PL194270B1 - Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, cząsteczka oligonukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, wyizolowany produkt genu AveC S. avermitilis, wyizolowany produkt homologu genu AveC S. hygroscopicus, sposób wytwarzania zrekombinowanego produktu genu AveC, sposób wytwarzania zrekombinowanego produktu homologu genu AveC, cząsteczka polinukleotydowa, wektor do zastępowania genu, sposób identyfikowania mutacji otwartej ramki odczytuAveC, sposób wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, szczep S. avermitilis i sposób wytwarzaniaawermektyn - Google Patents

Abstract

1. Wyizolowana czasteczka polinukleotydowa zawierajaca kompletna otwarta ramke odczytu AveC Streptomyces avermitilis lub jej znaczna czesc, przy czym ta otwarta ramka odczytu jest ostat- nia kompletna ramka odczytu w tej czasteczce i ma sekwencje nukleotydowa z fig. 1 (SEQ ID NO: 1). 5. Czasteczka oligonukleotydowa, która hybrydyzuje z czasteczka polinukleotydowa majaca se- kwencje nukleotydowa z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO 3, albo z czasteczka polinukleotydowa majaca sekwencje nukleotydowa, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO: 3, w warunkach o wysokiej surowosci. 7. Zrekombinowany wektor zawierajacy czasteczke polinukleotydowa zawierajaca sekwencje nu- kleotydowa wybrana z grupy obejmujacej sekwencje nukleotydowa otwartej ramki odczytu AveC z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej znaczna czesc oraz sekwencje nukleotydowa, która jest homologiczna do otwartej ramki odczytu kodujacej produkt genu AveC S. avermitilis z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej znaczna czesc. 18. Wyizolowany produkt genu AveC S. avermitilis majacy sekwencje aminokwasowa kodowana przez sekwencje nukleotydowa kodujaca produkt genu AveC S. avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencje aminokwasowa z SEQ ID NO: 2 lub jej znaczna czesc, albo polipeptyd do niego homologiczny. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są wyizolowana cząsteczka polinu kleotydowa, cząsteczka oligonukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, wyizolowany produkt genu AveC S. avermitilis, wyizolwany produkt homologu genu AveC S. hygroscopicus, sposób wytwarzania zrekombinowanego produktu genu AveC, sposób wytwarzania zrekombinowanego produktu homologu genu AveC, cząsteczka polinukleotydowa, wektor do zastępowania genu, sposób identyfikowania mutacji otwartej ramki odczytu AveC, sposób wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, szczep S. avermitilis i sposób wytwarzania awermektyn.

Awermektyny

Gatunki Streptomyces wytwarzają różnorodne metabolity wtórne, w tym awermektyny, które stanowi grupa ośmiu pokrewnych szesnastoczłonowych makrocyklicznych laktonów, wykazujących silną aktywność przeciw robakom pasożytniczym i owadobójczą. Te osiem odrębnych, lecz ściśle pokrewnych związków określa się symbolami A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a i B2b. Grupa „a związków to naturalne awermektyny, w których podstawnikiem w pozycji C25 jest grupa (S)-secbutylowa, grupa „b zaś to związki, w których podstawnikiem w pozycji C25 jest izopropyl. Oznaczenia „A i „B odnoszą się do awermektyn, w których podstawnikiem w pozycji C5 są odpowiednio metoksyl i hydroksyl. Cyfra „1 odnosi się do awermektyn, w których wiązanie podwójne występuje w pozycji C22,23, a cyfra „2 odnosi się do awermektyn mających atom wodoru w pozycji C22 i hydroksyl w pozycji C23. Wśród tych pokrewnych awermektyn typ B1 awermektyny uważa się za wykazujący najskuteczniejszą aktywność przeciwpasożytniczą i szkodnikobójczą, toteż jest to awermektyna najbardziej pożądana handlowo.

Awermektyny i ich wytwarzanie w procesie fermentacji tlenowej szczepów S. avermitilis opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4310519 i 4429042. Uważa się, że biosynteza naturalnych awermektyn inicjowana jest endogennie z tioestrowych analogów CoA kwasu izomasłowego i kwasu S-(+)-2-metylomasłowego.

Połączenie ulepszenia szczepu w wyniku losowej mutagenezy oraz zastosowania egzogennie dostarczanych kwasów tłuszczowych doprowadziło do wydajnego wytwarzania analogów awermektyn. Mutanty S. avermitilis pozbawione dehydrogenazy 2-oksokwasów o rozgałęzionych łańcuchach (mutanty pozbawione bkd) mogą wytwarzać awermektyny tylko wówczas, gdy fermentacje wzbogaca się o kwasy tłuszczowe. Przeszukiwanie i izolowanie mutantów pozbawionych aktywności dehydrogenazy łańcuchów rozgałęzionych (np. S. avermitilis ATCC 53567) opisano w europejskim opisie patentowym (EP) nr 276103. Fermentacja takich mutantów w obecności egzogennie dostarczanych kwasów tłuszczowych prowadzi do wytwarzania tylko czterech awermektyn odpowiadających zastosowanemu kwasowi tłuszczowemu. Zatem wynikiem wzbogacania fermentacji S. avermitilis (ATCC 53567) o kwas S-(+)-2-metylomasłowy jest wytwarzanie naturalnych awermektyn A1a, A2a, B1a i B2a; wynikiem wzbogacania fermentacji o kwas izomasłowy jest wytwarzanie naturalnych awermektyn A1b, A2b, B1b i B2b; a wynikiem wzbogacania fermentacji o kwas cyklopentanokarboksylowy jest wytwarzanie czterech nowych cyklopentyloawermektyn A1, A2, B1i B2.

Jeśli stosuje się wzbogacanie o inne kwasy tłuszczowe, wytwarzane są nowe awermektyny. Dzięki przeszukaniu ponad 800 potencjalnych prekursorów zidentyfikowano ponad 60 innych nowych awermektyn (patrz np. Dutton i in., 1991, J. Antibiot. 44: 357-365 oraz Banks i in., 1994, Roy. Soc. Chem. 147: 16-26). Ponadto mutanty S. avermitilis pozbawione aktywności 5-O-metylotransferazy wytwarzają zasadniczo tylko analogi B awermektyn. W konsekwencji, mutanty S. avermitilis pozbawione zarówno aktywności dehydrogenazy 2-oksokwasów o rozgałęzionych łańcuchach, jak i 5-O-metylotransferazy, wytwarzają tylko awermektyny B odpowiadające kwasom tłuszczowym zastosowanym do wzbogacania fermentacji. Zatem wynikiem wzbogacania takich podwójnych mutantów o kwas S-(+)-2-metylomasłowy jest wytwarzanie tylko naturalnych awermektyn B1a i B2a, podczas gdy wynikiem wzbogacania o kwas izomasłowy lub cyklopentanokarboksylowy jest wytwarzanie odpowiednio naturalnych awermektyn B1b i B2b lub nowych cyklopentyloawermektyn B1 i B2. Wzbogacanie szczepu podwójnego mutanta o kwas cykloheksanokarboksylowy jest korzystnym sposobem wytwarzania handlowo ważnej nowej awermektyny, cykloheksyloawermektyny B1 (doramektyny). Izolowanie i charakterystykę takich podwójnych mutantów, np. S. avermitilis (ATCC 53692) opisano w europejskim opisie patentowym nr 276103.

PL 194 270 B1

Geny uczestniczące w biosyntezie awermektyn

W wielu przypadkach geny uczestniczące w wytwarzaniu metabolitów wtórnych oraz geny kodujące określony antybiotyk są zgrupowane razem w chromosomie. Tak jest np. w przypadku grupy genu syntazy poliketydowej (PKS) Streptomyces (patrz Hopwood i Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 37-66). Zatem jedną ze strategii klonowania genów danego szlaku metabolitycznego było izolowanie genu oporności na lek, a następnie testowanie sąsiadujących regionów chromosomu pod względem innych genów związanych z biosyntezą tego określonego antybiotyku. Inną strategią klonowania genów związanych z biosyntezą ważnych metabolitów była komplementacja mutantów. Przykładowo, części biblioteki DNA z organizmu zdolnego do wytwarzania danego metabolitu wprowadza się do niewytwarzającego mutanta i przeszukuje się transformanty pod kątem wytwarzania metabolitu. Ponadto, do identyfikacji i klonowania genów szlaków biosyntezy stosowano hybrydyzację biblioteki z zastosowaniem sond pochodzących z innego gatunku Streptomyces.

Geny uczestniczące w biosyntezie awermektyn (geny ave), podobnie jak geny wymagane do biosyntezy innych wtórnych metabolitów Streptomyces (np. PKS), występują zgrupowane na chromosomie. Liczne geny ave z powodzeniem sklonowano stosując wektory do komplementacji mutantów S. avermitilis o zablokowanej biosyntezie awermektyn. Klonowanie takich genów opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5252474. Ponadto, Ikeda i in., 1995, J. Antibiot. 48: 532-534, opisują lokalizację regionu chromosomu biorącego udział w etapie dehydratacji C22,23 (AveC) we fragmencie BamHI S. avermitilis o długości 4,82 Kb, jak również mutacje genu AveC, których wynikiem jest tworzenie szczepu producenta wytwarzającego jeden składnik, B2a. Ponieważ iwermektynę, silny związek przeciwrobaczy, można wytwarzać chemicznie z awermektyny B2a, taki szczep wytwarzający pojedynczy składnik, awermektynę B2a, uważa się za szczególnie użyteczny do przemysłowego wytwarzania iwermektyny.

Identyfikacja mutacji w genie AveC, które minimalizują złożoność wytwarzania awermektyn, takich jak np. mutacji obniżających stosunek awermektyn B2:B1, powinna uprościć wytwarzanie i oczyszczanie handlowo ważnych awermektyn.

Wynalazek dotyczy wyizolowanej cząsteczki polinukleotydowej zawierającej kompletną otwartą ramkę odczytu AveC Streptomyces avermitilis lub jej znaczną część, przy czym ta otwarta ramka odczytu jest ostatnią kompletną ramką odczytu w tej cząsteczce i ma sekwencję nukleotydową z fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

Korzystna jest wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa zawierająca ponadto sekwencje nukleotydowe, które naturalnie flankują gen AveC in situw S. avermitilis.

Wynalazek dotyczy również wyizolowanej cząsteczki polinukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do kodującej produkt genu AveC Streptomyces avermitilis sekwencji nukleotydowej otwartej ramki odczytu AveC przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej znacznej części.

Wynalazek dotyczy także wyizolowanej cząsteczki polinukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydową SEQ ID NO: 3 lub jej znaczną część, albo sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do sekwencji nukleotydowej SEQID NO: 3.

Wynalazek dotyczy ponadto cząsteczki oligonukleotydowej, która hybrydyzuje z cząsteczką polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO 3, albo z cząsteczką polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQID NO: 3, w warunkach o wysokiej surowości.

Korzystna jest cząsteczka oligonukleotydowa, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO: 3, albo do cząsteczki polinukleotydowej mającej sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO: 3.

Wynalazek dotyczy ponadto zrekombinowanego wektora zawierającego cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu AveC z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej znaczną część oraz sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do otwartej ramki odczytu kodującej produkt genu AveC S. avermitilis zfig. 1(SEQ ID NO: 1) lub jej znaczną część.

Korzystny jest zrekombinowany wektor zawierający ponadto sekwencję nukleotydową kodującą jeden lub większą liczbę elementów regulujących, która to sekwencja nukleotydowa kodująca elementy regulujące jest funkcjonalnie połączona z sekwencją nukleotydową zdefiniowaną powyżej.

PL 194 270 B1

Szczególnie korzystny jest zrekombinowany wektor zawierający ponadto sekwencję nukleotydową kodującą marker selekcyjny.

W szczególności ten zrekombinowany wektor stanowi plazmid pSE186 (ATCC 209604).

Wynalazek dotyczy ponadto komórki gospodarza, zawierającej zrekombinowany wektor zdefiniowany powyżej.

Korzystna jest komórka gospodarza, którą stanowi Streptomyces avermitilis.

Wynalazek dotyczy również zrekombinowanego wektora zawierającego cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej sekwencję nukleotydową SEQ ID NO: 3 lub jej znaczną część, sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do sekwencji nukleotydowej SEQID NO: 3 oraz sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQID NO: 4.

Korzystny jest zrekombinowany wektor zawierający ponadto sekwencję nukleotydową kodującą jeden lub większą liczbę elementów regulujących, która to sekwencja nukleotydowa kodująca elementy regulujące jest funkcjonalnie połączona z sekwencją nukleotydową cząsteczki polinukleotydowej wektora, zdefiniowaną powyżej.

Szczególnie korzystny jest zrekombinowany wektor zawierający ponadto sekwencję nukleotydową kodującą marker selekcyjny.

Wynalazek dotyczy ponadto komórki gospodarza zawierającej zrekombinowany wektor zdefiniowany powyżej.

Korzystna jest komórka gospodarza, którą stanowi Streptomyces hygroscopicus.

Wynalazek dotyczy ponadto wyizolowanego produktu genu AveC S. avermitilis mającego sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową kodującą produkt genu AveC S. avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 2, lub jej znaczną część, albo polipeptyd do niego homologiczny.

Wynalazek dotyczy również wyizolowanego produktu homologu genu AveC S. hygroscopicus mającego sekwencję aminokwasową z SEQID NO: 4.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania zrekombinowanego produktu genu AveC, polegającego na tym, że hoduje się komórkę gospodarza stransformowaną zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym, który to zrekombinowany wektor ekspresyjny zawiera cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 2 lub jej znaczną część, która to cząsteczka polinukleotydowa jest funkcjonalnie połączona z jednym lub większą liczbą elementów regulujących, kontrolujących ekspresję cząsteczki polinukleotydowej w komórce gospodarza w warunkach umożliwiających wytwarzanie zrekombinowanego produktu genu AveC, oraz wyodrębnia się produkt genu AveC z hodowli komórkowej.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania zrekombinowanego produktu homologu genu AveC, polegającego na tym, że hoduje się komórkę gospodarza stransformowaną zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym, który to zrekombinowany wektor ekspresyjny zawiera cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową z SEQID NO: 4 lub jej znaczną część, która to cząsteczka polinukleotydowa jest funkcjonalnie połączona z jednym lub większą liczbą elementów regulujących, kontrolujących ekspresję cząsteczki polinukleotydowej w komórce gospodarza w warunkach umożliwiających wytwarzanie zrekombinowanego produktu homologu genu AveC, oraz wyodrębnia się produkt homologu genu AveC z hodowli komórkowej.

Wynalazek dotyczy również cząsteczki polinukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydową, która jest pod innymi względami taka sama jak kodująca produkt genu AveC S. avermitilis sekwencja z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencja nukleotydowa otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis przedstawiona na fig. 1(SEQ ID NO: 1) albo jej zdegenerowany wariant, ale która to sekwencja nukleotydowa zawiera ponadto jedną lub większą liczbę takich mutacji, że komórki szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zinaktywowano allel AveC typu dzikiego i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydowej zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydową, wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 gdy fermentację prowadzi się w obecności kwasu cykloheksanokarboksylowego, w porównaniu ze stosunkiem otrzymywanym w przypadku komórek szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego.

Korzystna jest cząsteczka polinukleotydowa, dla której obniżony stosunek cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wynosi poniżej 1,6:1.

PL 194 270 B1

Szczególnie korzystna jest cząsteczka polinukleotydowa, dla której obniżony stosunek cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 wynosi około 0,94:1.

W szczególności korzystna jest cząsteczka polinukleotydowa, w której mutacja otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis z fig. 1(SEQ ID NO: 1) koduje zamianę aminokwasu reszty 139 produktu genu AveC z alaniny na treoninę.

Szczególnie korzystna jest również cząsteczka polinukleotydowa, dla której obniżony stosunek cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 wynosi około 0,88:1.

W szczególności użyteczna jest cząsteczka polinukleotydowa, w której mutacja otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis z fig. 1(SEQ ID NO: 1) koduje zamianę aminokwasu reszty 138 produktu genu AveC z seryny na treoninę.

Szczególnie korzystna jest także cząsteczka polinukleotydowa, dla której obniżony stosunek cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 wynosi około 0,84:1.

Szczególnie użyteczna jest cząsteczka polinukleotydowa, w której mutacja otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis z fig. 1(SEQ ID NO: 1) koduje pierwszą zamianę aminokwasu reszty 138 produktu genu AveC z seryny na treoninę oraz drugą zamianę aminokwasu reszty 139 produktu genu AveCz alaniny na treoninę.

Wynalazek dotyczy także cząsteczki polinukleotydowej zawierającej silny promotor funkcjonalnie połączony z otwartą ramką odczytu AveC S. avermitilis z fig. 1(SEQ ID NO: 1).

Korzystna jest cząsteczka polinukleotydowa, w której tym silnym promotorem jest promotor ermE z Saccharopolyspora erythraea.

Wynalazek dotyczy też cząsteczki polinukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydową kodującą otwartą ramkę odczytu kodującą produkt genu AveC z fig. 1(SEQ ID NO: 1), którą zinaktywowano przez insercję do tej sekwencji nukleotydowej heterologicznej sekwencji nukleotydowej.

Wynalazek dotyczy ponadto cząsteczki polinukleotydowej zawierającej allel AveC, zinaktywowany przez wydeletowanie z otwartej ramki odczytu AveC z fig. 1(SEQ ID NO: 1) fragmentu Pstl/Sphl o długości 640 bp.

Wynalazek dotyczy również cząsteczki polinukleotydowej zawierającej allel AveC zinaktywowany przez wprowadzenie mutacji zmiany ramki odczytu do otwartej ramki odczytu AveC z fig. 1(SEQ ID NO: 1).

Korzystna jest cząsteczka polinukleotydowa, w której mutację zmiany ramki odczytu wprowadzono przez dodanie dwóch nukleotydów G po nukleotydzie C w pozycji nukleotydowej 471 otwartej ramki odczytu AveC z fig. 1(SEQ ID NO: 1).

Wynalazek dotyczy również cząsteczki polinukleotydowej zawierającej allel AveC zinaktywowany przez wprowadzenie kodonu terminacji transkrypcji w pozycji nukleotydowej, która koduje aminokwas 116 produktu genu AveC S. avermitilis kodowanego przez otwartą ramkę odczytu AveC z fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

Wynalazek dotyczy również cząsteczki polinukleotydowej zawierającej allel AveC zinaktywowany przez wprowadzenie pierwszej mutacji w pozycji aminokwasowej 256 produktu genu AveC, która zmienia glicynę na asparaginian, oraz drugiej mutacji w pozycji 275 produktu genu AveC, która zmienia tyrozynę na histydynę.

Wynalazek dotyczy ponadto wektora do zastępowania genu zawierający cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencje nukleotydowe, które naturalnie flankują otwartą ramkę odczytu AveC in situw chromosomie S. avermitilis.

Wynalazek dotyczy również zrekombinowanego wektora zawierającego cząsteczkę polinukleotydową zdefiniowaną powyżej.

Wynalazek dotyczy także zrekombinowanego wektora zawierającego cząsteczkę polinukleotydową kodującą otwartą ramkę odczytu kodującą produkt genu AveC z fig. 1 (SEQ. ID NO: 1), którą zinaktywowano przez insercję do tej sekwencji nukleotydowej heterologicznej sekwencji nukleotydowej, którym to wektorem jest pSE180 (ATCC 209605).

Wynalazek dotyczy również komórki gospodarza Streptomyces zawierającej zrekombinowany wektor zdefiniowany powyżej.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu identyfikowania mutacji otwartej ramki odczytu AveC zdolnych do obniżania stosunku klas 2:1 wytwarzanych awermektyn, polegającego na tym, że (a) określa się stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zinaktywowano natywny allel AveC i do których wprowadzono ulegającą ekspresji cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą produkt zmutowanego genu AveC; (b) określa się stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego

PL 194 270 B1 szczepu S. avermitilis jak w etapie (a), ale w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC mającego sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub sekwencję nukleotydową, która jest do niej homologiczna; oraz (c) porównuje się stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis w etapie (a) ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis w etapie (b), przy czym stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis w etapie (a) różny od stosunku klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis w etapie (b) oznacza zidentyfikowanie mutacji otwartej ramki odczytu AveC zdolnej do obniżania stosunku klas 2:1 awermektyn.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis zawierających komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, i które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z komórkami tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego, który to sposób polega na tym, że transformuje się komórki szczepu S. avermitilis wektorem, który zawiera zmutowany allel AveC kodujący produkt genu, który obniża stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego, oraz wybiera się stransformowane komórki, które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 wytwarzanym przez komórki szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja allelu AveC typu dzikiego.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, których komórki zawierają zinaktywowany allel AveC, polegającego na tym, że transformuje się komórki szczepu S. avermitilis wektorem inaktywującym ten allel AveC, oraz wybiera się stransformowane komórki, w których ten allel AveC został zinaktywowany.

Korzystnie jako wektor stosuje się pSE 180 (ATCC 209605).

Wynalazek dotyczy ponadto szczepu S. avermitilis obejmującego komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, której wynikiem jest wytwarzanie przez komórki awermektyn o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego.

Korzystny jest szczep, którego komórki wytwarzają awermektyny o stosunku cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 niższym niż 1,6:1.

Korzystny jest szczep, którego komórki wytwarzają awermektyny o stosunku cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wynoszącym około 0,94:1.

Korzystny jest szczep, którego komórki wytwarzają awermektyny o stosunku cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wynoszącym około 0,88:1.

Korzystny jest szczep, którego komórki wytwarzają awermektyny o stosunku cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wynoszącym około 0,84:1.

Wynalazek dotyczy również szczepu S. avermitilis zawierającego komórki, w których gen AveC został zinaktywowany.

Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania awermektyn, polegającego na tym, że hoduje się komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC kodującego produkt genu, który obniża stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, w po równaniu z komórkami tego samego szczepu, w których nie zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, natomiast zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego, w pożywce hodowlanej w warunkach, które umożliwiają lub indukują wytwarzanie awermektyn, oraz wyodrębnia się te awermektyny z hodowli.

Sposób ten umożliwia wytwarzanie z wysoką wydajnością handlowo cennych awermektyn, takich jak doramektyna.

Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa według wynalazku zawiera kompletną otwartą ramkę odczytu AveC S. avermitilis lub jej znaczną część, która to wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa pozbawiona jest całej następnej otwartej ramki odczytu, która znajduje się za tą otwartą ramką odczytu AveC in situ w chromosomie S. avermitilis. Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa korzystnie zawiera sekwencję nukleotydową, która jest taka sama jak sekwencja kodująca produkt genu AveC S. avermitilis plazmidu pSE186 (ATCC 209604), lub która jest taka sama jak sekwencja nukleotydowa otwartej ramki odczytu AveC na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej znaczną część.

W innej postaci cząsteczka polinukleotydowa ma sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do sekwencji kodującej produkt genu AveC S. avermitilis plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub

PL 194 270 B1 do sekwencji nukleotydowej otwartej ramki odczytu AveC przedstawionej na fig. 1(SEQ ID NO: 1) lub jej znaczną część.

W kolejnej postaci cząsteczka polinukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową homologiczną do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez sekwencję kodującą produkt genu AveC plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencji aminokwasowej z fig. 1(SEQID NO: 2) lub jej znaczną część.

W kolejnej postaci wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową kodującą produkt homologu genu AveC. Korzystnie wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową kodującą produkt homologu genu AveC z S. hygroscopicus, który to produkt homologu genu zawiera sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 4 lub jej znaczną część. Korzystnie wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa, która koduje produkt homologu genu AveC S. hygroscopicus, zawiera sekwencję nukleotydową z SEQID NO: 3 lub jej znaczną część.

