2,0 g
Casein 1,5 g
NaCl 50 mg
L-Arginin 15 mg
Spurenelementmischung A 1,0 ml
Destilliertes Wasser 1000 ml
pH 6,9

SPURENELEMENTMISCHUNG

Citronensäure 46,2 mg
FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 2,0 mg
ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O 1,0 mg
MnCl&sub2; · 4H&sub2;O 0,8 mg
CoCl&sub2; · 6H&sub2;O 0,1 mg
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 50 ml
Ascorbinsäure 0,12 mg
H&sub2;O 160 ml

MEDIUM 6

Baumwollsamenöl 5,0 g
Hefeextrakt 0,5 g
Dextrose 4,5 g
Sojabohnenöl 0,5 ul
CaCO&sub3; 0,6 g
Spurenelementmischung 1,0 ml
Destilliertes H&sub2;O 1000 ml
Die Fermentationen mit Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, können bei Temperaturen durchgeführt werden, die von etwa 20ºC bis etwa 40ºC reichen. Für optimale Ergebnisse ist es am zweckmäßigsten, diese Fermentationen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 24ºC bis etwa 30ºC durchzuführen. Temperaturen von etwa 27º-28ºC sind besonders bevorzugt. Der pH-Wert des Nährmediums, das sich zur Erzeugung der vorliegenden Verbindungen eignet, kann von etwa 5,0 bis etwa 8,5 variieren, wobei ein bevorzugter Bereich bei etwa 6,0 bis 7,5 liegt.
Fermentationen im kleinen Ansatz werden zweckmäßigerweise durchgeführt, indem geeignete Mengen des Nährmediums unter Anwendung bekannter Sterilverfahren in einen Kolben gegeben werden, der Kolben entweder mit Sporen oder vegetativem Zellwuchs von Streotomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, beimpft wird, der Kolben mit Watte lose verschlossen wird und man die Fermentation bei einer konstanten Raumtemperatur von etwa 30ºC auf einem Rotationsschüttler mit 95 bis 300 U/min etwa 2 bis 10 Tage lang ablaufen läßt. Für Arbeiten mit größeren Ansätzen ist es bevorzugt, die Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, welche mit einem Rührer und einem Mittel zur Belüftung des Fermentationsmediums ausgestattet sind. Das Nährmedium wird in dem Tank zubereitet und wird nach der Sterilisation mit einer Quelle vegetativem Zellwuchs von Streotomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, beimpft. Man läßt die Fermentation 1 bis 8 Tage lang bei einer Temperatur im Bereich von etwa 24ºC bis 37ºC weiterlaufen, wobei das Nährmedium gerührt und/oder belüftet wird. Der Belüftungsgrad hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. von der Größe des Fermenters, der Rührgeschwindigkeit und dergleichen. Im allgemeinen werden die größeren Fermentationsansätze mit etwa 95 bis 500 U/min und mit etwa 50 bis 500 Liter pro Minute Luft gerührt.
Die neuen Verbindungen dieser Erfindung werden nach Beendigung der Fermentation von Streptomyces avermitilis MA 6941, ATCC 55292, sowohl in dem wäßrigen Teil als auch den Myzelien des Fermentationsmediums gefunden und können wie nachstehend beschrieben daraus entfernt oder davon abgetrennt werden.
Die Abtrennung der neuen Verbindungen von der gesamten Fermentationsbrühe und die Gewinnung der Verbindungen wird durch Lösungsmittelextraktion und durch Anwendung chromatographischer Fraktionierungen mit verschiedenen chromatographischen Verfahren und Lösungsmittelsystemen durchgeführt.
Die vorliegenden Verbindungen haben eine geringe Löslichkeit in Wasser, in organischen Lösungsmitteln sind sie jedoch löslich. Diese Eigenschaft kann zweckmäßigerweise eingesetzt werden, um die Verbindung aus der Fermentationsbrühe zu gewinnen. Daher wird bei einem Gewinnungsverfahren die gesamte Fermentationsbrühe mit etwa einem gleichen Volumen eines organischen Lösungsmittels vereint. Obwohl ein beliebiges organisches Lösungsmittel eingesetzt werden kann, ist es bevorzugt, ein wasserunmischbares Lösungsmittel, wie z. B. Ethylacetat, Methylenchlorid, Chloroform, Methylethylketon und dergleichen, zu verwenden. Im allgemeinen sind mehrere Extraktionen wünschenswert, um eine maximale Ausbeute zu erzielen. Das Lösungsmittel entfernt die vorliegenden Verbindungen sowie andere Substanzen, denen die antiparasitäre