KR20040053390A - 아베르멕틴의 비2:비1의 비를 제어할 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유전자 - Google Patents

아베르멕틴의 비2:비1의 비를 제어할 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유전자 Download PDF

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KR20040053390A KR10-2004-7008310A KR20047008310A KR20040053390A KR 20040053390 A KR20040053390 A KR 20040053390A KR 20047008310 A KR20047008310 A KR 20047008310A KR 20040053390 A KR20040053390 A KR 20040053390A
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가토요시히로
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Abstract

본 발명은 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)의 발효 배양물에서 생산되는 아베르멕틴의 계열 2:1의 비 또는 양을 변화시키기 위해 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 벡터, 숙주 세포, 및aveC유전자가 불활성화되거나 또는 생산되는 아베르멕틴의 계열 2:1의 비 또는 양을 변화시키기 위해 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 돌연변이주에 관한 것이다.

Description

아베르멕틴의 비2:비1의 비를 제어할 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유전자{STREPTOMYCES AVERMITILIS GENE DIRECTING THE RATIO OF B2:B1 AVERMECTINS}
본 발명은 아베르멕틴을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 주로 동물 건강 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)의 배양물을 발효시켜 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 조절하기 위해 사용될 수 있는, AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 이러한 폴리뉴클레오티드 분자를 탐색하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한aveC유전자가 생산되는 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 조절할 수 있도록 돌연변이된 벡터, 형질전환된 숙주 세포, 및 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 돌연변이주에 관한 것이다.
아베르멕틴
스트렙토마이세스 종은 강력한 구충제 및 살충제 활성을 갖는 연관된 16원의 거대환상 락톤의 8종의 시리즈를 포함하는 아베르멕틴을 비롯하여 광범위한 2차 대사산물을 생산한다. 구별되지만 매우 관련되어 있는 8종의 화합물들을 A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a 및 B2b로 지칭한다. "a" 계열의 화합물들은 25번 탄소 위치의 치환체가 (S)-2급-부틸인 천연 아베르멕틴을 지칭하고, "b" 계열의 화합물들은 25번 탄소 위치의 치환체가 이소프로필인 화합물들을 지칭한다. "A" 및 "B"의 표시는 5번 탄소 위치의 치환체가 각각 메톡시 및 하이드록시인 아베르멕틴을 지칭한다. 숫자 "1"은 이중 결합이 22번과 23번 탄소 위치에 존재하는 아베르멕틴을 지칭하며, 숫자 "2"는 22번 탄소 위치에 수소 그리고 23번 탄소 위치에 하이드록시를 갖는 아베르멕틴을 지칭한다. 이와 같은 연관된 아베르멕틴들 중에서, B1 유형의 아베르멕틴은 가장 효과적인 구충제 및 살충제 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 따라서 상업적으로 가장 바람직한 아베르멕틴이다.
아베르멕틴, 및 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 호기성 발효에 의한 그의 생산은 미국 특허 제 4,310,519 호 및 제 4,429,042 호에 기술되어 있다. 천연 아베르멕틴의 생합성은 이소부티르산 및 S-(+)-2-메틸부티르산의 CoA 티오에스테르 유사체로부터 내인적으로 개시되는 것으로 생각된다.
무작위(random) 돌연변이 유발법을 통한 균주의 개발 및 외인적으로 공급된 지방산을 사용하는 방법을 조합함으로써, 아베르멕틴 유사체를 효율적으로 생산할 수 있었다. 분지쇄 2-옥소산 디하이드로게나제가 결손된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 돌연변이주(bkd 결손된 돌연변이주)는 발효시 지방산을 보충해주어야만 아베르멕틴을 생산할 수 있다. 분지쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 활성이 결손된 돌연변이주(예를 들어, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스, ATCC 53567)를 탐색하고 단리하는 것은 유럽 특허(EP) 제 276103 호에 기술되어 있다. 이러한 돌연변이주를 외인적으로 공급된 지방산의 존재하에 발효시킴으로써, 사용된 지방산에 상응하는 4종의 아베르멕틴만을 생산할 수 있다. 따라서, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(ATCC 53567)를 S-(+)-2-메틸부티르산을 보충하면서 발효시키면 천연 아베르멕틴 A1a, A2a, B1a 및 B2a가 생산되고, 이소부티르산을 보충하면서 발효시키면 천연 아베르멕틴 A1b, A2b, B1b 및 B2b가 생산되며, 사이클로펜탄카복실산을 보충하면서 발효시키면 4종의 신규한 사이클로펜틸아베르멕틴 A1, A2, B1 및 B2가 생산된다.
그밖의 지방산으로 보충하면서 발효시키면 신규한 아베르멕틴이 생산된다. 800종의 가능성있는 전구체들에 대해서 탐색함으로써, 60종 이상의 다른 신규한 아베르멕틴이 확인되었다(예를 들어, 두톤(Dutton) 등의 문헌[J. Antibiot.,44, 357-365, 1991] 및 뱅크스(Banks) 등의 문헌[Roy. Soc. Chem.,147, 16-26, 1994] 참조). 또한, 5-O-메틸트랜스퍼라제 활성이 결손된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 돌연변이주는 본질적으로 B 유사체 아베르멕틴만을 생산한다. 결과적으로, 분지쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 및 5-O-메틸트랜스퍼라제 활성이 모두 손실된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 돌연변이주는 발효시에 보충물질로서 사용된 지방산에 상응하는 B 아베르멕틴만을 생산한다. 따라서, 이러한 이중 돌연변이주를 S-(+)-2-메틸부티르산을 보충하면서 발효시키면 천연 아베르멕틴 B1a 및 B2a만을 생산하는 반면, 이소부티르산 또는 사이클로펜탄카복실산을 보충하면서 발효시키면 각각 천연 아베르멕틴 B1b 및 B2b 또는 신규한 사이클로펜틸 B1 및 B2 아베르멕틴이 생산된다. 상기 이종 돌연변이주를 사이클로헥산 카복실산으로 보충하면서 발효시키는 것이 상업적으로 중요한 신규한 아베르멕틴인 사이클로헥실아베르멕틴 B1(도라멕틴)을 생산하는 바람직한 방법이다. 이러한 이중 돌연변이주, 예를 들어 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(ATCC 53692)의 단리 방법 및 특성은 EP 제 276103 호에 기술되어 있다.
아베르멕틴 생합성에 관련된 유전자
대부분의 경우, 2차 대사산물의 생산에 관련된 유전자 및 특정 항생물질을 암호화하는 유전자는 염색체상에 함께 몰려있음이 밝혀졌다. 이러한 예로서 스트렙토마이세스 폴리케티드 신타제 유전자 클러스터(PKS)를 들 수 있다(합우드(Hopwood) 및 쉐어맨(Sherman)의 문헌[Ann. Rev. Genet.,24, 37-66, 1990] 참조). 따라서, 생합성 경로의 유전자를 클로닝하는 한 가지 전략은 약제 저항성 유전자를 단리한 후, 특정 항생물질의 생합성에 관련된 다른 유전자에 대해서 염색체의 이웃 영역을 시험하는 것이었다. 중요한 대사산물의 생합성에 관련된 유전자를 클로닝하는 또다른 전략은 돌연변이주를 보충시키는 것이었다. 예를 들어, 특정 대사산물을 생산할 수 있는 유기체로부터의 DNA 라이브러리(library)의 일부분을 비-생산성 돌연변이주에 도입시켜, 대사산물을 생산하는 형질전환체를 탐색하는 것이다. 또한, 다른 스트렙토마이세스 종으로부터 유래한 탐침을 사용하여 라이브러리를 혼성화시키는 방법을 사용함으로써, 생합성 경로의 유전자를 확인하고 클로닝할 수 있다.
다른 스트렙토마이세스 유래 2차 대사산물의 생합성에 필요한 유전자(예를 들어, PKS)와 같이 아베르멕틴 생합성에 관련된 유전자(ave유전자)는 염색체상에 몰려있는 것으로 밝혀졌다. 수많은ave유전자는 아베르멕틴 생합성이 차단된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 돌연변이주를 보충하는 벡터를 사용하여 성공적으로 클로닝되어 왔다. 이러한 유전자의 클로닝은 미국 특허 제 5,252,474 호에 기술되어 있다. 또한, 이케다(Ikeda) 등의 문헌[J. Antibiot.,48,532-534, 1995]에는 22번 및 23번 탄소의 탈수 단계에 관련된 염색체 영역(aveC)을 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 4.82kbBamHI 단편에 위치시키는 방법 뿐만 아니라 단일 성분 B2a 생산자를 제조할 수 있도록aveC유전자를 돌연변이시키는 방법이 기술되어 있다. 강력한 구충제 화합물인 이베르멕틴은 아베르멕틴 B2a로부터 화학적으로 제조될 수 있으므로, 이러한 아베르멕틴 B2a의 단일 성분 생산자는 이베르멕틴의 상업적인 생산에 특히 유용한 것으로 여겨진다.
생산되는 아베르멕틴의 복잡한 종류를 최소화시키는aveC유전자의 돌연변이주, 예를 들어 아베르멕틴 B2:B1의 비를 감소시키는 돌연변이주를 동정함으로써, 상업적으로 중요한 아베르멕틴를 간단하게 생산하고 정제할 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)의 배양물을 발효시켜 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 조절하기 위해 사용될 수 있는, AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 이러한 폴리뉴클레오티드 분자를 탐색하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한aveC유전자가 생산되는 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 조절할 수 있도록 돌연변이된 벡터, 형질전환된 숙주 세포, 및 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 돌연변이주를 제공하는 것이다.
도 1은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF를 포함하는 DNA 서열(서열번호: 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호: 2)을 도시한 것이다.
도 2는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveC유전자의 전체 ORF를 포함하는 플라스미드 벡터 pSE186(ATCC 209604)을 도시한 것이다.
도 3은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF로 삽입된 사카로폴리스포라 에리트래아(Saccharopolyspora erythraea)의ermE유전자를 포함하는 유전자 치환용 벡터 pSE180(ATCC 209605)을 도시한 것이다.
도 4는 확인된 5가지 중첩 코스미드 클론(즉, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69)과 함께 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유래의 아베르멕틴 폴리케티드 신타제 유전자 클러스터의BamHI 제한 지도를 도시한 것이다. pSE118 및 pSE119의 관계도 표시되어 있다.
도 5a 내지 5d는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주에서 생산된 발효 산물의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다. 피크의 정량화는 사이클로헥실 B1의 표준량과 비교하여 수행하였다. 사이클로헥실 B2의 체류 시간은 7.4 내지 7.7분이었고, 사이클로헥실 B1의 체류 시간은 11.9 내지 12.3분이었다. 도 5a는 불활성화된aveCORF를 갖는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11이다. 도 5b는 pSE186(ATCC 209604)으로 형질전환된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11이다. 도 5c는 pSE187로 형질전환된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11이다. 도 5d는 pSE188로 형질전환된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11이다.
도 6은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveCORF에 의해서 암호화된 추론된 아미노산 서열(서열번호: 2), 스트렙토마이세스 그리세오크로모제네스 (Streptomyces griseochromogenes)의aveC동족체의 일부 ORF에 의해서 암호화된 추론된 아미노산 서열(서열번호: 5), 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus)의aveC동족체 ORF에 의해서 암호화된 추론된 아미노산 서열(서열번호: 4)을 비교한 것이다. 굵은체로 표시된 발린 잔기는 단백질의 추정적인 개시 부위이다. 보존성 잔기는 3개의 모든 서열에서 상동성인 경우 대문자로 나타냈고, 3개의 서열중 2개의 서열에서만 상동성인 경우 소문자로 나타냈다. 아미노산 서열은 약 50%의 서열 동일성을 갖는다.
도 7은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF에서BsaAI/KpnI 부위에 삽입된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스aveC동족체 유전자 유래의 564bp의BsaAI/KpnI 단편을 함유하는 혼성화 플라스미드 구성물을 나타낸 것이다.
발명의 요약
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 완전한aveC개방 판독틀(ORF) 또는 그의 실질적인 부분을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로서, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체에서 원래 위치의aveCORF로부터 다운스트림(downstream)에 위치하는 바로 다음의 완전한 ORF가 결손된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 바람직하게는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일하거나, 또는 도 1에 제시된aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그의 실질적인 부분과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열, 또는 도 1에 제시된aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그의 실질적인 부분에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열에 상동성이거나, 도 1에 제시된 아미노산 서열(서열번호: 2) 또는 그의 실질적인 부분에 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 이 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스로부터 유래한, 서열번호: 4의 아미노산 서열 또는 그의 실질적인 부분을 포함하는 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화하는 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 서열번호:3의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 실질적인 부분을 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호: 3의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 뉴클레오티드 서열에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 동족체 유전자 산물에 상동성인 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화되거나, 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하거나 발현시키는데 유용한, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveCORF 또는aveC동족체 ORF를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 갖는 재조합 클로닝 벡터 및 발현 벡터들을 제공한다. 비제한적인 실시태양에서, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveC유전자의 전체 ORF를 포함하는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포, 및 그로부터 유래한 신규한 균주 또는 세포주를 제공한다.
본 발명은 또한 실질적으로 정제되거나 단리된, 재조합적으로 발현된 AveC 유전자 산물 또는 AveC 동족체 유전자 산물, 또는 이들의 실질적인 부분, 및 이들의 동족체를 제공한다. 본 발명은 또한 재조합 AveC 유전자 산물 또는 AveC 동족체 유전자 산물의 생산을 보조하는 조건하에서, AveC 유전자 산물 또는 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지며 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절성 요소와 작용상 연관되어 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터 AveC 유전자 산물 또는 AveC 동족체 유전자 산물을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 AveC 유전자 산물의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열 또는 도 1에 제시된 바와 같은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)과 동일하지만, 추가로 1회 이상 돌연변이되어 야생형aveC대립형질 유전자가 불활성화되고 이 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포가, 단지 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포에서 생산된 아베르멕틴에 비해 상이한 비 또는 양으로 아베르멕틴이 생산되도록 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본 발명에 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 사용하여 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 동일한 균주에 비해서 검출가능한 수준으로 아베르멕틴 생산의 변화를 나타내는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제조할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주로부터 생산되는 아베르멕틴에 비해 감소된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제조하는데 유용하다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 이러한 폴리뉴클레오티드 분자는 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주보다 더 많은 양의 아베르멕틴을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제조하는데 유용하다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는aveC유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하는데 유용하다.
본 발명은 생산되는 아베르멕틴의 비 및/또는 양을 변화시킬 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveCORF의 돌연변이를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 네이티브(native)aveC대립형질 유전자가불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 도입시키고 발현시켜, 이 균주의 세포에서 생산되는 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 측정하는 단계; (b) 도 1에 제시된 ORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 것을 제외하고는 상기 (a) 단계에서와 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 상기 (b) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비와 비교하여, 상기 (a) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비가 상기 (b) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비와 상이한 경우 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 변화시킬 수 있는aveCORF의 돌연변이임을 확인하는 단계를 포함하는, 생산되는 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 변화시킬 수 있는aveCORF의 돌연변이를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 아베르멕틴의 계열 2:1의 비는 돌연변이에 의해 감소된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 네이티브aveC대립형질 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에, 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이러한 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구성물을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 도입시키고 발현시켜, 이 균주의 세포에서 생산되는 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; (b) 도 1에 제시된 ORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 것을 제외하고는 상기 (a) 단계에서와 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양을 상기 (b) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양과 비교하여, 상기 (a) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양이 상기 (b) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양과 상이한 경우 아베르멕틴의 양을 변화시킬 수 있는aveCORF 또는 유전자 구성물의 돌연변이임을 확인하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴의 생산량을 변화시킬 수 있는aveCORF 또는 이러한aveCORF를 포함하는 유전자 구성물의 돌연변이를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 아베르멕틴의 생산량은 돌연변이에 의해 증가된다.
본 발명은 아베르멕틴을 기존과는 다르게 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제조하는데 유용한 재조합 벡터를 추가로 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 표적화하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 염색체의aveC유전자 부위에서aveCORF 또는 그의 일부에 삽입시키거나 또는aveCORF 또는 그의 일부를 상동 재조합에 의해서 대체시키는데 사용할 수 있는 벡터를 제공한다. 그러나, 본 발명에 따라서, 본원에 제공된 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자는 또한aveC유전자 이외의 부위에서 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체에 삽입되거나, 또는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 에피좀(episome)내에서 유지되는 경우에도 아베르멕틴의 생합성을 조절하는 작용을 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 이 폴리뉴클레오티드 분자를aveC유전자 이외의 부위에서 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 염색체에 삽입시키거나 에피좀내에서 유지시키기 위해 사용될 수 있는 벡터도 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 염색체로 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 삽입시킴으로써, 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 동일한 균주 세포에 비해 감소된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 신규한 균주 세포를 제조하는데 사용할 수 있는 유전자 치환용 벡터를 제공한다.
본 발명은 추가로 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에 비해 변화된 비 및/또는 양으로 아베르멕틴을 생산하는, 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 변화시키는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 갖는 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 형질전환시키는 단계; 및 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 상기 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해 변화된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해서 변화된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는, 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 신규한 균주 세포는 감소된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양에 비해서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 이러한aveC대립형질 유전자를 포함하는 유전자 구성물을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에서 생산되는 아베르멕틴의 양을 변화시킬 수 있는 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 이러한aveC대립형질 유전자를 포함하는 유전자 구성물을 갖는 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포를 형질전환시키는 단계; 및 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양에 비해 변화된 양으로 아베르멕틴을 생산하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 변화된 양의 아베르멕틴을 생산하는 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 신규한 균주는 보다 많은 양의 아베르멕틴을 생산한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은aveC대립형질 유전자를 불활성화시키는 벡터로 야생형aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 형질전환시키는 단계; 및aveC대립형질 유전자가 불활성화된 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 불활성화된aveC대립형질 유전자를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터로 형질전환된 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 야생형aveC대립형질 유전자 대신에 또는 그와 함께 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 세포를 포함하는, 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 동일한 균주의 세포에 비해 변화된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제공한다. 보다 바람직한 실시태양에서, 상기 신규한 균주의 세포는 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 균주의 세포에 비해서 감소된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산한다. 이러한 신규한 균주는 도라멕틴과 같은 상업적으로 바람직한 아베르멕틴을 대규모로 생산하는데 유용하다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 야생형aveC대립형질 유전자 대신에 또는 그와 함께 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 이러한aveC대립형질 유전자를 포함하는 유전자 구성물을 발현시키는 세포를 포함하는, 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양에 비해 변화된 양으로 아베르멕틴을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 신규한 세포는 보다 많은 양의 아베르멕틴을 생산한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은aveC유전자가 불활성화된 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제공한다. 이러한 균주는 야생형 균주에 비해 상이한 종류의 아베르멕틴을 생산한다는 측면에서, 그리고aveC유전자의 표적화된 또는 무작위 돌연변이 유발법이 아베르멕틴의 생산에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 본원에 개시된 바와 같은 보충적 탐색 분석법에 대해서 모두 유용하다.
본 발명은 또한 돌연변이된aveC대립형질 유전자는 발현시키지 않고 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1 비를 변화시키는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 배양 배지에서 아베르멕틴의 생산이 허용되거나 유도되는 조건하에 배양하는 단계; 및 이 배양물로부터 상기 아베르멕틴을 회수하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴의 생산 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 돌연변이된 유전자를 발현시키는 상기 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비는 감소된다. 상기 방법은 도라멕틴과 같은 상업적으로 값비싼 아베르멕틴의 생산 효율을 증대시킨다.
