JP2002503473A - Ｂ２：ｂ１アベルメクチンの比に関するストレプトミセス・アベルミティリス遺伝子 - Google Patents

Ｂ２：ｂ１アベルメクチンの比に関するストレプトミセス・アベルミティリス遺伝子

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芳弘 加藤
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ファイザー・プロダクツ・インク
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ａｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子に関する。前記ポリヌクレオチド分子は、ストレプトミセス・アベルミティリスの発酵培養物において生成されるクラス２：１アベルメクチンの比又は量を変化させるのに用いることができる。また、本発明は、ベクター、宿主細胞、及び生成されるクラス２：１アベルメクチンの比又は量が変化するようにａｖｅＣ遺伝子が突然変異又は不活性化されたストレプトミセス・アベルミティリスの突然変異株にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 １．発明の属する技術分野 本発明は、組成物及びアベルメクチンの製造方法（主に、動物の健康の分野）
に関する。より詳しくは、本発明は、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチド分子、組成物、及び前記ポリヌクレオチド分子
のスクリーニング方法に関する。なお、前記ＡｖｅＣ遺伝子産物は、ストレプト
ミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉ
ｓ）培養物の発酵によって生成されるクラス２：１アベルメクチンの比を調整す
るのに用いることができる。更に、本発明は、ベクター、形質転換宿主細胞、そ
して、生成されるクラス２：１アベルメクチンの比を調整するようにａｖｅＣ遺
伝子を突然変異させたストレプトミセス・アベルミティリスの新規突然変異株に
関する。
【０００２】 ２．発明の背景 ２．１．アベルメクチン ストレプトミセス種は、多様な種々の二次代謝物を生成する。前記二次代謝物
には、有効な駆虫（ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ）及び殺虫（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉ
ｄａｌ）活性を有する８種の関連する１６員大環状ラクトンの一群を含むアベル
メクチンが含まれる。８種の異なる（但し、密接に関連する）化合物は、Ａ１ａ
、Ａ１ｂ、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ｂ１ａ、Ｂ１ｂ、Ｂ２ａ、及びＢ２ｂと称する。「
ａ」が付く一連の化合物は、Ｃ２５位における置換基が（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル
基である天然アベルメクチンを意味し、「ｂ」が付く一連の化合物は、Ｃ２５位
における置換基がイソプロピル基である化合物を意味する。「Ａ」及び「Ｂ」の
呼称は、Ｃ５位の置換基が、それぞれ、メトキシ基及びヒドロキシ基であるアベ
ルメクチンを意味する。数字の「１」は、Ｃ２２，２３位に二重結合を有するア
ベルメクチンを意味し、数字の「２」は、Ｃ２２位に水素原子を有し、Ｃ２３位
にヒドロキシ基を有するアベルメクチンを意味する。前記の関連するアベルメク
チンの中で、Ｂ１タイプのアベルメクチンが、最も有効な殺寄生生物（ａｎｔｉ
ｐａｒａｓｉｔｉｃ）及び殺虫（ｐｅｓｔｉｃｉｄａｌ）活性を有することが認
められているので、最も商業的に望ましいアベルメクチンである。
【０００３】 アベルメクチン及びストレプトミセス・アベルミティリス株の好気性発酵によ
るそれらの製造が、米国特許第４３１０５１９号及び第４４２９０４２号各明細
書に記載されている。天然アベルメクチンの生合成は、イソ酪酸及びＳ−（＋）
−２−メチル酪酸のＣｏＡチオエステル類似体から内因的に開始されると考えら
れている。
【０００４】 無作為な突然変異誘発による菌株の向上と、外因的に供給される脂肪酸の使用
との両方を組み合わせることによって、アベルメクチン類似体の効果的な製造が
行なわれてきた。分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼが欠損しているストレプ
トミセス・アベルミティリスの突然変異体（ｂｋｄ欠損突然変異体）は、脂肪酸
補充下で発酵した場合には、アベルメクチンのみを生成することができる。分枝
鎖デヒドロゲナーゼ活性が欠けている突然変異体（例えば、ストレプトミセス・
アベルミティリス，ＡＴＣＣ５３５６７）のスクリーニング及び単離方法が、欧
州特許（ＥＰ）第２７６１０３号明細書に記載されている。外因的に供給される
脂肪酸の存在下で前記突然変異体を発酵させると、使用した脂肪酸に相当する４
種類のアベルメクチンのみが生成される。従って、ストレプトミセス・アベルミ
ティリス（ＡＴＣＣ５３５６７）をＳ−（＋）−２−メチル酪酸補充下で発酵さ
せると、天然アベルメクチンＡ１ａ、Ａ２ａ、Ｂ１ａ、及びＢ２ａが生成される
。また、イソ酪酸補充下で発酵させると、天然アベルメクチンＡ１ｂ、Ａ２ｂ、
Ｂ１ｂ、及びＢ２ｂが生成される。更に、シクロペンタンカルボン酸補充下で発
酵させると、４種の新規シクロペンチルアベルメクチンＡ１、Ａ２、Ｂ１、及び
Ｂ２が生成される。
【０００５】 もし、別の脂肪酸を補充した場合には、新規なアベルメクチンが生成される。
８００に亘る潜在的前駆体をスクリーニングすることによって、６０を超える別
の新規アベルメクチンが同定されている（Ｄｕｔｔｏｎら，１９９１，Ｊ．Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔ．４４：３５７−３６５；及びＢａｎｋｓら，１９９４，Ｒｏｙ．
Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．１４７：１６−２６）。更に、５−Ｏ−メチルトランスフェ
ラーゼ活性のないストレプトミセス・アベルミティリスの突然変異体は、本質的
に、Ｂ類似アベルメクチンのみを生成する。結果的に、分枝鎖２−オキソ酸デヒ
ドロゲナーゼ及び５−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの両方を欠いているストレ
プトミセス・アベルミティリス突然変異体は、発酵の補充に使用した脂肪酸に相
当するＢアベルメクチンのみを生成する。従って、前記の二重突然変異体にＳ−
（＋）−２−メチル酪酸を補充すると、天然アベルメクチンＢ１ａ及びＢ２ａの
みが生成されるが、イソ酪酸又はシクロペンタンカルボン酸を補充する場合には
、それぞれ、天然アベルメクチンＢ１ｂ及びＢ２ｂ、あるいは、新規のシクロペ
ンチルＢ１及びＢ２アベルメクチンが生成される。前記二重突然変異体にシクロ
ヘキサンカルボン酸を補充することは、商業的に重要な新規アベルメクチンであ
るシクロヘキシルアベルメクチンＢ１（ドラメクチン：ｄｏｒａｍｅｃｔｉｎ）
を生成するのに好ましい方法である。このような二重突然変異体［例えば、スト
レプトミセス・アベルミティリス（ＡＴＣＣ５３６９２）］の単離及び特徴が、
欧州特許第２７６１０３号明細書に記載されている。
【０００６】 ２．２．アベルメクチン生合成に関連する遺伝子 多くの場合において、二次代謝物の生成に関連する遺伝子及び特定の抗生物質
をコードする遺伝子が、染色体上で共に集まって発見されている。その例として
は、例えば、ストレプトミセスにおけるポリケチドシンターゼ遺伝子クラスター
（ＰＫＳ）（Ｈｏｐｗｏｏｄ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３７−６６を参照）を挙げることができる。従って、
生合成経路における遺伝子をクローニングするための一つの戦略は、薬剤耐性遺
伝子を単離し、次に、その特定の抗生物質の生合成に関する別の遺伝子に関して
、染色体の隣接領域を試験することであった。重要な代謝物の生合成に関連する
遺伝子のクローニングに関する別の戦略は、突然変異体の相補性であった。例え
ば、特定の代謝物を生成することのできる生物由来のＤＮＡライブラリーの一部
を、生成しない突然変異体中に導入し、前記代謝物の生成に関して形質転換体ス
クリーニングする。更に、別のストレプトミセス種由来のプローブを用いてライ
ブラリーをハイブリダイゼーションすることが、生合成経路における遺伝子の同
定及びクローニングに用いられている。
【０００７】 アベルメクチンの生合成に関連する遺伝子（ａｖｅ遺伝子）は、別のストレプ
トミセスの二次代謝物（例えば、ＰＫＳ）の生合成に必要な遺伝子のように、染
色体上においてクラスターとして発見される。アベルメクチンの生合成が妨害さ
れているストレプトミセス・アベルミティリス突然変異体を補完するためのベク
ターを用いて、多くのａｖｅ遺伝子が、首尾よくクローニングされている。前記
遺伝子のクローニングは、米国特許第５２５２４７４号明細書中に記載されてい
る。更に、Ｉｋｅｄａら，１９９５，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．４８：５３２−５
３４には、Ｃ２２，２３脱水工程に関連する染色体領域（ａｖｅＣ）が、ストレ
プトミセス・アベルミティリスの４．８２ＫｂのＢａｍＨＩフラグメント内にあ
ることを突き止めたこと、そして、単独成分Ｂ２ａプロデューサーの生成を引き
起こすａｖｅＣ遺伝子における突然変異が記載されている。有効な駆虫性化合物
であるイベルメクチンは、アベルメクチンＢ２ａから化学的に生成することがで
きるので、アベルメクチンＢ２ａの単独成分プロデューサーは、イベルメクチン
の商業生産に特に有用であると考えられる。 アベルメクチン生成の複雑さを最小化するａｖｅＣ遺伝子内の突然変異（例え
ば、アベルメクチンのＢ２：Ｂ１比を減少させる突然変異）を同定することは、
商業的に重要なアベルメクチンの製造及び精製を単純化するであろう。
【０００８】 ３．発明の概要 本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの完全ａｖｅＣ−ＯＲＦ又は
その実体部分を含む、単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記単離ポリ
ヌクレオチド分子が、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体において、生
体内でａｖｅＣ−ＯＲＦの下流に位置する次の完全ＯＲＦを欠失する、前記単離
ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明による単離ポリヌクレオチド分子は、
好ましくは、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミ
セス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と同じであるか、
あるいは、図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部分の
ヌクレオチド配列と同じであるヌクレオチド配列を含む。
【０００９】 更に、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレ
プトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列に対して、
あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部
分のヌクレオチド配列に対して、相同なヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオ
チド分子を提供する。 更に、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅ
Ｃ遺伝子産物をコードする配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、ある
いは、図１（配列表の配列番号２）のアミノ酸配列又はその実体部分に対して、
相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
、ポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１０】 更に、本発明は、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含
む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。好ましい態様では、前記単離ポリヌ
クレオチド分子が、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ
ｉｃｕｓ）由来のＡｖｅＣ相同遺伝子産物（但し、前記相同遺伝子産物は、配列
表の配列番号４のアミノ酸配列又はその実体部分を含む）をコードするヌクレオ
チド配列を含む。好ましい態様では、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖ
ｅＣ相同遺伝子産物をコードする本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配列表
の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体部分を含む。
【００１１】 更に、本発明は、配列表の配列番号３のストレプトミセス・ヒグロスコピカス
のヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子を
提供する。更に、本発明は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するストレ
プトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物に相同なポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。 更に、本発明は、図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対して、あるいは、図１（配列表
の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチド分子に対してハイブリダイズする、オリゴヌ
クレオチドを提供する。
【００１２】 更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ又
はａｖｅＣ相同ＯＲＦを含むポリヌクレオチド分子を含む、組換えクローニング
ベクター及び発現ベクターを提供する。前記ベクターは、本発明のポリヌクレオ
チドをクローニング又は発現するのに有用である。非限定的な態様では、本発明
は、ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ遺伝子の完全ＯＲＦを含む
プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）を提供する。更に、本発明は
、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターを含む形質転換宿主細胞、
及びそれらに由来する新規株又は細胞系を提供する。
【００１３】 更に、本発明は、実質的に精製又は単離された、組換え発現ａｖｅＣ遺伝子産
物若しくはＡｖｅＣ相同遺伝子産物、又はそれらの実体部分、及びそれらの相同
体を提供する。更に、本発明は、組換え発現ベクター［但し、前記組換え発現ベ
クターは、ＡｖｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子と
、宿主細胞中におけるポリヌクレオチド分子の発現を制御する調節要素１又はそ
れ以上とが、影響を及ぼす関係にある］で形質転換した宿主細胞を、組換えＡｖ
ｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相同遺伝子産物の生成を促す条件下で培養し、その
細胞培養物からＡｖｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相同遺伝子産物を回収すること
を含む、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の製造方法を提供する。
【００１４】 更に、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が不活化されており、しかも、突
然変異１又はそれ以上を更に含むヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子
が発現されるストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株の細胞
が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベ
ルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株の細胞によって生成されるアベルメクチンと
比較して、異なる比又は量のアベルメクチンを生成するような前記突然変異ヌク