Wirkung der vorliegenden Verbindungen fehlt. Wenn das Lösungsmittel ein wasserunmischbares Lösungsmittel ist, werden die Schichten getrennt und das organische Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Wenn das Lösungsmittel wassermischbar ist, kann es mit einem wasserunmischbaren Lösungsmittel extrahiert werden, um das mitgeschleppte Wasser abzutrennen. Dieses Lösungsmittel kann dann unter vermindertem Druck eingeengt werden. Der Rückstand wird auf eine Chromatographiesäule, die vorzugsweise Kieselgel enthält, gegeben. Die Säule hält die erwünschten Produkte und einige Verunreinigungen zurück, sie läßt jedoch viele der Verunreinigungen, insbesondere die nichtpolaren Verunreinigungen, hindurch. Die Säule wird mit einem mäßig polaren organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid, Chloroform oder Hexan, gewaschen, um weitere Verunreinigungen zu entfernen, und wird dann mit einer Mischung aus Methylenchlorid, Chloroform oder Hexan und einem organischen Lösungsmittel, das bevorzugt Aceton, Ethylacetat, Methanol, Ethanol oder dergleichen ist, gewaschen. Das Lösungsmittel wird eingedampft und der Rückstand unter Verwendung von Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie, präparativer Schichtchromatographie, Hochdruckflüssigchromatographie und dergleichen mit Kieselgel, Aluminiumoxid, Dextran-Gelen und dergleichen als das Chromatographiemedium mit verschiedenen Lösungsmitteln und Lösungsmittelkombinationen als Elutionsmittel weiter chromatographiert. Dünnschicht-, Hochdruck-, Flüssig- und präparative Schichtchromatographie können eingesetzt werden, um die Gegenwart der vorliegenden Verbindungen zu detektieren und diese zu isolieren. Die Verwendung der obigen Verfahren sowie anderer, den Fachleuten bekannter Verfahren, wird gereinigte Zusammensetzungen ergeben, welche die vorliegenden Verbindungen enthalten. Die Anwesenheit der erwünschten Verbindungen wird durch Analyse der verschiedenen Chromatographiefraktionen auf biologische Wirksamkeit gegen bestimmte Parasiten oder physikochemische Eigenschaften bestimmt. Die Strukturen der vorliegenden Verbindungen sind durch detaillierte Analysen der verschiedenen spektralen Eigenschaften der Verbindungen, insbesondere ihrer kernmagnetischen Resonanz-, Massen-, Ultraviolett- und Infrarotspektren, bestimmt worden.
Die vorliegenden Verbindungen sind wirksame endo- und ekto-antiparasitäre Mittel gegen Parasiten, insbesondere Helminthen, Ektoparasiten, Insekten und Akaride, die Menschen, Tiere und Pflanzen befallen, wodurch sie für die Gesundheit von Mensch und Tier, für die Landwirtschaft und zur Schädlingsbekämpfung in Haushalt und Industriebereichen von Nutzen sind.
Die Krankheit oder die Gruppe von Krankheiten, die im allgemeinen als Helminthiasis bezeichnet wird, wird durch Befall eines Wirttiers mit Parasitenwürmern, die als Helminthen bekannt sind, hervorgerufen. Helminthiasis ist ein weitverbreitetes und ernstes wirtschaftliches Problem bei domestizierten Tieren, wie z. B. Schwein, Schaf, Pferden, Rindern, Ziegen, Hunden, Katzen, Fischen, Büffel, Kamelen, Lamas, Renntieren, Labortieren, Pelztieren, Zootieren und exotischen Arten und Geflügel. Unter den Helminthen verursacht die als Nematoden bezeichnete Gruppe von Würmern eine weitverbreitete und oftmals ernsthafte Infektion bei verschiedenen Tierarten. Die häufigsten Nematodengattungen, welche die obengenannten Tiere befallen, sind Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostumum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Habronema, Druschia, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris und Parascaris. Einige davon, wie z. B. Nematodirus, Cooperia und Oesophagostomum, befallen hauptsächlich den Darmtrakt, während andere, wie z. B. Haemonchus und Ostertagia, sich bevorzugt im Magen aufhalten, während noch andere, wie z. B. Dictyocaulus, in den Lungen gefunden werden. Noch andere Parasiten können sich in anderen Geweben und Organen des Körpers