본 발명은 또한 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 유전자 구성물은 발현시키지 않고 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양에 비해서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 유전자 구성물을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산되는 아베르멕틴의 양을 변화시키는aveC대립형질 유전자를 포함하는 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 유전자 구성물을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 배양 배지에서 아베르멕틴의 생산이 허용되거나 유도되는 조건하에 배양하는 단계; 및 이 배양물로부터 상기 아베르멕틴을 회수하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴의 생산 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 돌연변이된 유전자 또는 유전자 구성물을 발현시키는 세포에서의 아베르멕틴의 생산량은 증가한다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자는 발현시키지 않고 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해서 감소된 계열 2:1의 비로 생산되는 아베르멕틴의 신규한 조성물을 제공한다.이러한 신규한 아베르멕틴 조성물은 발효 배양액에서 생산된 그대로 존재하거나, 그로부터 수확되거나, 또는 그로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제될 수 있다.
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 확인하고 특징을 분석하는 것, 돌연변이된 AveC 유전자 산물이 아베르멕틴 생산에 미치는 영향에 대해서 이러한 유전자 산물을 탐색하기 위해 사용될 수 있는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 구성하는 것, 및 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 생산된 아베르멕틴의 B2:B1의 비를 감소시킬 수 있는 특정 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 발견해내는 것에 관한 것이다. 한 예로써, 본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 도 1에 제시된 ORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 그로부터 유래한 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 이하에 기술한다. 그러나, 본 발명에 개시된 이론은 다른 스트렙토마이세스 종, 예를 들어 그중에서도 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 및 스트렙토마이세스 그리세오크로모제네스로부터 수득한aveC동족체 유전자를 포함하는, 다른 폴리뉴클레오티드 분자에 유사하게 적용될 수 있다.
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 완전한aveCORF 또는 그의 실질적인 부분을 포함하며, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체에서 원래 위치의aveCORF로부터 다운스트림에 위치하는 그 이하의 완전한 ORF가 결손된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 바람직하게는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일하거나, 도 1에 제시된aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그의 실질적인 부분과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자의 "실질적인 부분"이란 도 1에 도시된 완전한aveCORF 서열(서열번호: 1)의 약 70% 이상을 포함하는, 작용적으로 동등한 AveC 유전자 산물을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 이와 관련하여, "작용적으로 동등한" AveC 유전자 산물이란 네이티브aveC대립형질 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC 53692에서 발현시킬 때, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692에 네이티브 형태인 야생형, 작용적aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692에서 생산된 바와 실질적으로 동일한 비 및 양으로 아베르멕틴을 생산하는 유전자 산물로서 정의된다.
aveCORF의 뉴클레오티드 서열 이외에, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 또한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 원래 위치의aveC유전자의 측면에 자연적으로 존재하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)의 측면에 존재하는 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드 분자", "폴리뉴클레오티드 서열", "암호화 서열", "개방 판독틀" 및 "ORF"라는 용어는 단일-스트랜드이거나 이중-스트랜드일 수 있으며, AveC 유전자 산물, 또는 이하에 기술된 바와 같이 AveC 동족체 유전자 산물, 또는 적절한 조절성 요소의 제어하에 놓여진 경우 적절한 숙주 세포 발현 시스템에서 AveC 유전자 산물 또는 AveC 동족체 유전자 산물과 상동성인 폴리펩타이드로 전사되고 해독되거나(DNA의 경우) 또는 해독되는(RNA의 경우) DNA 및 RNA 분자 모두를 지칭하고자 한다. 암호화 서열은 원핵생물 유래 서열, cDNA 서열, 게놈 DNA 서열, 및 화학적으로 합성된 DNA 및 RNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)은 42번, 174번, 177번 및 180번 bp 위치에서 4가지 상이한 GTG 코돈을 포함한다. 하기 실시예 4에서 기술된 바와 같이,aveCORF(도 1; 서열번호: 1)의 5' 영역의 다중 결손물을 구성하면 이들 코돈중 어느 것이aveCORF에서 단백질의 발현에 대한 개시 부위로서 작용할 수 있는지를 정의하는데 도움이 된다. 42번 bp에서의 첫 번째 GTG를 결손시키면 AveC 활성이 제거되지 않았다. 추가로 174번, 177번 및 180번 bp 위치에서의 GTG 코돈을 결손시키면 모두 AveC 활성이 제거되었는데, 이는 이 영역이 단백질의 발현에 필수적인 영역임을 나타내는 것이다. 따라서 본 발명은 도 1(서열번호: 1)에 제시된 바와 같이 174번, 177번 또는 180번 bp에 위치하는 GTG 부위중 어느 한 곳에서 해독을 개시하는 다양한 길이의aveCORF 및 각각에 상응하는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명은 또한 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 상동성이거나, 도 1에 제시된aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그의 실질적인 부분에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 상동성인 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하기 위해 사용되는 경우, "상동성"이란 용어는 (a) 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열과 동일한 AveC 유전자 산물을 암호화하거나, 도 1에 제시된aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)과 동일한 AveC 유전자 산물을 암호화하지만, 유전자 코드의 퇴행에 따라 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 사일런트(silent) 변화를 포함하거나; 또는 (b) 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해서 암호화되는 아미노산 서열을 암호화하거나 도 1에 도시된 아미노산 서열(서열번호: 2)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자의 상보적인 서열에 대해 다소 엄격한 조건하에서 혼성화되고, 즉 0.5M NaHPO4, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1mM EDTA중에서 65℃에서 필터-결합된 DNA에 혼성화시킨 후, 42℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS로 세척하고(문헌[Ausubel et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, p. 2.10.3.] 참조), 상기 정의된 바와 같은 작용적으로 동등한 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 상동성 폴리뉴클레오티드 분자는 매우 엄격한 조건하에서도(즉, 0.5M NaHPO4, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1mM EDTA중에서 65℃에서 필터-결합된 DNA에 혼성화시킨 후, 68℃에서 0.1×SSC/0.1% SDS로 세척한다(상기 문헌[Ausubel et al., 1989] 참조)) 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열, 또는 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 이들의 실질적인 부분의 상보적 서열에 혼성화되며, 전술한 바와 같은 작용적으로 동등한 AveC 유전자 산물을 암호화한다.
AveC 유전자 산물 및 그의 잠재적인 작용적 등가물의 활성은 하기 실시예에 기술한 바와 같이, 발효 산물의 HPLC 분석을 통해서 측정할 수 있다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물의 작용적 등가물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자는 다른 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 균주에 존재하는 자연적으로 존재하는aveC유전자, 다른 스트렙토마이세스 종에 존재하는aveC동족체 유전자, 및 자연적으로 존재하거나 유전공학적으로 제조된 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 포함한다.
본 발명은 또한 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열에 상동성이거나, 도 1에 제시된 아미노산 서열(서열번호: 2) 또는 그의 실질적인 부분에 상동성인 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 도 1에 제시된 아미노산 서열(서열번호: 2)의 "실질적인 부분"이란 도 1에 도시된 아미노산 서열(서열번호: 2)의 약 70% 이상을 포함하는, 상기 정의된 바와 같이 작용적으로 동등한 AveC 유전자 산물을 구성하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유래의 AveC 유전자 산물의 아미노산 서열에 상동성인 아미노산 서열을 지칭하기 위해 본원에 사용된 바와 같이, "상동성"이란 용어는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해 암호화되거나 도 1에 제시된 아미노산 서열(서열번호: 2)을 갖지만, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 보존적으로(conservatively) 치환된 폴리펩타이드를 지칭하며, 이때 이러한 보존적 치환에 의해서는 상기 정의된 바와 같이 작용적으로 동등한 유전자 산물이 생산된다. 보존적 아미노산 치환은 당해 분야에 널리 알려져 있다. 이러한 치환 방법의 규칙은 다른 문헌들중에서 문헌[Dayhof, M.D., Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3, 1978]에 기술된 것을 포함한다. 더욱 구체적으로, 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 한 계열의 아미노산내에서 일어나며, 산도, 극성 또는 그들의 측쇄 크기와 관련되어 있다. 유전학적으로 암호화되는 아미노산은 일반적으로 4가지 군으로 나누어진다: (1) 산성=아스파테이트, 글루타메이트, (2) 염기성=라이신, 아르기닌, 히스티딘, (3) 비극성=알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 및 (4) 비전하 극성=글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 또한 함께 방향족아미노산으로 분류된다. 임의의 특정 군내에서의 하나 이상의 치환은, 예를 들어 류신의 이소류신 또는 발린으로의 치환, 또는 아스파테이트의 글루타메이트로의 치환, 또는 트레오닌의 세린으로의 치환, 또는 임의의 다른 아미노산 잔기의 구조적으로 연관된 아미노산 잔기, 예를 들어 유사한 산도, 극성, 크기 또는 이들의 유사한 조합을 갖는 아미노산 잔기로의 치환은 일반적으로 폴리펩타이드의 작용에 그다지 큰 영향을 미치지 않는다.
본 발명은 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "AveC 동족체 유전자 산물"이란 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해서 암호화된 아미노산 서열, 또는 도 1에 도시된 아미노산 서열(서열번호: 2)을 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 AveC 유전자 산물과 약 50% 이상의 아미노산 서열이 동일한 유전자 산물로서 정의된다. 비제한적인 실시태양에서, AveC 동족체 유전자 산물은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(유럽 특허 공개 제 0 298 423 호; FERM BP-1901로 기탁됨)로부터 유래하며, 서열번호: 4의 아미노산 서열 또는 그의 실질적인 부분을 포함한다. 서열번호: 4의 아미노산 서열의 "실질적인 부분"은 서열번호: 4의 아미노산 서열의 약 70% 이상을 포함하고 작용적으로 동등한 AveC 동족체 유전자 산물을 구성하는 폴리펩타이드를 의미한다. "작용적으로 동등한" AveC 동족체 유전자 산물은 네이티브aveC동족체 대립형질 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주 FERM BP-1901에서 발현되는 경우, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주 FERM BP-1901에 대해 네이티브 형태인 야생형 작용적aveC동족체 대립형질 유전자만을 발현시키는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주 FERM BP-1901에서 생산된 밀베마이신과 실질적으로 동일한 비 및 양으로 밀베마이신이 생산되도록 하는 유전자 산물로서 정의된다. 비제한적인 실시태양에서, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화하는 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 실질적인 부분을 포함한다. 이와 관련하여, 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자의 "실질적인 부분"이란 서열번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열의 70% 이상을 포함하고 바로 앞에서 정의한 바와 같이 작용적으로 동등한 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다.
본 발명은 또한 서열번호: 3의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 뉴클레오티드 서열에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 서열번호: 3의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 동족체 유전자 산물-암호화 서열에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하기 위해 사용되는 경우, "상동성"이란 용어는 (a) 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 실질적인 부분에서와 동일한 유전자 산물을 암호화하지만, 유전자 코드의 퇴행에 따라 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 사일런트 변화를 포함하거나; 또는 (b) 서열번호: 4의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자의 상보적인 서열에 대해 다소 엄격한 조건하에서혼성화되고, 즉 0.5M NaHPO4, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1mM EDTA중에서 65℃에서 필터-결합된 DNA에 혼성화시킨 후, 42℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS로 세척하고(상기 문헌[Ausubel et al.] 참조), 상기 정의된 바와 같이 작용적으로 동등한 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 상동성 폴리뉴클레오티드 분자는 매우 엄격한 조건하에서도(즉, 0.5M NaHPO4, 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 1mM EDTA중에서 65℃에서 필터-결합된 DNA에 혼성화시킨 후, 68℃에서 0.1×SSC/0.1% SDS로 세척한다(상기 문헌[Ausubel et al., 1989] 참조)) 서열번호: 3의 AveC 동족체 유전자 산물-암호화 뉴클레오티드 서열 또는 그의 실질적인 부분에 상보적인 서열에 혼성화되며, 전술한 바와 같이 작용적으로 동등한 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화한다.
본 발명은 또한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 동족체 유전자 산물에 상동성인 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스로부터 유래한 서열번호: 4의 AveC 동족체 유전자 산물에 상동성인 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 본원에 사용된 바와 같은, "상동성"이란 용어는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖지만, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 보존적으로 치환된 폴리펩타이드를 지칭하며, 이때 이러한 보존적 치환에 의해서는 상기 정의된 바와 같이 작용적으로 동등한 AveC 동족체 유전자 산물이 생산된다.
본 발명은 또한 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 도 1에 제시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)에 상보적이거나 서열번호: 3에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 약 10개 이상의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 매우 엄격한 조건하에서, 즉 약 14-염기 올리고에 대해서는 약 37℃에서, 약 17-염기 올리고에 대해서는 약 48℃에서, 약 20-염기 올리고에 대해서는 약 55℃에서, 그리고 약 23-염기 올리고에 대해서는 약 60℃에서 6×SSC/0.5% 나트륨 피로포스페이트로 세척함으로서 전술한 폴리뉴클레오티드 분자들중 하나에 혼성화된다. 바람직한 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 전술한 폴리뉴클레오티드 분자중 하나의 일부분에 대해 상보적이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 유전자 조절에 유용한 안티센스(antisense) 분자를 암호화하거나, 안티센스 분자로서 작용하거나 또는aveC-암호화 또는aveC동족체-암호화 폴리뉴클레오티드 분자의 증폭에서 프라이머로서 작용하는 것을 비롯한 다양한 목적에 유용하다.
또다른aveC동족체 유전자는 공지된 기술과 함께 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자 또는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 스트렙토마이세스의 다른 종 또는 균주에서 동정될 수 있다. 예를 들어, 도 1에 제시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)의 일부 또는 서열번호: 3의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드 분자를 검출가능하게 표지를 부착시키고, 이를 사용하여 목표 유기체로부터 유래한 DNA로 구성된 게놈 라이브러리를 탐색할 수 있다. 혼성화 조건의 엄격한 정도는 목표 유기체에 관련된 유기체, 본 발명의 실시예에서는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 또는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스와의 관계에 기초하여 선택된다. 여러 가지 엄격한 조건에서의 요구사항은 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있으며, 이러한 조건은 라이브러리 및 표지가 부착된 서열이 유래된 특정 유기체에 따라 예측할 수 있는 수준으로 다양할 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 약 15개 이상의 뉴클레오티드 길이를 가지며, 예를 들어 하기 실시예에 기술된 것들을 포함한다. 동족체 유전자의 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 표준 기술들을 적용함으로써 이들 올리고뉴클레오티드 및 다른 올리고뉴클레오티드를 사용하여 행해질 수 있지만, 당해 분야에 공지된 그밖의 증폭 기술들, 예를 들어 리가제 연쇄 반응도 또한 사용할 수 있다.
aveC동족체 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 밝혀진 클론은 이들이 작용적인 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화할 수 있는지에 대해서 시험할 수 있다. 이를 위해, 상기 클론은 서열을 분석하여 적절한 판독틀 뿐만 아니라 개시 및 종결 신호를 확인할 수 있다. 또 다르게는 또는 추가적으로는, 클로닝된 DNA 서열을 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질-암호화 서열의 전사 및 해독에 필수적인 요소를 함유하는 벡터로 삽입시킬 수 있다. 임의의 다양한 숙주/벡터 시스템은 이하에 기술한 바와 같이 사용할 수 있으며, 플라스미드, 박테리오파지 또는 코스미드 발현 벡터들과 같은 박테리아 시스템을 예로 들 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 그다음 유력한aveC동족체 암호화 서열을 포함하는 상기 벡터로 형질전환된 적절한 숙주 세포를 하기 실시예 2에 기술된 바와 같이 발효 산물의 HPLC 분석법과 같은 방법을 사용하여 AveC-유형 활성에 대해 분석할 수 있다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자의 생산 및 조작 방법은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 본원에 참고로 인용된 문헌[Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]; 문헌[Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY, 1989]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]; 문헌[Innis, et al.(eds), PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego, 1995]; 및 문헌[Erlich(ed), PCR Technology, Oxford University Press, New York, 1992]에 기술된 재조합 기술에 따라 수행할 수 있다. AveC 유전자 산물 또는 AveC 동족체 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 클론은 하기 실시예 2에 개시된 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 게놈 DNA 라이브러리에서, 박테리오파지 라이브러리에 대한 벤톤(Benton) 및 데이비스(Davis)의 문헌[Science,196,180, 1977]에 개시된 방법 및 플라스미드 라이브러리에 대한 그룬스타인(Grunstein) 및 호그니스(Hogness)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,72, 3961-3965, 1975]에 개시된 방법과 같은 기술을 사용하여aveC및aveC동족체 암호화 서열에 대해 탐색할 수 있다.aveCORF를 포함하는 것으로 공지된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자, 예를 들어 플라스미드 pSE186(ATCC 209604) 또는 플라스미드 pSE119(하기 실시예 2에 기술됨)에 존재하는 것과 같은 분자를 상기 탐색 실험에서 탐침으로 사용할 수 있다. 또 다르게는 정제된 AvcC 동족체 유전자 산물의 부분적인 또는 완전한 아미노산 서열로부터 추론된 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드 탐침을 합성할 수 있다.
재조합 시스템
클로닝 및 발현 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하거나 발현시키는데 유용한, 예를 들어 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveCORF 또는aveC동족체 ORF를 포함하는 재조합 클로닝 벡터 및 발현 벡터들을 제공한다. 비제한적인 실시태양에서, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveC유전자의 전체 ORF를 포함하는 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)을 제공한다.
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유래의aveCORF, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유래의aveCORF 또는 그의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물에 관한 이하의 모든 설명은 또한, 분명하게 명시되거나 문맥과 관련되어 지시되지 않는 한,aveC동족체 및 AveC 동족체 유전자 산물을 지칭한다.
스트렙토마이세스에서 특정하게 사용하기 위한 다양한 여러 벡터들, 예를 들어 그중에서 파지, 고 카피수(high copy number) 플라스미드, 저 카피수 플라스미드 및 이 콜라이(E. Coli)-스트렙토마이세스 셔틀 벡터들이 개발되어 왔으며, 이들 모두를 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 다수의 약제 저항성 유전자가 또한 스트렙토마이세스로부터 클로닝되어 왔으며, 이들 유전자중 몇 가지는 선택성 표지로서 벡터에 혼입되어 왔다. 현재 스트렙토마이세스에 사용되는 벡터들의 예는 여러 문헌중에서 허친슨(Hutchinson)의 문헌[Applied Biochem. Biotech.,16,169-190, 1980]에 제시되어 있다.