W kolejnej postaci cząsteczka polinukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do sekwencji nukleotydowej S. hygroscopicus z SEQ ID NO: 3. W innej postaci cząsteczka polinukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd homologiczny do produktu homologu genu AveC S. hygroscopicus, mającego sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEQ ID NO: 4.

Zrekombinowane wektory klonujące i wektory ekspresyjne są użyteczne do klonowania lub ekspresji cząsteczek polinukleotydowych według wynalazku, w tym cząsteczek polinukleotydowych zawierających otwartą ramkę odczytu AveC S. avermitilis lub otwartą ramkę odczytu homologu AveC. W szczególności przydatny jest plazmid pSE186 (ATCC 209604), który zawiera kompletną otwartą ramkę odczytu genu AveC S. avermitilis. Ponadto stosowane są stransformowane komórki gospodarza, zawierające cząsteczkę polinukleotydową lub zrekombinowany wektor, oraz nowe szczepy lub linie komórkowe z nich pochodzące.

W wyniku rekombinacyjnej ekspresji otrzymuje się produkt genu AveC lub produkt homologu genu AveC, lub jego znaczną część, które zostały w znacznym stopniu oczyszczone lub wyizolowane, jak również jego homologi.

Zgodnie z wynalazkiem cząsteczki polinukleotydowe można stosować do wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, które wykazują wykrywalną zmianę w wytwarzaniu awermektyn w porównaniu z tym samym szczepem, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu typu dzikiego genu AveC. Korzystnie takie cząsteczki polinukleotydowe są użyteczne w tworzeniu nowych szczepów S. avermitilis, które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z tym samym szczepem, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu typu dzikiego AveC. Takie cząsteczki polinukleotydowe są również użyteczne w tworzeniu nowych szczepów S. avermitilis, które wytwarzają zwiększone poziomy awermektyn w porównaniu z tym samym szczepem, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu typu dzikiego AveC. Ponadto cząsteczki polinukleotydowe są użyteczne do wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, w których gen AveC został zinaktywowany.

Zrekombinowane wektory według wynalazku są użyteczne w tworzeniu nowych szczepów S. avermitilis o zmienionym wytwarzaniu awermektyn. Przykładowo, te wektory można stosować do kierowania cząsteczek polinukleotydowych zawierających zmutowane sekwencje nukleotydowe do miejsca genu AveC na chromosomie S. avermitilis w celu albo wprowadzenia do, albo zastąpienia otwartej ramki odczytu AveC lub jego części przez rekombinację homologiczną. Jednakże zgodnie z wynalazkiem, dostarczana przez nie cząsteczka polinukleotydowa zawierająca zmutowaną sekwencję nukleotydową może również, po wprowadzeniu do chromosomu S. avermitilis w innym miejscu niż gen AveC lub utrzymywana episomalnie w komórkach S. avermitilis, działać modulujące na biosyntezę awermektyn. Zatem wektory zawierające cząsteczkę polinukleotydową obejmującą zmutowaną sekwencję nukleotydową można stosować do wprowadzania cząsteczki polinukleotydowej do innego niż gen AveC miejsca w chromosomie S. avermitilis lub do jej episomalnego utrzymywania. Zgodne z wynalazkiem wektory do zastępowania genu można stosować do wprowadzania zmutowanego allelu AveC do chromosomu S. avermitilis w celu wytwarzania nowych szczepów komórek, które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się nowe szczepy S. avermitilis obejmujące komórki stransformowane cząsteczkami polinukleotydowymi lub wektorami, zawierającymi zmutowaną sekwencję nukleotydową. Nowe szczepy są użyteczne do wytwarzania w dużej skali handlowo pożądanych awermektyn, takich jak doramektyna.

PL 194 270 B1

Zgodnie z wynalazkiem nowe szczepy S. avermitilis obejmujące komórki, w których zinaktywowano gen AveC, są użyteczne zarówno do uzyskiwania odmiennego spektrum wytwarzanych awermektyn w porównaniu ze szczepem typu dzikiego oraz w testach przeszukiwania pod kątem komplementacji, jak opisano w niniejszym opisie, w celu określenia czy ukierunkowana lub losowa mutageneza genu AveC wpływa na wytwarzanie awermektyn.

Sposobem według wynalazku, z użyciem szczepu S. avermitilis wytwarza się kompozycję awermektyn, w której stosunek klas 2:1 wytworzonych awermektyn jest obniżony w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, w których nie zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, natomiast zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego. Kompozycja awermektyn może być w postaci wytworzonej w brzeczce fermentacyjnej, albo może być z niej wyodrębniana oraz może być częściowo lub zasadniczo całkowicie z niej oczyszczona.

Wynalazek umożliwia identyfikowanie i charakteryzowanie cząsteczek polinukleotydowych mających sekwencje nukleotydowe kodujące produkt genu AveC Streptomyces avermitilis, konstruowanie nowych szczepów S. avermitilis, które można stosować do przeszukiwania produktów zmutowanego genu AveC pod kątem ich wpływu na wytwarzanie awermektyn. Stwierdzono, że niektóre produkty zmutowanego genu AveC mogą obniżać stosunek awermektyn B2:B1 wytwarzanych przez S. avermitilis. Wynalazek opisano poniżej przykładowo dla cząsteczki polinukleotydowej mającej sekwencję nukleotydową, która jest albo taka sama jak sekwencja kodująca produkt genu AveC S. avermitilis w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604), albo jak sekwencja nukleotydowa otwartej ramki odczytu z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) oraz pochodzących od nich cząsteczek polinukleotydowych mających zmutowane sekwencje nukleotydowe. Jednakże zasady podane w niniejszym opisie można analogicznie stosować do innych cząsteczek polinukleotydowych, w tym genów homologów AveC z innych gatunków Streptomyces, w tym między innymi np. z S. hygroscopicus i S. griseochromogenes.

Cząsteczki polinukleotydowe kodujące produkt genu AveC S. avermitilis

Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa według wynalazku zawiera kompletną otwartą ramkę odczytu AveC S. avermitilis lub jej znaczną część, która to wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa nie ma następnej kompletnej otwartej ramki odczytu, która znajduje się za otwartą ramką odczytu AveC in situ w chromosomie S. avermitilis.

Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa korzystnie zawiera sekwencję nukleotydową, która jest taka sama jak sekwencja kodująca produkt genu AveC S. avermitilis w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604), albo która jest taka sama jak sekwencja nukleotydowa otwartej ramki odczytu na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub ich znaczna część. Określenie „znaczna część wyizolowanej cząsteczki polinukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydową kodującą produkt genu AveC S. avermitilis oznacza tu wyizolowaną cząsteczkę polinukleotydową zawierającą co najmniej około 70% kompletnej sekwencji otwartej ramki odczytu AveC przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) i kodującą funkcjonalnie równoważny produkt genu AveC. W tym znaczeniu „funkcjonalnie równoważny produkt genu AveC definiuje się jako produkt genu, który, jeśli ulega ekspresji w szczepie S. avermitilis ATCC 53692, w którym zinaktywowano natywny allel AveC, prowadzi do wytwarzania awermektyn zasadniczo w takim samym stosunku i ilości, jak wytwarzane przez szczep S. avermitilis ATCC 53692, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko funkcjonalnego allelu AveC typu dzikiego, natywnego dla szczepu S. avermitilis ATCC 53692.

Poza sekwencją nukleotydową otwartej ramki odczytu AveC, wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa według wynalazku może ponadto zawierać sekwencje nukleotydowe, które naturalnie flankują gen AveC in situ w S. avermitilis, takie jak te flankujące sekwencje nukleotydowe przedstawione na fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

Określenia „cząsteczka polinukleotydowa, „sekwencja polinukleotydowa, „sekwencja kodująca, „otwarta ramka odczytu i „ORF odnoszą się zarówno do cząsteczek DNA, jak i RNA, które mogą być albo jednoniciowe, albo dwuniciowe, i które mogą ulegać transkrypcji i translacji (DNA) lub translacji (RNA) do produktu genu AveC lub, jak opisano poniżej, do homologu produktu genu AveC, albo do polipeptydu, który jest homologiczny do produktu genu AveC lub homologu produktu genu AveC w odpowiednim układzie ekspresyjnym komórek gospodarza po umieszczeniu pod kontrolą odpowiednich elementów regulujących. Sekwencja kodująca może obejmować, ale nie jest ograniczona do sekwencji prokariotycznych, sekwencji cDNA, sekwencji DNA genomowego i sekwencji chemicznie syntetyzowanych DNA i RNA.

Sekwencja nukleotydowa przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) zawiera cztery różne kodony GTG w pozycjach par zasad 42, 174, 177 i 180. Jak opisano poniżej, skonstruowano wielokrotne

PL 194 270 B1 delecje 5'-końcowego regionu otwartej ramki odczytu AveC (fig. 1; SEQID NO :1), aby pomóc w określeniu, który z tych kodonów mógłby działać w otwartej ramce odczytu AveC jako miejsce inicjacji w ekspresji białka. Delecja pierwszego miejsca GTG w pozycji par zasad 42 nie wyeliminowała aktywności AveC. Dodatkowa delecja wszystkich kodonów GTG łącznie w pozycjach par zasad 174, 177 i 180 wyeliminowała aktywność AveC, wskazując, że region ten jest niezbędny do ekspresji białka. Zatem możliwe są otwarte ramki odczytu AveC o różnej długości, które inicjują translację w którymkolwiek z miejsc GTG zlokalizowanych w pozycjach 174, 177 lub 180 par zasad, jak przedstawiono na fig. 1(SEQID NO: 1) oraz odpowiadające każdej z nich polipeptydy.

W innej postaci cząsteczka polinukleotydowa ma sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do sekwencji kodującej produkt genu AveC S. avermitilis w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) lub do sekwencji nukleotydowej otwartej ramki odczytu AveC przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub ich znacznej części. Określenie „homologiczny, gdy używane jest w odniesieniu do cząsteczki polinukleotydowej, która jest homologiczna do sekwencji kodującej produkt genu AveC S. avermitilis, oznacza cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową, która: (a) koduje taki sam produkt genu AveC jak sekwencja kodująca produkt genu AveC S. avermitilis w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604), lub koduje taki sam produkt genu AveC jak sekwencja nukleotydowa otwartej ramki odczytu AveC przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), ale która zawiera w sekwencji nukleotydowej jedną lub większą liczbę zmian milczących zgodnie z degeneracją kodu genetycznego; albo (b) hybrydyzuje z komplementarną cząsteczką polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kodującą produkt genu AveC w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) lub koduje sekwencję aminokwasową przed stawioną na fig. 1(SEQ ID NO: 2), w warunkach umiarkowanej surowości, czyli hybrydyzacji z DNA związanym z sączkiem w 0,5 M NaHPO4, 7% dodecylosiarczanie sodu (SDS), 1 mM EDTA w temperaturze 65°C i przemywania roztworem 0,2 x SSC/0,1% SDS w temperaturze 42°C (patrz Ausubel i in. (red.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, tom I, Green Publishing Associates, Inc. i John Wiley and Sons, Nowy Jork, str. 2.10.3) oraz koduje funkcjonalnie równoważny produkt genu AveC, jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie, gdy homologiczna cząsteczka polinukleotydowa hybrydyzuje z komplementarną sekwencją nukleotydową kodującą produkt genu AveC w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) lub z komplementarną sekwencją nukleotydową przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub ich znaczną częścią w warunkach wysokiej surowości, czyli hybrydyzacji z DNA związanym z sączkiem w 0,5 M NaHPO4, 7% dodecylosiarczanie sodu (SDS), 1 mM EDTA w temperaturze 65°C, i przemywania roztworem 0,1 x SSC/0,1% SDS w temperaturze 68°C (patrz Ausubel i in., 1989, powyżej) oraz koduje funkcjonalnie równoważny produkt genu AveC, jak zdefiniowano powyżej.

Aktywność produktu genu AveC i jego potencjalnych funkcjonalnych równoważników można określić na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC, jak opisano w poniższych przykładach. Cząsteczki polinukleotydowe mające sekwencje nukleotydowe, które kodują funkcjonalne równoważniki produktu genu AveC S. avermitilis, obejmują naturalnie występujące geny AveC obecne w innych szczepach S. avermitilis, geny homologów AveC obecne w innych gatunkach Streptomyces oraz zmutowane allele genu AveC, niezależnie od tego, czy są występującymi naturalnie, czy otrzymanymi technikami inżynierii genetycznej.

W innej postaci cząsteczka polinukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd mający sekwencję aminokwasową, która jest homologiczna do sekwencji aminokwasowej kodowanej przez sekwencję kodującą produkt genu AveC w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub ich znaczną część. Określenie „znaczna część sekwencji aminokwasowej z fig. 1(SEQ IDNO: 2) oznacza tu polipeptyd zawierający co najmniej około 70% sekwencji aminokwasowej przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 2) i który stanowi funkcjonalnie równoważny produkt genu AveC, jak zdefiniowano powyżej.

W odniesieniu do sekwencji aminokwasowych homologicznych do sekwencji aminokwasowej produktu genu AveC z S. avermitilis, określenie „homologiczny odnosi się do polipeptydu kodowanego przez sekwencję kodującą produkt genu AveCw plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) lub mającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO: 2), ale w którym jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych konserwatywnie podstawiono inną resztą aminokwasową, a wynikiem takiego konserwatywnego podstawienia jest funkcjonalnie równoważny produkt genu, jak zdefiniowano powyżej. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe są dobrze znane w tej dziedzinie. Zasady dokonywania takich podstawień obejmują między innymi te opisane w M. D. Dayhof, 1978, Nat. Biomed. Res. Found. Washington, D.C., tom 5, Sup. 3. Bardziej szczegółowo, konserwatywnymi podsta10

PL 194 270 B1 wieniami aminokwasowymi są te, które zazwyczaj zachodzą w obrębie tej samej rodziny aminokwasów, które są zbliżone pod względem kwasowości, polarności lub wielkości ich łańcuchów bocznych. Genetycznie kodowane aminokwasy ogólnie dzielą się na cztery grupy: (1) kwasowe = asparaginian, glutaminian; (2) zasadowe = lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolarne = alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan oraz (4) pozbawione ładunku, polarne = glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina, tyrozyna. Fenyloalaninę, tryptofan i tyrozynę klasyfikuje się także wspólnie jako aminokwasy aromatyczne. Jedna lub większa liczba zamian w obrębie poszczególnej grupy, np. leucyny na izoleucynę lub walinę lub asparaginianu na glutaminian albo treoniny na serynę, lub jakiejkolwiek innej reszty aminokwasowej resztą aminokwasową zbliżoną strukturalnie, np. resztą aminokasową o podobnej kwasowości, polarności, wielkości lub o podobieństwie pewnej ich kombinacji, będzie zazwyczaj wywierać nieznaczny wpływ na funkcję polipeptydu.

W kolejnej postaci wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową kodującą produkt homologu genu AveC. Określenie „produkt homologu genu AveC definiuje się jako produkt genu mający, co najmniej około 50% identyczności sekwencji aminokwasowej w stosunku do produktu genu AveC S. avermitilis zawierającego sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kodującą produkt genu AveC w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO: 2). W szczególności produkt homologu genu AveC pochodzi z S. hygroscopicus (opisanego w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0298423; depozyt FERM BP-1901) i zawiera sekwencję aminokwasową z SEQID NO: 4 lub jej znaczną część. „Znaczna część sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEQID NO: 4 oznacza polipeptyd zawierający, co najmniej około 70% sekwencji aminokwasowej z SEQID NO: 4, i który stanowi funkcjonalnie równoważny produkt homologu genu AveC. „Funkcjonalnie równoważny produkt homologu genu AveC definiuje się jako produkt genu, który ulegając ekspresji w szczepie S. hygroscopicus FERM BP1901, w którym natywny homolog allelu AveC zinaktywowano, powoduje wytwarzanie milbemycyn zasadniczo w takim samym stosunku i ilości, jakie wytwarza szczep S. hygroscopicus FERM BP-1901, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja funkcjonalnego homologu allelu AveC, natywnego dla szczepu S. hygroscopicus FERM BP-1901. Przykładowo, wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa według wynalazku, kodująca produkt homologu genu AveC S. hygroscopicus, zawiera sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO: 3 lub jej znaczną część. „Znaczna część wyizolowanej cząsteczki polinukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydową z SEQ ID NO: 3 oznacza wyizolowaną cząsteczkę polinukleotydową, która zawiera co najmniej około 70% sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEQID NO: 3 i która koduje funkcjonalnie równoważny produkt homologu genu AveC, jak zdefiniowano bezpośrednio powyżej.

W kolejnej postaci cząsteczka polinukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do sekwencji nukleotydowej z S. hygroscopicus, przedstawionej w SEQ ID NO: 3. Określenie „homologiczna, stosowane w odniesieniu do cząsteczki polinukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydową homologiczną do sekwencji przedstawionej w SEQID NO: 3, kodującej produkt homologu genu AveC z S. hygroscopicus, oznacza cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową, która (a) koduje taki sam produkt genu jak sekwencja nukleotydowa przedstawiona w SEQ ID NO: 3 lub jej znaczna część, ale zawiera jedną lub większą liczbę milczących zmian w sekwencji nukleotydowej, zgodnie z degeneracją kodu genetycznego, albo (b) hybrydyzuje z komplementarną cząsteczką polinukleotydową, mającą sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową z SEQID NO: 4, w warunkach umiarkowanej surowości, czyli hybrydyzacji z DNA związanym z sączkiem w 0,5 M NaHPO4, 7% dodecylosiarczanie sodu (SDS), 1mM EDTA w temperaturze 65°C i przemywania 0,2 x SSC/0,1% SDS w temperaturze 42°C (patrz Ausubel i in., powyżej) i koduje funkcjonalnie równoważny produkt homologu genu AveC, jak zdefiniowano powyżej. W przykładowym rozwiązaniu homologiczna cząsteczka polinukleotydowa hybrydyzuje z komplementarną sekwencją nukleotydową z SEQ ID NO: 3, kodującą produkt homologu genu AveC lub jej znaczną częścią w warunkach wysokiej surowości, czyli hybrydyzacji z DNA związanym z sączkiem w 0,5 M NaHPO4, 7% dodecylosiarczanie sodu (SDS), 1 mM EDTA w temperaturze 65°C i przemywania 0,1 x SSC/0,1% SDS w temperaturze 68°C (patrz Ausubel i in., powyżej) i koduje funkcjonalnie równoważny produkt homologu AveC, jak zdefiniowano powyżej.

W kolejnej postaci cząsteczka polinukleotydowa zawiera sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd, który jest homologiczny do produktu homologu genu AveC S. hygroscopicus. Określenie „homologiczny w odniesieniu do polipeptydów homologicznych do produktu homologu genu AveC przedstawionego w SEQID NO: 4 z S. hygroscopicus oznacza polipeptyd mający sekwencję aminoPL 194 270 B1 kwasową z SEQID NO: 4, ale w którym jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych podstawiono konserwatywnie inną resztą aminokwasową, przy czym takie konserwatywne podstawienie prowadzi do funkcjonalnie równoważnego produktu homologu genu AveC, jak to zdefiniowano powyżej.

Cząsteczki oligonukleotydowe według wynalazku hybrydyzują z cząsteczką polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub w SEQ ID NO: 3, albo z cząsteczką polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub w SEQ ID NO: 3. Takie oligonukleotydy mają długość co najmniej 10 nukleotydów, a korzystnie długość około 15 - 30 nukleotydów, oraz hybrydyzują z jedną z wymienionych powyżej cząsteczek polinukleotydowych w warunkach wysokiej surowości, czyli przemywania w 6 x SSC/0,5% pirofosforanie sodu w temperaturze około 37°C dla oligomerów o długości około czternastu zasad, w temperaturze około 48°C dla oligomerów o długości około siedemnastu zasad, w temperaturze około 55°C dla oligomerów o długości około dwudziestu zasad, a w temperaturze około 60°C dla oligomerów o długości około dwudziestu trzech zasad. W przykładowym rozwiązaniu cząsteczki oligonukleotydowe są komplementarne do części jednej z wyżej wymienionych cząsteczek polinukleotydowych. Są one użyteczne do wielu celów, w tym do kodowania lub działania jako cząsteczki antysensowne przydatne w regulacji genu, albo jako startery do amplifikacji cząsteczek polinukleotydowych kodujących gen AveC lub homolog genu AveC.

Dodatkowe geny homologów AveC można zidentyfikować w innych gatunkach lub szczepach Streptomyces dzięki zastosowaniu cząsteczek polinukleotydowych lub oligonukleotydów ujawnionych w niniejszym opisie, w połączeniu ze znanymi technikami. Przykładowo, cząsteczkę oligonukleotydową zawierającą część sekwencji nukleotydowej S. avermitilis przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub część sekwencji nukleotydowej S. hygroscopicus przedstawionej w SEQ ID NO: 3 można znakować w sposób umożliwiający wykrywanie i stosować do przeszukiwania genomowej biblioteki skonstruowanej z DNA pochodzącego z organizmu będącego przedmiotem zainteresowania. Surowość warunków hybrydyzacji wybiera się na podstawie pokrewieństwa organizmu odniesienia, w tym przypadku S. avermitilis lub S. hygroscopicus, do organizmu będącego przedmiotem zainteresowania. Wymagania dla różnych warunków surowości są dobrze znane fachowcom, przy czym takie warunki będą przewidywalnie różniły się zależnie od specyficznych organizmów, z których pochodzą biblioteka i znakowane sekwencje. Takie oligonukleotydy mają korzystnie długość co najmniej piętnastu nukleotydów i obejmują, np. te opisane w poniższych przykładach. Amplifikację genów homologicznych można prowadzić stosując te i inne oligonukleotydy z wykorzystaniem znanych technik, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), chociaż można również stosować inne znane w tej dziedzinie techniki amplifikacji, takie jak reakcja łańcuchowa ligazy.

Klony zidentyfikowane jako zawierające sekwencje nukleotydowe homologów AveC można testować pod kątem ich zdolności do kodowania funkcjonalnego produktu homologu genu AveC. W tym celu klony te można poddawać analizie sekwencji dla zidentyfikowania odpowiedniej ramki odczytu, jak również sygnałów inicjacji i terminacji. Alternatywnie lub dodatkowo, sklonowane sekwencje DNA można wprowadzać do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, czyli wektora, który zawiera elementy konieczne do transkrypcji i translacji wstawionej sekwencji kodującej białko. Jak opisano poniżej, można zastosować którykolwiek z różnych układów gospodarz/wektor, w tym, ale bez ograniczenia do układów bakteryjnych, takie jak plazmidowe, bakteriofagowe lub kosmidowe wektory ekspresyjne. Odpowiednie komórki gospodarza stransformowane takimi wektorami zawierającymi potencjalne sekwencje kodujące homolog genu AveC można następnie analizować pod kątem aktywności typu AveC stosując takie metody, jak analiza produktów fermentacji metodą HPLC, jak opisano przykładowo poniżej.