befinden, wie z. B. im Herz und in den Blutgefäßen, im subkutanen und Lymphgewebe und dergleichen. Die als Helminthiasis bezeichneten parasitären Infektionen können zu Anämie, Unterernährung, Schwäche, Gewichtsverlust, zur schweren Schädigung der Wände des Darmtraktes und anderer Gewebe und Organe und, wenn sie nicht behandelt werden, zum Tod des befallenen Wirts führen. Die Verbindungen dieser Erfindung haben unerwartet hohe Wirkung gegen diese Parasiten und sind zusätzlich auch wirksam gegen Dirofilaria bei Hunden und Katzen, Nematospiroides, Syphacia, Aspiculuris bei Nagetieren, arthropode Ektoparasiten von Tieren und Vögeln, wie z. B. Zecken, Milben, Läuse, Flöhe, Schmeißfliegen, Lucilia sp. bei Schafen, beißende Insekten und solche zweiflüglige Wanderlarven, wie z. B. Hypoderma sp. bei Rindern, Gasterophilus bei Pferden und Cuterebra sp. bei Nagetieren und Fliegen-Lästlingen, einschließlich blutsaugenden Fliegen und Schmutzfliegen.
Die vorliegenden Verbindungen sind auch gegen Parasiten geeignet, die Menschen befallen. Die häufigste Parasitengattungen des menschlichen Gastrointestinaltrakts sind Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris und Enterobius. Andere medizinisch wichtige Parasitengattungen, die im Blut oder anderen Geweben und Organen außerhalb des Gastrointestinaltrakts gefunden werden, sind die Fadenwürmer, wie z. B. Wuchereria, Brugia, Onchocerca und Loa, Dracunuculus sowie extraintestinale Stadien der Darmwürmer Strongyloides und Trichinella. Die Verbindungen sind auch von Nutzen gegen den Menschen parasitierende Arthropoden, beißende Insekten und andere zweiflüglige Schädlinge, die Menschen plagen.
Die Verbindungen sind auch gegen Haushaltsschädlinge, wie z. B. die Schabe, Blatella sp., Kleidermotte, Tineola sp., Teppichkäfer, Attagenus sp., die Stubenfliege, Musca domestica, sowie Flöhe, Hausstaubmilben, Termiten und Ameisen wirksam.
Die Verbindungen sind auch gegen Schadinsekten in gelagertem Getreide, wie z. B. Tribolium sp., Tenebrio sp., und in landwirtschaftlichen Pflanzen, wie z. B. Aphiden, (Acyrthiosiphon sp.), gegen Wanderorthoptere, wie z. B. Heuschrecken, und gegen unentwickelte Stadien von auf Pflanzengewebe lebenden Insekten, nützlich. Die Verbindungen sind auch als Nematozide zur Bekämpfung von Bodennematoden und Pflanzenparasiten, wie z. B. Meloidogyne sp., geeignet, was für die Landwirtschaft wichtig sein kann. Die Verbindungen sind auch in hohem Maße zur Behandlung von mit Feuerameisennestern befallenen Anbauflächen geeignet. Die Verbindungen werden über dem befallenen Bereich in geringen Konzentrationen in Köderformulierungen, die zum Nest zurückgebracht werden, verstreut. Zusätzlich zu einem direkten, aber langsamen Beginn der toxischen Wirkung auf die Feuerameisen, hat die Verbindung durch Sterilisation der Königin eine Langzeitwirkung auf das Nest, wodurch das Nest wirkungsvoll vernichtet wird.
Die Verbindungen dieser Erfindung können in Formulierungen verabreicht werden, worin die Wirkverbindung innig mit einem oder mehreren inerten Bestandteilen vermischt ist und gegebenenfalls ein oder mehrere zusätzliche Wirkstoffe enthält. Die Verbindungen können in irgendeiner den Fachleuten bekannten Zusammensetzung zur Verabreichung an Menschen und Tiere, zum Ausbringen auf Pflanzen und zur Grundstücks- und Flächenausbringung zur Bekämpfung von Haushaltsschädlingen in entweder einer Wohn- oder Industrielage verwendet werden. Zur Anwendung bei Menschen und Tieren zur Bekämpfung innerer und äußerer Parasiten können feste oder flüssige orale Formulierungen oder parenterale flüssige, Implantat- oder Depotinjektionsformen verwendet werden. Zur topischen Verabreichung können Tauchbad, Spray, Pulver, Staub, Aufgieß-, Tüpfel-, Flüssigkeitsaufspritz- Formulierungen, Shampoos, Halsbänder, Anhänger oder Geschirr verwendet werden. Zur Ausbringung auf landwirtschaftliche Grundstücke oder Flächen können Flüssigsprays, Pulver, Staub oder Köderformen verwendet werden. Zusätzlich können "Durchfreß"-Formen verwendet werden, um Fliegen-Lästlinge, die sich von Tierkot ernähren oder darin fortpflanzen, zu bekämpfen. Die Verbindungen werden formuliert, z. B. durch Einkapseln, um einen Rückstand des Wirkstoffes in dem Tierkot zurückzulassen, der Schmutzfliegen oder andere Arthropodenschädlinge bekämpft.