본 발명의 재조합 벡터, 특히 발현 벡터는 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 암호화하는 서열이 폴리펩타이드를 생산하기 위해 암호화 서열을 전사 및 해독하는데 필수적인 하나 이상의 조절성 요소와 작용상 연관되어 있도록 구성된다. 본원에 사용된 바와 같이, "조절성 요소"란 용어는 폴리뉴클레오티드 암호화 서열의 발현을 일으키고/일으키거나 조절하는 기능을 하는 당해 분야에 공지된 유도성 및 비유도성 프로모터, 인핸서(enhancer), 작동유전자 및 다른 요소들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한, 본원에 사용된 바와 같이, 상기 암호화 서열은 하나 이상의 조절성 요소와 "작용상 연관"되어 조절성 요소가 암호화 서열의 전사 또는 그의 mRNA의 해독 또는 이들 모두를 효과적으로 조절하고 일어나도록 한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하도록 유전공학적으로 가공될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 수많은 다른 벡터들 중에서 pCR-블런트(Blunt), pCR2.1(인비트로진(Invitrogen)), pGEM3Zf(프로메가(Promega)) 및 셔틀 벡터 pWHM3(바라(Vara) 등의 문헌[J. Bact., 171, 5872-5881, 1989] 참조)를 포함한다.
적절한 조절성 요소와 작용상 연관되어 있는 특정 암호화 서열을 포함하는 재조합 벡터를 구성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이러한 방법을 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합 방법을 포함한다. 예를 들어, 상기 문헌들[Maniatis et al., 1989; Ausubel et al., 1989; Sambrook et al., 1989; Innis et al., 1995; 및 Erlich, 1992]에 개시된 기술들을 참조한다.
이들 벡터의 조절성 요소는 그의 강도 및 특이성에서 다양할 수 있다. 사용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 다수의 적절한 전사 및 해독 요소를 사용할 수 있다. 박테리아의 전사적 조절성 영역 또는 프로모터의 비제한적인 예로는 β-gal 프로모터, T7 프로모터, TAC 프로모터, λ 좌측 및 우측 프로모터, trp 및 lac 프로모터, trp-lac 융합 프로모터, 및 더욱 구체적으로 스트렙토마이세스에 대해서는ermE,melC및tipA프로모터 등을 들 수 있다. 하기 실시예 6에 기술된 특정 실시태양에서, 사카로폴리스포라 에리트래아로부터 유래한 강력한 항구적ermE프로모터에 인접하여 클로닝된aveCORF를 포함하는 발현 벡터를 제조하였다. 이 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스를 형질전환시킨 후, 발효 산물을 HPLC로 분석한 결과 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 균주에서 생산된 아베르멕틴에 비해 더 많은 양의 아베르멕틴이 생산된 것으로 나타났다.
융합 단백질 발현 벡터를 사용하여 AveC 유전자 산물-융합 단백질을 발현시킬 수 있다. 정제된 융합 단백질은 AveC 유전자 산물에 대한 항혈청을 야기시키거나, AveC 유전자 산물의 생화학 특성을 연구하거나, 상이한 생화학 활성을 갖는AveC 융합 단백질을 제조하거나, 또는 발현된 AveC 유전자 산물의 특징 분석 또는 정제를 보조하는데 사용할 수 있다. 가능한 융합 단백질 발현 벡터는 β-갈락토시다제와, trpE와의 융합물, 말토스-결합 단백질과의 융합물, 글루타치온-S-트랜스퍼라제와의 융합물 및 폴리히스티딘과의 융합물(캐리어(carrier) 영역)을 암호화하는 서열이 혼입된 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또다른 실시태양에서, AveC 유전자 산물 또는 그의 일부를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 또는 스트렙토마이세스 그리세오크로모제네스와 같은 스트렙토마이세스의 또다른 종 또는 균주로부터 유래한 AveC 동족체 유전자 산물 또는 그의 일부에 융합시킬 수 있다. 하기 실시예 7에 기술되고 도 7에 도시된 특정한 실시태양에서, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF의 상동성 564bp 영역이 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스aveC동족체 ORF의 564bp 영역으로 대체된 키메릭(chimeric) 플라스미드를 구성하였다. 이러한 혼성 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포를 형질전환시켜, 이들의 효과, 예를 들어 생산되는 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 대한 효과를 측정하기 위해 시험할 수 있다.
AveC 융합 단백질이 정제에 유용한 영역을 포함하도록 유전공학적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, AveC-말토스-결합 단백질 융합물은 아밀로스 수지를 사용하여 정제할 수 있고, AveC-글루타치온-S-트랜스퍼라제 융합 단백질은 글루타치온-아가로즈 비드(bead)를 사용하여 정제할 수 있으며, AveC-폴리히스티딘 융합물은 2가 니켈 수지를 사용하여 정제할 수 있다. 또 다르게는, 캐리어 단백질 또는 펩타이드에 대한 항체를 융합 단백질의 친화성 크로마토그래피 정제 방법에 사용할 수있다. 예를 들어, 단일클론 항체의 표적 에피토프를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에서 조절성 요소가 작용상 연관되어 있도록 유전공학적으로 제조함으로써 발현된 에피토프가 AveC 폴리펩타이드에 융합되도록 할 수 있다. 예를 들어, 친수성 표지 펩타이드인 FLAG(상표명) 에피토프 태그(tag)(인터내쇼날 바이오테크놀러지스 인코포레이티드(International Biotechnologies Inc.))를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 표준 기술을 사용하여 발현 벡터에, 예를 들어 AveC 폴리펩타이드의 카복실 말단에 상응하는 지점에서 삽입시킬 수 있다. 그다음 발현된 AveC 폴리펩타이드-FLAG(상표명) 에피토프 융합 단백질을 상업적으로 시판중인 항-FLAG(상표명) 항체를 사용하여 검출하고 친화성-정제할 수 있다.
AveC 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터는 또한 특정한 프로테아제로 처리함으로써 발현된 AveC 폴리펩타이드가 캐리어 영역 또는 융합 파트너로부터 방출될 수 있도록 특정한 프로테아제 절단 부위를 암호화하는 폴리링커(polylinker) 서열을 함유하도록 유전공학적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질 벡터는 다른 절단 부위중에서 트롬빈 또는 Xa 인자 절단 부위를 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
aveCORF로부터 업스트림에 판독틀내에 위치하는 신호 서열을 공지된 방법으로 상기 발현 벡터에 유전공학적으로 삽입시켜 발현된 유전자 산물의 트래픽킹(trafficking) 및 분비를 유도할 수 있다. 비제한적인 신호 서열의 예로는 다른 것들중에서 α-인자, 면역글로불린, 외측막 단백질, 페니실리나제 및 T-세포 수용체로부터 유래한 것들을 들 수 있다.
본 발명의 클로닝 또는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 선택하는 것을 쉽게 하기 위해, 리포터(reporter) 유전자 산물 또는 다른 선택성 표지를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 벡터를 유전공학적으로 제조할 수 있다. 이러한 암호화 서열은 바람직하게는 전술한 바와 같이 조절성 요소 암호화 서열과 작용상 연관되어 있다. 본 발명에 유용한 리포터 유전자는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 다른 것들중에서 녹형광 단백질, 루시페라제,xylE및 타이로시나제를 암호화하는 것을 포함한다. 선택성 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 항생물질 또는 항대사물질에 대해 저항성을 부여하는 유전자 산물을 암호화하거나, 또는 영양요구성을 제공하는 것을 들 수 있다. 이러한 서열의 예로는 수많은 다른 것중에서 에리트로마이신, 티오스트렙톤 또는 카나마이신에 대한 저항성을 암호화하는 것들을 들 수 있다.
숙주 세포의 형질전환
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포, 및 그로부터 유래한 신규한 균주 또는 세포주를 제공한다. 본 발명의 실시에서 유용한 숙주 세포는 바람직하게는 스트렙토마이세스 세포이지만, 다른 원핵세포 또는 진핵세포도 사용할 수 있다. 상기 형질전환된 숙주 세포는 전형적으로 다른 것들중에서 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 벡터로 형질전환된 박테리아, 또는 재조합 벡터로 형질전환된 효모와 같은 미생물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 스트렙토마이세스 세포에서 작용시키고자 하지만, 또한 예를 들어 클로닝 또는 발현 목적을 위해 다른 박테리아 또는 진핵세포를 이들로 형질전환시킬 수 있다. 미국 매릴랜드주 락빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 구입가능하고(수탁번호 31343) 상업적으로 시판중인(스트래타진(Stratagene)) DH5α 균주와 같은 이 콜라이 균주를 전형적으로 사용할 수 있다. 바람직한 진핵세포 숙주는 효모 세포를 포함하지만, 포유동물 세포 또는 곤충 세포도 또한 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 실질적으로 균일한 세포 배양물의 1종 이상의 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 공지된 기술, 예를 들어 원형질체(protoplast) 형질전환, 인산칼슘 침점법, 염화칼슘 처리법, 미세주입법(microinjection), 전기충격법(electroporation), 재조합된 바이러스로 접촉시키는 형질감염, 리포좀-매개된 형질감염, DEAE-덱스트란 형질감염, 형질도입, 접합 또는 미세발사체 충격법(microprojectile bombardment)에 따라 숙주 세포로 일반적으로 도입된다. 형질전환체는 선택성 표지, 예를 들어 전술한 바와 같이 재조합 벡터와 연관된 항생물질 저항성을 발현시키는 세포를 선택하는 방법과 같은 표준 절차에 따라 선택할 수 있다.
발현 벡터가 숙주 세포로 도입되면,aveC암호화 서열이 숙주 세포의 염색체 또는 에피좀내에 혼입되어 유지되는지를 표준 기술, 예를 들어 서던(Southern) 혼성화 분석법, 제한 효소 분석법, 역전사효소 PCR(rt-PCR)을 포함하는 PCR 분석법, 또는 기대되는 유전자 산물을 검출하기 위한 면역학적 분석법을 사용하여 확인할 수 있다. 재조합aveC암호화 서열을 포함하고/하거나 발현시키는 숙주 세포는 당해 분야에 널리 공지된 4가지 이상의 일반적인 접근법, 예를 들어 (i) DNA-DNA, DNA-RNA 또는 RNA-안티센스 RNA의 혼성화 방법; (ii) "표지" 유전자의 작용 여부를 검출하는 방법; (iii) 숙주 세포에서aveC-특이성 mRNA의 전사물의 발현으로 측정하는 전사 수준의 평가; 및 (iv) 면역학적 분석법 또는 AveC 생물학적 활성(예를 들어, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 숙주 세포 등에서 AveC 활성을 나타내는 생산되는 아베르멕틴의 특정 비 및 양) 등으로 측정하는 바와 같이 성숙한 폴리펩타이드 산물의 존재를 검출하는 방법에 의해서 확인할 수 있다.
재조합 AveC 유전자 산물의 발현 및 특징 분석
aveC암호화 서열이 적절한 숙주 세포에 안정적으로 도입되면, 이 형질전환된 숙주 세포는 복제되면서 증식하며, 생성된 세포는 AveC 유전자 산물의 최대 생산을 보조하는 조건하에서 생육시킬 수 있다. 이러한 조건은 전형적으로 세포를 고밀도로 생육시키는 것을 포함한다. 발현 벡터가 유도성 프로모터를 포함하는 경우, 적절한 유도성 조건, 예를 들어 온도 변화, 영양소의 소모, 유사 유도물질(예를 들어, 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 같은 탄수화물의 유사체)의 첨가, 과량의 대사 부산물의 축적 등의 조건이 발현을 유도하는데 필요한 경우 사용된다.
발현된 AveC 유전자 산물이 숙주 세포내에서 보유되는 경우, 세포를 수확하고 용해시킨 후, 단백질의 분해를 최소화하기 위한 당해 분야에 공지된 추출 조건, 예를 들어 4℃의 온도에서 또는 프로테아제 저해제의 존재하에 또는 이들 두 조건하에서 용해물로부터 산물을 단리하고 정제한다. 발현된 AveC 유전자 산물이 숙주세포로부터 분비되는 경우, 소모된 영양소 배지를 간단하게 수거하여 그로부터 산물을 단리할 수 있다.
발현된 AveC 유전자 산물은 적절한 경우, 하기 방법의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 표준 방법을 사용하여 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 단리하거나 실질적으로 정제할 수 있다: 황산암모늄 침전법, 크기 분획법, 이온교환 크로마토그래피, HPLC, 밀도 원심분리법 및 친화성 크로마토그래피. 발현된 AveC 유전자 산물이 생물학적 활성을 나타내는 경우, 제조물의 순도 증가를 적절한 분석법을 사용하여 정제 절차의 각 단계에서 관측할 수 있다. 발현된 AveC 유전자 산물이 생물학적 활성을 나타내는지의 여부는, 예를 들어 크기 또는 AveC에 특이적인 항체와의 반응성에 기초하여 또는 융합 태그의 존재에 의해 검출할 수 있다.
따라서 본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 도 1에 제시된 아미노산 서열(서열번호: 2) 또는 그의 실질적인 부분, 및 이들의 동족체를 포함하는 재조합적으로 발현된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물을 제공한다.
본 발명은 또한 서열번호: 4의 아미노산 서열 또는 그의 실질적인 부분, 및 그의 동족체 포함하는 재조합적으로 발현된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 동족체 유전자 산물을 제공한다.
본 발명은 또한 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 숙주 세포에서의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절성 요소와 작용상 연관되어 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 재조합 AveC 유전자 산물의 생산을 보조하는 조건하에서 배양하는 단계; 및 이 세포 배양물에서 AveC 유전자 산물을 회수하는 단계를 포함하는, AveC 유전자 산물의 생산 방법을 제공한다.
재조합적으로 발현된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물은 AveC 유전자 산물의 작용을 바꾸어 아베르멕틴 생합성을 조절하는 화합물을 탐색하고, AveC 유전자 산물에 대한 항체의 생산을 야기시키는 것을 비롯한 다양한 목적에 유용하다.
충분한 순도를 갖는 AveC 유전자 산물이 수득되면, SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피, 아미노산 서열 분석, 아베르멕틴 생합성 경로에서 적절한 산물을 생산하는 생물학적 활성 등을 포함하는 표준 방법들을 사용하여 특징을 분석할 수 있다. 예를 들어, AveC 유전자 산물의 아미노산 서열은 표준 펩타이드 서열 분석 기술을 사용하여 측정할 수 있다. AveC 유전자 산물은 추가로 친수성 분석법(예를 들어, 홉(Hopp) 및 우즈(Woods)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA,78, 3824, 1981]을 참조한다) 또는 유사한 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 특징을 분석함으로써, AveC 유전자 산물의 소수성 및 친수성 영역을 확인할 수 있다. 구조적 분석을 행하여 특이적 2차 구조를 추정할 수 있는 AveC 유전자 산물의 영역을 확인할 수 있다. X-선 결정학(엥그스트롬(Engstrom)의 문헌[Biochem. Exp. Biol.,11, 7-13, 1974] 참조), 컴퓨터 모델링(문헌[Fletterick and Zoller(eds.), Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, NY, 1986] 참조) 및 핵자기 공명(NMR)과 같은 생물 물리적 방법을 사용하여 AveC 유전자 산물과 그의 기질 사이의 상호작용 부위를 지도로 나타내고 연구할 수 있다. 이러한 연구로부터 수득한 정보를aveCORF에서의 새로운 돌연변이 부위를 선택하는데 사용함으로써, 더욱 바람직한 아베르멕틴 생산 특징을 갖는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 보다 용이하게 개발할 수 있다.
AveC 돌연변이주의 구성 및 용도
본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열 또는 도 1에 제시된 바와 같은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)과 동일하지만, 추가로 1회 이상 돌연변이되어 야생형aveC대립형질 유전자가 불활성화되고 이 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 발현하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포가, 단지 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCVC 53692의 세포에서 생산된 아베르멕틴에 비해 변화된 비 또는 양으로 아베르멕틴을 생산하도록 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다.
본 발명에 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 사용하여 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주에 비해서 검출가능한 수준으로 아베르멕틴 생산의 변화를 나타내는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제조할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주로부터 생산된 아베르멕틴에 비해 감소된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제조하는데 유용하다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 이러한 폴리뉴클레오티드 분자는 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주보다 더 많은 양의 아베르멕틴을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제조하는데 유용하다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는aveC유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 신규한 균주를 제조하는데 유용하다.
aveC암호화 서열에서의 돌연변이는 AveC 유전자 산물에서 아미노산 결손, 추가 또는 치환을 도입시키거나 AveC 유전자 산물의 말단을 절단시키거나 이들이 조합되어 일어나는, 또한 원하는 결과를 생성시키는 임의의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 AveC 유전자 산물-암호화 서열 또는 도 1에 제시된 바와 같은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)을 포함하며, 추가로 AveC 유전자 산물의 선택된 위치에서 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 치환된 1회 이상의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 이하에 예시된 몇몇 비제한적인 실시태양에서, 이러한 치환은 아미노산 위치 55번, 138번, 139번 또는 230번중 어느 하나 또는 이들의 일부 조합에서 일어날 수 있다.
aveC암호화 서열에 대한 돌연변이는 착오 유발법(error-prone) PCR 또는 카세트(cassette) 돌연변이 유발법을 포함하는 다양한 임의의 공지된 방법을 사용하여 행해질 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드-지향성 돌연변이 유발법을 사용하여 한정된 방식으로, 예를 들어 하나 이상의 제한 부위 또는 종결 코돈을aveCORF 서열내 특정 영역에 도입시키는 것과 같은 방식으로aveCORF 서열을 변형시킬 수 있다. 무작위 단편화 방법, 돌연변이 유발법의 반복 주기 및 뉴클레오티드 뒤섞음(shuffling)을 포함하는 미국 특허 제 5,605,793 호에 개시된 방법과 같은 방법을 사용하여aveC돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 대규모 라이브러리를 제조할 수 있다.
표적화 돌연변이는 특히 AveC 유전자 산물에서 하나 이상의 보존된 아미노산 잔기를 변형시키는 기능을 하는 경우 유용할 수 있다. 예를 들어, 도 6에 도시된 바와 같이, AveC 유전자 산물의 추론된 아미노산 서열과 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 AveC 동족체 유전자 산물(서열번호: 2), 스트렙토마이세스 그리세오크로모제네스의 AveC 동족체 유전자 산물(서열번호: 5) 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 AveC 동족체 유전자 산물(서열번호: 4)을 비교함으로써, 이들 종간의 아미노산 잔기의 중요한 보존된 부위를 나타낼 수 있다. 이들 보존된 아미노산 잔기중 하나 이상을 변화시키는 표적화 돌연변이는 아베르멕틴의 생산에서 바람직한 변화를 나타내는 신규한 돌연변이 균주를 생산하는데 특히 효과적일 수 있다.
무작위 돌연변이 유발법도 또한 유용할 수 있으며, 자외선 조사 또는 X-선, 또는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘, 에틸 메탄 설포네이트, 아질산 또는 질소 머스타드(mustard)와 같은 화학 돌연변이원에 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 세포를 노출시킴으로써 행해질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 유발 기술의 고찰을 위한 문헌으로서 상기 문헌[Ausubel, 1989]을 참조한다.
돌연변이된 폴리뉴클레오티드 분자가 제조되면, 이들을 탐색하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 아베르멕틴의 생합성을 조절할 수 있는지를 결정한다. 바람직한 실시태양에서,aveC음성(aveC - ) 배경을 제공하는aveC유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 균주를 보충하여 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 시험한다. 비제한적인 방법으로, 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 분자를 하나 이상의 조절성 요소가 작용상 연관되어 있으며 또한 바람직하게는 형질전환된 세포를 선택할 수 있도록 하나 이상의 약제 저항성 유전자를 포함하는 발현 플라스미드에 접합시킨다. 그다음 이 벡터로 공지된 기술을 사용하여aveC - 숙주 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 선택한 후, 아베르멕틴의 생산을 허용하거나 유도하는 조건하에 적절한 발효 배지에서 배양한다. 그다음 발효 산물을 HPLC로 분석하여 돌연변이된 폴리뉴클레오티드가 상기 숙주 세포를 보충시킬 수 있는지를 측정한다. pSE188, pSE199 및 pSE231을 포함하는, 아베르멕틴의 B2:B1 비를 감소시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 갖는 몇몇 벡터는 하기 실시예 3의 B2:B1 비를 감소시키는 돌연변이편에 예시되어 있다.