レオチド配列を更に含むこと以外は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９
６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードす
る配列と、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に記載のストレプトミセス・
アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配
列を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。本発明によれば、前記ポリヌクレ
オチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株と比較
して、アベルメクチンの生成において検知可能な変化を示すストレプトミセス・
アベルミティリスの新規株を生成することに用いることができる。好ましい態様
では、前記ポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに
発現する同じ株と比較して、クラス２：１比が減少した状態でアベルメクチンを
生成するストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を生成するのに有用であ
る。更に好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立
遺伝子のみを代わりに発現する同じ株と比較して、増加したレベルでアベルメク
チンを生成するストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を生成するのに有
用である。更に好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＣ遺伝
子が不活性化されているストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を生成す
るのに有用である。
【００１５】 更に、本発明は、アベルメクチンの生成比及び／又は量を変化させることので
きるストレプトミセス・アベルミティリスのＡｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定
する方法を提供する。好ましい態様では、本発明は、（ａ）天然のａｖｅＣ対立
遺伝子が不活性化されており、しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコー
ドするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現している
ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチ
ンのクラス２：１比を決定し；（ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌ
クレオチド配列、あるいは、それに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対
立遺伝子のみを代わりに発現すること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセ
ス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：
１比を決定し；そして、（ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリ
ス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のス
トレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのク
ラス２：１比とを比較し；工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細
胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のストレ
プトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス
２：１比とが異なる場合に、アベルメクチンのクラス２：１比を変化させること
のできるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定することを含む、生成されるアベル
メクチンのクラス２：１比を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変
異を同定する方法を提供する。
【００１６】 更に、好ましい態様では、本発明は、（ａ）天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活
性化されており、しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレ
オチド配列を含むか、あるいは、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド
配列を含む遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現している
ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチ
ンの量を決定し；（ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配
列、あるいは、それに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子のみ
を代わりに発現すること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス・アベルミ
ティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量を決定し；そして、（
ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成される
アベルメクチンの量と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞
によって生成されるアベルメクチンの量とを比較し；工程（ａ）のストレプトミ
セス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量と、工程（
ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメク
チンの量とが異なる場合に、アベルメクチンの量を変化させることのできるａｖ
ｅＣ−ＯＲＦ又は遺伝子構築物の突然変異を同定することを含む、生成されるア
ベルメクチンの量を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦ又はａｖｅＣ−Ｏ
ＲＦを含む遺伝子構築物の突然変異を同定する方法を提供する。好ましい態様で
は、生成されるアベルメクチンの量は、突然変異によって増加する。
【００１７】 更に、本発明は、アベルメクチン生成が変化したストレプトミセス・アベルミ
ティリスの新規株の製造に有用な組換えベクターを提供する。例えば、本発明は
、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体のＡｖｅＣ遺伝子の部位を標的と
して、本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含む任意のポリヌクレオチド分子を
、相同組換えによって、ａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその一部に挿入又は置換するのに
使用することのできるベクターを提供する。しかしながら、本発明によれば、本
発明と共に提供される本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ド分子は、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体中のａｖｅＣ遺伝子以外
の部分に挿入する場合や、あるいは、ストレプトミセス・アベルミティリス細胞
中でエピソーム的に維持される場合には、アベルメクチン生合成を調整する機能
を果たすこともできる。従って、本発明は、本発明の突然変異ヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド分子を含むベクターも提供する。前記ベクターは、ポリ
ヌクレオチド分子を、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体のａｖｅＣ遺
伝子以外の位置に挿入するか、あるいは、エピソーム的に維持するのに用いるこ
とができる。好ましい態様では、本発明は、突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子をスト
レプトミセス・アベルミティリス染色体中に挿入することにより、野生型ａｖｅ
Ｃ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比
が低いアベルメクチンを生成する細胞の新規株を製造するのに用いることができ
る遺伝子置換ベクターを提供する。
【００１８】 更に、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも、野生型
ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリ
スの同じ株の細胞と比較して、比及び／又は量が異なるアベルメクチンを生成す
る細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法を提供する
。好ましい態様では、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、し
かも、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・ア
ベルミティリスの同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が異なるアベルメク
チンを生成する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方
法であって、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａ
ｖｅＣ対立遺伝子（但し、前記遺伝子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わ
りに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異した対立遺伝子を発現するスト
レプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの
クラス２：１比を変化させる遺伝子産物をコードする）を担持するベクターによ
って形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する株
の細胞により生成されるクラス２：１比と比較して、クラス２：１比が異なるア
ベルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法を提
供する。好ましい態様では、前記の新規株の細胞中において、生成されるアベル
メクチンのクラス２：１割合が、減少する。
【００１９】 より好ましい態様では、本発明は、異なる量のアベルメクチンを生成する細胞
を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、ストレ
プトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又
はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物（但し、その発現の結果、突然変異し
たａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現するストレプトミセス・アベルミ
ティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量が、野生型ａｖｅＣ対
立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、変化する）を担持す
るベクターによって形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わ
りに発現する株の細胞により生成されるアベルメクチンの量と比較して、異なる
量のアベルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方
法を提供する。好ましい態様では、前記の新規株の細胞中において、生成される
アベルメクチンの量が、増加する。
【００２０】 更に、好ましい態様では、本発明は、細胞が、不活性化されたａｖｅＣ対立遺
伝子を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、野
生型ａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細
胞を、ａｖｅＣ対立遺伝子を不活性化させるベクターで形質転換し、そして、ａ
ｖｅＣ対立遺伝子が不活性化された形質転換細胞を選択することを含む、前記製
造方法を提供する。
【００２１】 更に、本発明は、本発明の突然変異したヌクレオチド配列を含む任意のポリヌ
クレオチド分子又はベクターで形質転換された細胞を含む、ストレプトミセス・
アベルミティリスの新規株を提供する。好ましい態様では、本発明は、野生型ａ
ｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、あるいは、それに加えて、突然変異したａｖｅＣ
対立遺伝子を発現する細胞を含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規
株（ここで、前記新規株の細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発
現する同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が異なるアベルメクチンを生成
する）を提供する。より好ましい態様では、新規株の細胞が、野生型ａｖｅＣ対
立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が減
少したアベルメクチンを生成する。前記新規株は、商業的に望ましいアベルメク
チン（例えば、ドラメクチン）の大規模生産に有用である。
【００２２】 更に、好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、
あるいは、それに加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺
伝子を含む遺伝子構築物を発現する細胞［但し、前記遺伝子は、野生型ａｖｅＣ
対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞により生成されるアベルメクチ
ンの量と比較して、異なる量のアベルメクチンの生成（細胞による）を引き起こ
す］を含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を提供する。好まし
い態様では、前記新規細胞は、増加した量のアベルメクチンを生成する。 より好ましい態様では、本発明は、ａｖｅＣ遺伝子が不活性化されている細胞
を含むストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を提供する。前記の株は、
野生型株とは異なるアベルメクチン（前記株により生成される）のスペクトルと
、アベルメクチン生成に影響を与えるａｖｅＣ遺伝子の標的突然変異誘発又はラ
ンダム突然変異誘発のいずれかを決定する本明細書に記載の相補性スクリーニン
グアッセイとの両方に有用である。
【００２３】 更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前記
細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野生型ａｖｅＣ対
立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅ
Ｃ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって
生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させる遺伝子産物をコードす
る突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）を、その細胞によるアベルメク
チンの生成を許容又は誘発する条件下で、培養培地中で培養し、そして、培養物
からアベルメクチンを回収することを含む、アベルメクチンの製造方法を提供す
る。好ましい態様では、前記突然変異を発現する細胞によって生成されたアベル
メクチンのクラス２：１比が、減少する。この製造方法は、商業的に価値のある
アベルメクチン（例えば、ドラメクチン）の生成における効率の増加を提供する
。
【００２４】 更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前記