Wytwarzanie ujawnionych w niniejszym opisie cząsteczek polinukleotydowych i ich wykorzystywanie pozostaje w zakresie umiejętności fachowców, przy czym można stosować techniki rekombinacji opisane np. w: Maniatis i in., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel i in. , 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates i Wiley Interscience, NY; Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis iin. (red.), 1995, PCR Strategies, Academic Press Inc., San Diego oraz w Erlich (red), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, Nowy Jork. Klony polinukleotydowe kodujące produkty genu AveC lub produkty homologów genu AveC można zidentyfikować stosując każdą ze znanych metod w tej dziedzinie, w tym, ale nie wyłącznie, metod wymienionych poniżej. Biblioteki genomowego DNA można przeszukiwać pod kątem sekwencji kodujących genu AveC lub homologu genu AveC stosując takie techniki, jak metody wymienione w Benton i Davis, 1977, Science 196: 180 dla bibliotek bakteriofago12

PL 194 270 B1 wych oraz w Grunstein i Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961-3965 dla bibliotek plazmidowych. Cząsteczki polinukleotydowe mające sekwencje nukleotydowe, o których wiadomo, że obejmują otwartą ramkę odczytu AveC, jak te obecne np. w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) lub w plazmidzie pSE119 (opisanym poniżej w przykładzie 2) można stosować w tych doświadczeniach przeszukiwania jako sondy. Alternatywnie, można zsyntetyzować sondy oligonukleotydowe, które odpowiadają sekwencjom nukleotydowym prze widywanym na podstawie częściowych lub całkowitych sekwencji aminokwaspwych oczyszczonego produktu homologu genu AveC.

Poniżej opisano układy rekombinacyjne.

Wektory klonujące i ekspresyjne

Zrekombinowane wektory klonujące i wektory ekspresyjne są użyteczne w klonowaniu lub ekspresji cząsteczek polinukleotydowych według wynalazku zawierających np. otwartą ramkę odczytu AveC S. avermitilis lub otwarte ramki odczytu jakichkolwiek homologów genu AveC. W konkretnym rozwiązaniu wektor stanowi plazmid pSE186 (ATCC 209604), który zawiera kompletną otwartą ramkę odczytu genu AveC S. avermitilis.

Poniżej podany szczegółowy opis dotyczący otwartej ramki odczytu AveC z S. avermitilis lub cząsteczki polinukleotydowej zawierającej otwartą ramkę odczytu AveC z S. avermitilis lub jej część, albo produktu genu AveC z S. avermitilis, odnosi się również do homologów genu AveCi produktów homologów genu AveC, o ile nie zaznaczono tego wyraźnie lub nie wskazuje na to kontekst.

Opracowano szereg różnych wektorów do konkretnego stosowania w Streptomyces, w tym między innymi fagi, plazmidy o wysokiej liczbie kopii, plazmidy o niskiej liczbie kopii i wektory wahadłowe E. coli-Streptomyces, i każdy z nich można stosować w praktycznej realizacji niniejszego wynalazku. Ze Streptomyces sklonowano również liczne geny oporności na leki, i kilka z tych genów wprowadzono do wektorów jako markery selekcyjne. Przykłady obecnych wektorów do stosowania w Streptomyces przedstawiono między innymi w Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16: 169-190.

Zrekombinowane wektory według wynalazku, zwłaszcza wektory ekspresyjne, korzystnie konstruuje się w taki sposób, że sekwencja kodująca cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku jest funkcjonalnie połączona z jednym lub większą liczbą elementów regulujących koniecznych do transkrypcji i translacji sekwencji kodującej dla wytwarzania polipeptydu. Określenie „element regulujący obejmuje sekwencje nukleotydowe, które kodują indukowalne i nieindukowalne promotory, sekwencje wzmacniające, operatory oraz inne znane elementy w tej dziedzinie, które służą do kierowania i/lub regulacji ekspresji polinukleotydowych sekwencji kodujących, ale nie ogranicza się do nich. Również, jak podano w niniejszym opisie, sekwencja kodująca znajduje się „w połączeniu funkcjonalnym z jednym lub większą liczbą elementów regulujących wówczas, gdy elementy regulujące skutecznie regulują i umożliwiają transkrypcję sekwencji kodującej lub translację powstałego z niej mRNA, lub oba te procesy.

Typowe wektory plazmidowe, które można zmieniać technikami inżynierii genetycznej, tak aby zawierały cząsteczkę polinukleotydową według wynalazku, obejmują, wśród wielu innych, pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) i wektor wahadłowy pWHM3 (Vara i in., 1989, J. Bact. 171: 5872-5881).

W dziedzinie tej dobrze znane są metody konstruowania zrekombinowanych wektorów zawierających określone sekwencje kodujące w połączeniu funkcjonalnym z odpowiednimi elementami regulującymi i można je wykorzystywać w praktycznej realizacji wynalazku. Metody te obejmują techniki rekombinacji in vitro, techniki syntetyczne oraz rekombinację genetyczną in vivo. Patrz np. techniki opisane w Maniatis i in., 1989, powyżej; Ausubel i in., 1989, powyżej; Sambrook i in., 1989, powyżej; Innis i in., 1995, powyżej oraz Erlich, 1992, powyżej.

Elementy regulujące tych wektorów mogą różnić się od siebie swoją siłą działania oraz specyficznością. W zależności od stosowanego układu gospodarz/wektor można stosować dowolną liczbę elementów odpowiednich dla transkrypcji i translacji. Przykłady regionów regulujących transkrypcje lub promotorów dla bakterii obejmują promotor b-gal, promotor T7, promotor TAC, lewy i prawy promotor l, promotory trp i lac, promotory fuzyjne trp-lac oraz, bardziej specyficzne wobec Streptomyces, promotory ermE, melC i tipA itp. W konkretnym rozwiązaniu opisanym poniżej w przykładzie 6, utworzono wektor ekspresyjny, który zawierał otwartą ramkę odczytu AveC sklonowaną w sąsiedztwie silnego konstytutywnego promotora ermE z Saccharopolyspora erythraea. Wektorem stransformowano S. avermitilis, a następnie analiza produktów fermentacji metodą HPLC wykazała podwyższone miano wytworzonych awermektyn w porównaniu z wytwarzaniem przez ten sam szczep, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego.

Do ekspresji białka fuzyjnego produktu genu AveC można stosować wektory ekspresyjne białek fuzyjnych. Oczyszczone białko fuzyjne można stosować do wytwarzania antysurowic skierowanych

PL 194 270 B1 przeciw produktowi genu AveC, do badania biochemicznych właściwości produktu genu AveC, do tworzenia technikami inżynierii genetycznej białek fuzyjnych AveC o różnych aktywnościach biochemicznych lub do wspomagania identyfikacji lub oczyszczania ulegającego ekspresji produktu genu AveC.

Możliwe wektory ekspresyjne białek fuzyjnych obejmują, ale nie ograniczają się do wektorów z wprowadzonymi sekwencjami kodującymi fuzje z b -galaktozydazą i trpE, fuzje z białkiem wiążącym maltozę, fuzje z S-transferazą glutationową i fuzje z polihistydyną (regiony nośnikowe). W alternatywnym rozwiązaniu, produkt genu AveC lub jego część można poddać fuzji z produktem homologu genu AveC, lub jego częścią, pochodzącymi z innego gatunku lub szczepu Streptomyces, takich jak np. S. hygroscopicus lub S. griseochromogenes. W konkretnym rozwiązaniu opisanym poniżej i przedstawionym na fig. 7, skonstruowano chimeryczny plazmid, w którym region o długości 564 bp z otwartej ramki odczytu homologu AveC S. hygroscopicus zastąpił homologiczny region o długości 564 par zasad z otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis. Takimi wektorami hybrydowymi można transformować komórki S. avermitilis oraz testować w celu określenia ich wpływu np. na proporcje klas 2:1 wytwarzanych awermektyn.

Białka fuzyjne AveC można zmieniać technikami inżynierii genetycznej w taki sposób, aby zawierały region użyteczny podczas oczyszczania. Przykładowo, białka fuzyjne AveC-białko wiążące maltozę można oczyszczać stosując żywicę amylozową; białka fuzyjne AveC-S-transferaza glutationowa można oczyszczać stosując perełki agarozowe z glutationem; a białka fuzyjne AveCpolihistydyna można oczyszczać stosując żywicę z dwuwartościowym niklem. Alternatywnie, do oczyszczania białka fuzyjnego metodą chromatografii powinowactwa można stosować przeciwciała skierowane przeciw białku lub peptydowi nośnikowemu. Przykładowo, sekwencję nukleotydową kodującą docelowy epitop dla przeciwciała monoklonalnego można wprowadzić technikami inżynierii genetycznej do wektora ekspresyjnego w połączeniu funkcjonalnym z elementami regulującymi i umiejscowić w taki sposób, aby ulegający ekspresji epitop tworzył fuzję z polipeptydem AveC. Przykładowo, sekwencję nukleotydową kodującą znacznik epitopowy FLAG™ (International Biotechnologies Inc.), który jest hydrofilowym peptydem markerowym, można wstawić znanymi technikami do wektora ekspresyjnego w miejscu odpowiadającym np. końcowi karboksylowemu peptydu AveC. Ulegający ekspresji produkt fuzyjny polipeptyd AveC-epitop FLAG™ można następnie wykrywać i oczyszczać na zasadzie powinowactwa stosując handlowo dostępne przeciwciała skierowane przeciw FLAG™.

Metodami inżynierii genetycznej można także modyfikować wektor ekspresyjny kodujący białko fuzyjne AveC, aby zawierał sekwencje poliłącznika kodujące specyficzne miejsca rozszczepiania przez proteazy, tak że ulegający ekspresji polipeptyd AveC można uwalniać z regionu nośnikowego lub partnera fuzyjnego działając specyficzną proteazą. Przykładowo, wektor białka fuzyjnego może zawierać sekwencje DNA kodujące, między innymi, miejsce rozszczepiania przez trombinę lub czynnik Xa.

W celu kierowania lokalizacją i sekrecją ulegającego ekspresji produktu genu, do wektora ekspresyjnego można wprowadzić sekwencję sygnałową przed otwartą ramką odczytu AveC, i w tej samej ramce odczytu, stosując znane metody inżynierii genetycznej. Przykłady sekwencji sygnałowych obejmują między innymi te z czynnika a, immunoglobulin, białek błony zewnętrznej, penicylinazy i receptorów komórek T.

Aby ułatwić selekcję komórek gospodarza stransformowanych lub stransfekowanych wektorami klonującymi lub ekspresyjnymi, wektor można tak skonstruować, aby zawierał także sekwencję kodującą produkt genu reporterowego lub inny marker selekcyjny. Taka sekwencja kodująca korzystnie jest funkcjonalnie połączona z sekwencjami kodującymi elementy regulujące, jak opisano powyżej. Geny reporterowe, które są użyteczne w realizacji wynalazku, są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują, między innymi, te kodujące zielone białko fluoryzujące, lucyferazę, xylE i tyrozynazę. Sekwencje nukleotydowe kodujące markery selekcyjne są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują te, które kodują produkty genów nadających oporność na antybiotyki lub antymetabolity, lub które zaspokajają wymagania auksotroficzne. Przykłady takich sekwencji obejmują te, które kodują, wśród wielu innych, oporność na erytromycynę, tiostrepton lub kanamycynę.

Transformacja komórek gospodarza

Stransformowane komórki gospodarza zawierają cząsteczkę polinukleotydową lub zrekombinowany wektor według wynalazku, oraz pochodzące od nich nowe szczepy lub linie komórkowe. Komórkami gospodarza użytecznymi w praktycznej realizacji wynalazku są korzystnie komórki Streptomyces, chociaż można również stosować inne komórki prokariotyczne lub eukariotyczne. Takie stransformowane komórki gospodarza zazwyczaj obejmują mikroorganizmy, między innymi takie jak bakterie stransformowane zrekombinowanym DNA bakteriofagowym, wektorami DNA plazmidowego

PL 194 270 B1 lub DNA kosmidowego, albo drożdże transformowane, zrekombinowanymi wektorami, ale nie ograniczają się do nich.

Cząsteczki polinukleotydowe według wynalazku w zamierzeniu działają w komórkach Streptomyces, ale można nimi również transformować, np. w celu klonowania lub ekspresji, inne komórki bakteryjne lub eukariotyczne. Zazwyczaj można stosować szczep E. coli, taki jak np. szczep DH5a dostępny w American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (numer dostępu 31343) i wźródłach komercyjnych (Stratagene). Korzystne eukariotyczne komórki gospodarza obejmują komórki drożdży, chociaż można także skutecznie wykorzystywać komórki ssaków lub komórki owadów.

Zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym korzystnie transformuje się lub transfekuje jedną lub większą liczbę komórek gospodarza z zasadniczo homogennej hodowli komórkowej. Wektor ekspresyjny zazwyczaj wprowadza się do komórek gospodarza zgodnie ze znanymi technikami, takimi jak np. transformacja protoplastów, wytrącanie fosforanem wapnia, działanie chlorkiem wapnia, mikroiniekcja, elektroporacja, transfekcja poprzez kontakt ze zrekombinowanym wirusem, transfekcja za pośrednictwem liposomów, transfekcja z użyciem DEAE-dekstranu, transdukcja, koniugacja lub bombardowanie mikropociskami. Selekcję transformantów można prowadzić zgodnie ze znanymi procedurami, takimi jak selekcja pod kątem komórek, w których zachodzi ekspresja markera selekcyjnego, np. związanej ze zrekombinowanym wektorem oporności na antybiotyk, jak opisano powyżej.

Po wprowadzeniu wektora ekspresyjnego do komórki gospodarza, znanymi technikami, np. metodą analizy hybrydyzacyjnej Southerna, analizy enzymami restrykcyjnymi, analizy PCR, w tym reakcji PCR z użyciem odwrotnej transkryptazy (rt-PCR), albo metodą oznaczania immunologicznego w celu wykrycia oczekiwanego produktu genu, można potwierdzić integrację i utrzymanie sekwencji kodującej AveC w chromosomie lub episomalnie w komórkach gospodarza. Komórki gospodarza, które zawierają i/lub eksprymują zrekombinowaną sekwencję kodującą AveC, można identyfikować drogą któregokolwiek z co najmniej czterech typowych podejść, które są dobrze znane w tej dziedzinie, obejmujących (i) hybrydyzację DNA-DNA, DNA-RNA lub RNA-antysensowny RNA, (ii) wykrywanie obecności funkcji genu „markerowego, (iii) określanie poziomu transkrypcji, którego miarą jest ekspresja w komórce gospodarza specyficznych dla AveC transkryptów mRNA, oraz (iv) wykrywanie obecności dojrzałego produktu polipeptydowego, mierzonej np. w teście immunologicznym lub na podstawie obecności aktywności biologicznej AveC (np. wytworzenia awermektyn w określonych stosunkach i ilościach, wskazujących na aktywność AveC np. w komórkach gospodarza S. avermitilis).

Ekspresja i charakterystyka zrekombinowanego produktu genu AveC

Po wprowadzeniu w trwały sposób sekwencji kodującej AveC do komórki gospodarza, stransformowaną komórkę gospodarza namnaża się klonalnie i uzyskane komórki można hodować w warunkach sprzyjających maksymalnemu wytwarzaniu produktu genu AveC. Takie warunki zazwyczaj obejmują hodowlę komórek do wysokiej gęstości. Gdy wektor ekspresyjny zawiera indukowalny promotor, stosuje się odpowiednie warunki do indukcji, takie jak zmiana temperatury, wyczerpanie składników odżywczych, dodanie dodatkowych induktorów (np. analogów węglowodanów, takich jak izopropylo-b-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)), nagromadzenie nadmiaru ubocznych produktów metabolicznych lub podobne, jakie są potrzebne do indukcji ekspresji.

Jeśli ulegający ekspresji produkt genu AveC zatrzymywany jest wewnątrz komórek gospodarza, komórki zbiera się i lizuje, a produkt izoluje się i oczyszcza z lizatu w warunkach ekstrakcji, o których w tej dziedzinie wiadomo, że minimalizują degradację białka, takich jak np. w temperaturze 4°C i/lub w obecności inhibitorów proteaz. Jeśli ulegający ekspresji produkt genu AveC ulega sekrecji z komórek gospodarza, można po prostu zbierać pożywkę z wyczerpanymi składnikami odżywczymi i z niej wyizolować produkt.

Ulegający ekspresji produkt genu AveC można wyizolować lub zasadniczo oczyścić odpowiednio z lizatów komórkowych lub z pożywki hodowlanej, stosując znane metody, w tym np. wytrącanie siarczanem amonu, frakcjonowanie na zasadzie wielkości, chromatografia jonowymiennej, HPLC, wirowanie w gradiencie gęstości i chromatografia powinowactwa, ewentualnie w połączeniu. Jeśli ulegający ekspresji produkt genu AveC wykazuje aktywność biologiczną, wzrastającą czystość preparatu można monitorować stosując odpowiedni test na każdym z etapów procedury oczyszczania. Niezależnie od tego czy ulegający ekspresji produkt genu AveC wykazuje aktywność biologiczną, można go wykrywać na podstawie np. wielkości lub reaktywności z przeciwciałem specyficznym wobec AveC, albo dzięki obecności znacznika fuzyjnego.

Zgodnie z wynalazkiem można otrzymać ulegający ekspresji na drodze rekombinacji produkt genu AveC S. avermitilis zawiera sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję kodującą

PL 194 270 B1 produkt genu AveC z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 1(SEQID NO: 2) lub jej znaczną część, oraz jego homologi.

Można też otrzymać ulegający ekspresji na drodze rekombinacji produkt homologu genu AveC z S. hygroscopicus zawierający sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 4 lub jej znaczną część, oraz jego homologi.

Produkt genu AveC wytwarza się sposobem polegającym na hodowaniu komórki gospodarza stransformowanej zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym, przy czym ten wektor zawiera cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową kodującą produkt genu AveC, która to cząsteczka polinukleotydowa jest funkcjonalnie połączona z jednym lub większą liczbą elementów regulujących, które kontrolują ekspresję cząsteczki polinukleotydowej w komórce gospodarza, w warunkach sprzyjających wytwarzaniu produktu rekombinowanego genu AveC, oraz wyodrębnianiu produktu genu AveCz hodowli komórkowej.

Ulegający ekspresji na drodze rekombinacji produkt genu AveC S. avermitilis jest użyteczny do wielu celów, w tym do przeszukiwania związków, które zmieniają funkcje produktu genu AveC, modulując w ten sposób biosyntezę awermektyn, oraz do wytwarzania przeciwciał skierowanych przeciw produktowi genu AveC.

Po otrzymaniu produktu genu AveC o wystarczającej czystości, można go charakteryzować znanymi metodami, w tym metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS, chromatografii wykluczenia, analizy sekwencji aminokwasowej, aktywności biologicznej w wytwarzaniu odpowiednich produktów na szlaku metabolicznym biosyntezy awermektyn itp. Przykładowo, sekwencję aminokwasową produktu genu AveC można określić stosując znane techniki sekwencjonowania peptydów. Produkt genu AveC można ponadto charakteryzować stosując analizę hydrofilowości (patrz np. Hopp i Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824) lub analogiczne algorytmy oprogramowania w celu zidentyfikowania hydrofobowych i hydrofilowych regionów w produkcie genu AveC. Analizę strukturalną można przeprowadzać w celu identyfikacji regionów produktu genu AveC, które przyjmują specyficzne struktury drugorzędowe. Metody biofizyczne, takie jak krystalografia rentgenowska (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7-13), modelowanie komputerowe (Fletterick i Zoller (red.), 1986, w: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) imagnetyczny rezonans jądrowy (NMR) mogą być stosowane do mapowania i badania miejsc oddziaływań pomiędzy produktem genu AveC a jego substratem. Informacje uzyskane w tych badaniach można wykorzystać do wyboru nowych miejsc mutacji otwartej ramki odczytu AveC, aby pomóc w opracowywaniu nowych szczepów S. avermitilis mających bardziej pożądane właściwości wytwarzania awermektyn.

Konstruowanie i stosowanie mutantów AveC

Cząsteczka polinukleotydowa według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową, która pod innymi względami jest taka sama jak sekwencja kodująca produkt genu AveC S. avermitilis w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencja nukleotydowa otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), lecz która ponadto zawiera jedną lub większą liczbę takich mutacji, że komórki szczepu S. avermitilis ATCC 53692, w których zinaktywowano allel AveC typu dzikiego i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydowej zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydową, wytwarzają awermektyny w innym stosunku lub ilości, niż w przypadku wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis ATCC 53692), w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego.

Zgodnie z wynalazkiem takie cząsteczki polinukleotydowe można stosować do wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, które wykazują wykrywalną zmianę w wytwarzaniu awermektyn w porównaniu z tym samych szczepem, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego. Takie cząsteczki polinukleotydowe są szczególnie użyteczne do wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z tym samym szczepem, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego. Ponadto takie cząsteczki polinukleotydowe są użyteczne do wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, które wytwarzają zwiększone poziomy awermektyn w porównaniu z tym samym szczepem, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego. Takie cząsteczki polinukleotydowe są również użyteczne do wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, w których zinaktywowano gen AveC.

Mutacje w obrębie sekwencji kodującej AveC obejmują wszystkie mutacje wprowadzające delecje, addycje lub podstawienia aminokwasowe w produkcie genu AveC, lub takie, których wynikiem jest skrócenie produktu genu AveC, lub jakąkolwiek ich kombinację, oraz takie, które powodują pożądany

PL 194 270 B1 wynik. Przykładowo, cząsteczki polinukleotydowe według wynalazku zawierają sekwencję kodującą produkt genu AveC z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu AveC z S. avermitilis przedstawioną na fig. 1(SEQID NO: 1), ale które zawierają ponadto jedną lub większą liczbę mutacji, które kodują podstawienia reszt aminokwasowych innymi resztami aminokwasowymi w wybranych pozycjach produktu genu AveC. W kilku rozwiązaniach, które przykładowo podano poniżej, takich podstawień można dokonywać w którejkolwiek z pozycji aminokwasowych 55, 138, 139 lub 230 lub niektórych ich kombinacjach.

Mutacje sekwencji kodującej AveC przeprowadza się stosując którąkolwiek z szeregu znanych metod, w tym PCR z możliwością powstawania błędów lub mutagenezę kasetkową. Przykładowo, mutagenezę ukierunkowaną oligonukleotydami można wykorzystywać do zmieniania sekwencji otwartej ramki odczytu AveC w określony sposób, tak jak np. wprowadzanie jednego lub więcej miejsc restrykcyjnych, lub kodonu terminacji, do określonych regionów sekwencji otwartej ramki odczytu AveC. Takie metody, jak opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5605793, które obejmują losową fragmentację, powtarzane cykle mutagenezy oraz tasowanie nukleotydów, również można stosować do tworzenia wielkich bibliotek polinukleotydów mających sekwencje kodujące mutacje AveC.

Użyteczne mogą być mutacje ukierunkowane, szczególnie jeśli służą do zmiany jednej lub większej liczby konserwatywnych reszt aminokwasowych w produkcie genu AveC. Przykładowo, porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych produktu genu AveC i produktów homologu genu AveC z S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) oraz S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4), przedstawionych na fig. 6 wskazuje miejsca o znaczącej konserwatywności reszt aminokwasowych pomiędzy tymi gatunkami. Mutageneza ukierunkowana, która prowadzi do zmiany jednej lub większej liczby tych konserwatywnych reszt aminokwasowych, może być szczególnie skuteczna w tworzeniu nowych zmutowanych szczepów, które wykazują pożądane zmiany w wytwarzaniu awermektyn.

Mutageneza losowa również może być użyteczna, i można ją przeprowadzać drogą ekspozycji komórek S. avermitilis na działanie promieniowania ultrafioletowego lub rentgenowskiego, albo mutagenów chemicznych, takich jak N-metylo-N'-nitrozoguanidyna, metanosulfonian etylu, kwas azotawy lub iperyty azotowe. Dla przeglądu technik mutagenezy, patrz np. Ausubel, 1989, powyżej.