본 발명은 생산되는 아베르멕틴의 비 및/또는 양을 변화시킬 수 있는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveCORF의 돌연변이를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 네이티브aveC대립형질 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에 돌연변이된 AveC 유전자 산물을암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 도입시키고 발현시켜, 이 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 측정하는 단계; (b) 도 1에 제시된 ORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 것을 제외하고는 상기 (a) 단계에서와 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 상기 (b) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비와 비교하여, 상기 (a) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비가 상기 (b) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비와 변화된 경우 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 변화시킬 수 있는aveCORF의 돌연변이임을 확인하는 단계를 포함하는, 생산되는 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 변화시킬 수 있는aveCORF의 돌연변이임을 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 아베르멕틴의 계열 2:1의 비는 돌연변이에 의해 감소된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 네이티브aveC대립형질 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에, 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이러한 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구성물을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 도입시키고 발현시켜, 이 균주의 세포에서 생산되는 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; (b) 도 1에 제시된 ORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖는aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 것을 제외하고는 상기 (a) 단계에서와 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양을 상기 (b) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양과 비교하여, 상기 (a) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양이 상기 (b) 단계의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양과 상이한 경우 아베르멕틴의 양을 변화시킬 수 있는aveCORF 또는 유전자 구성물의 돌연변이임을 확인하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴의 생산량을 변화시킬 수 있는aveCORF 또는 이러한aveCORF를 포함하는 유전자 구성물의 돌연변이를 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 아베르멕틴의 생산량은 돌연변이에 의해 증가된다.
전술한 돌연변이를 확인하는 방법중 임의의 방법은 바람직하게는 사이클로헥산 카복실산으로 보충된 발효 배양 배지를 사용하여 수행되지만, 다른 적절한 지방산 전구체, 예를 들어 하기 표 1에 개시된 지방산 전구체들중 임의의 것을 또한 사용할 수 있다.
바람직한 방향으로 아베르멕틴의 생산을 조절하는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 분자가 확인되면, 뉴클레오티드 서열내 돌연변이된 위치를 알아낼 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는폴리뉴클레오티드 분자를 PCR로 단리하고 공지된 방법을 사용하여 DNA 서열을 분석할 수 있다. 돌연변이된aveC대립형질 유전자의 DNA 서열을 야생형aveC대립형질 유전자와 비교함으로써, 아베르멕틴의 생산에서의 변화를 담당하는 돌연변이를 확인할 수 있다. 본 발명의 특정한, 그러나 비제한적인 실시태양에서, 55번(S55F), 138번(S138T), 139번(A139T) 또는 230번(G230D) 잔기들중 임의의 위치에서의 단일 아미노산 치환, 또는 138번(S138T)과 139번(A139T) 위치에서의 이중 치환을 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물은 아베르멕틴의 계열 2:1의 비가 변화되도록 AveC 유전자 산물을 변화시켰다(하기 실시예 3 참조). 따라서, 55번, 138번, 139번 또는 230번 아미노산 잔기중 하나 이상이 치환되거나 이들이 조합되어 치환된 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자가 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 아베르멕틴의 생산을 변화시키는 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제조하기 위한 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오티드 분자를 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체의aveC유전자 부위로 표적화하여aveCORF 또는 그의 일부에 삽입시키거나 또는aveCORF 또는 그의 일부를 상동 재조합에 의해서 대체시키는데 사용할 수 있는 재조합 벡터를 제공한다. 그러나, 본 발명에 따라서, 본원에 제공된 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자는 또한aveC유전자 이외의 부위에서 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체에 삽입되거나, 또는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 에피좀내에서 유지되는 경우에도 아베르멕틴의 생합성을 조절하는 작용을 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 벡터를 제공하며, 이 벡터는 폴리뉴클레오티드 분자를aveC유전자 이외의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 염색체 부위에 삽입시키거나 에피좀내에서 유지시키기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주에 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 삽입시킴으로써, 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 균주 세포에 비해 감소된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포를 제조하는데 사용될 수 있는 유전자 치환용 벡터를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 세포는 감소된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산한다. 이러한 유전자 치환용 벡터는 하기 실시예 3의 B2:B1의 비를 감소시키는 돌연변이편에 예시된 발현 벡터들인 pSE188, pSE199 및 pSE231과 같이 본원에 제공된 발현 벡터들에 존재하는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 분자를 사용하여 구성될 수 있다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 삽입시켜 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 균주의 세포에 비해 변화된 양의 아베르멕틴을 생산하는 신규한 균주 세포를 제조하는데 사용될 수 있는 벡터를 제공한다. 바람직한실시태양에서, 상기 세포는 보다 많은 양의 아베르멕틴을 생산한다. 특정하지만 비제한적인 실시태양에서, 상기 벡터는aveCORF로부터 업스트림에 작용적으로 관련되어 위치하는 당해 분야에 공지된 바와 같은 강력한 프로모터, 예를 들어 사카로폴리스포라 에리트래아로부터 유래한 강력한 항구성ermE프로모터를 포함한다. 이러한 벡터는 하기 실시예 6에 기술된 플라스미드 pSE189이거나, 또는 플라스미드 pSE189의 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 사용하여 구성될 수 있다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 야생형 균주에서aveC유전자를 불활성화시키는데 유용한 유전자 치환용 벡터를 제공한다. 비제한적인 실시태양에서, 이러한 유전자 치환용 벡터는 하기 실시예 3의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveC유전자의 불활성화편에 예시된 플라스미드 pSE180(ATCC 209605)(도 3)에 존재하는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 분자를 사용하여 구성될 수 있다. 본 발명은 또한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 염색체에서 원래 위치의aveC유전자의 측면에 자연적으로 존재하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)의 측면에 존재하는 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF를 제거하기 위해 사용될 수 있는 유전자 치환용 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에 비해 변화된 비 및/또는 양으로 아베르멕틴을 생산하는, 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 세포를 포함하는신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 변화시키는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 갖는 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포를 형질전환시키는 단계; 및 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 상기 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해 변화된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해서 변화된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 아베르멕틴의 계열 2:1의 비는 감소된다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양에 비해서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 이러한 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 포함하는 유전자 구성물을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산되는 아베르멕틴의 양을 변화시킬 수 있는 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 이러한 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 포함하는 유전자 구성물을 갖는 벡터로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포를 형질전환시키는 단계; 및 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴에 비해 변화된 양으로 아베르멕틴을 생산하는 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 변화된 양의 아베르멕틴을 생산하는 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 형질전환된 균주는 보다 많은 양의 아베르멕틴을 생산한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은aveC대립형질 유전자를 불활성화시키는 벡터로 야생형aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포를 형질전환시키는 단계; 및aveC대립형질 유전자가 불활성화된 형질전환된 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 불활성화된aveC대립형질 유전자를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 제조 방법을 제공한다. 바람직하지만 비제한적인 실시태양에서, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포는 돌연변이에 의해서 또는 이종의 유전자 서열로aveC대립형질 유전자의 일부를 치환시키는 방법에 의해서 불활성화된aveC대립형질 유전자를 포함하는 유전자 치환용 벡터로 형질전환되고, 세포의 네이티브aveC대립형질 유전자가 불활성화된aveC대립형질 유전자로 치환된 형질전환된 세포가 선택된다.aveC대립형질 유전자의 불활성화는 하기 기술한 바와 같이 발효 산물의 HPLC 분석에 의해서 측정할 수 있다. 특정한, 그러나 비제한적인 하기 실시예 3.1에 기술된 실시태양에서,aveC대립형질 유전자는 사카로폴리스포라 에리트래아 유래의ermE유전자를aveCORF에 삽입시킴으로써 불활성화된다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터로 형질전환된 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 야생형aveC대립형질 유전자 대신에 또는 그와 함께 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 세포를 포함하는, 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해 변화된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 신규한 세포는 감소된 계열 2:1의 비로 아베르멕틴을 생산한다. 이러한 신규한 균주는 도라멕틴과 같은 상업적으로 바람직한 아베르멕틴을 대규모로 생산하는데 유용하다.
본원에 기술된 탐색 분석법의 일차적인 목적은 발현시 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 세포에서 생산되는 아베르멕틴 계열 2:1의 비를 변화시키는, 더욱 구체적으로는 감소시키는aveC유전자의 돌연변이된 대립형질 유전자를 밝히는 것이다. 바람직한 실시태양에서, 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 감소시키는 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 본 발명의 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에서 생산된 B2:B1 아베르멕틴의 비는 1.6:1 미만 내지 약 0:1이고, 더욱 바람직한 실시태양에서 이 비는 약 1:1 내지 약 0:1이며, 가장 바람직한 실시태양에서 이 비는 약 0.84:1 내지 약 0:1이다. 하기 기술된 특정 실시태양에서, 본 발명의 신규한 세포는 1.16:1 미만의 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비로 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기술된 다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.94:1의 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비로 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기술된 또다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.88:1의 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비로 아베르멕틴을 생산한다. 하기 기술된 다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 신규한 세포는 약 0.84:1의 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비로 아베르멕틴을 생산한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에 비해 변화된 양의 아베르멕틴을 생산하는, 야생형aveC대립형질 유전자 대신에 또는 그와 함께 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 이러한 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 포함하는 유전자 구성물을 발현시키는 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 이 신규한 균주는 보다 많은 양의 아베르멕틴을 생산한다. 비제한적인 실시태양에서, 상기 유전자 구성물은aveCORF로부터 업스트림에 작용상 연관되어 있는, 사카로폴리스포라 에리트래아 유래의 강력한 항구적ermE프로모터와 같은 강력한 프로모터를 추가로 포함한다.
또다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은aveC유전자가 불활성화된 세포를 포함하는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주를 제공한다. 이러한 균주는 야생형 균주에 비해 상이한 종류의 아베르멕틴을 생산한다는 측면에서, 그리고aveC유전자의 표적화 또는 무작위 돌연변이 유발법이 아베르멕틴의 생산에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 본원에 개시된 바와 같은 보충적 탐색 분석법에 대해서 모두 유용하다. 하기 기술된 특정 실시태양에서, 불활성화된aveC유전자를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 숙주 세포를 유전공학적으로 제조하였다. 예를 들어, 하기 실시예에 기술된 균주 SE180-11은ermE저항성 유전자를aveC암호화 영역에 삽입시킴으로써 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveC유전자를 불활성화시키도록 구성된 유전자 치환용 플라스미드 pSE180(ATCC 209605)(도 3)을 사용하여 제조하였다.
본 발명은 또한 전술한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 암호화되고 재조합적으로 발현된, 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물, 및 그의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1 비를 변화시키는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 배양 배지에서 아베르멕틴의 생산이 허용되거나 유도되는 조건하에 배양하는 단계; 및 이 배양물로부터 상기 아베르멕틴을 회수하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴의 생산 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 세포에 의해 배양물에 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비는 감소된다. 상기 방법은 도라멕틴과 같은 상업적으로 값비싼 아베르멕틴의 생산 효율을 증가시킨다.
본 발명은 또한 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 유전자 구성물은 발현시키지 않고 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양에 비해서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 유전자 구성물을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포에서 생산된 아베르멕틴의 양을 변화시키는aveC대립형질 유전자를 포함하는 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 유전자 구성물을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 세포를 배양 배지에서 아베르멕틴의 생산이 허용되거나 유도되는 조건하에 배양하는 단계; 및 이 배양물로부터 상기 아베르멕틴을 회수하는 단계를 포함하는, 아베르멕틴의 생산 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자 또는 유전자 구성물을 발현시키는 세포에 의해 배양물에 생산되는 아베르멕틴의 생산량은 증가한다.
본 발명은 또한 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비에 비해서, 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 감소시키는 유전자 산물을 암호화하는 돌연변이된aveC대립형질 유전자를 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주에서, 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 동일한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 세포에서 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의비에 비해 감소된 계열 2:1의 비로 생산된 아베르멕틴의 신규한 조성물을 제공한다. 이러한 신규한 아베르멕틴 조성물은 다 사용한 발효 배양액에서 생산된 그대로 존재하거나, 또는 그로부터 수확될 수 있다. 상기 신규한 아베르멕틴 조성물은 황산암모늄 침전법, 투석법, 크기 분획법, 이온교환 크로마토그래피, HPLC 등과 같은 공지된 생화학적 정제 기술을 사용하여 배양액으로부터 부분적으로 또는 실질적으로 정제될 수 있다.
아베르멕틴의 용도
아베르멕틴은 구충제, 체외기생충 박멸제, 살충제 및 진드기 박멸제로서의 특정 용도를 갖는 매우 활성이 높은 기생충 박멸제이다. 본 발명의 방법에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 이들 용도에 모두 유용하다. 예를 들어, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 인간에 발생하는 다양한 질환 또는 증상을 치료하는데, 특히 당해 분야에 공지된 바와 같이 기생충 감염에 의해 발생하는 질환 또는 증상을 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 이케다 및 오무라(Omura)의 문헌[Chem. Rev.,97(7), 2591-2609, 1997]을 참조한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 인간, 가축, 돼지, 양, 가금류, 말 또는 소가 감염될 수 있는 체내기생충, 예를 들어 선충에 의해서 발행하는 다양한 질환 또는 증상을 치료하는데 효과적이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 인간을 감염시키는 선충 뿐만 아니라 다양한 종의 동물을 감염시키는 선충에 효과적이다. 상기 선충에는 십이지장충(Ancylostoma), 구충(Necator), 회충,분선충(Strongyloides), 선모충(Trichinella), 모두충, 편충, 요충, 개사상충(Dirofilaria) 같은 위장관내 기생충, 및 혈액 또는 다른 조직이나 기관에서 발견되는 기생충, 예를 들어 사상충 벌레, 및 분선충 및 선모충의 내장외 상태를 포함한다.
본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 또한 체외기생충 감염, 예를 들어 소 및 말에 존재할 수 있는 참진드기, 좀진드기, 벼룩, 이, 검정파리, 무는 곤충, 또는 유주성 쌍시류의 유충에 의해 발생하는, 포유동물 및 조류의 절지 동물 기생충 감염을 치료하는데 유용하다.
본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 또한, 예를 들어 바퀴벌레, 옷좀나방, 카페트 딱정벌레 및 집파리와 같은 집의 해충뿐만 아니라, 특히 거미 진드기, 진딧물, 애벌레 및 직시류 곤충(예를 들어, 메뚜기)을 포함하는 저장된 곡물 및 농작물의 곤충 해충에 대해서도 살충제로서 유용하다.
본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물로 박멸될 수 있는 동물에는 양, 소, 말, 사슴, 염소, 돼지, 가금류를 비롯한 조류, 개 및 고양이를 들 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 의도된 특정 용도, 치료할 숙주 동물의 특정한 종, 치료할 기생충 또는 곤충의 종류에 따라 적절한 제형으로 투여된다. 기생충 박멸제로서 사용하기 위해, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 캡슐, 환약, 정제 또는 액체 물약의 형태로 경구적으로 투여되거나, 또는 다르게는 쏟아부어 피부에 바르거나, 주사하거나 또는 이식편으로서 투여될 수 있다. 이러한 제형은 표준 수의학 실시에 따라 통상적인 방식으로 제조된다. 따라서, 캡슐, 환약 또는 정제는 활성 성분을 붕해제 및/또는 결합제(예를 들어, 전분, 락토스, 활석, 스테아르산 마그네슘 등)를 추가로 함유하는 적절한 미분된 희석제 또는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다. 용액 제형은 활성 성분을 분산제 또는 습윤제 등과 함께 수용액에 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 주사가능한 제형은 혈액과 등장인 용액으로 만드는 충분한 염 및/또는 글루코스 등과 같은 기타 성분들을 함유할 수 있는 멸균 용액의 형태로 제조될 수 있다.
이러한 제형은 환자 또는 치료할 숙주 동물의 종, 감염의 심각성 및 유형, 및 숙주의 체중에 따라 활성 성분의 중량과 관련하여 다양할 것이다. 일반적으로 경구 투여를 위해서는 환자 또는 동물 체중 1kg당 약 0.001 내지 10㎎의 활성 성분의 투여량으로 1일 내지 5일 동안 1회로 또는 분할하여 투여하는 것이 만족스러운 결과를 나타낼 것이다. 그러나, 임상적인 증후에 기초하여 의사 또는 수의사 등에 의해 결정된 바와 같이, 그보다 더 많거나 더 적은 투여량을 사용할 수 있다.
또 다르게는, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 동물 사료와 혼합하여 투여될 수 있으며, 이를 위해 농축된 사료 첨가물 또는 프리믹스(premix)를 제조하여 일반적인 동물 사료와 혼합할 수 있다.
살충제로서 그리고 농작물의 해충을 처리할 목적으로 사용하기 위해, 본 발명에 따라 생산된 아베르멕틴 화합물은 표준 농업학적 실시에 따라 분무제, 분진제(dust), 유화액 등으로 살포될 수 있다.
실시예
실시예 1
스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 발효 및 아베르멕틴 B2:B1의 분석
분지쇄 2-옥소산 디하이드로게나제 및 5-O-메틸트랜스퍼라제가 모두 결손된 균주는 발효 배지에 지방산이 보충되지 않는 한 아베르멕틴을 생산하지 않는다. 이 실시예는 이러한 돌연변이주에서 여러 지방산의 존재하에 생합성을 개시하였을 때 다양한 B2:B1의 비로 아베르멕틴이 수득될 수 있음을 나타낸다.
1.1. 물질 및 방법
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC 53692를 전분(나덱스, 레잉 내셔날(Nadex, Laing National)) 20g; 파마메디아(Pharmamedia)(미국 테네시주 멤피스 소재의 트레이더스 프로테인(Trader's Protein)) 15g, 아르다민(Ardamine) pH(이스트 프로덕츠 인코포레이티드(Yeast Products Inc.)) 5g, 및 탄산칼슘 1g으로 구성된 종배지에서 제조된 전체 배양액으로서 -70℃에 저장하였다. 최종 부피를 수돗물로 1ℓ로 조정하고, pH를 7.2로 조정한 후, 배지를 25분간 121℃에서 오토클레이빙(autoclaving)시켰다.
상기 제조물을 해동시킨 현탁액 2㎖를 사용하여 50㎖의 동일 배지가 함유된 플라스크에 접종하였다. 회전식 진탕기에서 180rpm으로 28℃에서 48시간 동안 배양한 후에, 배양액 2㎖를 사용하여 전분 80g, 탄산칼슘 7g, 파마메디아 5g, 인산수소이칼륨 1g, 황산마그네슘 1g, 글루탐산 0.6g, 황산철(II) 7수화물 0.01g, 황산아연 0.001g, 및 황산망간 0.001g으로 구성된 생산용 배지 50㎖를 함유하는 플라스크에 접종하였다. 최종 부피를 수돗물로 1ℓ로 조정하고, pH를 7.2로 조정한 후, 배지를 25분간 121℃에서 오토클레이빙시켰다.