Diese Verbindungen können oral in einer Einheitsdosisform, wie z. B. einer Kapsel, einem Bolus oder einer Tablette, oder als ein flüssiger Arzneitrank bei Verwendung als Anthelmintikum für Säugetiere verabreicht werden. Der Arzneitrank ist normalerweise eine Lösung, Suspension oder Dispersion des Wirkstoffes in der Regel in Wasser zusammen mit einem Suspensionsmittel, wie z. B. Bentonit, und einem Benetzungsmittel oder einem ähnlichen Hilfsstoff. Im allgemeinen enthalten die Arzneitränke auch ein Antischaummittel. Arzneitrank-Formulierungen enthalten im allgemeinen etwa 0,001 bis 0,5 Gew.-% der Wirkverbindung. Bevorzugte Arzneitrank- Formulierungen können 0,01 bis 0,1 Gew.-% enthalten. Die Kapseln und Boli enthalten den Wirkstoff vermischt mit einem Trägervehikel, wie z. B. Stärke, Talk, Magnesiumstearat oder Dicalciumphosphat.
Wenn es erwünscht ist, die vorliegenden Verbindungen in einer trockenen, festen Einheitsdosisform zu verabreichen, werden in der Regel Kapseln, Boli oder Tabletten, die die erwünschte Menge der Wirkverbindung enthalten, verwendet. Diese Dosisformen werden durch inniges und gleichmäßiges Vermischen des Wirkstoffes mit geeigneten feinteiligen Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Sprengmitteln und/ oder Bindemitteln, wie z. B. Stärke, Lactose, Talk, Magnesiumstearat, Pflanzengummen und dergleichen, hergestellt. Solche Einheitsdosisformulierungen können bezüglich ihres Gesamtgewichts und ihres Gehalts an antiparasitärem Mittel stark variiert werden, in Abhängigkeit von Faktoren, wie z. B. der Art des zu behandelnden Wirttiers, der Schwere und Art der Infektion und dem Gewicht des Wirts.
Wenn die Wirkverbindung durch ein Tierfutter verabreicht werden soll, wird sie innig in dem Futter dispergiert oder auf die Futteroberfläche aufgebracht oder in Form von Pellets oder einer Flüssigkeit verwendet, die dann dem Endfutter zugegeben oder gegebenenfalls getrennt verfüttert werden können/kann. Alternativ können einzelne Dosisformen auf Futterbasis verwendet werden, wie z. B. ein kaubarer Leckerbissen. Alternativ können die antiparasitären Verbindungen dieser Erfindung parenteral, z. B. durch intraruminale, intramuskuläre, intravaskuläre, intratracheale oder subkutane Injektion, an Tiere verabreicht werden, wobei der Wirkstoff in einem flüssigen Trägervehikel gelöst oder dispergiert wird. Zur parenteralen Verabreichung wird der Wirkstoff geeigneterweise mit einem annehmbaren Vehikel, vorzugsweise aus der Vielzahl von Pflanzenölen, wie z. B. Erdnußöl, Baumwollsamenöl und dergleichen, vermischt. Andere parenterale Vehikel, wie z. B. organische Präparate, die Solketal, Glycerinformal, Propylenglycol verwenden, und wäßrige parenterale Formulierungen werden ebenfalls verwendet. Die Wirkverbindung oder Wirkverbindungen wird/werden in der parenteralen Formulierung zur Verabreichung gelöst oder suspendiert; solche Formulierungen enthalten im allgemeinen 0,0005 bis 5 Gew.-% der Wirkverbindung.
Obwohl die Hauptanwendung der antiparasitären Mittel dieser Erfindung die Behandlung und/oder Prävention von Helminthiasis ist, sind sie auch zur Prävention und Behandlung von Erkrankungen, die durch andere Parasiten verursacht wurden, zum Beispiel durch Arthropoden-Parasiten, wie z. B. durch Zecken, Läuse, Flöhe, Milben und andere beißende Arthropoden, bei domestizierten Tieren und Geflügel geeignet. Sie sind auch bei der Behandlung parasitärer Erkrankungen, die bei anderen Tieren, einschließlich dem Mensch, auftreten, wirksam. Die zum Erzielen bester Ergebnisse eingesetzte optimale Menge wird natürlich von der speziellen verwendeten Verbindung, der