細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子
構築物を発現することなく野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同
じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発
現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベル
メクチン生成量の変化を引き起こす突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子
構築物を発現する）を、その細胞によるアベルメクチンの生成を許容又は誘発す
る条件下で、培養培地中で培養し、そして、培養物からアベルメクチンを回収す
ることを含む、アベルメクチンの製造方法を提供する。好ましい態様では、前記
の突然変異又は遺伝子構築物を発現する細胞によって生成されるアベルメクチン
の量が、増加する。
【００２５】 更に、本発明は、本発明の突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレ
プトミセス・アベルミティリス株によって生成されるアベルメクチン（ここで、
前記アベルメクチンは、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野
生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミテ
ィリスの同じ株の細胞により生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と比較
して、減少したクラス２：１比で生成される）の新規組成物を提供する。前記の
新規アベルメクチン組成物は、発酵培養液中で生成されたものとして存在するか
、あるいは、それらから回収されたものであることができるか、そして、それら
から部分的に又は実質的に精製したものであることができる。
【００２６】 ４．図面の簡単な説明 図１．ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦを含むＤＮＡ配
列（配列表の配列番号１）及び推定されるアミノ酸配列（配列表の配列番号２）
。 図２．ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ遺伝子の完全ＯＲＦを
含むプラスミドベクターｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）。 図３．ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ中に挿入され
た、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）のｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ１８
６（ＡＴＣＣ２０９６０５）。 図４．ストレプトミセス・アベルミティリス由来のアベルメクチンポリケチド
シンターゼ遺伝子クラスターのＢａｍＨＩ制限地図、及び同定された５種の重複
コスミドクローン（すなわち、ｐＳＥ６５、ｐＳＥ６６、ｐＳＥ６７、ｐＳＥ６
８、ｐＳＥ６９）。ｐＳＥ１１８とｐＳＥ１１９との関係も示す。 図５．ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物の
ＨＰＬＣ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実
施した。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシ
ルＢ１の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。図５Ａ．不活性ａｖｅＣ−ＯＲ
Ｆを有するストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。図５Ｂ．
ｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）で形質転換されたストレプトミセス・ア
ベルミティリスＳＥ１８０−１１株。図５Ｃ．ｐＳＥ１８７で形質転換されたス
トレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。図５Ｄ．ｐＳＥ１８８
で形質転換されたストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。 図６．ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦでコードされ
る推定アミノ酸配列（ＳＥＣ ＩＤ ＮＯ：２）と、ストレプトミセス・グリセ
オクロモゲネス（ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のａｖｅＣ相同部
分的ＯＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（配列表の配列番号５）と、ストレ
プトミセス・ヒグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のａｖｅＣ
相同ＯＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（配列表の配列番号４）との比較。
太字（ｂｏｌｄ）のバリン残基が、タンパク質の推定上のスタート部位である。
保存されている残基を、３種の全ての配列で相同であれば大文字で示し、３種の
配列の内、２つが相同であれば小文字で示す。アミノ酸配列は、約５０％の配列
一致を含む。 図７．ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦ中のＢｓａＡＩ
／ＫｐｎＩ部位に挿入された、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスａｖｅＣ相
同遺伝子由来の５６４ｂｐのＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩフラグメントを含むハイブリ
ッドプラスミド構築物。
【００２７】 ５．発明の詳細な説明 本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス由来のＡｖｅＣ遺伝子産物を
コードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子の同定及び特徴付け
、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物を、アベルメクチン生成におけるそれらの効
果に関してスクリーニングするのに用いることのできるストレプトミセス・アベ
ルミティリスの新規株の構成、そして、或る突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物が
ストレプトミセス・アベルミティリスにより生成されるＢ１：Ｂ２アベルメクチ
ンの比を減少することができるという発見に関する。例えば、プラスミドｐＳＥ
１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅ
Ｃ遺伝子産物をコードする配列と同じヌクレオチド配列か、あるいは、図１（配
列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子
に関して、そして、それから誘導される突然変異したヌクレオチド配列を有する
ポリヌクレオチド分子に関して、後出のセクションに本発明を記載している。し
かしながら、本発明に記載の前記原理は、別のポリヌクレオチド分子、例えば、
別のストレプトミセス種［例えば、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）及びストレプトミセス・グリセオクロモゲネス（ｇｒ
ｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）など］由来のＡｖｅＣ相同遺伝子にも同様に
適用することができる。
【００２８】 ５．１．ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする
ポリヌクレオチド分子 本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの完全ａｖｅＣ−ＯＲＦ又は
その実体部分を含む単離ポリヌクレオチド分子であって、前記単離ポリヌクレオ
チド分子が、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体において、生体内でａ
ｖｅＣ−ＯＲＦの下流に位置する次の完全ＯＲＦを欠失する、前記単離ポリヌク
レオチド分子を提供する。
【００２９】 本発明の前記の単離ポリヌクレオチド分子は、好ましくは、プラスミドｐＳＥ
１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅ
Ｃ遺伝子産物をコードする配列と同じであるか、あるいは、図１（配列表の配列
番号１）のＯＲＦ又はその実体部分のヌクレオチド配列と同じであるヌクレオチ
ド配列を含む。本明細書において、ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅ
Ｃ遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分
子の「実体部分」とは、図１（配列表の配列番号１）に示す完全ａｖｅＣ−ＯＲ
Ｆ配列の少なくとも約７０％を含み、しかも、機能的に等価なＡｖｅＣ遺伝子産
物をコードする単離ポリヌクレオチド分子を意味する。これに関連して、「機能
的に等価な」ＡｖｅＣ遺伝子産物は、ストレプトミセス・アベルミティリスＡＴ
ＣＣ５３６９２株（この株では、天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されてい
る）中で発現した場合に、野生型（ストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣ
Ｃ５３６９２株に天然の機能的ａｖｅＣ対立遺伝子）のみを代わりに発現するス
トレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株によって生成されるア
ベルメクチンと実質的に同じ比及び量の生成を引き起こす遺伝子産物として規定
される。
【００３０】 ａｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列に加えて、本発明の単離ポリヌクレオチ
ド分子は、更に、ストレプトミセス・アベルミティリスの生体内でａｖｅＣ遺伝
子に天然に隣接しているヌクレオチド配列［例えば、図１（配列表の配列番号１
）に示す隣接ヌクレオチド配列］を含むことができる。
【００３１】 本明細書において、用語「ポリヌクレオチド分子」、「ポリヌクレオチド配列
」、「コード配列」、「オープンリーディングフレーム」、及び「ＯＲＦ」は、
一本鎖又は二本鎖のいずれかであることができるＤＮＡ及びＲＮＡ分子を意味す
ることを意図しており、そして、それらは、適当な調節要素の制御下に置かれた
場合に、適当な宿主細胞発現系において、ＡｖｅＣ遺伝子産物に、あるいは、以
下に示すように、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物に、あるいは、ＡｖｅＣ遺伝子産物又
はＡｖｅＣ相同遺伝子産物と相同なポリペプチドに、転写及び翻訳（ＤＮＡ）又
は翻訳（ＲＮＡ）されることができる。コード配列には、原核配列、ｃＤＮＡ配
列、ゲノムＤＮＡ配列、及び化学的に合成されたＤＮＡ及びＲＮＡ配列が含まれ
ることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】 図１（配列表の配列番号１）に示すヌクレオチド配列は、ｂｐ位置４２、１７
４、１７７、及び１８０に、４個の異なるＧＴＧコドンを含む。後出のセクショ
ン９に記載されているように、ａｖｅＣ−ＯＲＦ（図１；配列表の配列番号１）
の５’領域に複合的な欠失を構築することにより、それらのコドンのどれがａｖ
ｅＣ−ＯＲＦ中でタンパク質発現に関するスタート部位として機能することがで
きるかを規定した。ｂｐ４２における第１のＧＴＧ位置の欠失は、ＡｖｅＣ活性
を消失しなかった。ｂｐ位置１７４、１７７、及び１８０における全てのＧＴＧ
コドンと一緒の更なる欠失は、ＡｖｅＣ活性を無くし、このことは、この領域が
タンパク質の発現に必要であることを示している。従って、本発明は、図１（配
列表の配列番号１）に示すｂｐ１７４、１７７、又は１８０ｂｐに位置する任意
のＧＴＧ部位において翻訳を開始する種々の長さのａｖｅＣ−ＯＲＦ、及びそれ
ぞれに対する相当するポリペプチドを含む。
【００３３】 更に、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレ
プトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列に対して、
あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部
分のヌクレオチド配列に対して、相同なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チド分子を提供する。用語「相同」とは、ストレプトミセス・アベルミティリス
ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と相同なポリヌクレオチド分子に関して使
用される場合には、以下のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を意
味する： （ａ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・
アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と同じＡｖｅＣ遺伝子産
物をコードするか、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すＡｖｅＣ−Ｏ
ＲＦのヌクレオチド配列と同じＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするが、遺伝子コー
ドの縮重によるヌクレオチド配列に対するサイレント変化１又はそれ以上を含む
ヌクレオチド配列；又は （ｂ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物
をコードする配列によってコードされるアミノ酸配列をコードするか、あるいは
、図１（配列表の配列番号２）に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチド分子の相補体に対して、適度なストリンジェントな
条件下でハイブリダイズ［すなわち、０．５Ｍ−ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中で、６５℃で、フィルター結合Ｄ
ＮＡへハイブリダイゼーションし、そして、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中
で４２℃で洗浄する］［Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），１９８９，Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．
，及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ２．
１０．３を参照のこと］し、しかも、先に規定した機能的等価ＡｖｅＣ遺伝子産
物をコードするヌクレオチド配列。 好ましい態様では、相同ポリヌクレオチド分子は、プラスミドｐＳＥ１８６（
ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の
相補体に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すヌクレオチド配
列又はその実体部分の相補体に対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズ［すなわち、０．５Ｍ−ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ ＤＳ）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中で、６５℃で、フィルター結合ＤＮＡへハイブリダ
イゼーションし、そして、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄す
る］（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，前出）し、しかも、先に規定した機能的等
価ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする。
【００３４】 ＡｖｅＣ遺伝子産物及びその潜在的機能的等価物の活性は、後出の実施例に記
載のように、発酵生成物をＨＰＬＣ分析することによって決定することができる
。ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物の機能的等価物をコ
ードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子には、天然に現われる
か設計されたかどうかに関わらず、ストレプトミセス・アベルミティリスの別の
株に存在する天然に現われるＡｖｅＣ遺伝子、ストレプトミセスの別の種に存在
するＡｖｅＣ相同遺伝子、及び突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子が含まれる。
【００３５】 更に、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅ
Ｃ遺伝子産物をコードする配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、あ
るいは、図１（配列表の配列番号２）のアミノ酸配列又はその実体部分に対して
、相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含
むポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、図１（配列表の配列番
号２）のアミノ酸配列の「実体部分」とは、図１（配列表の配列番号２）に示す
アミノ酸配列の少なくとも約７０％を含み、しかも、先に規定した機能的等価Ａ
ｖｅＣ遺伝子産物を構成するポリペプチドを意味する。
【００３６】 本明細書において、ストレプトミセス・アベルミティリス由来のＡｖｅＣ遺伝
子産物のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を意味する場合の用語「相同」は、
プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物をコー
ドする配列によりコードされるか、あるいは、図１（配列表の配列番号２）のア
ミノ酸配列を有するが、その中のアミノ酸残基１又はそれ以上が、別のアミノ酸
残基で保存的に（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｌｙ）置換されている（前記の保存
的置換の結果、先に規定した機能的等価遺伝子産物が生じる）ポリペプチドを意
味する。保存的アミノ酸置換は、当業者に周知である。前記の置換を実施するた
めのルールとしては、「Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，１９７８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍ
ｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｖｏｌ，５，
Ｓｕｐ．３」などに記載のものを挙げることができる。より具体的には、保存的
なアミノ酸置換は、側鎖の酸度、極性、又は嵩高さの関連するアミノ酸ファミリ
ー内で一般的に起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般的に
、４種に分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基
性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファ
ン；及び（４）荷電されていない極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、
システイン、セリン、トレオニン、チロシン。また、フェニルアラニン、トリプ
トファン及びチロシンは、芳香族アミノ酸としてまとめて分類される。いずれか
の特定の基内における１又はそれ以上の置換［例えば、イソロイシン又はバリン
によるロイシンの置換、あるいは、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、
あるいは、セリンによるトレオニンの置換、あるいは、構造的に関連するアミノ
酸残基（例えば、類似する酸度、極性、嵩高さ、又はそれらのいくつかの組合せ
における類似性を有するアミノ酸残基）による任意の別のアミノ酸残基の置換］
が、一般的に、ポリペプチドの機能において些細な効果を有するであろう。
【００３７】 更に、本発明は、ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含
む、単離ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書において、「ＡｖｅＣ相同
遺伝子産物」は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ
遺伝子産物をコードする配列によりコードされるアミノ酸配列、あるいは、図１
（配列表の配列番号２）に示すアミノ酸配列を含むストレプトミセス・アベルミ
ティリスのＡｖｅＣ遺伝子産物に対して、少なくとも約５０％のアミノ酸配列同
一性を有する遺伝子産物として規定される。限定されない態様では、ＡｖｅＣ相
同遺伝子産物が、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（欧州出願０２９８４２
３に記載；寄託ＦＥＲＭ ＢＰ−１９０１）由来であり、配列表の配列番号４の
アミノ酸配列又はその実体部分を含む。配列表の配列番号４のアミノ酸配列の「
実体部分」は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも約７０％を含み
、機能的等価ＡｖｅＣ相同体生成物を構成するポリペプチドを意味する。「機能
的等価」ＡｖｅＣ相同遺伝子産物は、天然ａｖｅＣ相同対立遺伝子が不活性化さ
れているストレプトミセス・ヒグロスコピカス株ＦＥＲＭ ＢＰ−１９０１中で
発現した場合に、野生型（ストレプトミセス・ヒグロスコピカス株ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１９０１に天然の機能的ａｖｅＣ相同対立遺伝子）のみを代わりに発現する
ストレプトミセス・ヒグロスコピカス株ＦＥＲＭ ＢＰ−１９０１によって生成
されるミルベマイシンと実質的に同じ比及び量の生成を引き起こす遺伝子産物と
して規定される。限定されない態様では、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス
ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする本発明の単離ポリヌクレオチド分子は、配
列表の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体部分を含む。これに関連して
、配列表の配列番号３のヌクレオチド配列を含む単離ヌクレオチド分子の「実体
部分」は、配列表の配列番号３のヌクレオチド配列の少なくとも７０％を含み、
直前に規定した機能的等価ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする単離ポリヌクレ
オチド分子を意味する。
【００３８】 更に、本発明は、配列表の配列番号３のストレプトミセス・ヒグロスコピカス
のヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチド分子
を提供する。用語「相同」は、配列表の配列番号３のストレプトミセス・ヒグロ
スコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードする配列に相同なヌクレオチド配列
を含むポリヌクレオチド分子を意味することに用いる場合には、以下のヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチド分子を意味する： （ａ）配列表の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体部分と同じ遺伝子産
物をコードするが、遺伝子コードの縮重によるヌクレオチド配列に対するサイレ
ント変化１又はそれ以上を含むヌクレオチド配列；又は （ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチド分子の相補体に対して、適度なストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズ［すなわち、０．５Ｍ−ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリ ウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中で、６５℃で、フィルター結合ＤＮＡへハ
イブリダイゼーションし、そして、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で４２℃
で洗浄する］（前出のＡｕｓｕｂｅｌら参照）し、しかも、先に規定した機能的
等価ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列。 好ましい態様では、相同ポリヌクレオチド分子が、配列表の配列番号３のＡｖ
ｅＣ相同遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列又はその実体部分の相補体に
対して、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ［すなわち、０．５Ｍ−
ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ−ＥＤＴＡ中で 、６５℃で、フィルター結合ＤＮＡへハイブリダイゼーションし、そして、０．
１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄する］（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９
８９，前出）し、しかも、先に規定した機能的等価ＡｖｅＣ相同遺伝子産物をコ
ードする。
【００３９】 更に、本発明は、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産
物と相同なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
分子を提供する。本明細書において、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス由来
の配列表の配列番号４のＡｖｅＣ相同遺伝子産物と相同なポリペプチドを意味す
る場合の用語「相同」は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するが、その
中のアミノ酸残基１又はそれ以上が、別のアミノ酸残基で保存的に置換されてい
る（前記の保存的置換の結果、先に規定した機能的等価相同遺伝子産物が生じる
）ポリペプチドを意味する。
【００４０】 更に、本発明は、図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対して、あるいは、図１（配列表
の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチド分子に対してハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを提供する。前記オリゴヌクレオチドは、長さが、少なくとも約１０ヌ
クレオチド、好ましくは長さ約１５〜約３０ヌクレオチドであり、そして、高ス
トリンジェントな条件下で前記ポリヌクレオチド分子の１つとハイブリダイズ（
すなわち、６×ＳＳＣ／０．５％ピロリン酸ナトリウム中で、〜１４塩基オリゴ
に対して〜３７℃で、〜１７塩基オリゴに対して〜４８℃で、〜２０塩基オリゴ
に対して〜５５℃で、そして、〜２３塩基オリゴに対して〜６０℃で洗浄する）
する。好ましい態様では、前記オリゴヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチド分
子の一つの一部と相補的である。これらのオリゴヌクレオチドは、種々の目的、
例えば、遺伝子調節に有用なアンチセンス分子を、あるいは、ａｖｅＣ−又はａ
ｖｅＣ相同体をコードするポリヌクレオチド分子の増幅におけるプライマーを、
コード又は作用させる目的に有用である。
【００４１】 更なるａｖｅＣ相同遺伝子は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子又はオ
リゴヌクレオチドを、公知の技術と関連させて使用することによって、ストレプ
トミセスの別の種又は株中で同定することができる。例えば、図１（配列表の配
列番号１）のストレプトミセス・アベルミティリスのヌクレオチド配列の一部、
又は配列表の配列番号３のストレプトミセス・ヒグロスコピカスのヌクレオチド
配列の一部を含むオリゴヌクレオチド分子を、検出可能に標識化し、そして、興
味ある生物由来のＤＮＡから構成されるゲノムライブラリーをスクリーニングす
ることに使用することができる。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェン
シーは、参考生物（本実施例では、ストレプトミセス・アベルミティリス又はス
トレプトミセス・ヒグロスコピカス）と興味ある生物との関係に基づいて選択す
る。種々のストリンジェンシー条件に対する要求は、当業者に周知であり、前記
条件は、ライブラリー及び標識配列を提供する特定の生物に従って、予想可能に
変化する。前記オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも約１５ヌクレオチドで
あることが好ましく、例えば、後出の実施例に記載のものを挙げることができる
。相同遺伝子の増幅は、これらの及び別のオリゴヌクレオチドを使用し、標準的
技術［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）］を適用することによって実施
することができるが、当業界で公知の他の増幅技術（例えば、リガーゼ鎖反応）
も用いることができる。
【００４２】 ａｖｅＣ相同ヌクレオチド配列を含むと確認されたクローンを、機能的Ａｖｅ
Ｃ相同遺伝子産物をコードする能力に関して試験することができる。この目的の
ために、前記クローンを、配列分析して、適当なリーディングフレーム、並びに
開始及び終止信号を確認する。あるいは、又は更に、クローン化したＤＮＡ配列
を適当な発現ベクター（すなわち、挿入したタンパク質コード配列の転写及び翻
訳に必要な要素を含むベクター）中に挿入することができる。多様な宿主／ベク
ター系のいずれも、以下のとおりに用いることができ、以下に限定するものでは
ないが、細菌に関する系、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又はコス
ミド発現ベクターが含まれる。次に、潜在的なａｖｅＣ相同体をコードする配列
を含む前記ベクターで形質転換された適当な宿主細胞を、例えば、後出のセクシ
ョン７に記載のとおりに、発酵生成物をＨＰＬＣ分析する方法を用いて、Ａｖｅ
Ｃ−タイプ活性に関して分析することができる。
【００４３】 本明細書で開示するポリヌクレオチド分子の生成及び操作は、当業者の技術の
範囲内であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｉｎｎｉｓら（ｅｄｓ），１９
９５，ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ
．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；及びＥｒｌｉｃｈ（ｅｄ），１９９２，ＰＣＲ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（これらのすべては引用により、本明細書中に組込まれる）に記載の
組換え技術に従って実施することができる。ＡｖｅＣ遺伝子産物又はＡｖｅＣ相
同遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドクローンは、当業者に公知の任意の
方法（例えば、これに限定されないが、後出のセクション７に記載の方法）を用
いて同定することができる。ゲノムＤＮＡライブラリーは、例えば、バクテリオ
ファージライブラリーに関しては、Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６：１８０及びプラスミドライブラリーに関しては、
Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｈｏｇｎｅｓｓ，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：３９６１−３９６５に記載の技術を用いて
、ａｖｅＣ及びａｖｅＣ相同体をコードする配列に関してスクリーニングするこ
とができる。ａｖｅＣ−ＯＲＦを含むことが知られているヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチド分子［例えば、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９
６０４）又はプラスミドｐＳＥ１１９（後出のセクション７に記載）に存在する
］は、それらのスクリーニング実験においてプローブとして使用することができ
る。あるいは、精製されたＡｖｅＣ相同遺伝子産物のアミノ酸配列の一部又は全
体から推定されるヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドプローブを合
成することができる。