다양한 카복실산 기질(하기 표 1을 참조)을 메탄올에 용해시키고, 접종한지 24시간 후에 발효 배양액에 0.2g/ℓ의 최종 농도로 첨가하였다. 발효 배양액을 28℃에서 14일간 배양한 후에, 배양액을 원심분리하고(2,500rpm에서 2분간) 상청액을 버렸다. 균사체 펠렛(pellet)을 아세톤(15㎖) 및 이어서 디클로메탄(30㎖)으로 추출하고, 유기상을 분리하고 여과시킨 후, 증발시켜 건조시켰다. 잔류물을 메탄올(1㎖)에 용해시키고, 240nm로 설정된 스캐닝 다이오드-어레이(scanning diode-array) 검출기가 장착된 휴렛-펙커드(Hewlett-Packard) 1090A 액체 크로마토그래피로 분석하였다. 사용된 칼럼은 40℃로 유지된 벡크만 울트라스피어(Beckman Ultrasphere) C-18, 5㎛, 4.6㎜×25㎝ 칼럼이었다. 상기 메탄올 용액 25㎕를 칼럼에 주입시켰다. 0.84㎖/분의 속도로 40분에 걸쳐 80:20 내지 95:5의 메탄올-물의 선형 구배로 용출시켰다. 사이클로헥실 B1의 2가지 표준 농도를 사용하여 검출기 반응을 보정하였고, B2 및 B1 아베르멕틴의 곡선하의 면적을 측정하였다.
1.2. 결과
B2 및 B1 아베르멕틴에 대해서 관찰된 HPLC 체류 시간, 및 이들 아베르멕틴의 2:1의 비를 하기 표 1에 나타낸다:
표 1에 제시된 데이타는 B2:B1의 아베르멕틴 산물의 비가 매우 광범위함을 나타내는데, 이는 계열 2의 화합물의 계열 1의 화합물로의 탈수적 전환 결과가 제공된 지방산 측쇄 개시제 단위에 따라 상당히 차이가 남을 지시한다. 이는 AveC 단백질의 변형에 기인한 B2:B1 비의 변화가 특정 기질에 특이적일 수 있음을 의미하는 것이다. 결과적으로, 특정 기질에서 수득될 수 있는 B2:B1 비의 변화를 나타내는 돌연변이를 탐색하는 것은 상기 특정 기질의 존재하에서 행해져야 한다. 하기 기술된 이후의 실시예에서는 탐색용 기질로서 사이클로헥산 카복실산을 사용한다. 그러나, 이 기질을 단순히 그 가능성을 예시하기 위해 사용한 것일 뿐이지 본 발명의 응용성을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 2
aveC 유전자의 단리
이 실시예에서는 AveC 유전자 산물을 암호화하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체의 영역을 단리하고 특징을 분석하는 것을 기술한다. 하기에 기술한 바와 같이,aveC유전자는 생산되는 아베르멕틴의 사이클로헥실-B2 대 사이클로헥실-B1(B2:B1)의 비를 변화시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
2.1. 물질 및 방법
2.1.1. DNA를 단리하기 위한 스트렙토마이세스의 배양
하기 방법에 따라 스트렙토마이세스를 배양하여 생육시켰다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC 31272의 단일 콜로니(단일 콜로니 단리물 #2)를 디프코(Difco) 효모 추출물 5g, 디프코 박토(Bacto)-펩톤 5g, 덱스트로스 2.5g, MOPS 5g 및 디프코 박토-아가 15g을 함유하는 1/2 농도 YPD-6에서 단리하였다. 최종 부피를 dH2O로 1ℓ로 조정하고, pH를 7.0으로 조정한 후, 배지를 25분간 121℃에서 가압멸균(autoclaving)하였다.
상기 배지에서 생육시킨 균사체를 48 내지 72시간 동안 28℃에서 진탕시키면서(300rpm) 유지된 25㎜×150㎜의 시험관내 TSB 배지(121℃에서 25분간 가압멸균한 1ℓ의 dH2O중의 디프코 트립신분해된 대두 배양물 30g) 10㎖에 접종하였다.
2.1.2. 스트렙토마이세스로부터 염색체 DNA 단리
전술한 바와 같이 생육시킨 균사체의 분취량(0.25㎖ 또는 0.5㎖)을 1.5㎖들이 미량원심분리기 시험관에 넣고, 세포를 12,000×g에서 60초간 원심분리하여 농축시켰다. 상청액을 버리고, 세포를 2㎎/㎖의 라이소자임을 함유하는 0.25㎖의 TSE 완충액(1.5M 수크로스 20㎖, 1M Tris-HCl, pH 8.0 2.5㎖, 1M EDTA, pH 8.0 2.5㎖, 및 dH2O 75㎖)에 재현탁시켰다. 샘플을 진탕시키면서 20분간 37℃에서 배양한후, 오토젠 540(AutoGen 540: 상표명) 자동화 핵산 단리 장치(미국 매사츄세츠주 내틱 소재의 인테그레이티드 세퍼레이션 시스템즈(Integrated Separation Systems))에 적재하여 게놈 DNA를 제조사의 지시에 따라 사이클(Cycle) 159(장치 소프트웨어)를 사용하여 단리하였다.
또 다르게는, 5㎖의 균사체를 17㎜×100㎜의 시험관에 넣고, 세포를 3,000rpm에서 5분간 원심분리하여 농축시킨 후, 상청액을 제거하였다. 세포를 1㎖의 TSE 완충액에 재현탁시키고, 3,000rpm에서 5분간 원심분리하여 농축시킨 후, 상청액을 제거하였다. 세포를 2㎎/㎖의 라이소자임을 함유하는 TSE 완충액 1㎖에 재현탁시키고, 30 내지 60분간 진탕시키면서 37℃에서 배양하였다. 배양이 끝난 후에, 10% 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 0.5㎖를 첨가하고 세포가 완전히 용해될 때까지 37℃에서 항온처리하였다. 용해물을 65℃에서 10분간 항온처리하고, 실온으로 냉각시킨 후, 2개의 1.5㎖들이 에펜도르프(Eppendorf) 시험관에 나누어 넣고, 0.5㎖의 페놀/클로로포름(0.5M Tris, pH 8.0으로 미리 평형시킨 50% 페놀; 50% 클로로포름)으로 1회 추출하였다. 수상을 제거하고 클로로포름:이소아밀 알콜(24:1)로 2 내지 5회 추출하였다. 추출된 DNA를 3M 아세트산나트륨(pH 4.8)을 1/10체적으로 첨가하여 침전시키고, 혼합물을 얼음상에서 10분간 항온처리한 후, 15,000rpm으로 5℃에서 10분간 원심분리하고 상청액을 빈 시험관에 옮기고, 여기에 1체적의 이소프로판올을 첨가하였다. 그다음 상청액+이소프로판올 혼합물을 20분간 얼음상에서 항온처리하고, 15,000rpm으로 20분간 5℃에서 원심분리한 후, 상청액을 제거하고 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 1회 세척하였다. 펠렛을 건조시킨 후에, DNA를 TE완충액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0)에 재현탁시켰다.
2.1.3. 스트렙토마이세스로부터 플라스미드 DNA의 단리
균사체의 분취량(1.0㎖)을 1.5㎖들이 미량원심분리기 시험관에 넣고 세포를 12,000×g에서 60초간 원심분리하여 농축시켰다. 상청액을 버리고, 세포를 10.3% 수크로스 1.0㎖에 재현탁시킨 후, 12,000×g에서 60초간 원심분리하여 농축시키고 상청액을 버렸다. 그다음 세포를 2㎎/㎖의 라이소자임을 함유하는 TSE 완충액 0.25㎖에 재현탁시키고, 진탕시키면서 37℃에서 20분간 항온처리한 후, 오토젠 540(상표명) 자동화 핵산 분리 장치에 적재하였다. 제조사의 지시에 따라 사이클 106(장치 소프트웨어)을 사용하여 플라스미드 DNA를 단리하였다.
또 다르게는 1.5㎖의 균사체를 1.5㎖들이 미량원심분리기 시험관에 넣고, 세포를 12,000×g에서 60초간 원심분리하여 농축시켰다. 상청액을 버리고, 세포를 10.3% 수크로스 1.0㎖에 재현탁시킨 후, 12,000×g에서 60초간 원심분리하여 농축시키고 상청액을 버렸다. 세포를 2㎎/㎖의 라이소자임을 함유하는 TSE 완충액 0.5㎖에 재현탁시키고, 37℃에서 15 내지 30분간 항온처리하였다. 항온처리가 끝난 후에, 알칼리 SDS(0.3N NaOH, 2% SDS) 0.25㎖를 첨가하고, 세포를 55℃에서 15 내지 30분간 또는 용액이 맑아질 때까지 항온처리하였다. 아세트산나트륨(0.1㎖, 3M, pH 4.8)을 상기 DNA 용액에 첨가한 후, 10분간 얼음상에서 항온처리하였다. DNA 샘플을 14,000prm에서 10분간 5℃에서 원심분리하였다. 상청액을 빈 시험관에 옮기고 0.2㎖의 페놀:클로로포름(50% 페놀; 50% 클로로포름)을 첨가하고 부드럽게 혼합하였다. DNA 용액을 5℃에서 14,000rpm으로 10분간 원심분리하고, 상층을 빈에펜도르프 시험관에 옮겼다. 이소프로판올(0.75㎖)을 첨가하고, 용액을 부드럽게 혼합한 후 실온에서 20분간 항온처리하였다. 이 DNA 용액을 14,000rpm으로 15분간 5℃에서 원심분리한 후, 상청액을 제거하고 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 1회 세척하고 건조시킨 후에, TE 완충액에 재현탁시켰다.
2.1.4. 이 콜라이로부터 플라스미드 DNA의 단리
형질전환된 이 콜라이 단일 콜로니를 5㎖의 루리아-베르타니(Luria-Bertani, LB) 배지(121℃에서 25분간 오토클레이빙시키고 100㎍/㎖의 암피실린으로 보충된, 1ℓ의 dH2O중의 박토-트립톤 10g, 박토-효모 추출물 5g 및 NaCl 10g)에 접종하였다. 배양물을 하롯밤 동안 배양하고, 1㎖의 분취량을 1.5㎖들이 미량원심분리기 시험관에 넣었다. 배양 샘플을 오토젠 540(상표명) 자동화 핵산 분리 장치에 적재하고, 제조사의 지시에 따라 사이클 3(장치 소프트웨어)을 사용하여 플라스미드 DNA를 단리하였다.
2.1.5. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 원형질체의 제조 및 형질전환
스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 단일 콜로니를 1/2 농도 YPD-6에서 단리하였다. 단리된 균사체를 25㎜×150㎜의 시험관내 TSB 배지 10㎖에 접종한 후, 진탕시키면서(300rpm) 28℃에서 48시간 동안 배양하였다. 1㎖의 균사체를 50㎖의 YEME 배지에 접종하였다. YEME 배지는 1ℓ당 디프코 효모 추출물 3g, 디프코 박토-펩톤 5g, 디프코 맥아 추출물 3g, 수크로스 300g을 함유한다. 121℃에서 25분간 오토클레이빙시킨 후에, 2.5M MgCl2·6H2O(별도로 121℃에서 25분간 오토클레이빙시켰다) 2㎖ 및 글리신(20%)(필터-살균됨) 25㎖를 첨가하였다.
균사체를 30℃에서 48 내지 72시간 동안 생육시키고 50㎖ 원심분리기 시험관(팔콘(Falcon))에서 3,000rpm으로 20분간 원심분리하여 수확하였다. 상청액을 버리고, 수크로스 205g, K2SO40.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, H2O 600㎖, K2PO4(0.5%) 10㎖, 미량 원소 용액(미량 원소 용액은 1ℓ당 ZnCl240㎎, FeCl3·6H2O 200㎎, CuCl2·2H2O 10㎎, MnCl2·4H2O 10㎎, Na2B4O7·10H2O 10㎎, (NH4)6Mo7O24·4H2O 10㎎을 함유한다) 20㎖, CaCl2·2H2O(3.68%) 100㎖, 및 MES 완충액(1.0M, pH 6.5) 10㎖를 함유하는 P 완충액에 상기 균사체를 재현탁시켰다. pH를 6.5로 조정하고, 최종 부피를 1ℓ로 조정한 후, 배지를 0.45 마이크론 필터를 통해 고온에서 여과시켰다.
균사체를 3,000rpm으로 20분간 펠렛화시키고, 상청액을 버린 후, 균사체를 2㎎/㎖의 라이소자임을 함유하는 P 완충액 20㎖에 재현탁시켰다. 이 균사체를 진탕시키면서 15분간 35℃에서 항온처리하고, 현미경으로 관찰하여 원형질체가 형성된 정도를 확인하였다. 원형질체가 완전히 형성되면, 이 원형질체를 8,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 원형질체를 10㎖의 P 완충액에 재현탁시켰다. 원형질체를 8,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상청액을 제거한 후, 2㎖의 P 완충액에 재현탁시켜 약 1×109개의 원형질체를 2.0㎖의 저온저장용 바이얼(날젠(Nalgene))에 분배하였다.
1×109개의 원형질체를 함유하는 바이얼을 8,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상청액을 버린 후, 원형질체를 0.1㎖의 P 완충액에 재현탁시켰다. 형질전환시킬 DNA 2 내지 5㎍을 상기 원형질체에 첨가하고 바로 0.5㎖의 반응 T 완충액을 첨가하였다. T 완충액 기본 용액은 PEG-1000(시그마(Sigma)) 25g, 수크로스 2.5g 및 H2O 83㎖를 함유한다. pH를 1N NaOH(필터 살균됨)로 8.8로 조정하고, T 완충액 기본 용액을 필터-살균한 후, 4℃에서 저장하였다. 반응 T 완충액은 동일자로 제조하여 사용하며, T 완충액 기본 용액 8.3㎖, K2PO4(4mM) 1.0㎖, CaCl2·2H2O(5M) 0.2㎖ 및 TES(1M, pH 8) 0.5㎖를 함유한다. 반응 T 완충액의 각 성분은 별도로 필터-살균되었다.
원형질체에 T 완충액을 첨가하고 20초 이내에 1.0㎖의 P 완충액을 또다시 첨가한 후, 원형질체를 8,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상청액을 버리고, 원형질체를 0.1㎖의 P 완충액에 재현탁시켰다. 그다음 원형질체를 수크로스 205g, K2SO40.25g, MgCl2·6H2O 10.12g, 글루코스 10g, 디프코 카사미노산 0.1g, 디프코 효모 추출물 5g, 디프코 오트밀 아가 3g, 디프코 박토 아가 22g, dH2O 800㎖를 함유하는 RM14 배지상에 도말하였다. 그 전에 RM14 배지 용액은 121℃에서 25분간 오토클레이빙시켰다. 오토클레이빙시킨 후에, 다음의 멸균 스톡(stock)을 첨가하였다: K2PO4(0.5%) 10㎖, CaCl2·2H2O(5M) 5㎖, L-프롤린(20%) 15㎖, MES 완충액(1.0M, pH 6.5) 10㎖, 미량 원소 용액(상기와 동일함) 2㎖, 사이클로헥스이미드 스톡(25㎎/㎖) 40㎖ 및 1N NaOH 2㎖. 1개의 플레이트(plate)당 25㎖의 RM14 배지를 취하고, 이 플레이트는 사용하기 전에 24시간 동안 건조시켰다.
원형질체를 95% 습도 및 30℃에서 20 내지 24시간 동안 배양하였다. 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 선택하기 위해, 125㎍/㎖의 티오스트렙톤을 함유하는 오버래이(overlay) 완충액 1㎖를 RM14 재생 플레이트상에 균일하게 도포하였다. 오버래이 완충액은 100㎖당 수크로스 10.3g, 미량 원소 용액(상기와 동일함) 0.2㎖ 및 MES(1M, pH 6.5) 1㎖를 함유한다. 원형질체를 티오스트렙톤 저항성(Thior) 콜로니가 육안으로 발견될 때까지 7 내지 14일 동안 95% 습도 및 30℃에서 배양하였다.
2.1.6. 스트렙토마이세스 리비단스( Streptomyces lividans ) 원형질체의 형질전환
스트렙토마이세스 리비단스 TK64(영국 노르위치 소재의 존 인즈 인스티튜트(John Innes Institute)에서 제공됨)를 몇몇 형질전환 방법에 사용하였다. 스트렙토마이세스 리비단스의 배양, 원형질체형성 및 형질전환을 위한 방법 및 조성물은 문헌[Hopwood et al., Genetic Manipulation ofStreptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985]에 기술된 바와 같이 행하였다. 플라스미드 DNA는 상기 실시예 2.1.3.에서 기술한 바와 같이 스트렙토마이세스 리비단스 형질전환체로부터 단리하였다.
2.1.7. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 발효 분석
1/2 농도의 YPD-6에서 4 내지 7일간 생육시킨 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균사체를 8㎖의 미리 제조된 배지 및 2개의 5㎜ 유리 비드를 함유하는 1×6인치의 시험관에 접종하였다. 미리 제조된 배지는 가용성 전분(약하게 비등시킨 전분, 또는 일본 노가야 소재의 재팬 콘 스타치 캄파니(Japan Corn Starch Co.)로부터 시판중인 KOSO) 20g/ℓ; 파마메디아 15g/ℓ; 아르다민 pH(미국 뉴저지주 클리프톤 소재의 캄플레인 인더스트리(Champlain Ind.)) 5g/ℓ; CaCO32g/ℓ; 및 배지중의 최종 농도로 50ppm의 2(±)-메틸부티르산, 60ppm의 이소부티르산 및 20ppm의 이소발레르산을 함유하는 2x bcfa("bcfa"란 분지쇄 지방산을 지칭한다)를 함유한다. pH를 7.2로 조정하고 배지를 121℃에서 25분간 오토클레이빙시켰다.
시험관을 17°각도로 215rpm으로 29℃에서 3일간 진탕시켰다. 종배양물 2㎖의 분취량을 사용하여 전분(약하게 비등시킨 전분 또는 KOSO) 160g/ℓ, 누트리소이(Nutrisoy)(미국 일리노이주 데카투르 소재의 아쳐 다니엘즈 미들랜드(Archer Daniels Midland)) 10g/ℓ, 아르다민 pH 10g/ℓ, K2HPO42g/ℓ, MgSO4·4H2O 2g/ℓ, FeSO4·7H2O 0.02g/ℓ, MnCl20.002g/ℓ, ZnSO4·7H2O 0.002g/ℓ, CaCO314g/ℓ, 2x bcfa(상기 정의한 바와 같음) 및 사이클로헥산 카복실산(CHC)(pH 7.0에서 20% 용액으로 제조됨) 800ppm을 함유하는 생산용 배지 25㎖를 함유하는 300㎖들이 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에 접종하였다. pH를 6.9로 조정하고, 배지를 121℃에서 25분간 오토클레이빙시켰다.