zu behandelnden Tierart und der Art und Schwere der Parasiteninfektion oder des Parasitenbefalls abhängen. Im allgemeinen werden gute Ergebnisse bei unseren neuen Verbindungen durch die orale Verabreichung von etwa 0,001 bis 10 mg pro kg Tierkörpergewicht erhalten, wobei eine solche Gesamtdosis auf einmal oder in Teildosen über einen relativ kurzen Zeitraum, wie z. B. 1-5 Tage, zugeführt wird. Mit den bevorzugten Verbindungen der Erfindung wird eine ausgezeichnete Bekämpfung solcher Parasiten bei Tieren durch Verabreichung von etwa 0,025 bis 0,5 mg pro kg Körpergewicht in einer Einzeldosis erreicht. Wiederholungsbehandlungen werden nach Bedarf angewendet, um eine erneute Infektion zu bekämpfen, und sind von der Parasitenart und den verwendeten Landwirtschaftsverfahren abhängig. Die Verfahren zur Verabreichung dieser Materialien an Tiere sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Veterinärmedizin bekannt.
Wenn die hier beschriebenen Verbindungen als Bestandteil des Tierfutters verabreicht oder im Trinkwasser gelöst oder suspendiert werden, werden Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, worin die Wirkverbindung oder Wirkverbindungen innig in einem inerten Träger oder Verdünnungsmittel dispergiert ist/sind. Mit inertem Träger ist ein Träger gemeint, der nicht mit dem antiparasitären Mittel reagiert und der sicher an Tiere verabreicht werden kann. Vorzugsweise ist ein Träger zur Futterverabreichung ein Träger, der ein Bestandteil der Tierration ist oder sein kann.
Geeignete Zusammensetzungen sind u. a. Futtervormischungen oder -zusätze, worin der Wirkstoff in relativ großen Mengen vorliegt und die zur direkten Verfütterung an das Tier oder zur Beimengung zum Futter direkt oder nach einem Zwischenverdünnungs- oder -verschnittschritt geeignet sind. Typische, für solche Zusammensetzungen geeignete Träger oder Verdünnungsmittel sind u. a. z. B. Getreideschlempe, Maismehl, Citrusmehl, Fermentationsrückstände, gemahlene Austernschalen, Mühlennachprodukte des Weizens, lösliche Melasseanteile, Maisspindelmehl, eßbares gemahlenes Bohnenfutter, Sojaschrot, zerstoßener Kalkstein und dergleichen. Die Wirkverbindungen werden durch Verfahren, wie z. B. Zerkleinern, Rühren, Zermahlen oder Vermischen, innig ganz in dem Träger dispergiert. Zusammensetzungen, die etwa 0,005 bis 2,0 Gew.-% der Wirkverbindung enthalten, sind als Futtervormischungen besonders geeignet. Futterzusätze, die dem Tier direkt verfüttert werden, enthalten etwa 0,0002 bis 0,3 Gew.- % der Wirkverbindungen.
Solche Zusätze werden zu dem Tierfutter in einer Menge zugegeben, um dem fertigen Futter die zur Behandlung und Bekämpfung parasitärer Erkrankungen erwünschte Wirkverbindungskonzentration zu verleihen. Obwohl die erwünschte Wirkverbindungskonzentration in Abhängigkeit von den zuvor genannten Faktoren sowie von der speziellen verwendeten Verbindung variieren wird, werden die Verbindungen dieser Erfindung in der Regel in Konzentrationen zwischen 0,00001 und 0,002% im Futter verfüttert, um das erwünschte antiparasitäre Ergebnis zu erzielen.
Zur Verwendung der Verbindungen dieser Erfindung können die einzelnen Verbindungen hergestellt und in dieser Form verwendet werden. Alternativ können Mischungen der einzelnen Verbindungen oder anderer Wirkverbindungen, die nicht mit den Verbindungen dieser Erfindung verwandt sind, verwendet werden.
Die Verbindungen dieser Erfindung sind auch zur Bekämpfung landwirtschaftlicher Schädlinge geeignet, die Kulturpflanzen während sie wachsen oder während der Lagerung Schaden zufügen. Die Verbindungen werden unter Verwendung bekannter Verfahren als Sprays, Stäube, Emulsionen und dergleichen auf die wachsenden oder gelagerten Kulturpflanzen aufgetragen, um einen Schutz vor solchen landwirtschaftlichen Schädlingen zu bewirken.
Die folgenden Beispiele werden zum besseren Verständnis dieser Erfindung zur Verfügung gestellt; sie sollen nicht als Beschränkung der Erfindung aufgefaßt werden.