Po wytworzeniu zmutowanych cząsteczek polinukleotydowych, przeszukuje się je w celu określenia, czy mogą one modulować biosyntezę awermektyn w S. avermitilis. Korzystnie cząsteczkę polinukleotydową mającą zmutowaną sekwencję nukleotydową testuje się przez komplementację szczepu S. avermitilis, w którym zinaktywowano gen AveC, w celu uzyskania ujemnego tła genetycznego AveC (AveC^-). W przykładowym sposobie, zmutowaną cząsteczkę polinukleotydową wstawia się do plazmidu ekspresyjnego w połączeniu funkcjonalnym z jednym lub większą liczbą elementów regulujących, który to plazmid korzystnie zawiera również jeden lub większą liczbę genów oporności na leki w celu umożliwienia selekcji stransformowanych komórek. Takim wektorem transformuje się następnie, stosując znane techniki, komórki gospodarza AveC^-, oraz stransformowane komórki selekcjonuje się i hoduje w odpowiedniej pożywce fermentacyjnej w warunkach, które umożliwiają lub indukują wytwarzanie awermektyn. Produkty fermentacji analizuje się następnie metodą HPLC w celu określenia zdolności zmutowanej cząsteczki polinukleotydowej do komplementacji komórek gospodarza. Kilka wektorów zawierających zmutowane cząsteczki polinukleotydowe zdolne do obniżania stosunku B2:B1 awermektyn, w tym pSE188, pSE199 i pSE231, np. podano w przykładzie 3.3.

Sposób identyfikacji mutacji realizuje się stosując fermentacyjną pożywkę hodowlaną korzystnie wzbogaconą o kwas cykloheksanokarboksylowy, chociaż można również stosować inne odpowiednie prekursory będące kwasami tłuszczowymi, takie jak którykolwiek z prekursorów będących kwasem tłuszczowym wymieniony w tabeli 1.

Po zidentyfikowaniu zmutowanej cząsteczki polinukleotydowej, która moduluje w pożądany sposób wytwarzanie awermektyn, można określić lokalizację mutacji w sekwencji nukleotydowej. Przykładowo, cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową kodującą zmutowany produkt genu AveC można wyizolować przez PCR i, stosując znane metody, poddać analizie sekwencji DNA. W wyniku porównania sekwencji DNA zmutowanego allelu AveC z sekwencją allelu typu dzikiego, można określić mutację(e) odpowiedzialną za zmiany w wytwarzaniu awermektyn. W konkretnych rozwiązaniach zgodnych z wynalazkiem, produkty genu AveC S. avermitilis zawierające albo pojedyncze podstawienia aminokwasowe każdej z reszt 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T) lub 230 (G230D), albo podwójne podstawienia w pozycjach 138 (S138T) i 139 (A139T), powodowały takie zmiany funkcji produktu genu AveC, że zmieniony był stosunek klas 2:1 wytwarzanych awermektyn

PL 194 270 B1 (patrz przykład 3 poniżej). Zgodnie z tym, cząsteczki polinukleotydowe mające sekwencje nukleotydowe kodujące zmutowane produkty genu AveC S. avermitilis, zawierające podstawienia jednej lub większej liczby z reszt aminokwasowych 55, 138, 139, 230, lub ich kombinację, są objęte zakresem wynalazku.

Dzięki wynalazkowi uzyskano środki do wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, których komórki zawierają zmutowany allel genu AveC powodujący zmiany wytwarzania awermektyn. Przykładowo, są to zrekombinowane wektory, które można stosować do kierowania cząsteczki polinukleotydowej zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydową do miejsca genu AveC na chromosomie S. avermitilis, w celu albo wstawienia jej do otwartej ramki odczytu AveC, albo zastąpienia otwartej ramki odczytu AveC lub jej części drogą rekombinacji homologicznej. Cząsteczka polinukleotydowa zawierająca zmutowaną sekwencję nukleotydową może także działać modulująco na biosyntezę awermektyn po wstawieniu do chromosomu w miejscu innym niż gen AveC, lub gdy utrzymywana jest episomalnie w komórkach S. avermitilis. Zatem uzyskano także wektory zawierające cząsteczkę polinukleotydową zawierającą zmutowaną sekwencję nukleotydową, które to wektory można stosować do wstawiania cząsteczki polinukleotydowej w innym miejscu w chromosomie S. avermitilis niż gen AveC, lub do utrzymywania episomalnego.

W szczególności przydatne są wektory do zastępowania genu, które można stosować do wstawiania zmutowanego allelu AveC do komórek szczepu S. avermitilis, tworząc w ten sposób nowe szczepy S. avermitilis, których komórki wytwarzają awermektyny o zmienionym stosunku klas 2:1 w porównaniu z komórkarni tego samego szczepu, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego. Stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki jest obniżony. Takie wektory do zastępowania genu można konstruować stosując zmutowane cząsteczki polinukleotydowe obecne w wektorach ekspresyjnych przedstawionych w niniejszym opisie, takich jak pSE188, pSE199 i pSE231, które to wektory ekspresyjne opisano np. w przykładzie 3.3 poniżej.

Ponadto przydatne są wektory, które można stosować do wstawiania zmutowanego allelu AveC do komórek szczepu S. avermitilis w celu wytwarzania nowych szczepów komórek, które wytwarzają zmienione ilości awermektyn w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w którym zamiast tego ulega ekspresji tylko allel AveC typu dzikiego. W konkretnym przykładowym rozwiązaniu, taki wektor zawiera ponadto silny promotor znany w tej dziedzinie, taki jak np. silny konstytutywny promotor ermE z Saccharopolyspora erythraea, który jest usytuowany przed, i w połączeniu funkcjonalnym z otwartą ramką odczytu AveC. Takim wektorem może być plazmid pSE189, opisany poniżej w przykładzie 6, lub można go skonstruować stosując zmutowany allel AveC z plazmidu pSE189.

Uzyskano też wektory do zastępowania genu, które są użyteczne do inaktywacji genu AveC w szczepie typu dzikiego S. avermitilis. Przykładowo, takie wektory do zastępowania genu można konstruować stosując zmutowaną cząsteczkę polinukleotydową obecną w plazmidzie pSE180 (ATCC 209605), który przykładowo opisano w przykładzie 3.1 poniżej (fig. 3). Ponadto uzyskano wektory do zastępowania genu, które zawierają cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencje nukleotydowe lub składającą się z sekwencji nukleotydowych, które naturalnie flankują gen AveC in situ w chromosomie S. avermitilis, w tym np. tych flankujących sekwencji nukleotydowych przedstawionych na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), które to wektory można stosować do deletowania otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis.

Nowe szczepy S. avermitilis, których komórki zawierają zinaktywowany allel AveC, można wytwarzać przez transformowanie komórek szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja allelu AveC typu dzikiego wektorem inaktywującym allel AveC, oraz selekcjonowanie stransformowanych komórek, w których allel AveC uległ inaktywacji. Przykładowo, komórki szczepu S. avermitilis transformuje się wektorem do zastępowania genu, zawierającym allel genu AveC, który zinaktywowano drogą mutacji lub zastąpienia części allelu AveC sekwencją genu heterologicznego, oraz selekcjonuje się stransformowane komórki, w których natywny allel AveC zamieniono na zinaktywowany allel AveC. Inaktywację allelu AveC można określić na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC, jak opisano poniżej. W konkretnym przykładowym rozwiązaniu opisanym w przykładzie 3.1 poniżej, allel AveC inaktywuje się przez wstawienie do otwartej ramki odczytu AveC genu ermE z Saccharopolyspora erythraea.

Nowe szczepy S. avermitilis zawierają komórki stransformowane cząsteczką polinukleotydową lub wektorem według wynalazku. Korzystne są nowe szczepy S. avermitilis zawierające komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC zamiast lub dodatkowo do allelu AveC typu dzikiego, przy czym komórki nowego szczepu wytwarzają awermektyny o zmienionym stosunku klas 2:1 w porównaniu z stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego

PL 194 270 B1 szczepu, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego. W szczególności stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez nowe komórki ulega obniżeniu. Takie nowe szczepy są użyteczne do wytwarzania w dużej skali handlowo pożądanych awermektyn, takich jak doramektyna.

Głównym celem opisanych w niniejszym opisie testów przeszukiwania jest identyfikacja zmutowanych alleli genu AveC, których ekspresja w komórkach S. avermitilis zmienia, a bardziej szczegółowo, obniża stosunek klas 2:1 wytwarzanych awermektyn. Korzystnie stosunek awermektyn B2:B1 wytwarzanych przez komórki nowego szczepu S. avermitilis według wynalazku, w którym zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, który zmniejsza stosunek klas 2:1 wytwarzanych awermektyn, pozostaje w zakresie od mniej niż 1,6:1 do około 0:1; korzystniej stosunek ten wynosi od 1:1 do 0:1; a najkorzystniej stosunek ten wynosi od 0,84:1 do 0:1. W konkretnym rozwiązaniu opisanym poniżej, nowe komórki według wynalazku wytwarzają cykloheksylo B2 awermektyny:cykloheksylo B1 awermektyny w stosunku poniżej 1,6:1. W innym opisanym poniżej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają cykloheksylo B2 awermektyny:cykloheksylo B1 awermektyny w stosunku około 0,94:1. W jeszcze innym opisanym poniżej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają cykloheksylo B2 awermektyny:cykloheksylo B1 awermektyny w stosunku około 0,88:1. W jeszcze innym opisanym poniżej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają cykloheksylo B2 awermektyny:cykloheksylo B1 awermektyny w stosunku około 0,84:1.

Nowe szczepy S. avermitilis zawierają komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC lub konstruktu genetycznego zawierającego allel AveC zamiast lub dodatkowo do allelu AveC typu dzikiego, przy czym komórki nowego szczepu wytwarzają zmienioną ilość awermektyn w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC typu dzikiego. W przykładowym rozwiązaniu, konstrukt genetyczny zawiera ponadto przed otwartą ramką odczytu AveCi w połączeniu funkcjonalnym z otwartą ramką odczytu AveC silny promotor, taki jak silny konstytutywny promotor ermE z Saccharopolyspora erythraea.

Nowe szczepy S. avermitilis mogą zawierać komórki, w których gen AveC został zinaktywowany. Takie szczepy są użyteczne zarówno z powodu odmiennego spektrum wytwarzanych awermektyn w porównaniu ze szczepem typu dzikiego, jak i w komplementacyjnych testach przeszukiwania, jak opisano w niniejszym opisie, do określania czy ukierunkowana lub losowa mutageneza genu AveC wpływa na wytwarzanie awermektyn. W opisanym poniżej konkretnym rozwiązaniu, komórki gospodarza S. avermitilis tak zmieniono technikami inżynierii genetycznej, aby zawierały zinaktywowany gen AveC. Przykładowo, szczep SE180-11, opisany w poniższych przykładach, utworzono stosując plazmid do zastępowania genu, pSE180 (ATCC 209605) (fig. 3), który skonstruowano w celu inaktywacji genu AveC S. avermitilis przez wstawienie genu oporności ermE do regionu kodującego genu AveC.

Zgodnie z wynalazkiem można otrzymać ulegające ekspresji na drodze rekombinacji, zmutowane produkty genu AveC S. avermitilis, kodowane przez opisane powyżej cząsteczki polinukleotydowe według wynalazku.

Kompozycja awermektyn wytworzona sposobem według wynalazku może występować w postaci wytworzonej w brzeczce fermentacyjnej o wyczerpanych składnikach odżywczych, albo może być z niej wyodrębniana. Nową kompozycję awermektyn można częściowo lub zasadniczo oczyszczać z brzeczki hodowlanej stosując znane biochemiczne techniki oczyszczania, takie jak wytrącanie siarczanem amonu, dializa, frakcjonowanie na zasadzie wielkości, chromatografia jonowymienna, HPLC itd.

Zastosowanie awermektyn

Awermektyny są środkami przeciwpasożytniczymi o wysokiej aktywności, szczególnie użytecznymi jako środki przeciw robakom, przeciw pasożytom zewnętrznym, owadobójcze i roztoczobójcze. Związki awermektynowe wytwarzane sposobem według wynalazku są użyteczne do każdego z tych celów. Przykładowo, związki awermektynowe wytwarzane sposobem według wynalazku są użyteczne w leczeniu różnych chorób lub stanów u ludzi, szczególnie gdy te choroby lub stany powodowane są zakażeniami pasożytami, jak znane w tej dziedzinie. Patrz np. Ikeda i Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609. Bardziej szczegółowo, związki awermektynowe wytwarzane sposobem według wynalazku są skuteczne w leczeniu różnych chorób lub stanów powodowanych przez pasożyty wewnętrzne, takie jak pasożytnicze nicienie, które mogą zakażać ludzi, zwierzęta domowe, świnie, owce, drób, konie lub bydło.

Bardziej szczegółowo, związki awermektynowe wytwarzane sposobem według wynalazku są skuteczne wobec nicieni zakażających ludzi, a także tych, które zakażają różne gatunki zwierząt. Do takich nicieni należą pasożyty układu pokarmowego, takie jak Ancylostoma, Necator, Ascaris, StrongyloPL 194 270 B1 ides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria, oraz pasożyty występujące we krwi lub innych tkankach lub narządach, takie jak nitkowce oraz uwolnione postacie jelitowe Strongyloides i Trichinella.

Związki awermektynowe wytwarzane sposobem według wynalazku są także użyteczne w leczeniu zakażeń pasożytami zewnętrznymi, obejmujących np. ataki ssaków i ptaków przez stawonogi, powodowane przez kleszcze, roztocza, wszy, pchły, muchy plujki i z rodzajów pokrewnych, owady gryzące lub migrujące larwy muchówek, które mogą atakować między innymi bydło i konie.

Związki awermektynowe wytwarzane sposobem według wynalazku są także użyteczne jako środki owadobójcze przeciw szkodnikom gospodarstw domowych, takim jak np. między innymi karaczany, mole, mrzyki i muchy domowe, jak również będące owadami szkodniki przechowywanego ziarna i roślin uprawnych, które obejmują przędziorki, mszyce, gąsienice oraz owady prostoskrzydłe, takie jak szarańczę.

Do zwierząt, które można leczyć związkami awermektynowymi wytwarzanymi sposobem według wynalazku, należą owce, bydło, konie, jelenie, kozy, świnie, ptaki, w tym drób, oraz psy i koty.

Związek awermektynowy wytworzony sposobem według wynalazku podaje się w postaci odpowiedniej do konkretnego zamierzonego zastosowania, określonego gatunku leczonego żywiciela zwierzęcego oraz zwalczanego pasożyta lub owada. W celu stosowania jako środek pasożytniczobójczy, związek awermektynowy wytworzony sposobem według wynalazku można podawać doustnie w postaci kapsułki, dużej pigułki, tabletki lub postaci płynnej lub, alternatywnie, można go podawać drogą wlewu, iniekcji lub jako wszczep. Takie postacie wytwarza się w zwykły sposób, zgodnie ze zwykłą praktyką weterynaryjną. Zatem kapsułki, duże pigułki lub tabletki można wytworzyć przez zmieszanie składnika czynnego z odpowiednim rozdrobnionym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem, dodatkowo zawierającym środek rozsadzający i/lub wiążący, takim jak skrobia, laktoza, talk, stearynian magnezu itp. Postać płynną można wytworzyć przez zdyspergowanie składnika czynnego w roztworze wodnym wraz z czynnikiem rozpraszającym lub zwilżającym itp. Postacie do iniekcji można wytwarzać w postaci jałowego roztworu, który może zawierać inne substancje, takie jak np. wystarczającą ilość soli i/lub glukozy do wytworzenia roztworu izotonicznego z krwią.

Takie postacie leków będą się różnić ilością związku czynnego w zależności od pacjenta lub gatunku żywiciela zwierzęcego, który ma zostać poddany leczeniu, ciężkości i rodzaju zakażenia oraz wagi ciała żywiciela. Ogólnie, do podawania doustnego wystarczająca będzie dawka związku czynnego od około 0,001 mg do 10 mg na kg masy ciała pacjenta lub zwierzęcia, podawana w postaci pojedynczej dawki lub dawek podzielonych w okresie od 1 do 5 dni. Jednakże mogą wystąpić przypadki, w których są wskazane wyższe lub niższe zakresy dawek, które określi np. lekarz lub weterynarz na podstawie objawów klinicznych.

Alternatywnie, związek awermektynowy wytworzony sposobem według wynalazku można podawać w połączeniu z karmą dla zwierząt, i w tym celu można przygotować zatężoną domieszkę lub przedmieszkę paszową do mieszania z normalną karmą dla zwierząt.

Do stosowania jako środek owadobójczy lub do zwalczania szkodników upraw, związek awermektynowy wytworzony sposobem według wynalazku można stosować jako aerozol, pył, emulsję i podobne, zgodnie ze zwykłą praktyką rolniczą.

Poniżej opisano figury rysunku podane dla dokładniejszego przedstawienia wynalazku.

Figura 1. Sekwencja DNA (SEQ ID NO: 1) zawierająca otwartą ramkę odczytu AveC S. avermitilis oraz przewidywana sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO: 2).

Figura 2. Wektor plazmidowy pSE186 (ATCC 209604) zawierający kompletną otwartą ramkę odczytu genu AveC S. avermitilis.

Figura 3. Wektor do zastępowania genu, pSE180 (ATCC 209605), zawierający gen ermE Sacc. erythraea wstawiony do otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis.

Figura 4. Mapa restrykcyjna BamHI grupy genu syntazy poliketydowej awermektyn z S. avermitilis z pięcioma zidentyfikowanymi, zachodzącymi na siebie klonami kosmidowymi (czyli pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Wskazano również zależności pomiędzy pSE118 i pSE119.

Figura 5. Analiza metodą HPLC produktów fermentacji wytwarzanych przez szczepy S. avermitilis. Ilościowe oznaczanie pików przeprowadzono przez porównanie z wzorcowymi ilościami cykloheksylo-B1. Czas retencji cykloheksylo-B2 wynosił 7,4-7,7 minuty; czas retencji cykloheksylo-B1 wynosił 11,9-12,3 minuty. Figura 5A. szczep SE180-11 S. avermitilis z inaktywowaną otwartą ramką odczytu AveC. Figura 5B. szczep SE180-11 S. avermitilis stransformowany plazmidem pSE186 (ATCC 209604). Figura 5C. szczep SE180-11 S. avermitilis stransformowany plazmidem pSE187. Figura 5D. szczep SE180-11 S. avermitilis stransformowany plazmidem pSE188.

PL 194 270 B1

Figura 6. Porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych kodowanych przez otwartą ramkę odczytu AveC S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), częściową otwartą ramkę odczytu homologu AveC z S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) oraz otwartą ramkę odczytu homologu AveCz S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4). Zaznaczona wytłuszczonym drukiem reszta waliny jest przypuszczalnym miejscem początku białka. Reszty konserwatywne przedstawiono dużymi literami dla wskazania homologii we wszystkich trzech sekwencjach oraz małymi literami dla wskazania homologii w dwóch z trzech sekwencji. Sekwencje aminokwasowe wykazują około 50% identyczności.

Figura 7. Hybrydowy konstrukt plazmidowy zawierający fragment BsaAI/Kpnl o długości 564 bp z homologu genu AveC z S. hygroscopicus wstawiony w miejsce BsaAI/Kpnl otwartej ramki odczytu genu AveC S. avermitilis.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

Przykład 1. Fermentacja Streptomyces avermitilis i analiza awermektyn B2:B1

Szczepy pozbawione zarówno aktywności dehydrogenazy 2-oksokwasów o łańcuchach rozgałęzionych, jak i 5-O-metylotransferazy nie wytwarzają awermektyn, o ile pożywka fermentacyjna nie zostanie wzbogacona o kwasy tłuszczowe. Przykład ten wykazuje, że w przypadku takich mutantów można otrzymywać awermektyny w szerokim zakresie stosunków B2:B1, jeżeli biosyntezę inicjuje się w obecności różnych kwasów tłuszczowych.

1.1. Materiały i metody

Streptomyces avermitilis ATCC 53692 przechowywano w temperaturze -70°C w postaci pełnej brzeczki przygotowanej w pożywce do zaszczepiania, składającej się z: skrobi (Nadex, Laing National) -20 g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) -15 g; Ardamine pH (Yeast Products Inc.) - 5 g; węglan wapnia - 1 g. Objętość końcową doprowadzono do 1 litra wodą wodociągową, odczyn doprowadzono do pH 7,2 i pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut.

Dwa ml rozmrożonej zawiesiny powyższego preparatu zastosowano do zaszczepienia kolby zawierającej 50 ml tej samej pożywki. Po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 28°C w wytrząsarce obrotowej przy 180 obrotach na minutę, 2 ml brzeczki stosowano do zaszczepiania kolby zawierającej ml pożywki do wytwarzania produktów, składającej się z: skrobi - 80 g; węglanu wapnia - 7 g;

Pharmamedia - 5 g; wodorofosforanu dipotasowego - 1 g; siarczanu magnezu - 1 g; kwasu glutaminowego - 0,6 g, heptawodzianu siarczanu żelazawego - 0,01 g; siarczanu cynku - 0,001 g; siarczanu manganawego - 0,001 g. Objętość końcową doprowadzono wodą wodociągową do 1 litra, odczyn doprowadzono do pH 7,2 g i pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut.

Różne substraty będące kwasami karboksylowymi (patrz tabela 1) rozpuszczano w metanolu idodawanodo brzeczki fermentacyjnej po 24 godzinach od zaszczepienia do uzyskania stężenia końcowego 0,2 g/litr. Brzeczkę fermentacyjną inkubowano w ciągu 14 dni w temperaturze 28°C, a następnie brzeczkę wirowano (2 500 obrotów na minutę w ciągu 2 minut) i supernatant odrzucano. Osad grzybni ekstrahowano acetonem (15 ml), a następnie dichlorometanem (30 ml), oddzielano fazę organiczną, przesączono, a następnie odparowywano do sucha. Pozostałość rozpuszczano w metanolu (1 ml) i analizowano metodą HPLC stosując chromatograf cieczowy Hewlett-Packard 1090A wyposażony w skanujący detektor z układem diod, nastawiony na długość fali 240 nm. Stosowaną kolumną była kolumna Beckman Ultrasphere C-18, 5 μm, o wymiarach 4,6 mm x 25 cm, utrzymywana w temperaturze 40°C. Do kolumny wstrzykiwano dwadzieścia pięć μl powyższego roztworu metanolowego. Elucję prowadzono stosując liniowy gradient metanol-woda od 80:20 do 95:5 w ciągu 40 minut przy szybkości przepływu 0,85 ml/minutę. Do kalibracji odpowiedzi detektora stosowano dwa stężenia wzorca cykloheksylo-B1oraz mierzono pole powierzchni pod krzywymi dla awermektyn B2 i B1.

1.2. Wyniki

Czas retencji obserwowane dla awermektyn B2 i B1oraz stosunek klas 2:1 przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

	Czas retencji HPLC (min)	Stosunek
1	2	3	4
Substrat	B2	B1	B2:B1
Kwas 4-tetrahydropiranokarboksylowy	8,1	14,5	0,25
Kwas izomasłowy	10,8	18,9	0,5
Kwas 3-pirośluzowy	7,6	14,6	0,62

PL 194 270 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4
Kwas S-(+)-2-metylomasłowy	12,8	21,6	1,0
Kwas cykloheksanokarboksylowy	16,9	26,0	1,6
Kwas 3-tiofenokarboksylowy	8,8	16,0	1,8
Kwas cyklopentanokarboksylowy	14,2	23,0	2,0
Kwas 3-trifluorometylomasłowy	10,9	18,8	3,9
Kwas 2-metylopentanowy	14,5	24,9	4,2
Kwas cykloheptanokarboksylowy	18,6	29,0	15,0

Dane przedstawione w tabeli 1 wykazują skrajnie szeroki zakres stosunków wytwarzanych awermektyn B2:B1, wskazując na znaczące różnice w wynikach przemiany dehydratacji związków klasy 2 w związki klasy 1, w zależności od charakteru wyjściowego łańcucha bocznego dodanego kwasu tłuszczowego. Wskazuje to, że zmiany w stosunkach B2:B1 powstające w wyniku zmian w białku AveC mogą być specyficzne dla poszczególnych substratów. W konsekwencji, przeszukiwanie pod kątem mutantów wykazujących zmiany stosunku B2:B1 uzyskiwane dla danego substratu powinno być dokonywane w obecności tego substratu. W dalszych opisanych poniżej przykładach jako substrat w przeszukiwaniu stosowano kwas cykloheksanokarboksylowy. Jednakże substrat ten stosuje się jedynie dla przykładowego przedstawienia możliwości niniejszego wynalazku, i w zamierzeniu nie ogranicza jego możliwości stosowania.