접종한 후에, 플라스크를 200rpm으로 진탕시키면서 12일간 29℃에서 배양하였다. 배양한 후에, 2㎖의 샘플을 플라스크로부터 회수하고, 8㎖의 메탄올로 희석하고 혼합한 후에, 이 혼합물을 1,250×g에서 10분간 원심분리하여 나머지 부분을 펠렛화시켰다. 그다음 상청액을 벡크만 울트라스피어 ODS 칼럼(25㎝×4.6㎜ 내경)을 사용하여 0.75㎖/분의 유속으로 HPLC로 분석하고, 240nm에서 흡광도를 측정하였다. 이동상은 86/8.9/5.1의 메탄올/물/아세토니트릴이었다.
2.1.8. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 PKS 유전자의 단리
스트렙토마이세스 아베르미틸리스(ATCC 31272, SC-2)의 염색체 DNA의 코스미드 라이브러리를 제조하고, 사카로폴리스포라 에리트래아 폴리케티드 신타제(PKS) 유전자의 단편으로부터 제조된 케토신타제(KS) 탐침과 혼성화시켰다. 코스미드 라이브러리의 제조 방법의 상세한 설명은 상기 문헌[Sambrook et al., 1989]에서 찾아볼 수 있다. 스트렙토마이세스의 염색체 DNA 라이브러리의 제조 방법에 대한 상세한 설명은 상기 문헌[Hopwood et al., 1985]에 제시되어 있다. 케토신타제-혼성화 영역을 함유하는 코스미드 클론은 pEX26(영국 캠브리지의 닥터 리들레이(P. Leadlay)가 친절하게 제공해줌)으로부터의 2.7kbNdeI/Eco47III 단편에 혼성화되는 것으로 확인되었다. 대략 5ng의 pEX26을NdeI 및Eco47III로 분해하였다. 반응 혼합물을 0.8% 시플라크(SeaPlaque: 상표명) GTG 아가로즈 겔(미국 매인주 락랜드 소재의 FMC 바이오프로덕츠(BioProducts))상에 적재하였다. 전기영동 후에 2.7kb의NdeI/Eco47III 단편을 상기 겔로부터 절제해내고, 에피센터 테크놀로지스 (Epicentre Technologies)로부터 구입한 겔라제(GELase: 상표명)를 패스트(Fast) 프로토콜에 따라 사용하여 상기 겔로부터 DNA를 회수하였다. 2.7kbNdeI/Eco47III 단편을 BRL 닉 트랜슬레이션 시스템(Nick Translation System)(미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재의 BRL 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(Life Technologies,Inc.))을 사용하여 제조사의 지시에 따라 [α-32P]dCTP(데옥시사이티딘 5'-트리포스페이트, 테트라(트리에틸암모늄) 염)(미국 매사츄세츠주 보스톤 소재의 NEN-듀퐁(Dupont)) 표지를 부착시켰다. 전형적인 반응은 0.05㎖ 체적으로 수행된다. 5㎕의 종결 완충액을 첨가한 후에, 표지가 부착된 DNA를 G-25 세파덱스 퀵 스핀(Sephadex Quick Spin: 상표명) 칼럼(뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim))을 사용하여 제조사의 지시에 따라 혼입되지 않은 뉴클레오티드로부터 분리하였다.
대략, 1,800개의 코스미드 클론을 콜로니 혼성화에 의해 탐색하였다. 사카로폴리스포라 에리트래아 KS 탐침에 강하게 혼성화되는 10개의 클론을 확인하였다. 코스미드 DNA를 포함하는 이 콜라이 콜로니를 LB 액체 배지에서 생육시키고, 각 배양물로부터 코스미드 DNA를 오토젠 540 자동화 핵산 단리 장치에서 제조사의 지시에 따라 사이클 3(장치 소프트웨어)을 사용하여 단리하였다. 제한 엔도뉴클레아제 지도 및 서던 블롯 혼성화 분석법을 행한 결과, 5개의 클론이 중첩된 염색체 영역을 함유함을 알 수 있었다. 5개의 코스미드(즉, pSE65, pSE66, pSE67, PSE68 및 pSE69)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 게놈BamHI 제한 지도는 코스미드의 중첩 분석법 및 혼성화 분석법으로 구성하였다(도 4).
2.1.9. 아베르멕틴 B2:B1의 비를 조절하는 DNA의 확인 및 aveC ORF의 확인
하기 방법을 사용하여 pSE66 코스미드 클론으로부터 유래한 서브클로닝(subcloning)된 단편이 AveC 돌연변이주에서 아베르멕틴 B2:B1의 비를 조절할 수 있는지를 시험하였다. pSE66(5㎍)을SacI 및BamHI으로 분해하였다.반응 혼합물을 0.8% 시플라크 GTG 아가로즈 겔(FMC 바이오프로덕츠)상에 적재하고, 전기영동 후에 2.9kb의SacI/BamHI 단편을 상기 겔로부터 절제해낸 후, 겔라제(상표명, 에피센터 테크놀로지스)를 패스트 프로토콜에 따라 사용하여 상기 겔로부터 DNA를 회수하였다. 대략 5㎍의 셔틀 벡터 pWHM3(바라 등의 문헌[J. Bacteriol., 171, 5872-5881, 1989] 참조)을SacI 및BamHI으로 분해하였다. 2.9kb의 삽입물 약 0.5㎍ 및 분해된 pWHM3 0.5㎍을 함께 혼합하고, 총 20㎕의 체적으로 1 유니트(unit)의 리가제(미국 매사츄세츠주 베벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.))를 사용하여 제조사의 지시에 따라 15℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 항온처리한 후에, 연결된 혼합물 5㎕를 70℃에서 10분간 항온처리하고, 실온으로 냉각시킨 후, 이를 사용하여 컴피턴트(competent) 이 콜라이 DH5α 세포(BRL)를 제조사의 지시에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 2.9kbSacI/BamHI 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE119로 명명하였다.
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38(화이자(Pfizer) 사내 균주)의 원형질체를 제조하고, 상기 실시예 2.1.5.에서 기술한 바와 같이 pSE119로 형질전환시켰다. 균주 1100-SC38은 사이클로헥산 카복실산으로 보충시키는 경우 아베르멕틴 사이클로헥실 B1 형태에 비해 아베르멕틴 사이클로헥실 B2 형태를 더 많이 생산하는 돌연변이주이다(약 30:1의 B2:B1의 비). 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 원형질체를 형질전환시키기 위해 사용된 pSE119는 이 콜라이 균주GM2163(미국 예일(Yale) 대학 이 콜라이 제네틱 스톡 센터(Genetic Stock Center) 소장인 닥터 바흐만(B.J. Bachmann)으로부터 수득함), 이 콜라이 균주 DM1(BRL) 또는 스트렙토마이세스 리비단스 균주 TK64로부터 단리하였다. 균주 1100-SC38의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고 발효 산물을 HPLC로 분석하였다. pSE119를 함유하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 형질전환체는 약 3.7:1의 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 변화된 비로 아베르멕틴을 생산하였다(하기 표 2 참조).
pSE119가 AveC 돌연변이주에서 아베르멕틴 B2:B1의 비를 조절할 수 있음이 입증됨에 따라, 삽입된 DNA의 서열을 분석하였다. 대략 10㎍의 pSE119를 플라스미드 DNA 단리 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아진(Qiagen))를 사용하여 제조사의 지시에 따라 단리하고, ABI 373A 자동화 DNA 서열분석기(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 서열을 분석하였다. 서열 데이타를 조합하고, 제네틱 컴퓨터 그룹(Genetic Computer Group)(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 GCG)의 프로그램을 사용하여 편집하였다. DNA 서열 및aveCORF를 도 1에 도시하였다(서열번호: 1).
pSE118로 명명된 새로운 플라스미드를 하기와 같이 구성하였다. 대략 5㎍의 pSE66을SphI 및BamHI으로 분해하였다. 반응 혼합물을 0.8% 시플라크 GTG 아가로즈 겔(FMC 바이오프로덕츠)상에 적재하고, 전기영동 후에 2.8kb의SphI/BamHI 단편을 상기 겔로부터 절제해낸 후, 겔라제(상표명, 에피센터 테크놀로지스)를 패스트 프로토콜에 따라 사용하여 상기 겔로부터 DNA를 회수하였다. 대략 5㎍의 셔틀 벡터pWHM3을SphI 및BamHI으로 분해하였다. 2.8kb의 삽입물 약 0.5㎍ 및 분해된 pWHM3 0.5㎍을 함께 혼합하고, 총 20㎕의 체적으로 1 유니트의 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 15℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 항온처리한 후에, 연결된 혼합물 5㎕를 70℃에서 10분간 항온처리하고, 실온으로 냉각시킨 후, 이를 사용하여 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 제조사의 지시에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 2.8kbSphI/BamHI 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE118로 명명하였다. pSE118 및 pSE119의 DNA 삽입물은 대략 838개의 뉴클레오티드만큼 중첩되었다(도 4).
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 원형질체를 전술한 바와 같이 pSE118로 형질전환시켰다. 균주 1100-SC38의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고 발효 산물을 HPLC로 분석하였다. pSE118을 함유하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 형질전환체는 균주 1100-SC38에서 생산된 아베르멕틴에 비해 아베르멕틴 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비를 변화시키지 않았다(하기 표 2 참조).
2.1.10. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체 DNA로부터 aveC 유전자의 PCR 증폭
aveCORF를 함유하는 약 1.2kb 단편을 상기에서 수득된aveC뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체 DNA로부터 PCR로 증폭시켜 단리하였다. PCR 프라이머는 미국 텍사스 소재의지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(Genosys Biotechnologies, Inc.)에서 구입하였다. 우측방향 프라이머는 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3'(서열번호: 6)이고, 좌측방향 프라이머는 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3'(서열번호: 7)이었다. PCR 반응은 제조사에서 제공된 완충액내 딥 벤트(Deep Vent: 상표명) 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여, 최종 부피 100㎕로 300μM dNTP, 10% 글리세롤, 200pmol의 각 프라이머, 0.1㎍의 주형 및 2.5 유니트의 효소의 존재하에 퍼킨-엘머 세투스 써멀 사이클러(Cetus thermal cycler)를 사용하여 수행하였다. 제 1 주기의 열 프로파일은 5분간 95℃(변성 단계), 2분간 60℃(어닐링(anealing) 단계) 및 2분간 72℃(연장 단계)이었다. 이후의 24회의 주기는 변성 단계를 45초로 단축시키고 어닐링 단계를 1분으로 단축시킨 것을 제외하고는 유사한 열 프로파일을 가졌다.
PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고, 약 1.2kb의 단일 DNA 밴드를 검출하였다. 이 DNA를 겔로부터 정제하고, 25ng의 선형화된 블런트 pCR-블런트 벡터(인비트로진)에 제조사의 지시에 따라 1:10의 벡터:삽입물의 몰비로 연결시켰다. 연결 혼합물을 사용하여 원 샷(One Shot: 상표명) 컴피턴트 이 콜라이 세포(인비트로진)를 제조사의 지시에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 약 1.2kb의 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE179로 명명하였다.
pSE179로부터 삽입물 DNA를BamHI/XbaI으로 분해하여 단리하고, 전기영동하여 분리한 후, 겔로부터 정제하고, 총 1㎍의 DNA 농도에서, 또한BamHI/XbaI으로 분해된 셔틀 벡터 pWHM3에 1:5의 벡터:삽입물의 몰비로 연결시켰다. 이 연결 혼합물을 사용하여 제조사의 지시에 따라 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 약 1.2kb의 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. pSE186(도 2, ATCC 209604)으로 명명된 이 플라스미드로 이 콜라이 DM1을 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다.
2.2. 결과
pSE119로부터 2.9kb의SacI/BamHI 단편은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38을 형질전환시켰을 때 생산되는 아베르멕틴 B2:B1의 비를 상당히 변화시켰음이 확인되었다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38은 통상적으로 약 30:1의 B2:B1의 비로 아베르멕틴을 생산하지만, 2.9kb의SacI/BamH1 단편을 포함하는 벡터로 형질전환된 후에는 약 3.7:1로 감소된 아베르멕틴 B2:B1의 비로 아베르멕틴을 생산하였다. 형질전환된 배양물을 발효 후 분석한 결과 형질전환시키는 DNA의 존재가 확인되었다.
2.9kb의 pSE119 단편의 서열을 분석하고, 약 0.9kb의 ORF(도 1, 서열번호: 1)를 확인하였는데, 이 ORF는 단지 B2 산물만을 생산하도록 다른 위치에서 미리 돌연변이시킨PstI/SphI 단편을 포함한다(이케다 등의 상기 문헌[1995] 참조). 이 ORF 또는 그의 상응하는 추론된 폴리펩타이드를 공지된 데이타베이스(GenEMBL, SWISS-PROT)에 대해서 비교한 결과, 공지된 DNA 또는 단백질 서열과의 강한 상동성을 나타내지 않았다.
하기 표 2는 다양한 플라스미드로 형질전환된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 발효 분석 결과를 나타낸 것이다.
실시예 3
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 돌연변이주의 구성
이 실시예는 전술한 조성물 및 방법을 사용하여 여러 가지 다양한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 돌연변이주의 구성을 기술한다. 스트렙토마이세스에서 유전자를 돌연변이시키는 기술에 대한 일반적인 설명은 키서(Kieser) 및 합우드의 문헌[Meth. Enzym., 204,430-458, 1991]에 기술되어 있다. 보다 상세한 설명은 안자이(Anzai) 등의 문헌[J. Antibiot., XLI(2), 226-233, 1988] 및 스투츠만-엔그월(Stutzman-Engwall) 등의 문헌[J. Bacteriol.,174(1), 144-154, 1992]에 기술되어 있다. 이들 참고 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
3.1. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC 유전자의 불활성화
불활성화된aveC유전자를 포함하는 AveC 돌연변이주를 이하에서 기술한 바와 같이 몇 가지 방법을 사용하여 구성하였다.
첫 번째 방법으로, pSE119(상기 실시예 2.1.9.에서 기술된 플라스미드)에서aveC유전자의 내부의 640bpSphI/PstI 단편을 사카로폴리스포라 에리트래아로부터 유래한ermE유전자(에리트로마이신 저항성 암호화 유전자)로 대체시켰다.ermE유전자는 pIJ4026(영국 노르위치 소재의 존 인즈 인스티튜트에서 제공됨; 또한 빕(Bibb) 등의 문헌[Gene,41, 357-368, 1985]을 참조한다)을BglII 및EcoRI으로 제한 효소 분해한 후, 전기영동하여 단리하고, 겔로부터 정제하였다. 이 약 1.7kb 단편을BamHI 및EcoRI으로 분해된 pGEM7Zf(프로메가)에 연결시키고, 이 연결 혼합물로 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 제조사의 지시에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 약 1.7kb 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE27로 명명하였다.
pSE118(상기 실시예 2.1.9.에서 기술된 플라스미드)을SphI 및BamHI으로 분해하고, 분해물을 전기영동한 후, 약 2.8kb의SphI/BamHI 삽입물을 겔로부터 정제하였다. pSE119를PstI 및EcoRI으로 분해하고, 분해물을 전기영동한 후, 약 1.5kb의PstI/EcoRI 삽입물을 겔로부터 정제하였다. 셔틀 벡터 pWHM3을BamHI 및EcoRI으로 분해하였다. pSE27을PstI 및SphI으로 분해하고, 분해물을 전기영동한 후, 약 1.7kb의PstI/SphI 삽입물을 겔로부터 정제하였다. 4개의 단편들(즉, 약 2.8kb, 약 1.5kb, 약 7.2kb, 약 1.7kb)을 모두 함께 4방향 연결 방법으로 연결시켰다. 이 연결 혼합물로 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 제조사의 지시에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE180(도 3; ATCC 209605)으로 명명하였다.
pSE180으로 스트렙토마이세스 리비단스 TK64를 형질전환시키고, 형질전환된 콜로니를 티오스트렙톤 및 에리트로마이신에 대한 저항성으로 확인하였다. pSE180을 스트렙토마이세스 리비단스로부터 단리하고, 이를 사용하여 스트레토마이세스 아베르미틸리스 원형질체를 형질전환시켰다. 4개의 티오스트렙톤 저항성 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 형질전환체를 확인하고, 이로부터 원형질체를 제조한 후, RM14 배지상에서 비-선택적인 조건하에 도말하였다. 원형질체를 재생시킨 후에, 에리트로마이신 저항성이 존재하고 티오스트렙톤 저항성이 존재하지 않는 단일 콜로니를 탐색하였는데, 이는 불활성화된aveC유전자가 염색체에 삽입되고 유리 레플리콘(replicon)이 손실되었음을 의미하는 것이다. 1개의 ErmrThios형질전환체를 확인하고 균주 SE180-11로서 명명하였다. 전체 염색체 DNA를 균주 SE180-11로부터 단리하고,BamHI,HindIII,PstI 또는SphI의 제한 효소로 분해한 후, 0.8% 아가로즈 겔상에서 전기영동하여 분리하고, 나일론 멤브레인으로 옮겨ermE탐침에 혼성화시켰다. 이러한 분석 결과는ermE저항성 유전자의 염색체 삽입 및 640bp의PstI/SphI 단편의 동시 결손이 이중 교차 사건으로 일어났음을 나타내었다. 균주 SE180-11의 발효 산물을 HPLC로 분석한 결과, 정상적인 아베르멕틴은 더 이상 생산되지 않는 것으로 나타났다(도 5a).
aveC유전자를 불활성화시키는 두 번째 방법으로, 1.7kb의ermE유전자를 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 염색체로부터 제거하여,aveC유전자에서 640bp의PstI/SphI 단편이 결손되도록 하였다. 유전자 치환용 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다. pSE180을XbaI으로 부분 분해하고, 약 11.4kb의 단편을 겔로부터 정제하였다. 약 11.4kb 밴드에서 1.7kb의ermE저항성 유전자가 손실되었다. 그다음 DNA를 연결시키고, 이를 사용하여 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. pSE184로 명명된 이 플라스미드로 이 콜라이 DM1을 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다. 이 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11을 형질전환시켰다. 원형질체를 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체로부터 제조하고, RM14상에 단일 콜로니로서 도말하였다. 원형질체를 재생시킨 후에, 에리트로마이신 저항성 및 티오스트렙톤 저항성이 모두 존재하지 않는 단일 콜로니를 탐색하였는데, 이는 불활성화된aveC유전자가 염색체에 삽입되고ermE유전자를 포함하는 유리 레플리콘이 손실되었음을 의미하는 것이다. 1개의 ErmsThios형질전환체를 확인하고 균주 SE184-1-13으로 명명하였다. SE184-1-13의 발효 분석 결과, SE184-1-13은 정상적인 아베르멕틴을 생산하지 않으며, SE180-11과 동일한 발효 프로파일을 가짐이 확인되었다.
aveC유전자를 불활성화시키는 세 번째 방법으로, PCR을 사용하여 염색체aveC유전자의 471번 뉴클레오티드 위치에서 C 이하에 2개의 G를 첨가함으로써 프레임쉬프트(frameshift)를 도입시켜BspE1 부위를 제조하였다. 유전공학적으로 제조된BspE1 부위의 존재는 유전자 치환 현상을 검출하는데 유용하였다.aveC유전자에 프레임쉬프트를 도입시키는 PCR 프라이머를 고안하고, 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드로부터 구입하였다. 우측방향 프라이머는 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3'(서열번호: 8)이고, 좌측방향 프라이머는 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3'(서열번호: 9)이었다. PCR 조건은 상기 실시예 2.1.10.에서 기술된 바와 같았다. 666bp의 PCR 생성물을SphI으로 분해하여 각각 278bp 및 388bp의 2가지 단편을 수득하였다. 388bp 단편을 겔로부터 정제하였다.