VERFAHREN UND BEISPIELE ZUR HERSTELLUNG VON 14a-HYDROXY- AVERMECTINEN/MILBEMYCINEN

KULTURBEDINGUNGEN

1. Herstellung gefrorener Kulturen

Ein L-Röhren (gefriergetrocknete Kultur) von Streptomyces lavendulae (MA6555 ATCC 14159) wird aseptisch in 250 ml Medium A in einem 2000- ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen übertragen und der Kolben an einem Rotationsschüttler (220 U/min) bei 27ºC bei 85%iger Feuchtigkeit 48 Stunden lang inkubiert. Zwei-Milliliter-Aliquote der Kultur wurden tiefgefroren und bei -80ºC gelagert und dienten als Quelle für gefrorene Kulturen.

2. Impfkulturen

Eine Ampulle mit tiefgefrorener Kultur (2 ml) wurde verwendet, um einen 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, der 50 ml Medium A enthielt, zu beimpfen. Die Kolben wurden an einem Rotationsschüttler (220 ml) bei 27ºC bei 85%iger Feuchtigkeit 24 Stunden lang inkubiert.

3. Transformationskulturen

Fünf ml entwickelte Impfkultur wurden verwendet, um 50 ml Medium B in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen; 13-Desoxyavermectin B&sub1;a (1-5 mg) oder 13-Desoxyavermectin B&sub1;b (0,2-1,0 mg) in DMSO wurde bei 0 Stunden hinzugegeben. Die Transformationskolben wurden 7 Tage lang bei 27ºC (220 U/min) bei 85%iger Feuchtigkeit inkubiert.

Medium A

Dextrose 1 g
Dextrin 10 g
Fleischextrakt 3 g
Ardaminine pH 5 g
NZ-Amin Typ E 5 g
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,05 g
K&sub2;HPO&sub4; 0,3 g
CaCO&sub3; 0,5 g
Destilliertes H&sub2;O 1000 ml

Medium B

Lösliche Stärke 30 g
Hycase SF 2 g
Fleischextrakt 1 g
Maisquellwasser 3 g
Morpholinpropansulfonsäure 30 g
Stelle auf pH 7,0 ein

ISOLIERUNG VON 14a-HYDROXYAVERMECTINEN

Die Kolben wurden mit drei 50-ml-Portionen CH&sub2;Cl&sub2; extrahiert. Die CH&sub2;Cl&sub2;- Extrakte wurden vereint und eingeengt. Die hydroxylierten Produkte wurden durch HPLC auf Dupont-Zorbax-ODS-Säulen unter Verwendung von CH&sub2;OH : H&sub2;O (85 : 15, 80 : 20 oder 70 : 30) als die mobile Phase isoliert, Die Strukturen der gereinigten Avermectine wurden durch NMR und Massenspektroskopie ermittelt.

SPEZIELLE BEISPIELE

Die folgenden Verbindungen wurden durch das obige Verfahren hergestellt:

Ausgangsmaterial Produkt

Herstellung 1

13-Desoxyavermectin-B&sub1;a-Aglykon 13-Desoxy-14a-hydroxyavermectin-B&sub1;a- Aglykon

Herstellung 2

13-Desoxyavermectin-B&sub1;a-Aglykon 13β-Hydroxy-14a-hydroxyavermectin- B&sub1;a-Aglykon

Herstellung 3

13-Desoxyavermectin-B&sub1;b-Aglykon 13β-Desoxy-14a-hydroxyavermectin-B&sub1;b- Aglykon

Herstellung 4

13-Desoxyaveremctin-B&sub1;b-Aglykon 13β-Hydroxy-14a-hydroxyavermectin- B&sub1;a-Aglykon