P r zyk ł a d 2. Izolowanie genu AveC

Przykład ten dotyczy izolowania i charakteryzowania regionu chromosomu Streptomyces avermitilis kodującego produkt genu AveC. Jak wykazano poniżej, gen AveC zidentyfikowano jako zdolny do modyfikowania stosunku wytwarzanych cykloheksylo-B2-awermektyn do cykloheksylo-B1-awermektyn (B2:B1).

2.1. Materiały i metody

2.1.1. Hodowla Streptomyces w celu izolowania DNA Hodowlę Streptomyces prowadzono zgodnie z następującą metodą. Pojedyncze kolonie S. avermitilis ATCC 31272 (izolat pojedynczej kolonii nr 2) izolowano z pożywki YPD-6 o połowie stężenia, zawierającej: ekstrakt drożdżowy Difco 5 g; Bacto-pepton Difco - 5 g; dekstroza - 2,5 g; MOPS - 5 g; Bacto-agar Difco - 15 g. Objętość końcową doprowadzano do 1 litra wodą destylowaną, odczyn doprowadzono do pH 7,0 i pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut.

Grzybnię wyrosłą w powyższej pożywce stosowano do zaszczepiania 10 ml pożywki TSB (Tryptic Soy Broth, Difco - 30 g w 1 litrze wody destylowanej, autoklawowane w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut) w probówce o wymiarach 25 mm x 150 mm, którą wytrząsano (300 obrotów na minutę) w temperaturze 28°C w ciągu 48-72 godzin.

2.1.2. Izolowanie chromosomalnego DNA ze Streptomyces Próbki (0,25 lub 0,5 ml) grzybni wyhodowanej w sposób opisany powyżej umieszczano w probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml i komórki zatężano przez wirowanie przy 12000 x g w ciągu 60 sekund. Supernatant odrzucano, a komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 0,25 ml buforu TSE (20 ml 1,5 M sacharoza, 2,5 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0, 2,5 ml 1M EDTA, pH 8,0 oraz 75 ml wody destylowanej) zawierającego 2 mg/ml lizozymu. Próbki inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut z wytrząsaniem, umieszczano w zautomatyzowanym aparacie do izolacji DNA AutoGen 540™ (Integrated Separation System, Natick, MA) i genomowy DNA izolowano stosując program aparatu Cycle 159, zgodnie z zaleceniami producenta.

Alternatywnie, 5 ml grzybni umieszczano w probówce o wymiarach 17 mm x 100 mm, komórki zatężano przez wirowanie przy 3 000 obrotów na minutę w ciągu 5 minut i odrzucano supernatant. Komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 1 ml buforu TSE, zatężano przez wirowanie przy 3 000 obrotów na minutę w ciągu 5 minut i odrzucano supernatant. Komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 1 ml buforu TSE zawierającego 2 mg/ml lizozymu i inkubowano w ciągu 30-60 minut w temperaturze 37°C z wytrząsaniem. Po inkubacji dodawano 0,5 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i komórki inkubowano w temperaturze 37°C do zakończenia lizy komórek. Lizat inkubowano w ciągu 10 minut w temperaturze 65°C, ochładzano do temperatury pokojowej, rozdzielano na dwie probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i ekstrahowano 1 raz 0,5 ml mieszaniny fenol/chloroform (50% fenol uprzednio zrównoważony 0,5 M Tris, pH 8,0; 50% chloroform). Zbierano

PL 194 270 B1 fazę wodną i ekstrahowano ją 2 do 5 razy mieszaniną chloroform:alkohol izoamylowy (24:1). DNA wytrącano przez dodanie 1/10 objętości 3 M octanu sodu, pH 4,8, inkubację mieszaniny w lodzie w ciągu 10 minut, wirowanie mieszaniny przy 15 000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut w temperaturze 5°C oraz usuwanie supernatantu do czystej probówki, do której dodawano 1 objętość izopropanolu. Mieszaninę supernatantu z izopropanolem inkubowano następnie w lodzie w ciągu 20 minut, wirowano przy 15 000 obrotów na minutę w ciągu 20 minut w temperaturze 5°C, usuwano supernatant, a osad DNA przemywano 1raz 70% etanolem. Po wysuszeniu osadu DNA, DNA ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze TE (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0).

2.1.3. Izolowanie plazmidowego DNA ze Streptomyces

Próbkę (1,0 ml) grzybni umieszczano w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i komórki zatężano przez wirowanie przy 12 000 x g w ciągu 60 sekund. Supernatant odrzucano, komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 1,0 ml 10,3% sacharozy i zatężano przez wirowanie przy 12 000 x g w ciągu 60 sekund i odrzucano supernatant. Następnie komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 0,25 ml buforu TSE zawierającego 2 mg/ml lizozymu i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut z wytrząsaniem i umieszczano w zautomatyzowanym aparacie do izolowania DNA AutoGen 540™. Plazmidowy DNA izolowano stosując program aparatu Cycle 106, zgodnie z zaleceniami producenta.

Alternatywnie, 1,5 ml grzybni umieszczano w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i komórki zatężano przez wirowanie przy 12 000 x g w ciągu 60 sekund. Supernatant odrzucano, komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 1,0 ml 10,3% sacharozy i zatężano przez wirowanie przy 12 000 x g w ciągu 60 sekund i supernatant odrzucano. Komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 0,5 ml buforu TSE zawierającego 2 mg/ml lizozymu i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 15-30 minut. Po inkubacji dodawano 0,25 ml zasadowego roztworu SDS (0,3 N NaOH, 2% SDS) i komórki inkubowano w temperaturze 55°Cw ciągu 15-30 minut lub do uzyskania klarownego roztworu. Do roztworu DNA dodawano octan sodu (0,1 ml, 3M, pH 4,8), a następnie inkubowano w lodzie w ciągu 10 minut. Próbki DNA wirowano przy 14 000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut w temperaturze 5°C. Supernatant usuwano do czystej probówki, dodawano 0,2 ml mieszaniny fenol:chloroform (50% fenol: 50% chloroform) i delikatnie mieszano. Roztwór DNA wirowano przy 14000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut w temperaturze 5°C i górną warstwę usuwano do czystej probówki Eppendorfa. Dodawano izopropanol (0,75 ml), roztwór delikatnie mieszano, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut. Roztwór DNA wirowano przy 14 000 obrotów na minutę w ciągu 15 minut w temperaturze 5°C, usuwano supernatant, a osad DNA przemywano 70% etanolem, suszono i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze TE.

2.1.4. Izolowanie plazmidowego DNA zE. coli

Pojedynczą kolonią stransformowanej E. coli zaszczepiano 5 ml pożywki Luria-Bertani (LB) (Bacto-Tryptone -10g; Bacto-ekstrakt drożdżowy -5 g oraz NaCl -10 g w 1 litrze wody destylowanej, pH 7,0, autoklawowanej w ciągu 25 minut w temperaturze 121°C i wzbogaconej roztworem 100 μg/ml ampicyliny). Hodowlę inkubowano przez noci próbkę o objętości 1ml umieszczanow probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Próbki hodowli umieszczano w zautomatyzowanym aparacie do izolowania DNA AutoGen 540™ i plazmidowy DNA izolowano stosując program aparatu Cycle 3, zgodnie z zaleceniami producenta.

2.1.5.Przygotowanie i transformacja protoplastów S. avermitilis

Pojedyncze kolonie S. avermitilis izolowano z pożywki YPD-6 o połowicznym stężeniu. Grzybnie stosowano do zaszczepiania 10 ml pożywki TSB w probówce o wymiarach 25 mm x 150 mm, które następnie inkubowano z wytrząsaniem (300 obrotów na minutę) w temperaturze 28°C w ciągu 48 godzin. Jeden ml grzybni stosowano do zaszczepiania 50 ml pożywki YEME. Pożywka YEME zawiera na litr: ekstrakt drożdżowy Difco -3 g; Bacto-pepton Difco -5 g; ekstrakt słodowy Difco -3 g; sacharoza - 300 g. Po autoklawowaniu w ciągu 25 minut w temperaturze 121°C, dodawano następujące składniki: 2,5 M MgCl₂OH₂O (autoklawowany oddzielnie w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut) - 2 ml oraz glicynę (20%) (wyjaławianą przez sączenie) -25 ml.

Grzybnię hodowano w temperaturze 30°C w ciągu 48-72 godzin i zbierano przez odwirowanie wprobówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (Falcon) przy 3 000 obrotów na minutę w ciągu 20 minut. Supernatant odrzucano, a grzybnię ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze P, który zawiera: sacharoza - 205 g; K₂SO₄ - 0,25 g; MgCl₂OH₂O - 2,02 g; H₂O - 600 ml; K₂PO₄ (0,5%) 10 ml; roztwór pierwiastków śladowych* - 20 ml; CaCl/2H₂O - (3,68%) - 100 ml oraz bufor MES (1 M, pH 6,5) - 10 ml. (*Roztwór pierwiastków śladowych zawiera na litr: ZnCl₂ - 40 mg; FeCl₃OH₂O - 200 mg;

PL 194 270 B1

CuCl₂^2H₂O - 10 mg; MnCl₂4H₂O - 10 mg; Na₂B₄O₇J0H₂O - 10 mg; (ΝΗ₄)₆Μο₇0₂₄·4Η₂0 -10 mg).

Odczyn doprowadzano do pH 6,5, objętość końcową do prowadzano do 1 litra i gorącą pożywkę przesączono przez 0,45 μm filtr.

Grzybnię wirowano przy 3 000 obrotów na minutę w ciągu 20 minut, supernatant odrzucano i grzybnię ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 20 ml roztworu P zawierającego 2 mg/ml lizozymu. Grzybnię inkubowano z wytrząsaniem w temperaturze 35°C w ciągu 15 minut i sprawdzano mikroskopowo w celu określenia stopnia tworzenia protoplastów. Gdy tworzenie protoplastów było zakończone, wirowano je przy 8000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut. Supernatant usuwano, a protoplasty ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 10 ml buforu P. Protoplasty wirowano przy 8000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut, supernatant usuwano, protoplasty ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 2 ml buforu P i około 1 x 10⁹ protoplastów umieszczano w fiolkach kriogenicznych o pojemności 2,0ml (Nalgene).

Fiolkę zawierającą 1 x 10⁹ protoplastów wirowano przy 8 000 obrotów na minutę, supernatant usuwano i protoplasty ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 0,1 ml buforu P.

Do protoplastów dodawano od 2 do 5 μg transformującego DNA, po czym natychmiast dodawano 0,5 ml roboczego buforu T. Bufor podstawowy T zawiera: PEG-1000 (Sigma) - 25 g; sacharoza2,5 g, H2O - 83 ml. Odczyn doprowadzono do pH 8,8 stosując 1N NaOH (wyjałowiany przez sączenie), a podstawowy roztwór T wyjaławiano przez sączenie i przechowywano w temperaturze 4°C. Roboczym buforem T, przygotowywanym w dniu stosowania, był podstawowy bufor T - 8,3 ml, K2PO4 (4 mM) - 1,0 ml; CaCl₂^2H₂O (5M) - 0,2 ml oraz TES (1M, pH 8) - 0,5 ml. Każdy ze składników roboczego buforu T osobno wyjaławiano przez sączenie.

W ciągu 20 sekund od dodania do protoplastów buforu T, dodawano także 1,0 ml buforu P i protoplasty wirowano przy 8 000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut. Supernatant odrzucano, a protoplasty ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 0,1 ml buforu P. Protoplasty wysiewano następnie na pożywkę RM14, która zawiera: sacharozę - 205 g, K₂SO₄ - 0,25 g, MgCl₂OH₂O - 10,12 g; glukozę - 10 g, hydrolizat kazeiny Difco - 0,1; ekstrakt drożdżowy Difco - 5 g; agar z mąką owsianą Difco - 3; Bacto agar Difco - 22 g; wodę destylowaną - 800 ml. Roztwór autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut. Po autoklawowaniu, dodawano następujące jałowe roztwory podstawowe: K₂PO4 (0,5%) - 10 ml; CaCl/2H₂O (5M) - 5 ml; L-proliny (20%) - 15 ml; bufor MES (1,0M, pH 6,5) - 10 ml; roztwór pierwiastków śladowych (taki sam, jak powyżej) - 2 ml; roztwór podstawowy cykloheksyimidu (25 mg/ml) - 40 ml; oraz 1N NaOH - 2 ml. Dwadzieścia pięć ml pożywki RM14 wylewano na płytkę i płytki suszono przed użyciem w ciągu 24 godzin.

Protoplasty inkubowano w atmosferze o 95% wilgotności w temperaturze 30°C w ciągu 20-24 godzin. W celu wyselekcjonowania transformantow opornych na tiostrepton, na płytkach do regeneracji z pożywką RM14 równomiernie rozprowadzano 1 ml buforu do pokrywania, zawierającego 125 μg/ml tiostreptonu. Bufor do pokrywania zawiera na 100 ml: sacharozę - 10,3 g; roztwór pierwiastków śladowych (taki sam, jak powyżej) - 0,2 ml oraz MES (1M, pH 6,5) - 1 ml. Protoplasty inkubowano w atmosferze o 95% wilgotności, w temperaturze 30°C w ciągu 7-14 dni, aż widoczne były kolonie oporne na tiostrepton (Thio^r).

2.1.6. Transformowanie protoplastów Streptomyces lividans

W niektórych przypadkach do transformowania stosowano S. lividans TK64 (dostarczony przez John Innes Institutes, Norwich, Wielka Brytania). Metody i pożywki do hodowli, tworzenia protoplastów i transformowania S. lividans opisano w Hopwood i in., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Wielka Brytania i prowadzono w sposób tam opisany. Plazmidowy DNA z transformantów S. lividans izolowano w sposób opisany powyżej w przykładzie 2.1.3.

2.1.7. Analiza fermentacji szczepów S. avermitilis

Grzybnią S. avermitilis wyrosłą na pożywce YPD-6 o połowicznym stężeniu w ciągu 4-7 dni zaszczepiano probówki o wymiarach 25,4 x 152,4 mm, zawierających 8 ml gotowej pożywki i dwie perełki szklane o średnicy 5 mm. Gotowa pożywka zawiera: rozpuszczalną skrobię (rzadka gotowana skrobia lub KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/litr; Pharmamedia 15 g/litr; Ardamine pH - 5 g/litr (Champlain Industry, Clifton, NJ); CaCO₃ - 2 g/litr; 2 x bcfa („bcfa oznacza kwasy tłuszczowe o rozgałęzionych łańcuchach), przy czym pożywka zawiera w stężeniu końcowym 50 ppm kwasu 2-(+/-)metylomasłowego; 60 ppm kwasu izomasłowego i 20 ppm kwasu izowalerianowego. Odczyn doprowadzano do pH 7,2 i pożywkę autoklawowano wtemperaturze 121°C w ciągu 25 minut.

PL 194 270 B1

Probówkę wytrząsano pod kątem 17° przy 215 obrotach na minutę w temperaturze 29°C w ciągu 3 dni. Próbkę 2 ml hodowli podstawowej używano do zaszczepiania kolby Erlenmeyera o pojemności 300 ml, zawierającej 25 ml pożywki do wytwarzania produktów, która zawiera: skrobię (rzadką skrobię gotowaną lub KOSO) - 160 g/litr; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) - 10 g/litr;

Ardamine pH - 10 g/litr; K₂HPO₄ - 2 g/litr; MgSO₂₂4H₂O - 2 g/litr; FeSO₂₂7H₂O - 0,02 g/litr; MnCl₂ 0,002 g/litr; ZnSO₂₂7H₂O - 0,002 g/litr; CaCO₃ - 14 g/litr; 2 x bcfa (jak powyżej) oraz kwas cykloheksanokarboksylowy (CHC - przygotowany jako 20% roztwór o pH 7,0) - 800 ppm. Odczyn doprowadzono do pH 6,9, pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut.

Po zaszczepieniu kolbę inkubowano z wytrząsaniem przy 200 obrotach na minutę w temperaturze 29°C w ciągu 12 dni. Po inkubacji z kolby pobierano próbkę o objętości 2 ml, rozcieńczano 8 ml metanolu, mieszano i mieszaninę wirowano przy 1250 x g w ciągu 10 minut w celu osadzenia pozostałości komórek. Supernatant poddawano następnie oznaczaniu stosując kolumnę HPLC Ultrasphere ODS, Beckman (25 cm x 4,6 mm, średnica wewnętrzna), przy szybkości przepływu 0,75 ml/min; i z detekcją przez pomiar absorbancji przy długości fali 240 mm. Fazą ruchomą była mieszanina metanol/woda/acetonitryl w stosunku 86/8,9/5,1.

2.1.8. Izolowanie genów PKS S. avermitilis

Przygotowywano bibliotekę kosmidową chromosomalnego DNA S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) i poddano hybrydyzacji z sondą ketosyntazy (KS), przygotowaną z fragmentu genu syntazy poliketydowej (PKS) Saccharopolyspora erythraea. Szczegółowy opis przygotowania bibliotek kosmidowych można znaleźć w Sambrook i in., 1989, powyżej. Szczegółowy opis przygotowania bibliotek chromosomalnego DNA Streptomyces przedstawiono w Hopwood i in., 1985, powyżej. Klony kosmidowe zawierające regiony hybrydyzujące z ketosyntazą identyfikowano przez hybrydyzację z fragmentem Ndel/Eco47III o długości 2,7 kb w pEX26 (otrzymanym dzięki uprzejmości dr P. Leadlay'a, Cambridge, Wielka Brytania). Około 5 ng pEX26 strawiono stosując Ndel i Eco47III. Mieszaninę reakcyjną nałożono na 0,8% żel agarozowy (SeaPlaque GTG Agarose, FMC BioProducts, Rockland, ME). Fragment NdeI/Eco47III o długości 2,7 kb wycięto po elektroforezie z żelu i DNA odzyskano z żelu stosując GELase™ z EpicentreTechnologies z zastosowaniem Fast Protocol. Fragment Ndel/Eco47Ill o długości 2,7 kb wyznakowano [a-³²P]dCTP (sól tetra(trietyloamonowa) 5'-trifofosforanu deoksycytydyny, [a-³²P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA), stosując BRL Nick Translation System (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) zgodnie z zaleceniami dostawcy. Typową reakcję prowadzono w objętości 0,05 ml. Po dodaniu 5 μl buforu Stop, wyznakowany DNA oddzielano od wolnych nukleotydów stosując kolumnę Quick Spin™ zawierającą Sephadex G-25 (Boehringer Mannheim), zgodnie z zaleceniami dostawcy.

Przez hybrydyzację kolonijną przeszukano około 1800 klonów kosmidowych. Zidentyfikowano dziesięć klonów, które silnie hybrydyzowały z sondą KS z Sacc. erythraea. KolonieE. coli zawierające kosmidowy DNA hodowano w płynnej pożywce LB i z każdej hodowli wyizolowano kosmidowy DNA w zautomatyzowanym aparacie do izolacji DNA AutoGen 540™ stosując program aparatu Cycle 3 zgodnie z zaleceniami producenta. Mapowanie przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych i analiza hybrydyzacyjna przez blotting Southerna wykazały, że pięć klonów zawierało zachodzące na siebie regiony chromosomalne. Genomowąmapę restrykcyjną BamHIS. avermitilis tych pięciu kosmidów (czyli pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) skonstruowano metodą analizy zachodzących na siebie kosmidów i hybrydyzacje (fig. 4).

2.1.9. Identyfikacja DNA modulującego stosunek awermektyn B2:B1 oraz identyfikacja otwartej ramki odczytuAveC

Następujące metody zastosowano do testowania zsubklonowanych fragmentów pochodzących z klonu kosmidowego pSE66 pod kątem ich zdolności do modulowania stosunku awermektyn B2:B1 w mutantach AveC. pSE66 (5 pg) strawiono SacI i BamHI. Mieszaninę reakcyjną nałożono na 0,8% żel agarozowy (SeaPlaque™ GTG Agarose, FMC BioProducts), po elektroforezie z żelu wycięto fragment SacI/BamHI o długości 2,9 kb i DNA odzyskano z żelu stosując GELase™ (Epicentre Technologies) z zastosowaniem Fast Protocol. Około 5 μg wektora wahadłowego pWHM3 (Vara i in., 1989, J. Bacteriol. 171: 5872-5881) strawiono SacI i BamHI. Zmieszano ze sobą około 0,5 μg wstawki o długości 2,9 kb i 0,5 μg strawionego wektora pWHM3 i inkubowano przez noc z 1 jednostką ligazy (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) w temperaturze 15°C, w całkowitej objętości 20 pi, zgodnie z zaleceniami dostawcy. Po inkubacji, 5 pl mieszaniny ligacyjnej inkubowano w temperaturze 70°C wciągu 10 minut, ochłodzono do temperatury pokojowej i zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a (BRL) zgodnie z zaleceniami dostawcy. Plazmidowy DNA izolowano

PL 194 270 B1 z transformantów opornych na ampicylinę, a obecność wstawki SacI/BamHI o długości 2,9 kb potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmid ten oznaczono jako pSE119.

Przygotowano protoplasty S. avermitilis szczepu 1100-SC38 (Pfizer, szczep własny) i stransformowano je plazmidem pSE119, jak opisano powyżej w przykładzie 2.1.5. Szczep 1100-SC38 jest mutantem, który wytwarza znacząco więcej postaci cykloheksylo-B2 awermektyny w porównaniu z awermektyną w postaci cykloheksylo-B1, jeśli dodaje się kwas cykloheksanokarboksylowy (B2:B1 około 30:1). pSE119 zastosowany do transformowania protoplastów S, avermitilis izolowano albo ze szczepu E. coli GM2163 (otrzymanego od dr B. J. Bachmanna, kuratora, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), ze szczepu E. coli DM1 (BRL) lub ze szczepu S. lividans TK64. Wyizolowano transformanty szczepu 1100-SC38 oporne na tiostrepton, a produkty fermentacji analizowano metodą HPLC. Transformanty szczepu S. avermitilis 1100-SC38 zawierające pSE119 wytwarzały zmieniony stosunek awermektyn cykloheksylo-B2: cykloheksylo-B1, wynoszący około 3,7:1 (tabela 2).

Po ustaleniu, że pSE119 jest zdolny do modulowania stosunków awermektyn B2:B1 w mutancie AveC, zsekwencjonowano wstawkę DNA. Wyizolowano około 10 μg pSE119 stosując zestaw do izolacji plazmidowego DNA (Qiagen, Valencia, CA) zgodnie z zaleceniami producenta, i zsekwencjonowano go stosując zautomatyzowany sekwenator DNA ABI 373A (Perkin Elmer, Foster City, CA). Dane uzyskane z sekwencjonowania poddano łączeniu i edycji stosując programy Genetic Computer Group (GCG, Madison, WI). Sekwencje DNA i otwartej ramki odczytu AveC przedstawiono na fig. 1 (SEQID NO: 1).