유전자 치환용 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다. 셔틀 벡터 pWHM3을BamHI 및EcoRI으로 분해하였다. pSE119를BamHI 및SphI으로 분해하고, 분해물을 전기영동한 후, 약 840bp의 단편을 겔로부터 정제하였다. pSE119를EcoRI 및XmnI으로 분해하고, 분해물을 전기영동하여 분리한 후, 약 1.7kb의 단편을 겔로부터 정제하였다. 4개의 단편들(즉, 약 7.2kb, 약 840bp, 약 1.7kb 및 388bp)을 모두 함께 4방향 연결 방법으로 연결시켰다. 이 연결 혼합물로 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법 및 DNA 서열 분석법으로 확인하였다. pSE185로 명명된 이 플라스미드로 이 콜라이 DM1을 형질전환시키고 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다. 이 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 원형질체를 형질전환시켰다. 균주 1100-SC38의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고 발효 산물을 HPLC로 분석하였다. pSE185는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38을 형질전환시켰을 때, 생산되는 아베르멕틴 B2:B1의 비를 그다지 변화시키지 않았다(표 2 참조).
pSE185를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 원형질체를 형질전환시켜 염색체aveC유전자에 프레임쉬프트 돌연변이를 도입시켰다. 원형질체는 티오스트렙톤 저항성 형질전환체로부터 제조하고, RM14상에 단일 콜로니로서 도말하였다. 원형질체를 재생시킨 후에, 티오스트렙톤 저항성이 존재하지 않는 단일 콜로니를 탐색하였다. 티오스트렙톤 민감성 콜로니로부터 염색체 DNA를 단리하고, 염색체로 삽입된 프레임쉬프트 돌연변이의 존재를 PCR로 탐색하였다. PCR 프라이머를aveC뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안하고, 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(텍사스)에서 구입하였다. 우측방향 PCR 프라이머는 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3'(서열번호: 10)이고, 좌측방향 PCR 프라이머는 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3'(서열번호: 11)이며, PCR 조건은 상기 실시예 2.1.10.에서 기술된 바와 같았다. 수득된 PCR 생성물은 543bp이었고,BspE1으로 분해하였을 때 368bp, 96bp 및 79bp의 3가지 단편이 관찰되었는데, 이는 불활성화된aveC유전자가 염색체에 삽입되었으며 유리 레플리콘이 손실되었음을 나타내는 것이다.
aveC유전자가 프레임쉬프트 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 돌연변이주를 발효하여 분석한 결과, 이들 돌연변이주는 정상적인 아베르멕틴을 더 이상 생산하지 않으며, 균주 SE180-11 및 SE 184-1-13과 동일한 발효 HPLC 프로파일을 가짐이 확인되었다. 1개의 Thios형질전환체가 확인되었고, 이를 균주 SE185-5a로 명명하였다.
또한,aveC유전자에서 520번 뉴클레오티드 위치의 G가 A로 바뀌어 116번 아미노산 위치의 트립토판(W)을 암호화하는 코돈이 종결 코돈으로 변화된 돌연변이주를 제조하였다. 이와 같이 돌연변이된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주는 정상적인 아베르멕틴을 생산하지 않으며, 균주 SE180-11, SE184-1-13 및 SE185-5a와 동일한 발효 프로파일을 가졌다.
또한,aveC유전자에서 (i) 970번 뉴클레오티드 위치의 G가 A로 바뀌어 256번 아미노산 위치의 글리신(G)이 아스파테이트(D)로 변화되고, (ii) 996번 뉴클레오티드 위치의 T가 C로 바뀌어 275번 아미노산 위치의 타이로신(Y)이 히스티딘(H)으로 변화된 돌연변이주를 제조하였다. 이와 같이 돌연변이된(G256D/Y275H) 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주는 정상적인 아베르멕틴을 생산하지 않으며, 균주 SE180-11, SE184-1-13 및 SE185-5a와 동일한 발효 프로파일을 가졌다.
본원에 제공된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveC불활성화 돌연변이주 SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a 및 기타 균주는aveC유전자의 다른 돌연변이의 영향을 평가하기 위한 탐색 도구로서 사용된다.aveC유전자의 야생형 카피를 함유하는 pSE186으로 이 콜라이 DM1을 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다. 이 pSE186 DNA를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환시켰다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC 분석함으로써 ThiorErmr형질전환체를 분석하였다. 트랜스(in trans) 작용성aveC유전자는 균주 SE180-11가 정상적인 아베르멕틴을 생산하도록 회복시킬 수 있었다(도 5b).
3.2. 계열 B2:B1의 비를 변화시키는 aveC 유전자에서의 돌연변이의 분석
전술한 바와 같이, 불활성aveC유전자를 포함하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11은 작용성aveC유전자를 포함하는 플라스미드(pSE186)로 형질전환시킴으로써 보충될 수 있다. 균주 SE180-11을 또한 숙주 균주로서 사용하여 이하에 기술한 바와 같이aveC유전자의 다른 돌연변이의 특징을 분석하였다.
염색체 DNA를 균주 1100-SC38로부터 단리하고,aveC유전자의 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. 1.2kb의 ORF를aveC뉴클레오티드 서열에 기초하여 고안된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켜 단리하였다. 우측방향 프라이머는 서열번호: 6이고, 좌측방향 프라이머는 서열번호: 7이었다(상기 실시예 2.1.10.을 참조한다). PCR 및 서브클로닝 조건은 상기 실시예 2.1.10.에 기술되어 있다. 1.2kb ORF의 DNA 서열을 분석한 결과,aveC유전자에서 337번 뉴클레티드 위치의 C가 T로 바뀌어 55번 아미노산 위치의 세린(S)을 페닐알라닌(F)으로 변화시키는 돌연변이가 일어났음을 발견하였다. S55F 돌연변이된aveC유전자를 pWHM3에 서브클로닝하여 pSE187로 명명된 플라스미드를 제조하고, 이를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환시켰다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC로 분석함으로써 ThiorErmr형질전환체를 분석하였다. 아미노산잔기 55번에서의 변화(S55F)를 암호화하는aveC유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산할 수 있도록 회복시킬 수 있으며(도 5c), 약 1.6:1의 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비로 아베르멕틴을 생산하는 pSE186으로 형질전환된 균주 SE180-11에 비해 약 26:1의 B2:B1의 비로 아베르멕틴을 생산하였는데, 이로부터 상기 단일 돌연변이(S55F)가 사이클로헥실 B1의 생산량에 비해서 사이클로헥실 B2의 생산량을 조절함을 알 수 있다.
aveC유전자에서 862번 뉴클레오티드 위치의 G가 A로 바뀌어 230번 아미노산 위치의 글리신(G)이 아스파테이트(D)로 변화된 또다른 돌연변이를 확인하였다. 이와 같이 돌연변이된(G230D) 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주는 약 30:1의 B2:B1의 비로 아베르멕틴을 생산한다.
3.3. B2:B1 비를 감소시키는 돌연변이
사이클로헥실 B1에 비해 사이클로헥실 B2의 생산량을 감소시키는 몇 가지 돌연변이주를 하기와 같이 구축하였다.
aveC유전자에서 588번 뉴클레오티드 위치의 G가 A로 바뀌어 139번 아미노산 위치의 알라닌(A)이 트레오닌(T)으로 변화된 돌연변이를 확인하였다. A139T 돌연변이를 포함하는aveC유전자를 pWHM3에 서브클로닝하여 pSE188로 명명된 플라스미드를 제조하고, 이를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11을 형질전환시켰다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC로 분석함으로써ThiorErmr형질전환체를 분석하였다. 아미노산 잔기 139번에서의 변화(A139T)를 암호화하는 돌연변이된aveC유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산할 수 있도록 회복시킬 수 있으며(도 5d), 약 0.94:1의 B2:B1의 비로 아베르멕틴을 생산하였는데, 이는 상기 돌연변이로 인해 사이클로헥실 B1의 생산량에 비해 사이클로헥실 B2의 생산량이 감소하였음을 나타내는 것이다. 이러한 결과는, 공개된 결과뿐만 아니라 전술한 돌연변이의 결과가 단지aveC유전자의 불활성화나 B1 형태의 아베르멕틴에 비해서 B2 형태의 생산 증가만을 나타내는 것으로 볼 때 예측하지 못한 것이었다(하기 표 3 참조).
A139T 돌연변이는 B2:B1의 비를 더욱 바람직한 B1이 더 많이 생산되는 방향으로 변화시키기 때문에, 138번 아미노산 위치의 세린 대신 트레오닌을 암호화하는 돌연변이주를 제조하였다. 따라서, pSE186을EcoRI으로 분해하고,EcoRI으로 분해된 pGEM3Zf(프로메가)에 클로닝하였다. pSE186a로 명명된 이 플라스미드를ApaI 및KpnI으로 분해하고, DNA 단편을 아가로즈 겔상에서 분리한 후, 약 3.8kb 및 약 0.4kb의 2가지 단편을 겔로부터 정제하였다. pSE186으로부터 약 1.2kb의 삽입물 DNA를 PCR 주형으로 사용하여 585번 뉴클레오티드 위치에서 단일 염기를 바꾸었다. 585번 뉴클레오티드 위치를 돌연변이시키는 PCR 프라이머를 고안하고 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(텍사스)로부터 구입하였다. 우측방향 PCR 프라이머는 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3'(서열번호: 12)이고, 좌측방향 프라이머는 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3'(서열번호: 13)이었다. PCR 반응은 제조사에서 제공된 완충액내 어드밴티지(Advantage) GC 게노믹(Genomic) PCR 키트(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 클론테크 래버로토리즈(Clonetech Laboratories))를 사용하여, 200μM dNTP, 200pmol의 각 프라이머, 50ng의 주형 DNA, 1.0M의 GC-용융물 및 1 유니트의 클렌태크 폴리머라제 믹스(KlenTaq Polymerase Mix)의 존재하에 최종 부피 50㎕에서 수행하였다. 제 1 주기의 열 프로파일은 1분간 94℃이었고, 이어서 30초간 94℃ 및 2분간 68℃에서 25회 주기를 수행한 후, 3분간 68℃에서 1회 주기를 수행하였다. 295bp의 PCR 생성물을ApaI 및KpnI으로 분해하여 254bp 단편을 수득하고, 이를 전기영동으로 분리한 후, 겔로부터 정제하였다. 3개의 단편들(약 3.8kb, 약 0.4kb 및 254bp)을 모두 함께 3방향 연결 방법으로 연결시켰다. 이 연결 혼합물로 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE198로 명명하였다.
pSE198을EcoRI으로 분해하고,EcoRI으로 분해된 pWHM3으로 클로닝한 후, 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법 및 DNA 서열 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드로 이 콜라이 DM1을 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. pSE199로 명명된 이 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11을 형질전환시켰다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC로 분석함으로써 ThiorErmr형질전환체를 분석하였다. 아미노산 잔기 138번에서의 변화(S138T)를 암호화하는 돌연변이된aveC유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산할 수 있도록 회복시킬 수 있으며, 약 0.88:1의 B2:B1의 비로 아베르멕틴을 생산하였는데, 이는 상기 돌연변이로 인해 사이클로헥실 B1의 생산량에 비해 사이클로헥실 B2의 생산량이 감소하였음을 나타내는 것이다(하기 표 3 참조). 상기 B2:B1의 비는 심지어 전술한 바와 같이 pSE188로 형질전환시킨 균주 SE180-11에서 생산된 A139T 돌연변이에서 관찰된 0.94:1의 비보다 더 낮았다.
아미노산 위치 138번 및 139번 둘다에 트레오닌을 도입시키는 또다른 돌연변이를 구축하였다. pSE186으로부터 수득한 약 1.2kb의 삽입물 DNA를 PCR 주형으로 사용하였다. 585번 및 588번 뉴클레오티드 위치를 돌연변이시키는 PCR 프라이머를 고안하고 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(텍사스)에서 구입하였다. 우측방향 PCR 프라이머는 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3'(서열번호: 14)이었고, 좌측방향 PCR 프라이머는 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3'(서열번호: 15)이었다. PCR 조건은 바로 위에서 기술한 조건을 사용하여 수행하였다. 449bp의 PCR 생성물을ApaI 및KpnI으로 분해하여 254bp 단편을 수득하고, 이를 전기영동으로 분리한 후, 겔로부터 정제하였다. pSE186a를ApaI 및KpnI으로 분해하고, DNA 단편을 아가로즈 겔상에서 분리한 후, 약 3.8kb 및 약 0.4kb의 2개의 단편들을 겔로부터 정제하였다. 3가지 단편들(약 3.8kb, 약 0.4kb 및 254bp)을 모두 함께 3방향 연결 방법으로 연결시키고, 이 연결 혼합물로 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE230으로 명명하였다.
pSE230을EcoRI으로 분해하고,EcoRI으로 분해된 pWHM3으로 클로닝한 후, 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법 및 DNA 서열 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드로 이 콜라이 DM1을 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. pSE231로 명명된 이 플라스미드를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환시켰다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 분석함으로써 ThiorErmr형질전환체를 분석하였다. S138T/A139T를 암호화하는 이중 돌연변이된aveC유전자의 존재는 균주 SE180-11이 정상적인 아베르멕틴을 생산할 수 있도록 회복시킬 수 있으며, 약 0.84:1의 B2:B1의 비로 아베르멕틴을 생산한 것으로 보아, 상기 돌연변이는 전술한 바와 같이 pSE188 또는 pSE199로 형질전환된 균주 SE180-11에서 수득되는 아베르멕틴의 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비의 감소된 수준보다 더욱 감소된 수준의 B2:B1의 비로 아베르멕틴을 생산하도록 함을 알 수 있다(하기 표 3 참조).
이러한 결과는aveC유전자에 특정한 돌연변이를 유발시킴으로써, 계열 2의 아베르멕틴에 비해 보다 상업적으로 바람직한 계열 1의 아베르멕틴을 더 많이 생산할 수 있음을 최초로 입증하는 것이다.
실시예 4
5' 결손 돌연변이주의 구성
상기 상세한 설명의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자편에서 설명한 바와 같이, 도 1에 도시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)은 42번, 174번, 177번 및 180번 bp 위치에서 잠재적인 개시 부위인 4개의 상이한 GTG 코돈을 포함한다. 이 실시예는 이들 코돈중 어느 것이 단백질 발현을 위해aveCORF의 개시 부위로서 작용할 수 있는지를 용이하게 규명하기 위해aveCORF(도 1; 서열번호: 1)의 5' 영역이 다중 결손된 돌연변이주를 제조하는 것을 기술한다.
5' 말단이 다양하게 결손된aveC유전자의 단편들을 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 염색체 DNA로부터 PCR 증폭시켜 단리하였다. PCR 프라이머를aveCDNA 서열에 기초하여 고안하고 지노시스 바이오테크놀로지스 인코포레이티드로부터 구입하였다. 우측방향 프라이머들은 5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3'(서열번호: 16)(D1F1); 5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3'(서열번호: 17)(D1F2); 5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3'(서열번호: 18)(D1F3); 및 5'-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3'(서열번호:19)(D2F2)이었다. 좌측방향 프라이머들은 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3'(서열번호: 20); 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3'(서열번호: 21); 및 5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3'(서열번호: 22)이었다. PCR 반응은 상기 실시예 3.3에서 기술된 바와 같이 수행하였다.
PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분리하고 약 1.0kb 또는 약 1.1kb의 단일 DNA 밴드를 검출하였다. 이 PCR 생성물을 겔로부터 정제하고, 25ng의 선형화된 pCR2.1 벡터(인비트로진)에 1:10의 벡터:삽입물의 몰비로 제조사의 지시에 따라 연결시켰다. 이 연결 혼합물을 사용하여 원 샷(상표명) 컴피턴트 이 콜라이 세포(인비트로진)를 제조사의 지시에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체를 단리하고, 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법 및 DNA 서열 분석법으로 확인하였다. 이들 플라스미드를 pSE190(프라이머 D1F1으로 수득됨), pSE191(프라이머 D1F2로 수득됨), pSE192(프라이머 D1F3으로 수득됨), 및 pSE193(프라이머 D2F2로 수득됨)으로 명명하였다.
삽입물 DNA들을 각각BamHI/XbaI으로 분해하고, 전기영동으로 분리한 후, 겔로부터 정제하고,BamHI/XbaI으로 분해된 셔틀 벡터 pWHM3에 1㎍의 총 DNA 농도에서 1:5의 벡터:삽입물의 몰비로 연결시켰다. 이 연결 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. pSE194(D1F1), pSE195(D1F2), pSE196(D1F3) 및 pSE197(D2F2)로 명명된 이들 플라스미드 각각으로 이 콜라이 균주 DM1을 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 DNA를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환시켰다. 균주 180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을 HPLC로 분석함으로써 ThiorErmr형질전환체를 분석하여 GTG 부위가aveC발현에 필수적임을 확인하였다. 상기 결과로부터 42번 위치의 GTG 코돈이aveC발현에 영향을 미치지 않으면서 제거될 수 있음이 밝혀졌는데, 그 이유는 42번 위치의 GTG 코돈은 포함하지 않지만 174번, 177번 및 180번 위치에서 3개의 GTG 코돈을 포함하는 pSE194, pSE195 및 pSE196이, 이들로 SE180-11을 형질전환시켰을 때 정상적인 아베르멕틴을 생산할 수 있도록 상기 균주를 회복시킬 수 있었기 때문이다. 4개의 GTG 부위가 모두 손실된 pSE197로 형질전환된 균주 SE180-11은 정상적인 아베르멕틴을 생산할 수 있도록 회복되지 않았다(하기 표 4 참조).
실시예 5
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 및 스트렙토마이세스 그리세오크로모제네스로부터 aveC 동족체의 클로닝
본 발명은 스트렙토마이세스의 다른 아베르멕틴-생산종 또는 밀베마이신-생산종으로부터aveC동족체 유전자를 발견하고 클로닝하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(FERM BP-1901)의 게놈 DNA의 코스미드 라이브러리를 전술한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 수득한 1.2kbaveC탐침과 혼성화시켰다. 강하게 혼성화되는 몇 가지 코스미드 클론이 확인되었다. 이들 코스미드로부터 염색체 DNA를 단리하고,aveC탐침과 혼성화되는 4.9kb의KpnI 단편을 확인하였다. 이 DNA의 서열을 분석하고, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveCORF에 대해 매우 큰 상동성을 갖는 ORF(서열번호: 3)를 확인하였다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스aveC동족체 ORF로부터 추론한 아미노산 서열(서열번호: 4)을 도 6에 나타내었다.
또한, 스트렙토마이세스 그리세오크로모제네스의 게놈 DNA의 코스미드 라이브러리를 전술한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 수득한 1.2kbaveC탐침과 혼성화시켰다. 강하게 혼성화되는 몇 가지 코스미드 클론이 확인되었다. 이들 코스미드로부터 염색체 DNA를 단리하고,aveC탐침과 혼성화되는 5.4kb의PstI 단편을 확인하였다. 이 DNA의 서열을 분석하고, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의aveCORF에 대해 매우 큰 상동성을 갖는aveC동족체의 일부 ORF를 확인하였다. 추론된 부분적인 아미노산 서열(서열번호: 5)을 도 6에 나타내었다.