【００４４】 ５．２．組換え系 ５．２．１．クローニング及び発現ベクター 更に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子（例えば、ストレプトミセス
・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ又は任意のａｖｅＣ相同体ＯＲＦを含む
）のクローニング又は発現に有用な、組換えクローニングベクター及び発現ベク
ターを供給する。非限定的な態様では、本発明は、ストレプトミセス・アベルミ
ティリスのａｖｅＣ遺伝子の完全ＯＲＦを含むプラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣ
Ｃ ２０９６０４）を提供する。 ストレプトミセス・アベルミティリス由来のａｖｅＣ−ＯＲＦ、又はストレプ
トミセス・アベルミティリス由来のａｖｅＣ−ＯＲＦ若しくはその一部を含むポ
リヌクレオチド分子、又はストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子
産物に関する以下の全ての記載は、特に断わらない限り、ａｖｅＣ相同体及びＡ
ｖｅＣ相同遺伝子産物も意味する。
【００４５】 多様な種々のベクター、例えば、ファージ、高コピー数のプラスミド、低コピ
ー数のプラスミド、及びＥ．ｃｏｌｉ−ストレプトミセスシャトルベクターなど
が、ストレプトミセスにおける特定の使用のために開発されて来ており、そして
、それらのいずれもが本発明の実施に使用することができる。また、多くの薬物
耐性遺伝子がストレプトミセスからクローン化されており、それらの遺伝子のい
くつかが選択マーカーとしてベクター中に組込まれている。ストレプトミセス中
で使用するための現行のベクターの例が、他の場所（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，１
９８０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１６９−１
９０）に存在する。
【００４６】 本発明の組換えベクター（特に発現ベクター）は、好ましくは、本発明のポリ
ヌクレオチド分子のためのコード配列が、ポリペプチドを生成するためのコード
配列の転写及び翻訳のために必要な調節要素１個以上と有効に関連して存在する
よう構成される。本明細書において、用語「調節要素」には、以下に限定するこ
となく、誘発性及び非誘発性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、並び
他の要素をコードするヌクレオチド配列が含まれる。なお、前記の他の要素とは
、ポリヌクレオチドをコードする配列の発現を誘導及び／又は調節するのに使用
される当業者に公知の別の要素である。また、本明細書において、前記のコード
配列は、調節要素１以上と「有効に関連」しており、ここで、前記調節要素は、
前記コード配列の転写又はそのｍＲＮＡの翻訳、あるいはその両方を、有効に調
節及び許容する。
【００４７】 本発明のポリヌクレオチド分子を含むように設計することができる典型的なプ
ラスミドベクターとしては、多くの別のものの中で、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＣ
Ｒ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び
シャトルベクターｐＷＨＭ３（Ｖａｒａら，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７１：
５８７２−５８８１）を挙げることができる。
【００４８】 適当な調節要素と有効に関連する特定のコード配列を含む組換えベクターの構
築方法は、当業者に周知であり、それらを本発明の実施に用いることができる。
これらの方法としては、例えば、イン・ビトロ組換え技術、合成技術、及びイン
・ビボ遺伝的組換えを挙げることができる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９
８９（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９８９（前出）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１
９８９（前出）；及びＥｒｌｉｃｈ，１９９２（前出）に記載の技術を参照され
たい。
【００４９】 これらのベクターの調節要素は、強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）及び特異性におい
て変化させることができる。用いる宿主／ベクター系によって、多くの適当な転
写及び翻訳要素の全てを使用することができる。細菌に関する転写調節領域又は
プロモーターの非限定的な例としては、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモー
ター、ＴＡＣプロモーター、λレフト及びライトプロモーター、ｔｒｐ及びｌａ
ｃプロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターを挙げることができ、ストレ
プトミセスに関してより具体的には、プロモーターｅｒｍＥ、ｍｅｌＣ、及びｔ
ｉｐＡなどを挙げることができる。後出のセクション１１に記載の特定の態様で
は、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来の強力な構成的ｅｒｍＥプロモーターに隣接してク
ローン化したＡｖｅＣ−ＯＲＦを含む発現ベクターを生成した。前記ベクターを
ストレプトミセス・アベルミティリス中に形質転換し、続いて発酵生成物をＨＰ
ＬＣ分析したところ、代わりに野生型ａｖｅＣ対立遺伝子を発現する同じ株によ
って生成されるアベルメクチンと比較して、生成されたアベルメクチンの量が増
えていることが明らかになった。
【００５０】 融合タンパク質発現ベクターを、ＡｖｅＣ遺伝子産物−融合タンパク質を発現
するために使用することができる。精製された融合タンパク質は、ＡｖｅＣ遺伝
子産物に対する抗血清を生じせしめるために、ＡｖｅＣ遺伝子産物の生化学特性
を研究するために、種々の生化学活性を有するＡｖｅＣ融合タンパク質を構築す
るために、あるいは、発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物の同定又は精製を助けるた
めに、使用することができる。可能な融合タンパク質発現ベクターとしては、以
下に限定されるものでなく、β−ガラクトシダーゼ及びｔｒｐＥ融合体、マルト
ース結合タンパク質融合体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合体、及
びポリヒスチジン融合体（キャリヤー領域）をコードする配列が組込まれている
ベクターを含む。別の態様では、ＡｖｅＣ遺伝子産物又はその一部を、ストレプ
トミセスの別の種又は株［例えば、ストレプトミセス・ヒグロスコピカス又はス
トレプトミセス・グリセオクロモゲネス（ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ
）］由来のＡｖｅＣ相同遺伝子産物又はその一部と融合させることができる。特
に好ましい態様が、後出のセクション１２に記載されており、図７に記載されて
いる。キメラプラスミドは、ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ−Ｏ
ＲＦの相同な５６４ｂｐ領域に換えて、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスａ
ｖｅＣ相同ＯＲＦの５６４ｂｐ領域を含むように構築した。前記ハイブリッドベ
クターは、ストレプトミセス・アベルミティリス細胞に形質転換し、そして、そ
れらの効果（例えば、生成されるアベルメクチンのクラス２：１比における効果
）に関して試験することができる。
【００５１】 ＡｖｅＣ融合タンパク質は、精製のために有用な領域を含むように構築するこ
とができる。例えば、ＡｖｅＣ−マルトース−結合タンパク質融合体を、アミロ
ース樹脂を用いて精製することができ；ＡｖｅＣ−グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ融合タンパク質を、グルタチオン−アガロースビーズを用いて精製す
ることができ；そして、ＡｖｅＣ−ポリヒスチジン融合体を、２価のニッケル樹
脂を用いて精製することができる。あるいは、担体タンパク質又はペプチドに対
する抗体を、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製に使用す
ることができる。例えば、モノクローナル抗体の標的エピトープをコードするヌ
クレオチド配列を、調節要素と有効に関連する発現ベクター中に構築し、そして
発現されるエピトープがＡｖｅＣポリペプチドに融合するように位置決定するこ
とができる。例えば、親水性マーカーペプチドであるＦＬＡＧTMエピトープタグ
（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
をコードするヌクレオチド配列は、標準技術により、相当する位置（例えば、Ａ
ｖｅＣポリペプチドのカルボキシル末端）で発現ベクター中に挿入することがで
きる。次に、発現したＡｖｅＣポリペプチド−ＦＬＡＧTMエピトープ融合生成物
を検出し、そして市販の抗−ＦＬＡＧTM抗体を用いてアフィニティー精製するこ
とができる。
【００５２】 また、ＡｖｅＣ融合タンパク質をコードする発現ベクターは、特定のプロテア
ーゼ切断部位をコードするポリリンカー配列を含むよう構築することができ、そ
の結果、発現したＡｖｅＣポリペプチドは、特定のプロテアーゼによる処理によ
り担持領域又は融合パートナーから開放されることができる。例えば、融合タン
パク質ベクターは、特には、トロンビン又はＸａ因子切断部位をコードするＤＮ
Ａ配列を含むことができる。 ａｖｅＣ−ＯＲＦの上流に（ａｖｅＣ−ＯＲＦとリーディングフレームとなる
ように）存在するシグナル配列は、公知の方法により、発現される遺伝子産物の
転送（トラフィキング）及び分泌を指図するために、発現ベクター中に構築する
ことができる。シグナル配列の非制限的な例としては、特には、α−因子、免疫
グロブリン、外層膜タンパク質、ペニシリナーゼ、及びＴ−細胞受容体由来のも
のを挙げることができる。
【００５３】 本発明のクローニング又は発現ベクターにより形質転換又はトランスフェクト
された宿主細胞の選択を助けるために、ベクターを、更にレポーター遺伝子産物
又は他の選択マーカーのためのコード配列を含むように構築することができる。
そのようなコード配列は、前記の調節要素をコードする配列と有効に関連して存
在することが好ましい。本発明において有用なレポーター遺伝子は、当業界にお
いて周知であり、例えば、特には、緑色螢光タンパク質、ルシフェラーゼ、ｘｙ
ｌＥ、及びチロシナーゼをコードするものを挙げることができる。選択マーカー
をコードするヌクレオチド配列は、当業界において周知であり、抗生物質又は抗
−代謝物に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードするか、あるいは、栄養要
求性必要条件を供給するものが含まれる。前記配列の例には、特には、エリスロ
マイシン、チオストレプトン、又はカナマイシンに対する耐性をコードするもの
が含まれる。
【００５４】 ５．２．２．宿主細胞の形質転換 更に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子又は組換えベクターを含む形
質転換された宿主細胞、及びそれらから誘導される新規株又は細胞系を供給する
。本発明の実施において有用な宿主細胞は、好ましくは、ストレプトミセス細胞
であるが、但し、他の原核細胞又は真核細胞も使用することができる。典型的に
は、前記の形質転換された宿主細胞としては、以下に限定されずに、特には、微
生物、例えば、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくは
コスミドＤＮＡベクターにより形質転換された細菌、又は組換えベクターで形質
転換された酵母が含まれる。
【００５５】 本発明のポリヌクレオチド分子は、ストレプトミセス細胞において機能するよ
う意図されるが、しかしまた、例えば、クローニング又は発現目的のために、他
の細菌又は真核細胞中に形質転換されることができる。典型的には、Ｅ．ｃｏｌ
ｉの株、例えば、ＤＨ５α株［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ（受託
番号３１３４３）又は市場（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手することができる
］を使用することができる。好ましい真核宿主細胞としては、酵母細胞を挙げる
ことができるが、哺乳類細胞又は昆虫細胞も効果的に使用することができる。
【００５６】 本発明の組換え発現ベクターは、好ましくは、実質的に均質の細胞培養物の宿
主細胞１個以上を形質転換又はトランスフェクトする。発現ベクターは、一般的
に、公知技術（例えば、プロトプラスト形質転換、リン酸カルシウム沈殿、塩化
カルシウム処理、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、組換え
ウィルスとの接触によるトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェク
ション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、トランスダクション、
接合、又はマイクロプロジェクティル衝撃）に従って、宿主細胞中に導入する。
形質転換体の選択は、標準的手順、例えば、選択マーカー（例えば、前記のよう
に、組換えベクターと関連する耐抗生物質性）を発現する細胞に関する選択によ
り実施することができる。
【００５７】 発現ベクターが宿主細胞中に導入されているならば、宿主細胞染色体における
又はエピソームにおける、ａｖｅＣコード配列の組込み及び維持を、標準的技術
、例えば、サザンハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、ＰＣＲ分析［逆
転写酵素ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含む］により、あるいは、予測される遺伝子
産物を検出する免疫学的アッセイにより確かめることができる。組換えａｖｅＣ
コード配列を含む及び／又は発現する宿主細胞は、少なくとも４種の当業界で周
知の一般的アプローチのいずれかによって同定することができる：（ｉ）ＤＮＡ
−ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡ、又はＲＮＡ−アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼー
ション；（ii）「マーカー」遺伝子機能の存在の検出；（iii) 宿主細胞におけ るａｖｅＣ−特異的ｍＲＮＡ転写体の発現により測定されるような転写のレベル
の評価；及び（iv）例えば、イムノアッセイにより、又はＡｖｅＣ生物学的活性
（例えば、例えばストレプトミセス・アベルミティリス宿主細胞におけるＡｖｅ
Ｃ活性を啓示する、アベルメクチン生産の特異的な割合及び量）の存在によって
測定される成熟ポリペプチド生成物の存在の検出。
【００５８】 ５．２．３．組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の発現及び特徴付け ａｖｅＣコード配列が適当な宿主細胞中に安定して導入されているならば、形
質転換された細胞宿主がクローン的に増殖され、そしてその得られる細胞は、ａ
ｖｅＣ遺伝子産物の最大生成の助けとなる条件下で増殖させることができる。前
記条件は、典型的には、細胞の高密度への増殖が含まれる。発現ベクターが誘発
性プロモーターを含む場合、適当な誘発条件、例えば、温度シフト、栄養物の消
耗、余計な誘発物質［例えば、炭水化物の類似体、例えばイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）］の添加、又は過剰代謝副生成物の蓄積
などが、発現を誘発する必要がある場合に使用される。
【００５９】 発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物が宿主細胞内に保持される場合、細胞を、収穫
及び溶解し、そしてその溶解物から、タンパク質分解を最少にするための当業界
で公知の抽出条件（例えば、４℃で、又はプロテアーゼ阻害剤の存在下で、ある
いはその両方）において、生成物を単離及び精製する。発現されたＡｖｅＣ遺伝
子産物が宿主細胞から分泌される場合、消耗された栄養培地を単純に収集し、そ
してそれから生成物を単離することができる。
【００６０】 発現されたＡｖｅＣ遺伝子産物は、所望により、標準的方法、例えば、以下に
限定するものでないが、以下の方法（すなわち、硫酸アンモニウム沈殿、サイズ
分別、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、密度遠心分離、及びアフィニ
ティークロマトグラフィー）の任意の組み合わせを用いて、細胞溶解物又は培養
培地から単離又は実質的に精製することができる。発現されたＡｖｅＣ遺伝子産
物が生物学的活性を示す場合、適切なアッセイを用いることによって、調製物の
上昇する純度を、精製手順の各工程で観視することができる。発現されたＡｖｅ
Ｃ遺伝子産物が生物学的活性を示すか示さないにかかわらず、例えば、サイズに
より、あるいは、さもなければＡｖｅＣに対して特異的な抗体との反応性に基づ