Nowy plazmid, oznaczony jako pSE118, skonstruowano w nastepujący sposób. Około 5 μg pSE66 strawiono Sphl i BamHI. Mieszaninę reakcyjną nałożono na 0,8% żel agarozowy (SeaPlaque GTG, FMC BioProducts), po elektroforezie z żelu wycięto fragment Sphl/BamHI o długości 2,8 Kb, a DNA odzyskano z żelu stosując GELase™ (Epicentre Technologies) z zastosowaniem Fast Protocol. Około 5 μg wahadłowego wektora pWHM3 strawiono Sphl i BamHI. Zmieszano ze sobą około 0,5 μg wstawki o długości 2,8 kb i około 0,5 μg strawionego wektora pWHM3 i inkubowano przez noc z 1 jednostką ligazy (New England Biolabs) w temperaturze 15°C w objętości całkowitej 20 pl, zgodnie z zaleceniami dostawcy. Po inkubacji, 5 pl mieszaniny ligacyjnej inkubowano w temperaturze 70°C wciągu 10 minut, ochłodzono do temperatury pokojowej i zastosowano do transformacji kompetentnych komórek E. coli DH5a, zgodnie z zaleceniami producenta. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność wstawki Sphl/BamHI o długości 2,8 kb potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmid ten oznaczono pSE118. DNA wstawek pSE118 i pSE119 zachodzą na siebie na długości około 838 nukleotydów (fig. 4).

Protoplasty szczepu S. avermitilis 1100-SC38 stransformowano pSE118 jak powyżej. Wyizolowano transformanty oporne na tiostrepton, a produkty fermentacji analizowano metodą HPLC. Transformanty szczepu S. avermitilis 1100-SC38 zawierające pSE118 nie powodowały zmian stosunków awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 w porównaniu ze szczepem 1100-SC38 (tabela 2).

2.1.10. Amplifikacja przez PCR genu AveCz chromosomalnego DNA S. avermitilis

Fragment o długości około 1,2 Kb, zawierający otwartą ramkę odczytu AveC wyizolowano z chromosomalnego DNA S. avermitilis przez amplifikację PCR, stosując startery zaprojektowane na podstawie otrzymanej powyżej sekwencji nukleotydowej AveC. Startery do PCR otrzymano z Genosys Biotechnologies, Inc. (Teksas). Starter prawy to 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO: 6), a Starter lewy to 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO: 7). Reakcję PCR przeprowadzano stosując polimerazę Deep Vent™ (New England Biolabs) w buforze dostarczonym przez producenta, i w obecności 300 pM dNTP, 10% glicerolu, 200 pmoli każdego ze starterów, 0,1 pg matrycy oraz 2,5 jednostek enzymu w objętości końcowej 100 pl, stosując aparat do cyklicznych zmian temperatury Perkin Elmer Cetus. Profil termiczny pierwszego cyklu to temperatura 95°C w ciągu 5 minut (etap denaturacji), temperatura 60°C w ciągu 2 minut (etap hybrydyzacji) oraz temperatura 72°C (etap wydłużania). Kolejne 24 cykle posiadały podobny profil termiczny z tym wyjątkiem, że etap denaturacji skrócono do 45 sekund, aetap hybrydyzacji skrócono do 1minuty.

Produkt PCR poddawano elektroforezie w 1% żelu agarozowym i wykryto pojedynczy prążek DNA o długości około 1,2 Kb. DNA ten oczyszczono z żelu i poddano ligacji z 25 ng przeprowadzonego w postać liniową wektora pCR-Blunt (Invitrogen) o tępych końcach w stosunku molowym wektora do wstawki 1:10, zgodnie z zaleceniami producenta. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli One Shot^TM (Invitrogen) zgodnie z zaleceniami producenta. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność wstawki o długości około 1,2 kb potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmid ten oznaczono pSE179.

PL 194 270 B1

W wyniku strawienia BamHI/XbaI, z pSE179 wyizolowano wstawkę DNA, oddzielono ją drogą elektroforezy, oczyszczono z żelu, zligowano z wahadłowym wektorem pWHM3, który także strawiono

BamHI/Xbal, przy całkowitym stężeniu DNA 1 μg i stosunku molowym wektora do wstawki 1:5. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a zgodnie zzaleceniami producenta. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność wstawki o długości około 1,2 kb potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej. Plazmidem tym, który oznaczono jako pSE186 (fig. 2, ATCC 209604), stransformowano E. coli DM1 , i ztransformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA.

2.2. Wyniki

Zidentyfikowano fragment SacI/BamHI o długości 2,9 kb z plazmidu pSE119, który, po transformowaniu nim szczepu S. avermitilis 1100-SC38, powodował znaczącą zmianę stosunku wytwarzania awermektyn B2:B1. Normalnie szczep S. avermitilis 1100-SC38 wytwarza awermektyny B2:B1 wstosunku około 30:1, ale po stransformowaniu go wektorem zawierającym fragment SacI/BamHI o długości 2,9 Kb, stosunek awermektyn B2:B1 obniżył się do 3,7:1. Pofermentacyjna analiza hodowli transformantów potwierdziła obecność transformującego DNA.

Fragment pSE119 o długości 2,9 kb zsekwencjonowano i zidentyfikowano otwartą ramkę odczytu o długości około 0,9 kb (fig. 1; SEQID NO: 1), która obejmuje fragment Pstl/Sphl, który został uprzednio zmutowany przez innych w celu wytwarzania jedynie produktów B2 (Ikeda i in., 1995, powyżej). Porównanie tej otwartej ramki odczytu, lub odpowiadającego jej przewidywanego polipeptydu, ze znanymi bazami danych (GenEMBL, SWISS-PROT) nie wykazało żadnej wysokiej homologii ze znanymi sekwencjami DNA lub białkowymi.

Tabela 2 przedstawia analizę fermentacyjną szczepu S. avermitilis 1100-SC38 transformowanego różnymi plazmidami.

Tabela 2

Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący)	Liczba testowanych transformantów	Średni stosunek B2:B1
1100-SC38(brak)	9	30,66
1100-SC38(pWHM3)	21	31,3
1100-SC38(pSE119)	12	3,7
1100-SC38(pSE118)	12	30,4
1100-SC38(pSE185)	14	27,9

Przykład 3. Konstruowanie mutantówAveCS. avermitilis

Przykład ten dotyczy konstruowania kilku różnych mutantówAveCS. avermitilis z zastosowaniem opisanych powyżej pożywek i sposobów. Ogólny opis technik wprowadzania mutacji do genu Streptomycesopisano w Kieser iHopwood, 1991, Meth. Enzym. 204: 430-458. Bardziej szczegółowy opis podano w Anzai i in., 1988, J. Antibiot. XLI(2): 226-233 oraz Stutzman-Engwall i in., 1992, J. Bacteriol. 174(1): 144-154.

3.1. Inaktywacja genuAveCS. avermitilis

Mutanty AveC zawierające zinaktywowane genyAveCskonstruowano stosując kilka metod, jak wyszczególniono poniżej.

W pierwszej metodzie, fragment Sphl/Pstl o długości 640 bp, znajdujący się w obrębie genu AveCw pSE119 (plazmidzie opisanym powyżej w przykładzie 2.1.9.) zastąpiono genem ermE (oporności na erytromycynę) z Sacc. erythraea. Gen ermE wyizolowano z pIJ4026 (dostarczonego przez John Innes Institute, Norwich, Wielka Brytania; patrz także Bibb i in., 1985, Gene 41: 357-368) przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Bglll i EcoRI, a następnie po elektroforezie fragment oczyszczono z żelu. Ten fragment, o długości około 1,7 Kb, zligowano z pGEM7Zf (Promega), który strawiono BamHl i EcoRI, a mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coliDH5a, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność wstawki o długości około 1,7 kb potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej. Plazmid ten oznaczono pSE27.

pSE118(opisany powyżej w przykładzie 2.1.9.) strawiono Sphl i BamHI, mieszaninę produktów trawienia poddano elektroforezie, i wstawkę Sphl/BamHl o długości około 2,8 kb oczyszczono z żelu. pSE119 strawiono Pstl i EcoRI, mieszaninę produktów trawienia poddawano elektroforezie, a wstawkę

PL 194 270 B1

Pstl/EcoRI o długości około 1,5 kb oczyszczano z żelu. Wektor wahadłowy pWHM3strawiono BamHI iEcoRI. pSE27 strawiono Pstl i Sphl, mieszaninę produktów trawienia poddawano elektroforezie, awstawkę Pstl/Sphl o długości około 1,7 kb oczyszczano z żelu. Wszystkie cztery fragmenty (tzn. o długościach około 2,8 Kb, około 1,5 Kb, około 7,2 kb oraz około 1,7 Kb) zligowano razem wczterostronnej ligacji. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a zgodnie zzaleceniami producenta. Plazmidowy DNA wyizolowano z transformantów opornych na ampicylinę, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmid ten oznaczono pSE180 (fig. 3, ATCC 209605).

pSE180 transformowano S. lividans TK64, a transformowane kolonie zidentyfikowano na podstawie oporności na tiostrepton i erytromycynę. pSE180 izolowano z S. lividans i zastosowano do transformowania protoplastów S. avermitilis. Zidentyfikowano cztery oporne na tiostrepton transformanty S. avermitilis, przygotowano protoplasty i wysiano je w warunkach braku selekcji na pożywkę RM14. Po zregenerowaniu protoplastów, pojedyncze kolonie przeszukiwano pod kątem oporności na erytromycynę i braku oporności na tiostrepton, wskazujących na chromosomalną integrację zinaktywowanego genu AveC i utratę wolnego replikonu. Zidentyfikowano jeden transformant Erm^r Thio^s ioznaczono go jako szczep SE180-11. Ze szczepu SE180-11 wyizolowano całkowity DNA chromosomalny, strawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI, Hindlll, Pstl lub Sphl, produkty trawienia rozdzielano w 0,8% żelu agarozowym, przeniesiono na membrany nylonowe i hybrydyzowano z sondą ermE. Analizy te wykazały, że dzięki podwójnemu zdarzeniu „crossover nastąpiła chromosomalnaintegracja genu oporności ermE,z jednoczesną delecją fragmentu Pstl/Sphl o długości 640 bp. Analiza produktów fermentacji szczepu SE180-11 metodą HPLC wykazała, że normalne awermektyny nie były już wytwarzane (fig. 5A).

W drugiej metodzie inaktywowania genuAveC, gen ermE o długości około 1,7 kb usuwano z chromosomu szczepu SE180-11 S. avermitilis, pozostawiając w genie AveC delecję Pstl/Sphl o długości 640 bp. Plazmid do zastępowania genu skonstruowano w następujący sposób: pSE180 częściowo strawiono Xbal i fragment o długości około 11,4 kb oczyszczono z żelu. Prążek o długości 11,4 kb nie zawiera genu oporności ermE o długości 1,7 kb. DNA następnie zligowano i transformowano komórki E. coliDH5a. Plazmidowy DNA wyizolowano z transformantów opornych na ampicylinę, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmidem tym, który oznaczono pSE184, stransformowano komórki E. coli DM1 i plazmidowy DNA wyizolowano z transformantów opornych na ampicylinę. Plazmid ten zastosowano do transformowania protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Z opornych na tiostrepton transformantów szczepu SE180-11 przygotowywano protoplasty i wysiano je jako pojedyncze kolonie na pożywkę RM14. Po regeneracji protoplastów, pojedyncze kolonie selekcjonowano pod kątem braku oporności zarówno na erytromycynę, jak i na tiostrepton, co wskazuje na chromosomalną integrację zinaktywowanego genuAveCi utratę wolnych replikonów zawierających gen ermE. Zidentyfikowano jeden transformant Erm^s Thio^s i oznaczono go SE184-1-13. Analiza fermentacyjna SE184-1-13 wykazała, że normalne awermektyny nie były wytwarzane i że SE184-1-13 posiadał taki sam profil fermentacji, jak SE180-11.

W trzeciej metodzie inaktywowania genuAveC, wprowadzano zmianę ramki odczytu w chromosomalnym genieAveCprzez dodanie dwóch zasad G po zasadzie C w pozycji nukleotydu 471, stosując PCR, tworząc w ten sposób miejsce BspE1. Obecność wprowadzonego miejsca BspE1była użyteczna do detekcji zjawiska zamiany genu. Zaprojektowano startery do PCR do wprowadzenia mutacji zmiany ramki odczytu genu AveC, które zostały dostarczone przez Genosys Biotechnologies, Inc. Prawy starter to 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID NO: 8), a lewy starter to 5'-AACT-CCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 9). Warunki prowadzenia PCR były takie same, jak opisane powyżej w przykładzie 2.1.10. Produkt PCR o długości 666 bp strawiono Sphl dla uzyskania dwóch fragmentów o długościach, odpowiednio, 278 bp i 388 bp. Fragment o długości 388 bp oczyszczano z żelu.

Plazmid do zastępowania genu skonstruowano w następujący sposób: wektor wahadłowy pWHM3 strawiono EcoRl i BamHI. pSE119 strawiono BamHl i Sphl, mieszaninę produktów trawienia poddano elektroforezie i z żelu oczyszczano fragment o długości około 840 bp. pSE119 strawiono EcoRl i Xmnl, mieszaninę produktów trawienia rozdzielono drogą elektroforezy i fragment o długości około 1,7 kb oczyszczano z żelu. Wszystkie cztery fragmenty (czyli o długościach około 7,2 Kb, około 840 bp, około 1,7 kb i 388 bp) zligowano ze sobą w czterostronnej ligacji. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej i analizy sekwencji DNA. Plazmidem tym, który oznaczono jako pSE185, stransformowano E. coli DM1

PL 194 270 B1 i z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA. Plazmid ten zastosowano do transformowania protoplastów szczepu 1100-SC38 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu 1100-SC38 i metodą HPLC analizowano produkty fermentacji. pSE185 nie zmieniał znacząco stosunku awermektyn B2:B1 po stransformowaniu nim szczepu 1100-SC38 S. avermitilis (tabela 2).

pSE185 zastosowano do transformowania protoplastów S. avermitilis w celu wytworzenia mutacji zmiany ramki odczytu w chromosomalnym genie AveC. Protoplasty przygotowano z transformantów opornych na tiostrepton i wysiano jako pojedyncze kolonie na pożywkę RM14. Po regeneracji protoplastów, pojedyncze kolonie przeszukiwano pod kątem braku oporności na tiostrepton. Wyizolowano chromosomalny DNA z kolonii wrażliwych na tiostrepton i przeszukiwano metodą PCR pod kątem obecności mutacji zmiany ramki odczytu zintegrowanej z chromosomem. Zaprojektowano startery do PCR w oparciu o sekwencje nukleotydową AveC, które zostały dostarczone przez Genosys Biotechnologies, Inc. (Teksas). Starter prawy to 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO: 10), starter lewy to 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO: 11), a warunki PCR były takie, jak opisano powyżej w przykładzie 2.1.10. Otrzymany produkt PCR miał długość 543 bp, a po strawieniu BspE1 obserwowano powstawanie trzech fragmentów o długościach 368 bp, 96 bp i 79 bp, co wskazuje na chromosomalną integrację zinaktywowanego genu AveCi utratę wolnego replikonu.

Analiza fermentacyjna mutantów S. avermitilis zawierających mutację zmiany ramki odczytu wykazała, ze normalne awermektyny nie były dłużej wytwarzane oraz że mutanty te posiadały taki sam profil HPLC, jak szczepy SE180-11 i SE184-1-13. Zidentyfikowano jeden transformant Thio^s i oznaczono go jako szczep SE185-5a.

Dodatkowo, utworzono mutację w genie AveC, która zmienia nukleotyd w pozycji 520 z G na A, czego wynikiem jest zmiana kodonu kodującego tryptofan (W) w pozycji 116 na kodon terminacji. Szczep S. avermitilis z tą mutacją nie wytwarzał normalnych awermektyn i posiadał taki sam profil fermentacji, jak szczepy SE180-11, SE184-1-13 i SE185-5a.

Dodatkowo, utworzono mutacje w genie AveC, które zmieniają zarówno (i) nukleotyd w pozycji 970 z G na A, co zmienia aminokwas w pozycji 256 z glicyny (G) na asparaginian (D), jak i (ii) nukleotyd w pozycji 996 z T na C, co zmienia aminokwas w pozycji 275 z tyrozyny (Y) na histydynę (H). Szczep S. avermitilis z tymi mutacjami (G256D/Y275H) nie wytwarzał normalnych awermektyn i posiadał taki sam profil fermentacji, jak szczepy SE180-11, SE184-1-13 i SE185-5a.

Szczepy mutantów z inaktywacjami genu AveC S. avermitilis, SE180-11, SE184-1-13 i SE1855a, oraz inne szczepy zgodne z wynalazkiem zapewniają narzędzia do przeszukiwania dla oceny wpływu innych mutacji w genie AveC. pSE186, który zawiera kopię genu AveC typu dzikiego, stransformowano komórki E. coli DM1 i z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA. Ten DNA pSE186 zastosowano do transformowania protoplastów szczepu S. avermitilis SE18011. Wyizolowano transformanty szczepu SE180-11 oporne na tiostrepton, określano obecność oporności na erytromycynę, i transformanty Thio^r Erm^r analizowano na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC. Obecność funkcjonalnego genu AveC in trans była zdolna do przywrócenia normalnego wytwarzania awermektyn szczepowi SE180-11 (fig. 5b).

3.2. Analiza mutacji genu AveC, które zmieniają stosunek klas B2:B1

Jak opisano powyżej, szczep S. avermitilis SE180-11 zawierający nieaktywny gen AveC komplementowano przez transformację plazmidem zawierającym funkcjonalny gen AveC (pSE186). Szczep SE180-11 stosowano także jako szczep gospodarza dla scharakteryzowania innych mutacji w genie AveC, jak opisano poniżej.

DNA chromosomalny wyizolowano ze szczepu 1100-SC38 i zastosowano jako matrycę do amplifikacji genu AveC przez PCR. Wyizolowano otwartą ramkę odczytu o długości 1,2 kb przez amplifikacje PCR z zastosowaniem starterów zaprojektowanych na podstawie sekwencji nukleotydowej AveC. Starterem prawym była sekwencja przedstawiona w SEQ ID NO: 6, a starterem lewym była sekwencja przedstawiona w SEQ ID NO: 7 (patrz przykład 2.1.10 powyżej). Warunki PCR i subklonowania były takie, jak opisano w przykładzie 2.1.10. Analiza sekwencji DNA otwartej ramki odczytu o długości 1,2 kb wykazuje mutację w genie AveC, która zmienia nukleotyd w pozycji 337 z C do T, co zmienia aminokwas w pozycji 55 z seryny (S) na fenyloalaninę (F). Gen AveC zawierający mutację S55F zsubklonowano w pWHM3 w celu utworzenia plazmidu, który oznaczono jako pSE187 i który zastosowano do stransformowania protoplastów S. avermitilis szczepu SE180-11. Wyizolowano transformanty szczepu SE180-11 oporne na tiostrepton, potwierdzono obecność oporności na erytromycynę i transformanty Thio^r Erm^r analizowano na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC.

PL 194 270 B1

Obecność genuAveCkodującego zmianę reszty aminokwasowej 55 (S55F) była w stanie przywrócić szczepowi SE180-11 zdolność wytwarzania normalnych awermektyn (fig. 5C); jednakże, stosunek cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 wynosił około 26:1; w porównaniu ze szczepem SE180-11 stransformowanym pSE186, w którym stosunek B2:B1 wynosił około 1,6:1 (tabela 3), co wskazuje, że pojedyncza mutacja (S55F) moduluje ilość wytwarzanych cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1 .

Zidentyfikowano inną mutację genuAveC, która zmienia nukleotyd w pozycji 862 z G na A, co zmienia aminokwas w pozycji 230 z glicyny (G) na asparaginian (D). Szczep S. avermitilis mający tę mutację (G230D) wytwarzał awermektyny o stosunku B2:B1 około 30:1.

3.3. Mutacje, które obniżają stosunek B2:B1

W poniższy sposób skonstruowano kilka mutacji, które obniżają ilość wytwarzanej cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1.

Zidentyfikowano mutację w genie AveC, która zmienia nukleotydw pozycji 588 z G do A, co zmienia aminokwas w pozycji 139 z alaniny (A) na treoninę (T). Gen AveC zawierający mutację A139T zsubklonowano w pWHM3 w celu utworzenia plazmidu, który oznaczono jako pSE188, i który zastosowano do transformowania protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11, potwierdzano obecność oporności na erytromycynę, itransformanty Thio^r Erm^r analizowano na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC. Obecność zmutowanego genuAveCkodującego zmianę w pozycji aminokwasowej 139 (A139T) była zdolna do przywracania wytwarzania awermektyn przez szczep SE180-11 (fig. 5D), jednakże, stosunek B2:B1 wynosił około 0,94:1, co wskazuje, że mutacja ta obniża ilość wytwarzanej awermektyny cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1. Wynik ten był nieoczekiwany, gdyż opublikowane wyniki, jak również wyniki mutacji opisanych powyżej, wykazywały tylko inaktywację genu AveClub zwiększone wytwarzanie postaci B2 awermektyny w stosunku do postaci B1(tabela 3).

Ponieważ mutacja A139T zmieniała stosunki B2:B1 w bardziej korzystnym kierunku B1, skonstruowano mutację, która kodowała treoninę zamiast seryny w pozycji aminokwasowej 138. Zatem pSE186 strawiono EcoRl i sklonowano w wektorzepGEM3Zf (Promega), który strawiono EcoRl. Plazmid ten, który oznaczono jako pSE186a, strawiono Apal i Kpnl, fragmenty DNA rozdzielono w żelu agarozowym i dwa fragmenty o długościach około 3,8 kb i około 0,4 kb oczyszczano z żelu. Wstawkę o długości 1,2 kbz pSE186 zastosowano jako matrycę w PCR w celu wprowadzenia zmiany pojedynczej zasady w pozycji nukleotydowej 585. Zaprojektowano startery do wprowadzenia mutacji w pozycji nukleotydowej 585, które zostały dostarczone przez Genosys Biotechnologies, Inc. (Teksas). Starter prawy do PCR to 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID NO: 12); starter lewy do PCR to: 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID NO: 13). Reakcję PCR prowadzono stosując zestaw Advantage GC genomic PCR kit (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) w buforze dostarczonym przez producenta w obecności 200 μM dNTP, 200 pmoli każdego ze starterów, 50 ng matrycowego DNA, 1,0 M GC-Melt i 1jednostki KlenTaq Polymerase Mix w objętości końcowej 50 pi. Profil termiczny pierwszego cyklu to temperatura 94°C w ciągu 1 minuty, po którym następowało 25 cykli z temperaturą 94°C w ciągu 30 sekund i temperaturą 68°C w ciągu 2 minut; oraz 1cykl w temperaturze 68°C w ciągu 3 minut. Produkt PCR o długości 295 bp strawiono Apal i Kpnl wcelu uwolnienia fragmentu o długości 254 bp, który rozdzielano drogą elektroforezy i oczyszczono zżelu. Wszystkie trzy fragmenty (o długościach około 3,8 kb, około 0,4 kb oraz 254 bp) zligowano razem w trójstronnej ligacji. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmid ten oznaczono jako pSE198.

pSE198 strawiono EcoRl, sklonowano w pWHM3, który strawiono EcoRl, i transformowano komórkiE. coliDH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej i analizy sekwencji DNA. Tym plazmidowym DNA transformowano E. coli DM1, plazmidowy DNA wyizolowano ztransformantów opornych na ampicylinę, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmid ten, oznaczony jako pSE199, zastosowano do stransformowania protoplastów S. avermitilis szczepu SE180-11. Wyizolowano transformanty szczepu SE180-11 oporne na tiostrepton, określono obecność oporności na erytromycynę, a transformanty Thio^r Erm^r analizowano na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC. Obecność zmutowanego genu kodującego zmianę w reszcie aminokwasowej 138 (S138T) była zdolna do przywrócenia wytwarzania normalnych awermektyn przez szczep SE180-11; jednakże, stosunek B2:B1 wynosił 0,88:1, co wskazuje, że mutacja ta obniża ilość wytwarzanej cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1(tabela 3). Ten stosunek B2:B1 jest

PL 194 270 B1 nawet niższy, niż 0,94:1 obserwowany dla mutacji A139T utworzonej przez transformacje szczepu

SE180-11 plazmidem pSE188, jak opisano powyżej.