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 및 스트렙토마이스세 그리세오크로모제네스로부터 수득한aveC동족체의 DNA 및 아미노산 서열을 분석한 결과, 이들 영역들이 서로간에 그리고 스트렙토마이세스 아베르메틸리스aveCORF 및 AveC 유전자 산물에 대해서 모두 상당한 상동성(아미노산 수준에서 약 50%의 서열 일치성)을 공유하고 있음이 밝혀졌다(도 6).
실시예 6
ermE 프로모터 이하에 aveC 유전자를 갖는 플라스미드의 구성
pSE186으로부터 유래한 1.2kbaveCORF를, pWHM3의KpnI/BamHI 부위에서KpnI/BamHI 단편으로서 삽입된 300bp의ermE프로모터를 갖는 셔틀 벡터 pWHM3인 pSE34에 서브클로닝하였다(와드(Ward) 등의 문헌[Mol. Gen. Genet.,203, 468-478, 1986] 참조). pSE186을BamHI 및HindIII로 분해하고, 분해물을 전기영동으로 분리한 후, 1.2kb의 단편을 아가로즈 겔로부터 단리하여BamHI 및HindIII로 분해된 pSE34에 연결시켰다. 이 연결 혼합물로 컴피턴트 이 콜라이 DH5α를 제조사의 지시에 따라 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 1.2kb 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법으로 확인하였다. pSE189로 명명된 이 플라스미드로 이 콜라이 DM1을 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하였다. pSE189로 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38의 원형질체를 형질전환시켰다. 균주 1100-SC38의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 발효 산물을 HPLC로 분석하였다.
pSE189를 함유하는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 1100-SC38 형질전환체는 균주 1100-SC38에서 생산되는 아베르멕틴의 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비(약 34:1)에 비해 상기 비를 변화시키고(약 3:1), pSE119로 형질전환된 균주 1100-SC38에 비해 아베르멕틴의 총 생산량을 약 2.4배 증가시켰다(하기 표 5 참조).
또한 pSE189로 야생형 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주의 원형질체를 형질전환시켰다. 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고 발효 산물을 HPLC로 분석하였다. pSE189로 형질전환된 야생형 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 생산되는 아베르멕틴의 총 생산량은 pSE119로 형질전환된 야생형 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 생산되는 아베르멕틴에 비해 약 2.2배 증가하였다(하기 표 5 참조).
실시예 7
스트렙토마이세스 아베르미틸리스 aveC ORF 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 aveC 동족체로부터 수득한 서열을 모두 함유하는 키메릭 플라스미드
스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF의 564bp 부분이 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스aveC동족체의 564bp의 상동성 부분으로 치환된, pSE350으로 명명된 혼성 플라스미드를 하기와 같이 구성하였다. pSE350은 양쪽 서열 모두에서 보존된BsaAI 제한 부위(aveC의 225번 위치), 및 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveC유전자에 존재하는KpnI 제한 부위(aveC의 810번 위치)를 사용하여 구성하였다. 상기 실시예 2.1.10.에 기술된 PCR 조건, 우측방향 프라이머 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3'(서열번호: 23) 및 좌측방향 프라이머 5'-GAACTGGTACCAGTGCCC-3'(서열번호: 24)(지노시스 바이오테크놀로지스로부터 구입함)를 사용하여 PCR에 의해KpnI 부위를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 DNA에 도입시켰다. PCR 생성물을BsaAI 및KpnI으로 분해하고, 단편들을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분리한 후, 564bp의BsaAI/KpnI 단편을 겔로부터 단리하였다.pSE179(상기 실시예 2.1.10.에 기술됨)를KpnI 및HindIII로 분해하고, 단편들을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분리한 후, 약 4.5kb의 단편을 겔로부터 단리하였다. pSE179를HindIII 및BsaAI으로 분해하고, 단편들을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분리한 후, 약 0.2kb의BsaAI/HindIII 단편을 겔로부터 단리하였다. 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스로부터 수득한 약 4.5kb의HindIII/KpnI 단편, 약 0.2kb의BsaAI/HindIII 단편, 및 564bp의BsaAI/KpnI 단편을 모두 함께 3방향 연결 방법으로 연결시키고, 이 연결 혼합물로 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리하고, 올바른 삽입물의 존재를KpnI 및AvaI을 사용하여 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드를HindIII 및XbaI으로 분해하여 1.2kb의 삽입물을 수득한 후,HindIII 및XbaI으로 분해된 pWHM3에 연결시켰다. 이 연결 혼합물로 컴피턴트 이 콜라이 DH5α 세포를 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를HindIII 및AvaI을 사용하여 제한 효소 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드 DNA로 이 콜라이 DM1을 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 암피실린 저항성 형질전환체로부터 단리한 후, 올바른 삽입물의 존재를 제한 효소 분석법 및 DNA 서열 분석법으로 확인하였다. 이 플라스미드를 pSE350으로 명명하고, 이를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 SE180-11의 원형질체를 형질전환시켰다. 균주 SE180-11의 티오스트렙톤 저항성 형질전환체를 단리하고, 에리트로마이신 저항성의 존재를 측정한 후, 발효 산물을HPLC로 분석하여 ThiorErmr형질전환체를 분석하였다. 그 결과, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스/스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 혼성 플라스미드를 포함하는 형질전환체는 약 109:1의 B2:B1의 평균 비로 아베르멕틴을 생산하는 것으로 나타났다(하기 표 6 참조).
플라스미드의 기탁
하기 플라스미드를 1998년 1월 29일자로 미국 메릴랜드주 20852 락빌 파크론 드라이브 12301 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 기탁하고, 다음의 수탁번호를 부여받았다:
상기 인용된 모든 특허, 특허원 및 공개문헌들은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
본원에 기술된 특정 실시태양은 본 발명의 개별 양태를 하나씩 예시하고자 하는 것으로, 본 발명의 범주를 한정하지 않으며, 이와 작용적으로 상응하는 방법및 성분들도 본 발명의 범주내에 포함된다. 사실 본원에 나타내고 기술된 것 외에, 본 발명의 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 상기 상세한 설명 및 첨부된 도면들로부터 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 하기 청구의 범위의 범주내에 포함된다.
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)의 배양물을 발효시켜 생산된 아베르멕틴의 계열 2:1의 비를 조절하기 위해 사용될 수 있는, AveC 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 이러한 폴리뉴클레오티드 분자를 탐색하기 위한 조성물 및 방법을 제공함으로써, 아베르멕틴의 생성에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> Pfizer Products Inc. <120> STREPTOMYCES AVERMITILIS GENE DIRECTING THE RATIO OF B2:B1 AVERMECTINS <130> PC9916A <150> 60/074,636 <151> 1998-02-13 <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1229 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <220> <221> CDS <222> (174)..(1085) <400> 1 tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60 tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120 aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg gtg 176 Val 1 gtg gtg tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg tac 224 Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala Tyr 5 10 15 gtg ttc agc cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg atc gag acg 272 Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu Thr 20 25 30 gcg ggc cag ggt cag ggc ggc agc aag gat acg ggg act acc gat gtg 320 Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val 35 40 45 gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc atc acc gcc gcg gcg gcg tgg 368 Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala Trp 50 55 60 65 ctc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa cga cgg ctg ctg ttc gac gcc ctt 416 Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala Leu 70 75 80 ctc ttc ctc ggg ctg ctg ttc gcg agc tgg cag agc ccg ctc atg aac 464 Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met Asn 85 90 95 tgg ttc cat tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg ggc gcg gtg 512 Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala Val 100 105 110 ggt tcc tgg ggt ccg tat gtg ccc ggc tgg cag ggg gcg ggc ccg ggt 560 Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro Gly 115 120 125 gcg gag gcg gaa atg ccg ctg gcg tcg gcc tcc gtc tgc atg tcg gct 608 Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser Ala 130 135 140 145 ctg atc gtc acc gtg ctg tgc agc aag gca ctg ggg tgg atc aag gcc 656 Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys Ala 150 155 160 cgc cgg ccg gca tgg cgg acc tgg cgg ctg gtc ctg gcc gtg ttc ttc 704 Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe Phe 165 170 175 atc ggc atc gtg ctc ggt ctg tcc gag ccg ctg ccg tcc gcc tcc ggg 752 Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gly 180 185 190 atc agc gta tgg gcc aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg agt ggc 800 Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser Gly 195 200 205 gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc ggt tcc ggc ctg gtc 848 Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu Val 210 215 220 225 tgc tgc atg ctg ggc tcg ctg cgc ttc ttc cgc gac gaa cgc gat gag 896 Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp Glu 230 235 240 tcg tgg gtg gaa cgg gga gcc tgg cgg ttg ccg caa cgg gca gcg aac 944 Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala Asn 245 250 255 tgg gcg cgt ttc ctc gcc gtg gtc ggt ggg gtg aat gcc gtg atg ttc 992 Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met Phe 260 265 270 ctc tac acc tgt ttc cat atc ctc ctg tcc ctc gtc ggt gga cag ccg 1040 Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln Pro 275 280 285 ccc gac caa ctg ccg gac tcc ttc caa gcg ccg gcc gct tac tga 1085 Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc 1145 ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205 acactcctcg gttcagcgat catg 1229 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis <400> 2 Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu 20 25 30 Thr Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp 35 40 45 Val Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala 100 105 110 Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro 115 120 125 Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser 130 135 140 Ala Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys 145 150 155 160 Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe 165 170 175 Phe Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser 180 185 190 Gly Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser 195 200 205 Gly Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr Gln Ala Val Gly Ser Gly Leu 210 215 220 Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp 225 230 235 240 Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala 245 250 255 Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met 260 265 270 Phe Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln 275 280 285 Pro Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 <210> 3 <211> 1150 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <220> <221> CDS <222> (58)..(990) <400> 3 gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg 57 gtg ttc acc ctt ccc gta aca ctg tgg gcg tgt gtc ggc gcg ctg gtg 105 Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 ctg gga ctt cag gtg tac gtg ttc gcc gcc tgg ctc gcc gac agc ggc 153 Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 tac cgc atc gag aag gcg tcc ccg gcc agg ggc ggt ggg gac tcg gag 201 Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 cgg atc gcc gat gtg ctg atc ccg ctg ctg tcc gtg gtg gga gcg gtg 249 Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60 gtc ctc gca gtg tgt ctg tac cgg agg tgt cgg gcc agg agg cgg ctg 297 Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 acg ttc gac gcg tcg ctc ttc atc ggg ctg ctg tcg gcc agt tgg cag 345 Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln 85 90 95 agt ccc ttg atg aac tgg atc aat ccg gtg ctc gcg tca aac gtc aat 393 Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn 100 105 110 gtg ttc gga gcg gtg gcc tcg tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag 441 Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln 115 120 125 ggg gcg ggg gcg cac cag gag gcc gag ctg ccg ctg gcg acc ctg agc 489 Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 atc tgt atg acg gcc atg atg gcc gcc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg 537 Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 ggt ctt gcc gcc gcc cgg tgg ccg cgg ctg ggg ccg ctc cgg ctg atc 585 Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile 165 170 175 gcg ctc ggc ttt ctg ctc gtc gtg ctc ctc gac atc gcc gag ccg ctg 633 Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu 180 185 190 gtg tcc ttc gcg ggc gtc tcc gtg tgg acg cgg gca gtg ccc gag ctg 681 Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu 195 200 205 acc atc tgg agt ggg cac tgg tat cag ttc ccg ctg tat cag atg gtg 729 Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val 210 215 220 gct tcg gcg ctc ttc ggc gcc tct ttg ggg gcc gcg cgc cac ttt cgc 777 Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240 aac cgg cgc ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gcc ctc cta ccg 825 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 gag ggc ccg agg cca tgg gtc cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873 Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 aac atc agc atc gcc ctc tac acc ggc gca cac ggc gca cac atc ctg 921 Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu 275 280 285 ttc tcg ctg atg gac ggc gct ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc 969 Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 290 295 300 cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg tacccgatgt 1020 Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080 catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140 gcggccgggg 1150 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 4 Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60 Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gln 85 90 95 Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn 100 105 110 Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln 115 120 125 Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile 165 170 175 Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu 180 185 190 Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu 195 200 205 Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Phe Pro Leu Tyr Gln Met Val 210 215 220 Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu 275 280 285 Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe 290 295 300 Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptomyces griseochromogenes <400> 5 Val Ile Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Val Leu Gln Val 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp 20 25 30 Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg Ile Ile Asp 35 40 45 Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe 50 55 60 Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala 100 105 110 Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr 130 135 140 Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gln Val Met Ser Arg Val Arg 145 150 155 160 Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gln Leu Val Gly Leu Ala Phe 165 170 175 Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe Ile Ser Phe Ala 180 185 190 Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg 195 200 205 Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg 210 215 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 6 tcacgaaacc ggacacac 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 7 catgatcgct gaaccgag 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 8 ggttccggat gccgttctcg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Streptomyces 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Claims (34)

  1. 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)을 갖는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)의 완전한aveC개방 판독틀(ORF) 또는 그의 실질적인 부분을 포함하는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 염색체에서 원래 위치의aveCORF로부터 다운스트림(downstream)에 위치하는 그 이하의 완전한 ORF가 결손된 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 원래 위치의aveC유전자의 측면에 자연적으로 존재하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  3. 도 1에 도시된aveCORF의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그의 실질적인 부분에 상동성인 뉴클레오티드 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  4. 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 실질적인 부분을 포함하거나, 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  5. 매우 엄격한 조건하에서, 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화되거나, 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 분자.
  6. 제 5 항에 있어서,
    도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열과 상보적이거나, 또는 도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자에 상보적인 올리고뉴클레오티드 분자.
  7. 도 1에 도시된aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1) 또는 그의 실질적인 부분; 및 도 1에 도시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 ORF(서열번호: 1) 또는 그의 실질적인 부분에 상동성인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제 7 항에 있어서,
    제 7 항의 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열과 작용상 연관되어 있는 하나 이상의 조절성 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 갖는 재조합 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서,
    선택성 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 갖는 재조합 벡터.
  10. 제 9 항에 있어서,
    플라스미드 pSE186(ATCC 209604)인 재조합 벡터.
  11. 제 9 항의 재조합 벡터를 포함하는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 숙주 세포.
  12. 제 11 항에 있어서,
    스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)인 숙주 세포.
  13. 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 실질적인 부분; 서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열에 상동성인 뉴클레오티드 서열; 및 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  14. 제 13 항에 있어서,
    제 13 항의 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열과 작용상 연관되어 있는 하나 이상의 조절성 요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 벡터.
  15. 제 14 항에 있어서,
    선택성 표지를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 벡터.
  16. 제 15 항의 재조합 벡터를 포함하는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 숙주 세포.
  17. 제 16 항에 있어서,
    스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)인 숙주 세포.
  18. 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 2의 아미노산 서열 또는 그의 실질적인 부분, 또는 이들의 상동성 폴리펩타이드를 갖는 단리된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물.
  19. 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 단리된 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AveC 동족체 유전자 산물.
  20. 서열번호: 2의 아미노산 서열 또는 그의 실질적인 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지며 숙주 세포에서의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절성 요소와 작용상 연관되어 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 재조합 AveC 유전자 산물의 생산을 보조하는 조건하에 배양하는 단계; 및 이 세포 배양물로부터 AveC 유전자 산물을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 AveC 유전자 산물의 생산 방법.
  21. 서열번호: 4의 아미노산 서열 또는 그의 실질적인 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지며 숙주 세포에서의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절성 요소와 작용상 연관되어 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 재조합 AveC 동족체 유전자 산물의 생산을 보조하는 조건하에 배양하는 단계; 및 이 세포 배양물로부터 AveC 동족체 유전자 산물을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 AveC 동족체 유전자 산물의 생산 방법.
  22. 플라스미드 pSE186(ATCC 209604)의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 AveC 유전자 산물-암호화 서열 또는 도 1에 제시된 바와 같은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1), 또는 이들의 퇴행 변화 서열과 동일하지만, AveC 유전자 산물의 55번, 138번, 139번, 230번 및 이들의 조합중 선택된 임의의 위치의 아미노산 잔기의 상이한 아미노산 잔기로의 치환을 암호화하는 1회 이상 돌연변이를 추가로 포함하며, 이 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 포함하는폴리뉴클레오티드 분자를 발현시키는, 야생형aveC대립형질 유전자가 불활성화된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포를 사이클로헥산 카복실산의 존재하에 발효시키는 경우, 단지 야생형aveC대립형질 유전자만을 발현시키는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 균주 ATCC 53692의 세포에서 생산된 아베르멕틴에 비해 감소된 사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 비로 아베르멕틴을 생산하도록 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자.
  23. 제 22 항에 있어서,
    사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 감소된 비가 약 1.6:1 미만인 폴리뉴클레오티드 분자.
  24. 제 23 항에 있어서,
    사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 감소된 비가 약 0.94:1인 폴리뉴클레오티드 분자.
  25. 제 24 항에 있어서,
    도 1에 제시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF(서열번호: 1)에 대한 돌연변이가 AveC 유전자 산물에서 139번 아미노산 잔기의 알라닌이 트레오닌으로 치환되도록 암호화하는 돌연변이인 폴리뉴클레오티드 분자.
  26. 제 23 항에 있어서,
    사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 감소된 비가 약 0.88:1인 폴리뉴클레오티드 분자.
  27. 제 26 항에 있어서,
    도 1에 제시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF(서열번호: 1)에 대한 돌연변이가 AveC 유전자 산물에서 138번 아미노산 잔기의 세린이 트레오닌으로 치환되도록 암호화하는 돌연변이인 폴리뉴클레오티드 분자.
  28. 제 23 항에 있어서,
    사이클로헥실 B2:사이클로헥실 B1의 감소된 비가 약 0.84:1인 폴리뉴크레오티드 분자.
  29. 제 28 항에 있어서,
    도 1에 제시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF(서열번호: 1)에 대한 돌연변이가, 먼저 AveC 유전자 산물에서 138번 아미노산 잔기의 세린이 트레오닌으로 치환된 후 이어서 139번 아미노산 잔기의 알라닌이 트레오닌으로 치환되도록 암호화하는 돌연변이인 폴리뉴클레오티드 분자.
  30. 도 1에 도시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스aveCORF(서열번호: 1)와 작용상연관되어 있는, β-gal 프로모터, T7 프로모터, TAC 프로모터, λ 좌측 및 우측 프로모터, trp 및 lac 프로모터, trp-lac 융합 프로모터, 및ermE,melC및tipA프로모터로 구성된 군에서 선택된 강력한 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오티드 분자.
  31. 제 30 항에 있어서,
    강력한 프로모터가 사카로폴리스포라 에리트래아(Saccharopolyspora erythraea)로부터 유래한ermE프로모터인 폴리뉴클레오티드 분자.
  32. 이종 뉴클레오티드 서열이 삽입되어 불활성화된, 도 1에 도시된 AveC 유전자 산물-암호화 ORF(서열번호: 1)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자.
  33. 도 1에 도시된aveCORF(서열번호: 1)에서 640bp의PstI/SphI 단편이 결손되어 불활성화된aveC대립형질 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자.
  34. 도 1에 도시된aveCORF(서열번호: 1)에 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이가 도입되어 불활성화된aveC대립형질 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자.
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