VERFAHREN UND BEISPIELE ZUR HERSTELLUNG VON 14a-O-OLEANDROSYL- AVERMECTINEN/MILBEMYCINEN

Kulturbedingungen

1. Inokulum-Erzeugung

Gefrorene vegetative Myzelien (FVM) von Streptomyces avermitilis MA 6941 ATCC 55292 wurden durch Beimpfen von 250 ml Impfmedium in einem 2-Liter-Kolben mit 3 Schikanen mit einer gefriergetrockneten Kultur und 16stündiger Inkubation bei 27ºC, 85%iger relativer Feuchtigkeit und 200 U/min hergestellt. Das gepackte Zellvolumen der Kultur betrug 10-15% und der pH-Wert 5,7-6,8. Aliquote der Kultur wurden tiefgefroren und als Inokulum-Quelle für zukünftige Versuche verwendet.

2. Impfkulturen

Zu 25 ml Impfkultur in einem 250-ml-Kolben mit 3 Schikanen wurden 1,0 ml FVM zugegeben und die Kolben bei 27ºC, 85%iger relativer Feuchtigkeit und 200 U/min 16 Stunden lang gerührt.

3. Biotransformation und Isolierung

Zu 22,5 ml Biotransformationsmedium wurden 1,0 ml Impfmedium zugegeben und die Kolben 48 Stunden lang bei 27ºC, 85%iger relativer Feuchtigkeit bei 200 U/min inkubiert. 1,0 mg 14a-Hydroxyavermectin B1a in 0,05 ml Dimethylsulfoxid wurden zugegeben und die Kolben 8 Tage lang bei 27ºC, 85%iger relativer Feuchtigkeit und 220 U/min inkubiert. Jeder Kolben wurde mit 50-ml-Portionen Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchlorid-Extrakte wurden vereint und eingeengt. Die Avermectinmonosaccharide wurden durch HPLC auf einer Dupont-Zorbax-ODS-Säule unter Verwendung von Methanol : Wasser (85 : 15, 80 : 20, 70 : 30) als die mobile Phase isoliert. Die Strukturen der gereinigten Avermectine wurden durch Massen- und NMR-Spektroskopie ermittelt.

Impfmedium

Difco-Hefeextrakt 20 g/l
Hycase S. F. 20 g/l
Dextrose 20 g/l
KNO&sub3; 2,0
NaCl 0,5
MnSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,005
ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,01
CaCl&sub2; · 6 H&sub2;O 0,02
FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,025
pH = 7,0

Biotransformationsmedium

Peptonisierte Milch 17,5 g/l
Ardamine pH 2,7 g/l
Dextrose 75 g/l
CuSO&sub4; · 5H&sub2;O 0,00006 g/l
ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,001 g/l
CoCl&sub2; · 6H&sub2;O 0,0001 g/l
FeCl&sub3; · 6H&sub2;O 0,003 g/l
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,5 g/l
pH = 7,2

Folgende Verbindungen wurden hergestellt:

13-Desoxy-14a-hydraxyavermectin-B1a-Aglykon → 13-Desoxy-14a-O-oleandrosyloxyavermect-B1a-Aglykon
13-Desoxy-14a-hydroxyavermectin-B1b-Aglykon → 13-Desoxy-14a-O-oleandrosyloxyavermectin-B1b-Aglykon
13-Desoxy-14a-hydroxy-22,23-dihydroavermectin-B1a-Aglykon → 13-Desoxy-14a-O-oleandrosyloxy-22,23-dihydroavermecin-B1a-Aglykon
13-Desoxy-14a-hydroxy-22,23-dihydroavermectin-B1b-Aglykon → 13-Desoxy-14a-O-oleandrosyloxy-22,23-dihydroavermectin-B1b-Aglykon
13β-14a-Hydroxyavermectin-B1a-Aglykon → 13β-14a-O-Oleandrosylavermectin-B1a-Aglykon
13β-14a-Hydroxyavermectin-B1a-Aglykon → 13β-14a-Hydroxyavermectin-B1a-Monosaccharid
13β-14a-Hydroxyavermectin-B1b-Aglykon → 13β-14a-O-Oleandrosyloxyavermectin-B1b-Aglykon
13β-14a-Hydroxyaveremctin-B1b-Aglykon → 13β-14a-Hydroxyavermectin-B1a-Monosaccharid
13β-14a-Hydroxy-22,23-dihydroavermectin-B1a-Aglykon → 13β-14a-O-Oleandrosyloxy-22,23-dihydroavermectin-B1a-Aglykon
13β-14a-Hydroxy-22,23-dihydroavermectin-B1a-Aglykon → 13β-14a-Hydroxy-22,23-dihydroavermectin-B1a-Monosaccharid
13β-14a-Hydroxy-22,23-dihydroavermectin-B1b-Aglykon → 14β-14a-O-Oleandrosyloxy-22,23-dihydroavermectin-B1b-Aglykon
Avermectin-B1a/B1b-Aglykon → Avermectin B1a/B1b-(Disaccharid)
Avermectin-B2a-Aglykon → Avermectin-B2a-(Disaccharid)
22,23-Dihydroavermectin-B1a/B1b-Aglykon → 22,23-Dihydroavermectin-B1a/B1b- (Disaacharid)
13β-22,23-Dihydroavermectin-B1a/B1b-Aglykon → 13β-22,23-Dihydroavermectin-B1a/B1b-Monosaccharid
13β-14a-Hydroxyavermectin-B1a-Aglykon → 13β-14a-Hydroxyavermectin-B1a-Manosaccharid
13β-Avermectin-B1a/B1b-Aglykan → 13β-Avermectin-B1a/B1b-Monosaccharid
13β-Hydroxymilbemycin 3 → 13β-O-Oleandrosyloxymilbemycin 3
13β-Hydroxymilbemycin 4 → 13β-O-Oleandrosyloxymilbemycin 4
13β-Hydroxynemadectin → 13β-O-Oleandrosyloxynemadectin