Inną mutację skonstruowano w celu wprowadzenia treoniny zarówno w pozycji 138, jak i 139. DNA wstawki z pSE186 o długości około 1,2 kb zastosowano jako matrycę w PCR. Zaprojektowano startery do PCR w celu wprowadzenia mutacji w pozycjach nukleotydowych 585 i 588, które zostały dostarczone przez Genosys Biotechnologies, Inc. (Teksas). Starter prawy do PCR to 5'-GGGGGCGG-GCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQID NO: 14), a starter lewy do PCR to 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). Reakcję PCR przeprowadzano stosując warunki opisane bezpośrednio powyżej w tej części. Produkt PCR o długości 449 bp strawiono Apal i Kpnl w celu uwolnienia fragmentu o długości 254 bp, który rozdzielano przez elektroforezę i oczyszczano z żelu pSE186a strawiono Apal i Kpnl, fragmenty DNA rozdzielano w żelu agarozowym, i dwa fragmenty o długościach około 3,8 kb i około 0,4 kb oczyszczano z żelu. Wszystkie trzy fragmenty (o długościach około 3,8 kb, około 0,4 kb oraz 254 bp) zligowano razem w trójstronnej ligacji i mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmid ten oznaczono jako pSE230.

Plazmid pSE230 strawiono EcoRI, sklonowano w pWHM3, który strawiono EcoRI, i transformowano komórki E. coliDH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej i analizy sekwencji DNA. Tym plazmidowym DNA stransformowano E. coli DM1, z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmid ten, oznaczony pSE231, zastosowano do transformowania protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano transformanty szczepu SE180-11 oporne na tiostrepton, określano obecność oporności na erytromycynę, a transformanty Thio^r Erm^r analizowano przez fermentację. Obecność podwójnie zmutowanego genu AveC, kodującego S138T/A139T, była zdolna przywrócić szczepowi SE180-11 normalne wytwarzanie awermektyn; jednakże, stosunek B2:B1 wynosił 0,84:1, co wykazuje, że ta mutacja dodatkowo zmniejsza ilość wytwarzanej cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1 (tabela 3), w większym stopniu, niż zmniejszanie zapewnione przez transformację szczepu SE180-11 pSE188 lub pSE199, jak opisano powyżej.

Tabela 3

Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący)	Liczba testowanych transformantów	Względne stężenie B2	Względne stężenie B1	Średni stosunek B2:B1
SE180-11 (brak)	30	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	30	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	26	222	140	1,59
SE180-11 (pSE187)	12	283	11	26,3
SE180-11 (pSE188)	24	193	206	0,94
SE180-11 (pSE199)	18	155	171	0,88
SE180-11 (pSE231)	6	259	309	0,84

Wyniki te po raz pierwszy wykazują specyficzne mutacje w genieAveC, których wynikiem są zwiększone poziomy bardziej handlowo pożądanych awermektyn klasy 1w stosunku do awermektyn klasy 2.

Przykład 4. Konstruowanie mutantów z delecją końca 5'

Jak wyjaśniono w opisie powyżej, w części dotyczącej cząsteczek polinukleotydowych kodujących produkt genuAveCS. avermitilis, sekwencja nukleotydowa S. avermitilis, przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), zawiera cztery różne kodony GTG w pozycjach 42, 174, 177 i 180, które są potencjalnymi miejsca początku transkrypcji. W tej części opisano konstruowanie wielokrotnej delecji wregionie końca 5' otwartej ramki odczytu AveC (fig. 1; SEQID NO: 1), aby pomóc w zdefiniowaniu, które z tych kodonów mogą działać jako miejsca początku ekspresji białka w otwartej ramce odczytuAveC.

PL 194 270 B1

Fragmenty genuAveCz, w różny sposób wydeletowanym końcem 5' wyizolowano z chromosomalnego DNA S. avermitilis metodą amplifikacji PCR. Zaprojektowano startery do PCR w oparciu osekwencję DNA genuAveC, które zostały dostarczone przez Genosys Biotechnologies, Inc. Startery prawe to

5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3' (SEQID NO: 16) (D1F1);

5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID NO: 17) (D1F2);

5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQID NO: 18) (D1F3) oraz

5'-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEQID NO: 19) (D2F2).

Startery lewe to 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEQ ID NO: 20);

5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID NO: 21) oraz

5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID NO: 22).

Reakcję PCR prowadzano w sposób opisany w przykładzie 2.3 powyżej.

Produkty reakcji PCR rozdzielano drogą elektroforezy w 1% żelu agarozowym i wykrywano pojedyncze prążki DNA o wielkości albo około 1,0 Kb, albo około 1,1 Kb. Produkty PCR oczyszczano zżelu i ligowano z 25 ng przeprowadzonego w postać liniową wektora pCR2.1 (Invitrogen) w stosunku molowym wektora do wstawki 1:10, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Mieszaninę ligacyjną stosowano do transformowania komórek E. coli One Shot™ Competent (Invitrogen), zgodnie zzaleceniami producenta. Z transformantów opornych na ampicylinę izolowano plazmidowy DNA, a obecność wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej i analizy sekwencji DNA. Plazmidy te oznaczono jako pSE190 (otrzymany ze starterem D1F1), pSE191 (otrzymany ze starterem D1F2), pSE192 (otrzymany ze starterem D1F3) oraz pSE193 (otrzymany ze starterem D2F2).

Każdy z DNA wstawek strawiono BamHI/XbaI, rozdzielano przez elektroforezę, oczyszczono zżelu i oddzielnie zligowano z wektorem wahadłowym pWHM3, który strawiono BamHI/XbaI, przy całkowitym stężeniu DNA 1pg i stosunku wektora do wstawki 1:5. Mieszaniny ligacyjne zastosowano do transformowania kompetentnych komórekE. coli DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność wstawki potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej. Każdym z tych plazmidów, które oznaczono jako pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3) oraz pSE197 (D2F2), oddzielnie stransformowano szczep E. coli DM1, z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwych wstawek potwierdzono metodą analizy restrykcyjnej. Ten DNA zastosowano do transformowania protoplastów S. avermitilis szczepu SE180-11. Wyizolowano transformanty szczepu SE180-11 oporne na tiostrepton, określono obecność oporności na erytromycynę i transformanty Thio^r Erm^r analizowano na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC dla określenia, które z miejsc GTG były konieczne do ekspresji genu AveC. Wyniki wskazują, że można wyeliminować kodon w pozycji 42 bez wpływu na ekspresje genu AveC, ponieważ pSE194, pSE195 i pSE196, z których każdy pozbawiony był miejsca GTG w pozycji 42, ale z których wszystkie zawierały trzy miejsca GTG w pozycjach 174, 177 i 180, zdolne były do przywrócenia normalnego wytwarzania awermektyn przez stransformowany nimi szczep SE180-11. Normalne wytwarzanie awermektyn nie było przywracane, jeśli szczep SE180-11 stransformowano pSE197, który nie posiadał wszystkich czterech miejsc GTG (tabela 4).

Tabel a 4

Szczep S. awermitilis (plazmid transformujący)	Liczba testowanych transformantów	Względne stężenie B2	Względne stężenie B1	Średni stosunek B2:B1
SE180-11 (brak)	6	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	6	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	6	241	152	1,58
SE180-11 (pSE194)	6	35	15	2,43
SE180-11 (pSE195)	6	74	38	1,97
SE180-11 (pSE196)	6	328	208	1,58
SE180-11 (pSE197)	12	0	0	0

PL 194 270 B1

Przykład 5. Klonowanie homologów genu AveC z S. hygroscopicus i S. griseochromogenes

Niniejszy wynalazek umożliwia identyfikowanie i klonowanie genów homologów AveC z innych, wytwarzających awemektyny lub milbemycyny, gatunków Streptomyces. Przykładowo, kosmidową bibliotekę genomowego DNA S. hygroscopicus (FERM BP-1901) hybrydyzowano z opisaną powyżej sondą AveC S. avermitilis o długości 1,2 Kb. Zidentyfikowano kilka silnie hybrydyzujących klonów kosmidowych. Z kosmidów tych wyizolowano chromosomalny DNA i zidentyfikowano fragment KpnI o długości 4,9 Kb, który hybrydyzował z sondą AveC. Zsekwencjonowano ten DNA i zidentyfikowano otwartą ramkę odczytu (SEQ ID NO: 3) mającą znaczącą homologię do otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis. Sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 4) przewidzianą na podstawie otwartej ramki odczytu homologu AveC S. hygroscopicus przedstawiono na fig. 6.

Ponadto, bibliotekę kosmidową genomowego DNA S. griseochromogenes poddano hybrydyzacji z opisaną powyżej sondą AveC o długości 1,2 kb z S. avermitilis. Zidentyfikowano kilka silnie hybrydyzujących klonów kosmidowych. Z kosmidów tych wyizolowano chromosomalny DNA i zidentyfikowano fragment Pstl o długości 5,4 Kb, który hybrydyzował z sondą AveC. Zsekwencjonowano ten DNA i zidentyfikowano część otwartej ramki odczytu mającą znaczącą homologię do otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis. Przewidywaną częściową sekwencję aminokwasową (SEQ ID NO: 5) przedstawiono na fig. 6.

Analiza sekwencji DNA i sekwencji aminokwasowej homologów AveC z S. hygroscopicus i S. griseochromogenes wskazuje, że regiony te posiadają znaczącą homologię (około 50% identyczności na poziomie aminokwasowym) zarówno do siebie wzajemnie, jak i do otwartej ramki odczytu AveC oraz produktu genu AveC S. avermitilis (fig. 6).

P r zyk ł a d 6. Konstruowanie plazmidu zawierającego gen AveC za promotorem ermE.

Otwartą ramkę odczytu AveC o długości 1,2 kb z pSE186 zsubklonowano w pSE34, który jest wektorem wahadłowym pWHM3 mającym promotor ermE o długości 300 bp wstawiony w postaci fragmentu KpnI/BamHI w miejscu KpnI/BamHI pWHM3 (patrz Ward i in., 1986, Mol. Gen. Genet. 203: 468-478). pSE186 strawiono BamHI i Hindlll, mieszaninę produktów trawienia rozdzielono drogą elektroforezy i fragment o długości 1,2 kb wyizolowano z żelu agarozowego i zligowano z wektorem pSE34, który strawiono BamHl/HindlIl. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a zgodnie z zaleceniami producenta. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność wstawki o długości 1,2 kb potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej. Plazmidem tym, który oznaczono jako pSE189, stransformowano E. coli DM1 i z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA. Plazmidem pSE189 stransformowano protoplasty S. avermitilis szczepu 1100-SC38. Wyizolowano transformanty szczepu 1100-SC38 oporne na tiostrepton i analizowano na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC.

Transformanty szczepu S. avermitilis 1100-SC38 zawierające pSE189 były zmienione pod względem stosunków wytwarzanych awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 (około 3:1) wobec szczepu 1100-SC38 (około 34:1), a całkowita ilość wytwarzanych awermektyn wzrosła około 2,4krotnie w stosunku do szczepu 1100-SC38 transformowanego pSE119 (tabela 5).

pSE189 stransformowano także protoplasty szczepu S. avermitilis typu dzikiego. Wyizolowano transformanty oporne na tiostrepton i analizowano na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC. Całkowita ilość awermektyn wytwarzanych przez szczep S. avermitilis typu dzikiego stransformowany pSE189 wzrosła około 2,2-krotnie w porównaniu ze szczepem typu dzikiego stransformowanym pSE119 (tabela 5).

T a b el a 5

Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący)	Liczba testowanych transformantów	Względne [B2]	Względne [B1]	Względna całkowita ilość awermektyn	Względny stosunek B2:B1
1100-SC38	6	155	4,8	176	33,9
1100-SC38 (pSE119)	9	239	50,3	357	4,7
1100-SC38 (pSE189)	16	546	166	849	3,3
Typ dziki	6	59	42	113	1,41
Typ dziki (pSE119)	6	248	151	481	1,64
Typ dziki (pSE189)	5	545	345	1071	1,58

PL 194 270 B1

P r z y k ł a d 7. Chimeryczny plazmid zawierający sekwencje zarówno otwartej ramki odczytu

AveCS. avermitilis, ja k i homologu AveCS. hygroscopicus

Plazmid hybrydowy, oznaczony jako pSE350, skonstruowano w taki sposób, aby zawierał część o długości 564 bp homologu AveC S. hygroscopicus zastępującą homologiczny fragment o długości 564 bp otwartej ramki odczytu AveCS. avermitilis (fig. 7). pSE350 skonstruowano wykorzystując miejsce restrykcyjne BsaAI, które jest zachowane w obu sekwencjach (pozycja 225 AveC) i miejsce restrykcyjne Kpnl, które jest obecne w genie AveC S. avermitilis (pozycja 810 AveC). Miejsce Kpnl wprowadzono do DNA S. hygroscopicus metodą PCR, stosując jako starter prawy 5'-CTTCAGGTG-TACGTGTTCG-3' (SEQ ID NO: 23), a jako starter lewy 5'-GAACTGGTACCAGTGCCC-3' (SEQ ID NO: 24) (dostarczone przez Genosys Biotechnologies) i warunki PCR opisane w przykładzie 2.1.10 powyżej. Produkt reakcji PCR strawiono stosując BsaAI i Kpnl, fragmenty rozdzielono drogą elektroforezy w 1% żelu agarozowym i fragment BsaAI/KpnI o długości 564 bp wyizolowano z żelu. pSE179 (opisany w przykładzie 2.1.10 powyżej) strawiono KpnI i Hindlll, fragmenty rozdzielano drogą elektroforezy w 1% żelu agarozowym i fragment o długości około 4,5 kb izolowano z żelu. pSE179 strawiono Hindlll i BsaAI, fragmenty rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym i fragment BsaAI/Hindlll o długości około 0,2 kb wyizolowano z żelu. Fragment Hindlll/KpnI o długości około 4,5 kb, fragment BsaAI/Hindlll o długości około 0,2 kb oraz fragment BsalA/KpnI o długości 564 bp z S. hygroscopicus zligowano razem w trójstronnej ligacji i mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej stosując KpnI i Aval. Plazmid ten strawiono Hindlll i Xbal w celu uwolnienia wstawki o długości 1,2 Kb, którą następnie zligowano z pWHM3 strawionym Hindlll i Xbal. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a, z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej stosując Hindlll i Aval. Tym plazmidowym DNA stransformowano komórki E. coli DM1, z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA, a obecność właściwej wstawki potwierdzano metodą analizy restrykcyjnej i analizy sekwencji DNA. Plazmid ten oznaczono jako pSE350 i zastosowano do transformowania protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano transformanty oporne na tiostrepton, określono w nich obecność oporności na erytromycynę, a transformanty Thio^r Erm^r analizowano na podstawie analizy produktów fermentacji metodą HPLC. Wyniki wskazują, że transformanty zawierające hybrydowy plazmid S. avermitilis/S. hygroscopicus wykazywały średni stosunek B2:B1 około 109:1 (tabela 6).

T ab el a 6

Szczep S. awermitilis (plazmid transformujący)	Liczba testowanych transformantów	Względne stężenie B2	Względne stężenie B1	Średni stosunek B2:B1
SE180-11 (brak)	8	0	0	0
SE180-11 (pHWM3)	8	0	0	0
SE180-11 (pSE350)	16	233	2	109

DEPOZYT MATERIAŁÓW BIOLOGICZNYCH stycznia 1998 r. następujące materiały biologiczne zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC) w 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, Stany Zjednoczone Ameryki, i nadano im następujące numery dostępu:

Plazmid Numer dostępu plazmid pSE180 209605 plazmid pSE186 209604

PL 194 270 B1

Wykaz sekwencji <11C> Ptizer Products ir.c.

<120 Gen Streptomyces avermitilis regulujący stosunek avermektyn B2:B1 <130 PC9916A <14 0>

<141>

<150> 60/074,636 <151> 1998-02-13 <160 24 <170> Patentln Ver. 2.0 - beta <210 1 <211> 1229 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <220>

<221> CDS <222> !174)..(1085) <400 1

tcacgaaacc	ggacacacca	cacacacgaa	ggtgagacag	cgtgaaccca	tccgagccgc	60
tcggcctgcc	caacgaacgt	gtagtagaca	cccgaccgtc	cgatgccacg	ctctcacccg	120
aggccggcct	gaacaggtca	ggagcgctgc	cccgtgaact	gctgtcgttg	ccg gtg	176

Val

gtg Val

gtg Val

tgg Trp

gcc Ala '5

ggg Gly

gtc Val

gcc Gly

ctg Leu

ctg Leu 10

ttt Phe

ctg Leu

gcc Ala

ctg Leu

cag Gin 15

gcg Ala

tac Tyr

224

gtg

ttc

agc

cgc

tgg

gcg

gcc

gac

ggt

ggc

tac

cgg

ctg

atc

gag

acg

272

Val

Phe

Ser 20

Arg

Trp

Ala

Ala

Asp 25

Gly

Gly

Tyr

Arg

Leu 30

Ile

Glu

Thr

gcg

ggc

cag

ggt

cag

ggc

ggc

agc

aag

gat

acg

ggg

act

acc

gat

gtg

320

Ala

Gly 35

Gin

Gly

Gin

Gly

Gly 40

Ser

Lys

Asp

Thr

Gly 45

Thr

Thr

Asp

Val

gtc

tat

ccc

gtg

att

tcc

gtc

gtc

tgc

atc

acc

gcc

gcg

gcg

gcg

tgg

368

PL 194 270 B1

Val 50

Tyr

Pro

Val

Ile

Ser 55

Val

Vai

cys

Ile

Thr 60

Ala

Ala

Ala

Ala

Trp 65

czc

ttc

cgg

agg

tgc

cgt

gtc

gaa

ega

cgg

ctg

ctg

ttc

gac

gcc

ctt

416

Leu

Phe

Arg

Arg

Cys

Arg

Val

Glu

Arg

Arg

Leu

Leu

Phe

Asp

Ala

Leu

70

75

80

ctc

ttc

ctc

ggg

ctg

ctg

ttc

gcg

agc

tgg

cag

agc

ccg

ctc

atg

aac

464

Leu

Phe

Leu

Gly

Leu

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Gin

Ser

Pro

Leu

Met

Asn

85

90

95

tgg

ttc

cat

tcc

gtt

ctc

gtc

tcc

aac

gcg

agt

gtg

tgg

ggc

gcg

gtg

512

Trp

Phe

His

Ser

Val

Leu

Val

Ser

Asn

Ala

Ser

Val

Trp

Gly

Ala

Val

100

105

110

ggt

tcc

tgg

ggt

ccg

tat

gtg

ccc

ggc

tgg

cag

ggg

gcg

ggc

ccg

ggt

560

Gly

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

Gly

Ala

Gly

Pro

Gly

115

120

125

gcg

gag

gcg

gaa

atg

ccg

ctg

gcg

tcg

gcc

tcc

gtc

tgc

atg

tcg

get

608

Ala

Glu

Ala

Glu

Met

Pro

Leu

Ala

Ser

Ala

Ser

Val

Cys

Met

Ser

Ala

130

135

140

145

ctg

atc

gtc

acc

gtg

ctg

tgc

agc

aag

gca

ctg

ggg

tgg

atc

aag

gcc

656

Leu

Ile

Val

Thr

Val

Leu

cys

Ser

Lys

Ala

Leu

Gly

Trp

Ile

Lys

Ala

150

155

160

cgc

cgg

ccg

gca

tgg

cgg

acc

tgg

cgg

ctg

gtc

ctg

gcc

gtg

ttc

ttc

704

Arg

Arg

Pro

Ala

Trp

Arg

Thr

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Val

Phe

Phe

165

170

175

atc

ggc

atc

gtg

ctc

ggt

ctg

tcc

gag

ccg

ctg

cpg

tcc

gcc

tcc

ggg

752

Zie

Gly

Ile

Val

Leu

Gly

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Pro

Ser

Ala

Ser

Gly

180

185

190

atc

agc

gta

tgg

gcc

aga

gcg

ctg

ccc

gag

gtg

acc

ttg

tgg

agt

ggc

800

Ile

Ser

Val

Trp

Ala

Arg

Ala

Leu

Pro

Glu

Val

Thr

Leu

Trp

Ser

Gly

195

200

205

gag

tgg

tac

cag

ttc

ccc

gtg

tat

cag

gcg

gtc

ggt

tcc

ggc

ctg

gtc

848

Glu

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Val

Tyr

Gin

Ala

Val

Gly

Ser

Gly

Leu

Val

210

215

220

225

tgc

tgc

atg

ctg

ggc

tcg

ctg

cgc

ttc

ttc

cgc

gac

gaa

cgc

gat

gag

896

Cys

Cys

Met

Leu

Gly

Ser

Leu

Arg

Phe

Phe

Arg

Asp

Glu

Arg

Asp

Glu

230

235

240

tcg

tgg

gtg

gaa

cgg

gga

gcc

tgg

cgg

ttg

ccg

caa

cgg

gca

gcg

aac

944

Ser

Trp

Val

Glu

Arg

Gly

Ala

Trp

Arg

Leu

Pro

Gin

Arg

Ala

Ala

Asn

245 250 255

PL 194 270 B1 tgg gcg egu ttc etc Trp Ala Arg Phe Leu 260 etc tac acc tgt ttc Leu Tyr Thr Cys Phe

275 ccc gac caa ctg ccg Pro Asp Gin Leu Pro 290

gee	gtg	gtc	ggt	ggg	gtg	aat
Ala	Val	Val 265	Gly	Gly	Val	Asn
cat	atc	etc	ctg	tcc	etc	gtc
His	Ile 280	Leu	Leu	Ser	Leu	Val 285
gac	tcc	ttc	caa	gcg	ccg	gee
Asp 295	Ser	Phe	Gin	Ala	Pro 300	Ala

gee gtg atg ttc 992

Ala Val Met Phe

270 ggt gga cag ccg 1040

Gly Gly Gin Pro get tac tga 1085

Ala Tyr gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc 1145 ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205 acactcctcg gtteagegat catg 1229 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis

<400> 2 Val Val Val 1

Trp

Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gin Ala

5

10

15

Tyr

Val

Phe

Ser

Arg

Trp

Ala

Ala

Asp

Gly

Gly

Tyr

Arg

Leu

Ile

Glu

20

25

30

Thr

Ala

Gly

Gin

Gly

Gin

Gly

Gly

Ser

Lys

Asp

Thr

Gly

Thr

Thr

Asp

35

40

45

Val

Val

Tyr

Pro

Val

Ile

Ser

Val

Val

Cys

Ile

Thr

Ala

Ala

Ala

Ala

50

55

60

Trp

Leu

Phe

Arg

Arg

Cys

Arg

Val

Glu

Arg

Arg

Leu

Leu

Phe

Asp

Ala

65

70

75

80

Leu

Leu

Phe

Leu

Gly

Leu

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Gin

Ser

Pro

Leu

Met

85

90

95

Asn

Trp

Phe

His

Ser

Val

Leu

Val

Ser

Asn

Ala

Ser

Val

Trp

Gly

Ala

100

105

110

Val

Gly

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

Gly

Ala

Gly

Pro

115

120

125

PL 194 270 B1

Gly

Ala 130

Glu

Ala

Glu

Met

Pro 135

Leu

Ala

Ser

Ala

Ser 140

Val

cys

Met

Ser

Ala

Leu

Ile

Val

Thr

Val

Leu

Cys

Ser

Lys

Ala

Leu

Gly

Trp

Ile

Lys

145

150

155

160

Ala

Arg

Arg

Pro

Ala

Trp

Arg

Thr

Trp

Arg

Leu

Val

Leu

Ala

Val

Phe

165

170

175

Phe

Ile

Gly

Ile

Val

Leu

Gly

Leu

Ser

Glu

Pro

Leu

Pro

Ser

Ala

Ser

180

185

190

Gly

Ile

Ser

Val

Trp

Ala

Arg

Ala

Leu

Pro

Glu

Val

Thr

Leu

Trp

Ser

195

200

205

Gly

Glu

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Val

Tyr

Gin

Ala

Val

Gly

Ser

Gly

Leu

210

215

220

Val

Cys

Cys

Met

Leu

Gly

Ser

Leu

Arg

Phe

Phe

Arg

Asp

Glu

Arg

Asp

225

230

235

240

Glu

Ser

Trp

Val

Glu

Arg

Gly

Ala

Trp

Arg

Leu

Pro

Gin

Arg

Ala

Ala

245

250

255

Asn

Trp

Ala

Arg

Phe

Leu

Ala

Val

Val

Gly

Gly

Val

Asn

Ala

Val

Met

260

265

270

Phe

Leu

Tyr

Thr

Cys

Phe

His

Ile

Leu

Leu

Ser

Leu

Val

Gly

Gly

Gin

275

280

285

Pro

Pro

Asp

Gin

Leu

Pro

Asp

Ser

Phe

Gin

Ala

Pro

Ala

Ala

Tyr

290 295 300 <210> 3 <211> 1150 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <220>

<221> CDS <222> (58)..(990) <400> 3 gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg 51 gtg ttc acc ctt ccc gta aca ctg tgg gcg tgt gtc ggc gcg ctg gtg 105

Val Phe Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val

5 10 15

PL 194 270 B1

ctg Leu

gga Gly

ctt Leu

cag Gin 20

gtg Val

tac Tyr

gtg Val

ttc Phe

gcc Ala 25

gcc Ala

tgg Trp

ctc Leu

gcc Ala

gac Asp 30

agc Ser

ggc Gly

153

tac

cgc

atc

gag

aag

gcg

tcc

ccg

gcc

agg

ggc

ggt

ggg

gac

tcg

gag

201

Tyr

Arg

ile

Glu

Lys

Ala

Ser

Pro

Ala

Arg

Glv

G1 y

Gly

Asp

Ser

Glu

35

40

45

cgg

atc

gcc

gat

gtg

ctg

atc

ccg

ctg

ctg

tcc

gtg

gtg

gga

gcg

gtg

249

Arg

Ile

Ala

Asp

Val

Leu

Ile

Pro

Leu

Leu

Ser

Val

Val

Gly

Ala

Val

50

55

60

gtc

ctc

gca

gtg

tgt

ctg

tac

cgg

agg

tgt

cgg

gcc

agg

agg

cgg

ctg

297

Val

Leu

Ala

Val

Cys

Leu

Tyr

Arg

Arg

Cys

Arg

Ala

Arg

Arg

Arg

Leu

65

70

75

80

acg

ttc

gac

gcg

tcg

ctc

ttc

atc

ggg

ctg

ctg

tcg

gcc

agt

tgg

cag

345

Thr

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu

Phe

Ile

Gly

Leu

Leu

Ser

Ala

Ser

Trp

Gin

85

90

95

agt

ccc

ttg

atg

aac

tgg

atc

aat

ccg

gtg

ctc

gcg

tca

aac

gtc

aat

393

Ser

Pro

Leu

Met

Asn

Trp

Ile

Asn

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Asn

Val

Asn

100

105

110

gtg

ttc

gga

gcg

gtg

gcc

tcg

tgg

ggg

ccg

tat

gtg

ccc

ggt

tgg

cag

441

Val

Phe

Gly

Ala

Val

Ala

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

115

12 0

125

ggg

gcg

ggg

gcg

cac

cag

gag

gcc

gag

ctg

ccg

ctg

gcg

acc

ctg

agc

489

Glv

Ala

Gly

Ala

His

Gin

Glu

Ala

Glu

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Leu

Ser

130

135

140

atc

tgt

atg

acg

gcc

atg

atg

gcc

gcc

gtg

gcc

tgc

ggc

aag

ggc

atg

537

Ile

Cys

Met

Thr

Ala

Met

Met

Ala

Ala

Val

Ala

Cys

Gly

Lys

Gly

Met

145

150

155

160

ggt

ctt

gcc

gcc

gcc

cgg

tgg

ccg

cgg

ctg

ggg

ccg

ctc

cgg

ctg

atc

585

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

Arg

Trp

Pro

Arg

Leu

Gly

Pro

Leu

Arg

Leu

Ile

165

170

175

gcg

ctc

ggc

ttt

ctg

ctc

gtc

gtg

ctc

ctc

gac

atc

gcc

gag

ccg

ctg

633

Ala

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Val

Val

Leu

Leu

Asp

Ile

Ala

Glu

Pro

Leu

180

185

190

gtg

tcc

ttc

gcg

ggc

gtc

tcc

gtg

tgg

acg

cgg

gca

gtg

ccc

gag

ctg

681

Val

Ser

Phe

Ala

Gly

Val

Ser

Val

Trp

Thr

Arg

Ala

Val

Pro

Glu

Leu

195

200

205

acc

atc

tgg

agt

ggg

cac

tgg

tat

cag

ttc

ccg

ctg

tat

cag

atg

gtg

729

Thr

Ile

Trp

Ser

Gly

His

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Leu

Tyr

Gin

Met

Val

PL 194 270 B1

210	215	220
gct tcg gcg ctc	ttc ggc gcc	tct ttg ggg gcc gcg cgc cac ttt cgc 777
Ala Ser Ala Leu	Phe Gly Ala	Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg
225	230	235 240
aac cgg cgc ggc	gaa acg tgt	ctg gag tcc ggc gcg gcc ctc eta ccg 825
Asn Arg Arg Gly	Glu Thr Cys	Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro
	245	250 255
gag ggc ccg agg	cca tgg gtc	cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873
Glu Gly Pro Arg	Pro Trp Val	Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
260		265 270
aac atc agc atc	gcc ctc tac	acc ggc gca cac ggc gca cac atc ctg 921
Asn Ile Ser Ile	Ala Leu Tyr	Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu
275		280 285
ttc tcg ctg atg	gac ggc gct	ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc 969
Phe Ser Leu Met	Asp Gly Ala	Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe
290	295	300
cgt ccg gcg gcc	ggc tac tga	gaccgccggc accacccacg tacccgatgt 1020
Arg Pro Ala Ala	Gly Tyr
305	310

gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080 catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140 gcggccgggg χ₁₅₀ <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 4

val

Phe

Thr

Leu

Pro

Val

Thr

Leu

Trp

Ala

Cys

Val

Gly

Ala

Leu

Val

1

5

10

15

Leu

Gly

Leu

Gin

Val

Tyr

Val

Phe

Ala

Ala

Trp

Leu

Ala

Asp

Ser

Gly

20

25

30

Tyr

Arg

Ile

Glu

Lys

Ala

Ser

Pro

Ala

Arg

Gly

Gly

Gly

Asp

Ser

Glu

35

40

45

Arg

Ile

Ala

Asp

Val

Leu

Ile

Pro

Leu

Leu

Ser

Val

Val

Gly

Ala

val

55 60

PL 194 270 B1

Val 65

Leu Ala Val

Cys

Leu 70

Tyr

Arg

Arg

Cys

Arg 75

Ala

Arg

Arg

Arg

Leu 80

Thr

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu

Phe

Ile

Gly

Leu

Leu

Ser

Ala

Ser

Trp

Gin

85

90

95

Ser

Pro

Leu

Met

Asn

Trp

Ile

Asn

Pro

Val

Leu

Ala

Ser

Asn

Val

Asn

100

105

110

Val

Phe

Gly

Ala

Val

Ala

Ser

Trp

Gly

Pro

Tyr

Val

Pro

Gly

Trp

Gin

115

120

125

Gly

Ala

Gly

Ala

His

Gin

Glu

Ala

Glu

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Leu

Ser

130

135

140

Ile

Cys

Met

Thr

Ala

Met

Met

Ala

Ala

Val

Ala

Cys

Gly

Lys

Gly

Met

145

150

155

160

Gly

Leu

Ala

Ala

Ala

Arg

Trp

Pro

Arg

Leu

Giy

Pro

Leu

Arg

Leu

Ile

165

170

175

Ala

Leu

Gly

Phe

Leu

Leu

Val

Val

Leu

Leu

Asp

Ile

Ala

Glu

Pro

Leu

180

135

190

Val

Ser

Phe

Ala

Gly

Val

Ser

Val

Trp

Thr

Arg

Ala

Val

Pro

Glu

Leu

195

200

205

Thr

Ile

Trp

Ser

Gly

His

Trp

Tyr

Gin

Phe

Pro

Leu

Tyr

Gin

Met

Val

210

215

220

Ala

Ser

Ala

Leu

Phe

Gly

Ala

Ser

Leu

Gly

Ala

Ala

Arg

His

Phe

Arg

225

230

235

240

Asn

Arg

Arg

Gly

Glu

Thr

cys

Leu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Leu

Leu

Pro

245

250

255

Glu

Gly

Pro

Arg

Pro

Trp

Val

Arg

Leu

Leu

Ala

Val

Val

Gly

Gly

Ala

260

265

270

Asn

Ile

Ser

Ile

Ala

Leu

Tyr

Thr

Gly

Ala

His

Gly

Ala

His

Ile

Leu

275

280

285

Phe

Ser

Leu

Met

Asp

Gly

Ala

Pro

Pro

Asp

Arg

Leu

Pro

Glu

Phe

Phe

290

295

300

A.rg

Pro

Ala

Ala

Gly

Tyr

305

310

PL 194 270 B1 <210 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptomyces griseochromogenes <400 5

Val Ile Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Val Leu Gin Val 15 10 15

Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Giy Gly Tyr His Leu Ala Asp 20 25 30

Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg Ile Ile Asp 35 40 45

Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe 50 55 60 '

Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala 65 70 75 80

Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met 85 90 95

Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala 100 105 110

Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro 115 120 125

Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr 130 135 140

Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gin Val Met Ser Arg Val Arg

145 150 155 ISO

Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gin Leu Val Gly Leu Ala Phe

165 170 175

Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe Ile Ser Phe Ala 180 185 190

Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg 195 200 205

Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg 210 215 <210> 6

PL 194 270 B1 <211> 13 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 6 tcacgaaacc ggacacac <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avenr.itilis <400> 7 catgatcgct gaaccgag <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 8 ggttccggat gccgttctcg <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 9 aactccggtc gactcccctt c <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 10 gcaaggatac ggggactac <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 11

PL 194 270 B1

<210> 17 <211> 17

PL 194 270 B1 <212> ONA <213> Streptomyces avermitilis <400> 17 tcggcctgcc aacgaac <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 18 ccaacgaacg tgtagtag 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> screptomyces avermitilis <400> 19 tgcaggcgta cgtgttcagc <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 20 catgategct gaaccga 17 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 21 catgategct gaaccgagga <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 22 aggagtgtgg tgcgtctgga 20

PL 194 270 B1 <210 23 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400 23 cttcaggtgt acgtgttcg <210 24 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 24 gaactggtac cagtgccc

Claims (52)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa zawierająca kompletną otwartą ramkę odczytu AveC Streptomyces avermitilis lub jej znaczną część, przy czym ta otwarta ramka odczytu jest ostatnią kompletną ramką odczytu w tej cząsteczce i ma sekwencję nukleotydową z fig. 1 (SEQ ID NO: 1).
2. 2. Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 1, zawierająca ponadto sekwencje nukleotydowe, które naturalnie flankują gen AveC in situ w S. avermitilis.
3. 3. Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa zawierająca sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do kodującej produkt genu AveC Streptomyces avermitilis sekwencji nukleotydowej otwartej ramki odczytu AveC przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej znacznej części.
4. 4. Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa zawierająca sekwencję nukleotydową SEQ ID NO: 3 lub jej znaczną część, albo sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do sekwencji nukleotydowej SEQID NO: 3.
5. 5. Cząsteczka oligonukleotydowa, która hybrydyzuje z cząsteczką polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO 3, albo z cząsteczką polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO: 3, w warunkach o wysokiej surowości.
6. 6. Cząsteczka oligonukleotydowa według zastrz. 5, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO: 3, albo do cząsteczki polinukleotydowej mającej sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do sekwencji nukleotydowej z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO: 3.
7. 7. Zrekombinowany wektor zawierający cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu AveC z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej znaczną część oraz sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do otwartej ramki odczytu kodującej produkt genu AveC S. avermitilis z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej znaczną część.
8. 8. Zrekombinowany wektor według zastrz. 7, zawierający ponadto sekwencję nukleotydową kodującą jeden lub większą liczbę elementów regulujących, która to sekwencja nukleotydowa kodująca elementy regulujące jest funkcjonalnie połączona z sekwencją nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 7.
9. 9. Zrekombinowany wektor według zastrz. 8, zawierający ponadto sekwencję nukleotydową kodującą marker selekcyjny.

   PL 194 270 B1
10. 10. Zrekombinowany wektor według zastrz. 9, który stanowi plazmidpSE186 (ATCC 209604).
11. 11. Komórka gospodarza, zawierająca zrekombinowany wektor zdefiniowany w zastrz. 7.
12. 12. Komórka gospodarza według zastrz. 11, którą stanowi Streptomyces avermitilis.
13. 13. Zrekombinowany wektor zawierający cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej sekwencję nukleotydową SEQID NO: 3 lub jej znaczną część, sekwencję nukleotydową, która jest homologiczna do sekwencji nukleotydowej SEQID NO: 3 oraz sekwencję nukleotydową, która koduje polipeptyd o sekwencji aminokwasowej SEQ ID NO: 4.
14. 14. Zrekombinowany wektor według zastrz. 13, zawierający ponadto sekwencję nukleotydową kodującą jeden lub większą liczbę elementów regulujących, która to sekwencja nukleotydowa kodująca elementy regulujące jest funkcjonalnie połączona z sekwencją nukleotydową cząsteczki polinukleotydowej wektora, zdefiniowaną w zastrz. 13.
15. 15. Zrekombinowany wektor według zastrz. 14, zawierający ponadto sekwencję nukleotydową kodującą marker selekcyjny.
16. 16. Komórka gospodarza, zawierająca zrekombinowany wektor zdefiniowany w zastrz. 15.
17. 17. Komórka gospodarza według zastrz. 16, którą stanowi Streptomyces hygroscopicus.
18. 18. Wyizolowany produkt genuAveCS. avermitilis mający sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową kodującą produkt genu AveC S. avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencję aminokwasową z SEQID NO: 2 lub jej znaczną część, albo polipeptyd do niego homologiczny.
19. 19. Wyizolowany produkt homologu genu AveC S. hygroscopicus mający sekwencję aminokwasową z SEQID NO: 4.
20. 20. Sposób wytwarzania zrekombinowanego produktu genuAveC, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza stransformowaną zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym, który to zrekombinowany wektor ekspresyjny zawiera cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 2 lub jej znaczną część, która to cząsteczka polinukleotydowa jest funkcjonalnie połączona z jednym lub większą liczbą elementów regulujących, kontrolujących ekspresję cząsteczki polinukleotydowej w komórce gospodarza w warunkach umożliwiających wytwarzanie zrekombinowanego produktu genu AveC, oraz wyodrębnia się produkt genu AveCz hodowli komórkowej.
21. 21. Sposób wytwarzania zrekombinowanego produktu homologu genuAveC, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza stransformowaną zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym, który to zrekombinowany wektor ekspresyjny zawiera cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową z SEQID NO: 4 lub jej znaczną część, która to cząsteczka polinukleotydowa jest funkcjonalnie połączona z jednym lub większą liczbą elementów regulujących, kontrolujących ekspresję cząsteczki polinukleotydowej w komórce gospodarza w warunkach umożliwiających wytwarzanie zrekombinowanego produktu homologu genu AveC, oraz wyodrębnia się produkt homologu genuAveCz hodowli komórkowej.
22. 22. Cząsteczka polinukleotydowa zawierająca sekwencję nukleotydową, która jest pod innymi względami taka sama jak kodującaprodukt genuAveCS. avermitilis sekwencja z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencja nukleotydowa otwartej ramki odczytuAveCS. avermitilis przedstawiona na fig. 1(SEQ ID NO: 1) albo jej zdegenerowany wariant, ale która to sekwencja nukleotydowa zawiera ponadto jedną lub większą liczbę takich mutacji, że komórki szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zinaktywowano allel AveCtypu dzikiego i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydowej zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydową, wytwarzają awermektyny oobniżonym stosunku cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 gdy fermentację prowadzi się w obecności kwasu cykloheksanokarboksylowego, w porównaniu ze stosunkiem otrzymywanym w przypadku komórek szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko alleluAveCtypudzikiego.
23. 23. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 22, dla której obniżony stosunek cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wynosi poniżej 1,6:1.
24. 24. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 23, dla której obniżony stosunek cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wynosi około 0,94:1.
25. 25. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 24, w której mutacja otwartej ramki odczytu AveCS. avermitilis z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) koduje zamianę aminokwasu reszty 139 produktu genu AveCz alaniny na treoninę.
26. 26. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 23, dla której obniżony stosunek cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wynosi około 0,88:1.

    PL 194 270 B1
27. 27. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 26, w której mutacja otwartej ramki odczytu AveC S. avermitilis z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) koduje zamianę aminokwasu reszty 138 produktu genu AveCz seryny na treoninę.
28. 28. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 23, dla której obniżony stosunek cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wynosi około 0,84:1.
29. 29. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 28, w której mutacja otwartej ramki odczytu AveCS. avermitilis z fig. 1(SEQ ID NO: 1) koduje pierwszą zamianę aminokwasu reszty 138 produktu genu AveC z seryny na treoninę oraz drugą zamianę aminokwasu reszty 139 produktu genu AveC z alaniny na treoninę.
30. 30. Cząsteczka polinukleotydowa zawierająca silny promotor funkcjonalnie połączony z otwartą ramką odczytuAveCS. avermitilis z fig. 1(SEQ ID NO: 1).
31. 31. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 30, w której tym silnym promotorem jest promotor ermE z Saccharopolyspora erythraea.
32. 32. Cząsteczka polinukleotydowa zawierająca sekwencję nukleotydową kodującą otwartą ramkę odczytu kodującą produkt genu AveC z fig. 1(SEQID NO: 1), którą zinaktywowano przez insercję do tej sekwencji nukleotydowej heterologicznej sekwencji nukleotydowej.
33. 33. Cząsteczka polinukleotydowa zawierająca allel AveC, zinaktywowany przez wydeletowanie z otwartej ramki odczytuAveC z fig. 1(SEQ ID NO: 1) fragmentu Pstl/Sphl o długości 640 bp.
34. 34. Cząsteczka polinukleotydowa zawierająca allel AveC zinaktywowany przez wprowadzenie mutacji zmiany ramki odczytu do otwartej ramki odczytu AveCz fig. 1(SEQ ID NO: 1).
35. 35. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 34, w której mutację zmiany ramki odczytu wprowadzono przez dodanie dwóch nukleotydów G po nukleotydzie C w pozycji nukleotydowej 471 otwartej ramki odczytu AveCz fig. 1(SEQ ID NO: 1).
36. 36. Cząsteczka polinukleotydowa zawierająca allel AveC zinaktywowany przez wprowadzenie kodonu terminacji transkrypcji w pozycji nukleotydowej, która koduje aminokwas 116 produktu genu AveCS. avermitilis kodowanego przez otwartą ramkę odczytu AveCz fig. 1(SEQ ID NO: 1).
37. 37. Cząsteczka polinukleotydowa zawierająca allel AveC zinaktywowany przez wprowadzenie pierwszej mutacji w pozycji aminokwasowej 256 produktu genu AveC, która zmienia glicynę na asparaginian, oraz drugiej mutacji w pozycji 275 produktu genu AveC, która zmienia tyrozynę na histydynę.
38. 38. Wektor do zastępowania genu zawierający cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencje nukleotydowe, które naturalnie flankują otwartą ramkę odczytu AveC in situw chromosomie S. avermitilis.
39. 39. Zrekombinowany wektor zawierający cząsteczkę polinukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 22 albo 30, albo 32, albo 33, albo 34, albo 36, albo37.
40. 40. Zrekombinowany wektor zawierający cząsteczkę polinukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 32, którym to wektorem jest pSE180 (ATCC 209605).
41. 41. Komórka gospodarza Streptomyces zawierająca zrekombinowany wektor zdefiniowany wzastrz. 39.
42. 42. Sposób identyfikowania mutacji otwartej ramki odczytu AveC zdolnych do obniżania stosunku klas 2:1 wytwarzanych awermektyn, znamienny tym, że (a) określa się stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zinaktywowano natywny allel AveC i do których wprowadzono ulegającą ekspresji cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydową kodującą produkt zmutowanego genu AveC; (b) określa się stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis jak w etapie (a), ale wktórych zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveC mającego sekwencję nukleotydową otwartej ramki odczytu z fig. 1(SEQ ID NO: 1) lub sekwencję nukleotydową, która jest do niej homologiczna; oraz (c) porównuje się stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis w etapie (a) ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis w etapie (b), przy czym stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis w etapie (a) różny od stosunku klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis w etapie (b) oznacza zidentyfikowanie mutacji otwartej ramki odczytu AveC zdolnej do obniżania stosunku klas 2:1 awermektyn.
43. 43. Sposób wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis zawierających komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, i które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z komórkami tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveCtypu dzikiego, znamienny tym, że transformuje się komórki szczepu S. avermitilis wektorem, który zawiera zmutowany allel AveC kodujący produkt genu, który obniża

    PL 194 270 B1 stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveCtypu dzikiego, oraz wybiera się stransformowane komórki, które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 wytwarzanym przez komórki szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja alleluAveCtypu dzikiego.
44. 44. Sposób wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, których komórki zawierają zinaktywowany allel AveC, znamienny tym, że transformuje się komórki szczepu S. avermitilis wek torem inaktywującym ten allel AveC, oraz wybiera się stransformowane komórki, w których ten allel AveC został zinaktywowany.
45. 45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że jako wektor stosujesię pSE 180 (ATCC 209605).
46. 46. Szczep S. avermitilis obejmujący komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, której wynikiem jest wytwarzanie przez komórki awermektyn o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu AveCtypu dzikiego.
47. 47. Szczep według zastrz. 46, którego komórki wytwarzają awermektyny o stosunku cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 niższym niż 1,6:1.
48. 48. Szczep według zastrz. 46, którego komórki wytwarzają awermektyny o stosunku cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 wynoszącym około 0,94:1.
49. 49. Szczep według zastrz. 46, którego komórki wytwarzają awermektyny o stosunku cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 wynoszącym około 0,88:1.
50. 50. Szczep według zastrz. 46, którego komórki wytwarzają awermektyny o stosunku cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 wynoszącym około 0,84:1.
51. 51. Szczep S. avermitilis zawierający komórki, w których genAveCzostał zinaktywowany.
52. 52. Sposób wytwarzania awermektyn, znamienny tym, że hoduje się komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC kodującego produkt genu, który obniża stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których nie zachodzi ekspresja zmutowanego allelu AveC, natomiast zachodzi ekspresja tylko allelu AveCtypu dzikiego, w pożywce hodowlanej w warunkach, które umożliwiają lub indukują wytwarzanie awermektyn, oraz wyodrębnia się te awermektyny z hodowli.