いて、あるいは、融合タグの存在により検出することができる。
【００６１】 従って、本発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖ
ｅＣ遺伝子産物をコードする配列によってコードされるアミノ酸配列を、あるい
は、図１（配列表の配列番号２）のアミノ酸配列又はその実体部分を含む組み換
え発現したストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物、及びその
相同体を提供する。 更に、本発明は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列又はその実体部分を含む
組み換え発現したストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物
及びその相同体を提供する。
【００６２】 更に、本発明は、組換え発現ベクター［前記ベクターは、ＡｖｅＣ遺伝子産物
をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリ
ヌクレオチド分子は、宿主細胞中における前記ポリヌクレオチド分子の発現を制
御する調節要素１種以上と有効な関係がある］で形質転換した宿主細胞を、組換
えＡｖｅＣ遺伝子産物の生成を促す条件下で培養し、そしてその細胞培養物から
ＡｖｅＣ遺伝子産物を回収することを含む、ＡｖｅＣ遺伝子産物の製造方法を提
供する。
【００６３】 前記の組み替え発現ストレプトミセス・アベルミティリスＡＶＥｃ遺伝子産物
は、種々の目的（例えば、ＡｖｅＣ遺伝子生成機能を変化させ、それにより、ア
ベルメクチン生合成を調整する化合物をスクリーニングする目的、及びＡｖｅＣ
遺伝子産物に対する抗体を生じさせる目的）に有用である。
【００６４】 充分な純度のＡｖｅＣ遺伝子産物が得られれば、それを、標準的方法（例えば
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、アミノ酸配列分析、アベ
ルメクチン生合成経路における適当な生成物の生成における生物学的活性など）
によって特徴付けることができる。例えば、ＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸配列
を、標準的ペプチド配列決定技術を用いて決定することができる。更に、Ａｖｅ
Ｃ遺伝子産物の疎水性及び親水性領域を同定するために、ＡｖｅＣ遺伝子産物を
、親水性分析（例えば、Ｈｏｐｐ ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４を参照されたい）、又
は類似ソフトウェアアルゴリズムを用いて特徴付けることができる。特定の二次
構造を想定するＡｖｅＣ遺伝子産物の領域を同定するために、構造分析を実施す
ることができる。ＡｖｅＣ遺伝子産物とその基質との間の相互作用の部位をマッ
ピング及び研究するために、生物物理学的方法、例えばＸ線結晶学（Ｅｎｇｓｔ
ｒｏｍ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７−１３）、コ
ンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ ａｎｄ Ｚｏｌｌｅｒ（ｅｄ
ｓ），１９８６，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、及び核
磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用することができる。それらの研究から得られる情報は
、より所望するアベルメクチン生成特徴を有するストレプトミセス・アベルミテ
ィリスの新菌株の開発を助けるために、ＡｖｅＣのＯＲＦにおける突然変異のた
めの新規部位を選択するために使用することができる。
【００６５】 ５．３．ＡｖｅＣ突然変異体の構成及び使用 本発明は、突然変異１又はそれ以上を更に含む（そのため、野生型ａｖｅＣ対
立遺伝子が不活性化されており、しかも、突然変異したヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチド分子が発現しているストレプトミセス・アベルミティリス株Ａ
ＴＣＣ５３６９２の細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する
ストレプトミセス・アベルミティリス株ＡＴＣＣ５３６９２の細胞によって生成
されるものと異なる割合及び量でアベルメクチンを生成する）こと以外は、プラ
スミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミテ
ィリスのＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と、あるいは、図１（配列表の配
列番号１）に示すストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦのヌ
クレオチド配列と同じであるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提
供する。
【００６６】 本発明によれば、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株と
比較して、アベルメクチン生成における検出可能な変化を示すＳ．アベルメクチ
ンの新規株を製造するために、前記ポリヌクレオチド分子を用いることができる
。好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子
のみを代わりに発現する同じ株と比較して、減少したクラス２：１比でアベルメ
クチンを生成するＳ．アベルメクチンの新規株を製造することに有用である。更
に好ましい態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子
のみを代わりに発現する同じ株と比較して、増加したレベルでアベルメクチンを
生成するＳ．アベルメクチンの新規株を製造することに有用である。更に好まし
い態様では、前記ポリヌクレオチド分子は、ａｖｅＣ遺伝子が不活性化されてい
るストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を製造することに有用である。
【００６７】 ａｖｅＣコード配列に対する突然変異には、ＡｖｅＣ遺伝子産物にアミノ酸の
欠失、付加、又は置換を起こさせるか、あるいは、ＡｖｅＣ遺伝子産物のトラン
ケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を引き起こし（又はそれらの任意の組み合
わせ）、しかも、所望の結果が得られる任意の突然変異が含まれる。例えば、本
発明は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産
物をコードする配列、又は図１（配列表の配列番号１）に示すストレプトミセス
・アベルミティリスのＡｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列を含むが、更に、Ａ
ｖｅＣ遺伝子産物中の選択した位置において或るアミノ酸残基が別のアミノ酸残
基によって置換されることをコードする突然変異１又はそれ以上を含む、ポリヌ
クレオチド分子を提供する。後に例示するいくつかの非限定的な態様では、前記
置換を、５５、１３８、１３９、又は２３０のアミノ酸位置、又はそれらのいく
つかの組み合わせにおいて実施することができる。
【００６８】 ａｖｅＣコード配列に対する突然変異は、種々公知の方法によって（例えば、
エラー傾向ＰＣＲ又はカセット突然変異誘発を用いることによって）、実施する
ことができる。例えば、オリゴヌクレオチド演出（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異
誘発を、明らかにされた方法（例えば、制限部位又は終始コドン１以上をＡｖｅ
Ｃ−ＯＲＦ配列中の特定の領域に導入する方法）で、ａｖｅＣ−ＯＲＦ配列を変
化させることに用いることができる。例えば、米国特許５６０５７９３に記載の
方法（ランダムフラグメンテーション、突然変異誘発の繰り返しサイクル、及び
ヌクレオチドシャッフリングを含む）も、ａｖｅＣ突然変異をコードするヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチドの大きなライブラリーを形成することに用
いることができる。
【００６９】 標的突然変異は、有用であることができ、特に、ＡｖｅＣ遺伝子産物における
保存されたアミノ酸残基１以上を変化させるためにそれらを役立たせる場合に有
用である。例えば、図６に示すように、ＡｖｅＣ遺伝子産物の推定アミノ酸配列
と、ストレプトミセス・アベルミティリス（配列表の配列番号２）、ストレプト
ミセス・グリセオクロモゲネス（配列表の配列番号５）、及びストレプトミセス
・ヒグロスコピカス（配列表の配列番号４）由来のＡｖｅＣ相同遺伝子産物との
比較は、それらの種の間のアミノ酸残基の重要な保存の位置を明らかにする。こ
れらの保存されたアミノ酸残基１個以上において変化をもたらす標的突然変異誘
発は、アベルメクチン生成において所望の変化を示す新規変異株を製造すること
に特に有効であることができる。
【００７０】 また、ランダム突然変異誘発も、有用であることができ、そして紫外線若しく
はＸ線、又は化学的突然変異誘発物質（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロソグ
アニジン、エチルメタンスルホネート、亜硝酸、又は窒素マスタード）にストレ
プトミセス・アベルミティリスの細胞をさらすことによって実施することができ
る。例えば、突然変異誘発技術の参考用に、Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８９（前出）
を参照されたい。
【００７１】 突然変異したポリヌクレオチド分子が生成したならば、それらをスクリーニン
グして、それらがストレプトミセス・アベルミティリスにおけるアベルメクチン
生合成を調整できるか否かを決定する。好ましい態様では、突然変異したヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ａｖｅＣ遺伝子が不活性化するこ
とによりａｖｅＣ陰性（ａｖｅＣ’）背景（ａｖｅＣ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａ
ｃｋｇｒｏｕｎｄ）を示すストレプトミセス・アベルミティリス株における補完
（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）によって試験する。非限定的な方法では、突然
変異したポリヌクレオチド分子を、調節要素１種以上と有効に関連する発現プラ
スミド（このプラスミドは、形質転換した細胞を選択可能な薬剤耐性遺伝子１種
以上も含むことが好ましい）中にスプライスさせる。次に、このベクターを、公
知技術を用いてａｖｅＣ宿主細胞中に形質転換させ、そして形質転換した細胞を
、適当な発酵培地中で、アベルメクチン生成を許容又は誘発する条件下で、選択
及び培養する。次に、発酵生成物を、ＨＰＬＣによって分析して、突然変異した
ポリヌクレオチド分子が宿主細胞を補完する能力を決定する。アベルメクチンの
Ｂ２：Ｂ１比を減少させることのできる突然変異したポリヌクレオチド分子を担
持するいくつかのベクター（例えば、ｐＳＥ１８８、ｐＳＥ１９９、及びｐＳＥ
２３１）を、後出のセクション８．３に例示する。
【００７２】 本発明は、生成されるアベルメクチンの比及び／又は量を変えることのできる
ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦにおける突然変異の同
定方法を提供する。好ましい態様では、本発明は、（ａ）天然のａｖｅＣ対立遺
伝子が不活性化されており、しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコード
するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現しているス
トレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチン
のクラス２：１比を決定し；（ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌク
レオチド配列、あるいは、それに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立
遺伝子のみを代わりに発現すること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス
・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１
比を決定し；そして、（ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス
細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のスト
レプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラ
ス２：１比とを比較し；工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞
によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のストレプ
トミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２
：１比とが異なる場合に、アベルメクチンのクラス２：１比を変化させることの
できるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定することを含む、生成されるアベルメ
クチンのクラス２：１比を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異
を同定する方法を提供する。好ましい態様では、突然変異によってアベルメクチ
ンのクラス２：１比が減少する。
【００７３】 更に好ましい態様では、本発明は、（ａ）天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性
化されており、しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオ
チド配列を含むか、あるいは、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配
列を含む遺伝子構築物を含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現しているス
トレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチン
の量を決定し；（ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列
、あるいは、それに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子のみを
代わりに発現すること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス・アベルミテ
ィリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量を決定し；そして、（ｃ
）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるア
ベルメクチンの量と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞に
よって生成されるアベルメクチンの量とを比較し；工程（ａ）のストレプトミセ
ス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量と、工程（ｂ
）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチ
ンの量とが異なる場合に、アベルメクチンの量を変化させることのできるａｖｅ
Ｃ−ＯＲＦ又は遺伝子構築物の突然変異を同定することを含む、生成されるアベ
ルメクチンの量を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦ又はａｖｅＣ−ＯＲ
Ｆを含む遺伝子構築物の突然変異を同定する方法を提供する。
【００７４】 突然変異を同定するための前記の全ての方法は、発酵培養培地（好ましくは、
シクロヘキサンカルボン酸を補充した発酵培養培地）を用いることによって実施
するが、別の適当な脂肪酸前駆体（例えば、表１に挙げた脂肪酸前駆体）も用い
ることができる。
【００７５】 所望の方向のアベルメクチン生成を調整する突然変異されたポリヌクレオチド
分子が同定されているならば、そのヌクレオチド配列における突然変異の位置を
決定することができる。例えば、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を、ＰＣＲによって単離し、そ
して公知の方法を用いてＤＮＡ配列分析を行うことができる。突然変異したａｖ
ｅＣ対立遺伝子のＤＮＡ配列と、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のＤＮＡ配列とを比
較することによって、アベルメクチン生成における変化に関する突然変異反応性