Claims

1. Eine biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Streptomyces avermitilis, ATCC 55292, oder einer Mutante davon, der/die in der Lage ist, Verbindungen mit der Formel:

zu erzeugen, worin:

R&sub1; nur vorliegt, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung in der 22,23-Stellung bedeutet, und Wasserstoff, Hydroxy oder Hydroximino ist,

R&sub2; Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen ist,

R&sub3; Hydroxy, Methoxy, Oxo oder Acetoxy ist und

R&sub4; Wasserstoff, β-Hydroxy oder

ist,

worin n 0 oder 1 ist,

m 1 oder 2 ist,

R&sub6; Hydroxy, Amino, Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Dialkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder (Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen)(Alkanoyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen)-Amino ist und

R&sub5; Wasserstoff oder Hydroxy ist,

und worin die Fermentation des Mikroorganismus in einem wäßrigen Medium aus assimilierbaren Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganisch.-Salz- Quellen und einer Verbindung mit der Formel:

durchgeführt wird, worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; wie oben definiert sind.

2. Die Kultur nach Anspruch 1, der die DNA fehlt, die das Gen zur C5-O-Methylierung und zur Synthese der Avermectinaglykonstruktur enthält.

3. Ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit der Formel:

worin:

R&sub3; Hydroxy, Methoxy, Oxo oder Acetoxy ist und

R&sub4; Wasserstoff, β-Hydroxy oder

ist,

worin n 0 oder 1 ist,

m 1 oder 2 ist,

R&sub5; Wasserstoff oder Hydroxy ist, welches die Fermentation einer Kultur von Streptomyces avermitilis, ATCC 55292, in einem wäßrigen Medium aus assimilierbaren Kohlenstoff-, Stickstoff- und anorganisch.-Salz-Quellen und einer Verbindung mit der Formel:

worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; wie oben definiert sind, umfaßt.

4. Eine Verbindung mit der Formel:

worin die gestrichelte Linie in der 22,23-Stellung eine Einfach- oder eine Doppelbindung in der 22,23-Stellung bedeutet,

R&sub1; nur vorliegt, wenn die gestrichelte Linie eine Einfachbindung in der 22,23-Stellung bedeutet, und Wasserstoff oder Hydroxy ist,

R&sub3; Hydroxy oder Methoxy ist,

R&sub4; Wasserstoff, β-Hydroxy oder

ist,

worin n 0 oder 1 ist, und

R&sub6; Hydroxy, Amino, Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Dialkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen oder (Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen)- (Alkanoyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen)-Amino ist.

5. Eine Zusammensetzung, die einen inerten Träger und eine wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 4 enthält.

6. Ein Verfahren zur Behandlung von Parasiteninfektionen bei Pflanzen oder Pflanzenfrüchten, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung nach Anspruch 4 an solche Pflanzen, an die Erde, in der solche Pflanzen wachsen, oder an die Früchte solcher Pflanzen umfaßt.

7. Die Verwendung einer wie in Anspruch 4 beanspruchten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Parasitenerkrankungen von Tieren.