を決定することができる。具体的であるが非限定的な本発明の態様では、５５（
Ｓ５５Ｆ）、１３８（Ｓ１３８Ｔ）、１３９（Ａ１３９Ｔ）、若しくは２３０（
Ｇ２３０Ｇ）の任意の残基における単独のアミノ酸の置換、又は１３８（Ｓ１３
８Ｔ）及び１３９（Ａ１３９Ｔ）位置における二重置換のいずれかを含むストレ
プトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物は、ＡｖｅＣ遺伝子産物の機
能における変化を生じた。例えば、生成されるクラス２：１アベルメクチンの比
が変わった（後出のセクション８を参照されたい）。従って、５５、１３８、１
３９、又は２３０のアミノ酸残基１以上又はそれらの任意の組み合わせにおける
アミノ酸置換を含む突然変異したストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ
遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子は、本
発明に含まれる。
【００７６】 更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株（その細胞は
、アベルメクチン生成を変化させる結果となる突然変異ａｖｅＣ対立遺伝子を含
む）を製造するための組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の突然変異
ヌクレオチド配列を含む全てのポリヌクレオチド分子を、ストレプトミセス・ア
ベルミティリス染色体のＡｖｅＣ遺伝子の部位に向かわせることにより、相同組
換えによるａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその一部を挿入又は置換するのに使用すること
のできる組み換えベクターを提供する。しかしながら、本発明によれば、これと
共に提供された本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子
は、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体中のａｖｅＣ遺伝子以外の部位
に挿入された場合、あるいは、ストレプトミセス・アベルミティリス細胞中でエ
ピソーム的に維持された場合に、アベルメクチン生合成を調整するように機能す
ることもできる。従って、本発明は、本発明の突然変異ヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチド分子を含むベクターも提供する。前記ベクターは、ストレプト
ミセス・アベルミティリス染色体中のａｖｅＣ遺伝子以外の部位にポリヌクレオ
チド分子を挿入するために、あるいは、エピソーム的に維持するために用いるこ
とができる。
【００７７】 好ましい態様では、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの株の細
胞中に突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を挿入して、ストレプトミセス・アベル
ミティリスの新規株（その細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発
現する同じ株の細胞と比較して、異なるクラス２：１比でアベルメクチンを生成
する）を生成するのに用いることができる遺伝子置換ベクターを提供する。好ま
しい態様では、前記細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比が
減少する。前記遺伝子置換ベクターは、これと共に提供される発現ベクター、例
えばｐＳＥ１８８、ｐＳＥ１９９、及びｐＳＥ２３１（これらの発現ベクターは
、後出のセクション８．３中に例示されている）中に存在する突然変異したポリ
ヌクレオチド分子を用いて構築することができる。
【００７８】 更に好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに
発現する同じ株の細胞と比較して、異なる量のアベルメクチンを生成する新規株
を生成するために、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞中に突然変異
したａｖｅＣ対立遺伝子を挿入するのに用いることのできるベクターを提供する
。好ましい態様では、前記細胞によって生成されるアベルメクチンの量が増加す
る。具体的であるが非限定的な態様では、前記ベクターは、更に、当業者に公知
の強力なプロモーター、例えば、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来の強力な構成的ｅｒｍ
Ｅプロモーター（これは、ａｖｅＣ−ＯＲＦの上流に位置し、そしてａｖｅＣ−
ＯＲＦと有効に関連している）を含む。前記ベクターは、プラスミドｐＳＥ１８
９（後出の実施例１１に記載）であることができるか、あるいは、プラスミドｐ
ＳＥ１８９の突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を用いて構築することができる。
【００７９】 更に好ましい態様では、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリスの野
生型株におけるａｖｅＣ遺伝子を不活性化することに有用な遺伝子置換ベクター
を提供する。非限定的な態様では、前記遺伝子置換ベクターを、プラスミドｐＳ
Ｅ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）［これは、後出のセクション８．１で例示さ
れている（図３）］中に存在する突然変異したポリヌクレオチド分子を用いて構
築することができる。更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス染
色体において、生体内でＡｖｅＣ遺伝子に天然に隣接するヌクレオチド配列［例
えば、図１（配列表の配列番号１）に示す隣接ヌクレオチド配列］からなるか、
あるいは、それを含むポリヌクレオチド分子を含む遺伝子置換ベクターを提供す
る。このベクターは、ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦを
欠失させることに用いることができる。
【００８０】 更に、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも、野生型
ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティリ
スの同じ株と比較して異なる比及び／又は量でアベルメクチンを生成する細胞を
含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株の製造方法を提供する。好
ましい態様では、本発明は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも
、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベル
ミティリスの同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が異なるアベルメクチン
を生成する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法で
あって、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅ
Ｃ対立遺伝子（但し、前記遺伝子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに
発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する
ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチ
ンのクラス２：１比を変化させる遺伝子産物をコードする）を担持するベクター
によって形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現す
る株の細胞により生成されるクラス２：１比と比較して、クラス２：１比が異な
るアベルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法
を提供する。好ましい態様では、アベルメクチンの変化したクラス２：１比が、
減少する。
【００８１】 更に好ましい態様では、本発明は、異なる量のアベルメクチンを生成する細胞
を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅＣ対立遺
伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物（但し、その発現の結果、突然
変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現するストレプトミセス・ア
ベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量が、野生型ａｖ
ｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、変化する）を
担持するベクターによって形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみ
を代わりに発現する株の細胞により生成されるアベルメクチンの量と比較して、
異なる量のアベルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記
製造方法を提供する。好ましい態様では、形質転換細胞において生成されるアベ
ルメクチンの量が、増加する。
【００８２】 更に好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子を発現するスト
レプトミセス・アベルミティリスの株の細胞を、ａｖｅＣ対立遺伝子を不活性化
するベクターで形質転換し、そしてａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されている形
質転換細胞を選択することを含む、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規
株（その細胞は、不活性化したａｖｅＣ対立遺伝子を含む）の製造方法を提供す
る。好ましいが非限定的な態様では、ストレプトミセス・アベルミティリス株の
細胞を、突然変異によって、あるいは、異種遺伝子配列によるａｖｅＣ対立遺伝
子の一部の置換によって不活性化されたａｖｅＣ対立遺伝子を担持する遺伝子置
換ベクターで形質転換し、そして形質転換細胞（その細胞の天然ａｖｅＣ対立遺
伝子は、不活性化ａｖｅＣ対立遺伝子で置換されている）を選択する。ａｖｅＣ
対立遺伝子の不活性化は、発酵生成物のＨＰＬＣ分析（後出）によって決定する
ことができる。後出のセクション８．１に記載の具体的であるが非限定的な態様
では、ａｖｅＣ−ＯＲＦ中に、サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）由来のｅｒｍＥ遺伝子を挿入
することによって、ａｖｅＣ対立遺伝子を不活性化する。
【００８３】 更に、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子又はベクターのいずれかで形
質転換された細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を提供す
る。好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子の代わりに、又は
野生型ａｖｅＣ対立遺伝子に加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現す
る細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリスの新規株（ここで、前記新規
株の細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞に
よって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と比較して、異なるクラス２
：１比でアベルメクチンを生成する）を提供する。好ましい態様では、前記の新
規細胞によって生成される異なったクラス２：１比が、減少する。前記の新規株
は、商業的に望ましいアベルメクチン（例えば、ドラメクチン）の大規模生産に
有用である。
【００８４】 本明細書に記載のスクリーニングアッセイの第１の目的は、ストレプトミセス
・アベルミティリス細胞中で発現することによって、生成されるアベルメクチン
のクラス２：１比を変化させる（特には、減少させる）ａｖｅＣ遺伝子の突然変
異した対立遺伝子を同定することにある。好ましい態様では、生成されるアベル
メクチンのクラス２：１比を減少させる突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現
している本発明のストレプトミセス・アベルミティリスの新規株の細胞によって
生成されるＢ２：Ｂ１アベルメクチンの比は、１．６：１未満〜約０：１の間で
あり；より好ましい態様では、前記割合は、約１：１〜約０：１の間であり；そ
して最も好ましい態様では、前記割合は、約０．８４：１〜約０：１である。後
出の具体的な態様では、本発明の新規細胞は、１．６：１未満の比で、シクロヘ
キシルＢ２：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する。別の後出の具体的
な態様では、本発明の新規細胞は、約０．９４：１の比で、シクロヘキシルＢ２
：シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する。更に別の後出の具体的な態様
では、本発明の新規細胞は、約０．８８：１の割合で、シクロヘキシルＢ２：シ
クロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する。更に別の後出の具体的な態様では
、本発明の新規細胞は、約０．８４：１の割合で、シクロヘキシル２：シクロヘ
キシルＢ１アベルメクチンを生成する。
【００８５】 更に好ましい態様では、本発明は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子に代えて、ある
いは、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子に加えて、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又
はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物（これにより、野生型ａｖｅＣ対立遺
伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、異なる量で、前記の新規
株の細胞がアベルメクチンを生成する）を発現する細胞を含む、ストレプトミセ
ス・アベルミティリスの新規菌株を提供する。好ましい態様では、前記の新規株
は、アベルメクチンを増加した量で生成する。非限定的な態様では、前記の遺伝
子構築物は、更に、強力なプロモーター（例えば、ａｖｅＣ−ＯＲＦの上流に位
置し、そしてａｖｅＣ−ＯＲＦと有効に関連している、サッカロポリスポラ・エ
リスラエア由来の強力な構成的ｅｒｍＥプロモーター）を含む。
【００８６】 更に好ましい態様では、本発明は、ａｖｅＣ遺伝子が不活性化されている細胞
を含有する、ストレプトミセス・アベルミティリスの新規株を提供する。前記株
は、野生型株とは異なるアベルメクチン（前記株により生成される）のスペクト
ルと、アベルメクチン生成に影響を与えるａｖｅＣ遺伝子の標的突然変異誘発又
はランダム突然変異誘発のいずれかを決定する本明細書に記載の相補性スクリー
ニングアッセイとの両方に有用である。後出の具体的態様では、ストレプトミセ
ス・アベルミティリス宿主細胞を、不活性化ａｖｅＣ遺伝子を含有するように遺
伝子的に設計した。例えば、ａｖｅＣコード領域中にｅｒｍＥ耐性遺伝子を挿入
することによってストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ遺伝子が不活性
化するように構築した遺伝子置換プラスミドｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０
５）（図３）を用いて、株ＳＥ１８０−１１（後出の実施例に記載）を生成した
。
【００８７】 更に、本発明は、本発明の任意の前記ポリヌクレオチド分子でコードされ、組
換え発現し、突然変異した、ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝
子産物、及びその製造方法を提供する。
【００８８】 更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前記
細胞は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較
して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミ
ティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化さ
せる遺伝子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）を、
その細胞によるアベルメクチンの生成を許容又は誘発する条件下で、培養培地中
で培養し、そして、培養物からアベルメクチンを回収することを含む、アベルメ
クチンの製造方法を提供する。好ましい態様では、突然変異したａｖｅＣ対立遺
伝子を発現する細胞により培養物中で生成されるアベルメクチンのクラス２：１
比が、減少する。この製造方法は、商業的に価値のあるアベルメクチン（例えば
、ドラメクチン）の生成における効率の増加を提供する。
【００８９】 更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前記
細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子
構築物を発現することなく野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同
じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発
現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベル
メクチン生成量の変化を引き起こす突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子
構築物を発現する）を、その細胞によるアベルメクチンの生成を許容又は誘発す
る条件下で、培養培地中で培養し、そして、培養物からアベルメクチンを回収す
ることを含む、アベルメクチンの製造方法を提供する。好ましい態様では、突然
変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現する細胞により培養物中で
生成されるアベルメクチンの量が、増加する。
【００９０】 更に、本発明は、ストレプトミセス・アベルミティリス株（但し、前記株は、
野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突
然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス
株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を減少させる遺伝
子産物をコードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）により生成さ
れたアベルメクチンの新規組成物であって、前記新規組成物中の前記アベルメク
チンが、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・
アベルミティリスの同じ株の細胞により生成されるアベルメクチンのクラス２：
１比と比較して、減少したクラス２：１比で生成される、前記組成物を提供する
。前記新規アベルメクチン組成物は、消耗された発酵培養液中で生成されたもの
として存在することができるか、あるいは、それらから収集することができる。
前記新規アベルメクチン組成物は、公知の生化学的精製技法（例えば、硫酸アン
モニウム沈殿、透析、サイズ分別、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣな
ど）によって、培養液から部分的に又は実質的に精製することができる。
【００９１】 ５．４．アベルメクチンの使用 アベルメクチンは、駆虫剤（ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ）、外部殺虫剤（ｅｃ
ｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃｉｄｅ）、殺虫剤（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）、及びダ
ニ駆虫剤（ａｃａｒｉｃｉｄｅ）としての特別な利用性を有する高活性の抗寄生
生物剤である。そして本発明の方法によって生成されるアベルメクチン化合物は
、それらの目的のすべてに有用である。例えば、本発明によって生成されるアベ
ルメクチンは、ヒトにおける種々の疾患又は状態を治療するために（特に、前記
の疾患又は状態が、当業界で公知の寄生生物感染により引き起こされる場合に）
有用である。例えば、Ｉｋｅｄａ及びＯｍｕｒａ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ
．，９７（７）：２５９１−２６０９を参照されたい。より具体的には、本発明
に従って調製されるアベルメクチン化合物は、ヒト、家畜、ブタ、ヒツジ、家禽
、ウマ、又はウシに感染することができる内部寄生生物（例えば、寄生性線虫）
により引き起こされる種々の疾患及び状態の治療において効果的である。
【００９２】 より具体的には、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物は、ヒトに
感染する線虫及び種々の動物種に感染する線虫に効果的である。前記線虫として
は、胃腸寄生生物［例えば、アンシロストマ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）、ネカ
トール（Ｎｅｃａｔｏｒ）、アスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）、ストロンギロイデ
ス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ）、トリキネラ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）、
カピラリア（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、トリクリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、エ
ンテロビウス（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ）、ジロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒ
ｉａ）］、及び血液又は他の組織若しくは器官に見出される寄生生物［例えば、
フィラリア属の虫（ｆｉｌａｒｉａｌ ｗｏｒｍ）、並びにストロンギロイデス
及びトリキネラの抽出腸状態］を含む。
【００９３】 また、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物は、外部寄生生物感染
［例えば、特には、マダニ、ダニ、シラミ、ノミ、ハエ（ｂｌｏｗｆｌｙ）、刺
傷昆虫、あるいは、牛及び馬に影響することができる移動性双翅類幼虫により引
き起こされる、哺乳類及び鳥類の節足動物侵入］の治療においても有用である。
【００９４】 また、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物は、屋内害虫（例えば
、特には、ゴキブリ、蛾、カーペットビートル、及びイエバエ）、並びに保存穀
物及び農作物を害する昆虫［例えば、クモダニ（ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）、ア
リマキ、イモムシ、及び直翅類（例えば、特にはバッタ）］に対する殺虫剤とし
ても有用である。
【００９５】 本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物により処理されることのでき
る動物には、ヒツジ、ウシ、ウマ、シカ、ヤギ、ブタ、鳥（家禽を含む）、並び
に犬及びネコが含まれる。
【００９６】 本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物は、意図された特定の使用、
治療される宿主動物の個々の種、及び関連する寄生生物又は昆虫に適切な製剤中
で投与される。殺寄生生物剤（ｐａｒａｓｉｔｉｃｉｄｅ）としての使用のため
には、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物を、カプセル、ボーラス
、錠剤、又は液体飲剤の形で経口投与することもできるし、あるいは、ポア−オ
ン（ｐｏｕｒ−ｏｎ）として、注射により、又は移植物として投与することもで
きる。前記製剤は、標準的獣医学的手法に従って、通常の方法で調製される。従
って、活性成分と微細に分割された適当な希釈剤又は担体とを混合し、更に、崩
壊剤及び／又は結合剤（例えば、スターチ、ラクトース、タルク、ステアリン酸
マグネシウムなど）を含むことによって、前記カプセル、ボーラス、又は錠剤を
調製することができる。飲用製剤は、分散又は湿潤剤などと共に、活性成分を水
溶液中に分散させることによって調製することができる。注射用製剤は、溶液を
血液と等張にするための他の物質（例えば、充分な塩及び／又はグルコース）を
含むことができる無菌溶液の形態で調製することができる。
【００９７】 前記製剤は、患者、又は処理される宿主動物の種類、感染の重篤度及びタイプ
、並びに宿主の体重によって、活性化合物の重量に関して変化するであろう。一
般的に、経口投与のためには、１〜５日間に対する単独投与量又は分割投与量と
して、患者又は動物体重１ｋｇ当たり約０．００１〜１０ｍｇの活性化合物の用
量が満足のいくものであろう。しかしながら、臨床学的症状に基づいて、例えば
医者又は獣医が決定するような、より高いか又はより低い投与量範囲が示される
場合が存在する。
【００９８】 あるいは、本発明に従って調製されたアベルメクチン化合物を、動物飼料と組
み合わせて投与することができ、そしてこの目的のために、通常の動物用飼料と
共に混合するための、濃縮された飼料添加物又はプレミックスを調製することが
できる。
【００９９】 殺虫剤としての使用、及び農業用害虫の処理用に、本発明に従って調製された
アベルメクチン化合物を、標準的農業手法に従って、噴霧、微粉末、及びエマル
ジョンなどとして適用することができる。
【０１００】 ６．実施例：ストレプトミセス・アベルミチリスの発酵及びＢ２：Ｂ１アベルメ
クチン分析 分枝鎖２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ活性及び５−Ｏ−メチルトランスフェラ
ーゼ活性の両方を欠いている菌株は、発酵培地に脂肪酸が補充されていない場合
に、アベルメクチンを生産しない。本実施例は、かかる突然変異体において生合
成が種々の脂肪酸の存在下で開始される場合に、広範囲のＢ２：Ｂ１比のアベル
メクチンを得ることができることを証明するものである。
【０１０１】 ６．１．材料及び方法 ストレプトミセス・アベルミチリスＡＴＣＣ５３６９２を、スターチ（Ｓｔａ
ｒｃｈ）［ナデックス（Ｎａｄｅｘ），レイン・ナショナル（Ｌａｉｎｇ Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ）］２０ｇ；ファーマメディア（Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ）［トレ
ーダーズ・プロテイン（Ｔｒａｄｅｒ’ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ），テネシー州メン
フィス］１５ｇ；アルダミンｐＨ（Ａｒｄａｍｉｎｅ ｐＨ）［イースト・プロ
ダクツ社（Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．）］５ｇ；炭酸カルシウム
１ｇからなる種培地中に調製した完全ブロスとして−７０℃で保存した。最終容
量は、生水（ｔａｐ ｗａｔｅｒ）で１リットルに調整し、ｐＨは７．２に調整
し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１０２】 前記調製物の解凍した懸濁液２ｍＬを、同じ培地５０ｍＬを含むフラスコに接
種するのに用いた。１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで２８℃のインキュベ
ーションを４８時間行った後、ブロス２ｍＬを、スターチ８０ｇ；炭酸カルシウ
ム７ｇ；ファーマメディア５ｇ；リン酸水素二カリウム１ｇ；硫酸マグネシウム
１ｇ；グルタミン酸０．６ｇ；硫酸第一鉄七水化物０．０１ｇ；硫酸亜鉛０．０
０１ｇ；硫酸第一マンガン０．００１ｇからなる生産培地５０ｍＬを含むフラス
コに接種するのに用いた。最終容量は、生水で１リットルに調整し、ｐＨは７．
２に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１０３】 種々のカルボン酸基質（表１を参照）をメタノールに溶かし、最終濃度が０．
２ｇ／Ｌとなるように接種の２４時間後に発酵ブロスに添加した。この発酵ブロ
スを２８℃で１４日間インキュベートした後、ブロスを遠心処理（２，５００ｒ
ｐｍで２分間）し、上澄み液を捨てた。この菌糸体ペレットをアセトン（１５ｍ
Ｌ）、次いでジクロロメタン（３０ｍＬ）で抽出し、有機相を分離、濾過し、次
いで蒸発乾固した。この残渣をメタノール（１ｍＬ）中に取り、スキャンニング
・ダイオード−アレー検出器セットを備えたヒューレット−パッカード（Ｈｅｗ
ｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１０９０Ａ液体クロマトグラフを用いたＨＰＬＣに
より２４０ｎｍで分析した。使用したカラムは、４０℃で保持したベックマン・
ウルトラスフフィアー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ）Ｃ−１８、
５μｍ、４．６ｍｍｘ２５ｃｍカラムであった。前記メタノール溶液２５μＬを
カラムに注入した。溶出は、８０：２０〜９５：５のメタノール−水のリニアー
グラジエントを４０分間にわたり０．８５／ｍＬ ｍｉｎで実施した。２つの標
準濃度のシクロヘキシルＢ１を用いて検出器応答をキャリブレーションし、Ｂ２
及びＢ１アベルメクチンに対する曲線下の面積を測定した。
【０１０４】 ６．２．結果 Ｂ２及びＢ１アベルメクチンについて観察されたＨＰＬＣのリテンションタイ
ム、及び２：１の比を表１に示す。
【０１０５】 《表１》 ＨＰＬＣリテンション 比 タイム（ｍｉｎ） 基質 Ｂ２ Ｂ１ Ｂ２：Ｂ１ ４−テトラヒドロピランカルボン酸 ８．１ １４．５ ０．２５ イソ酪酸 １０．８ １８．９ ０．５ ３−フランカルボン酸 ７．６ １４．６ ０．６２ Ｓ−（＋）−２−メチル酪酸 １２．８ ２１．６ １．０ シクロヘキサンカルボン酸 １６．９ ２６．０ １．６ ３−チオフェンカルボン酸 ８．８ １６．０ １．８ シクロペンタンカルボン酸 １４．２ ２３．０ ２．０ ３−トリフルオロメチル酪酸 １０．９ １８．８ ３．９ ２−メチルペンタン酸 １４．５ ２４．９ ４．２ シクロヘプタンカルボン酸 １８．６ ２９．０ １５．０
【０１０６】 表１に示したデータは、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチンの生産量の比が非常に広範
囲であることを証明するものであり、このことは、供給した脂肪酸側鎖スタータ
ーユニットの性質に応じてクラス２の化合物からクラス１の化合物への脱水転換
（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｖｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）の結果にかなりの差が生じ
ることを示している。このことは、ＡｖｅＣタンパク質に対する変性（ａｌｔｅ
ｒａｔｉｏｎｓ）から生じるＢ２：Ｂ１の比の変化が特定の基質に特異的である
ことができることを示している。従って、特定の基質を用いて得られるＢ２：Ｂ
１比に変化を示す突然変異体のスクリーニングは、当該基質の存在下に実施され
ることが必要である。下記の引き続きの実施例では、スクリーニング基質として
シクロヘキサンカルボン酸を用いている。しかしながら、この基質は単に可能性
を例示するために用いるに過ぎず、本発明の適用性を限定しようとするものでは
ない。
【０１０７】 ７．実施例：ａｖｅＣ遺伝子の単離 本実施例は、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするストレプトミセス・アベルミチ
リス染色体の領域の単離及び特徴付けを述べるものである。以下に示すように、
ａｖｅＣ遺伝子は、生産されるシクロヘキシル−Ｂ２対シクロヘキシル−Ｂ１（
Ｂ２：Ｂ１）アベルメクチンの比を変えることができるものとして同定された。
【０１０８】 ７．１．材料及び方法 ７．１．１．ＤＮＡ単離のためのストレプトミセスの増殖 ストレプトミセスの増殖を行うため、以下の方法に従った。ストレプトミセス
・アベルミチリスＡＴＣＣ３１２７２の単一コロニー（単一コロニー単離物＃２
）を、ディフコ・イースト・エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔ
ｒａｃｔ）５ｇ；ディフコ・バクト−ペプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ−ｐｅ
ｐｔｏｎｅ）５ｇ；デキストロース２．５ｇ；ＭＯＰＳ５ｇ；ディフコ・バクト
・アガー（Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ）１５ｇを含む１／２強度のＹＰ
Ｄ−６上で単離した。最終容量は、ｄＨ2Ｏで１リットルに調整し、ｐＨは７． ０に調整し、そして培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１０９】 前記培地で増殖した菌糸体を、２５ｍｍｘ１５０ｍｍの試験管中のＴＳＢ培地
［１リットルのｄＨ2Ｏ中、ディフコ・トリプティック・ソイ・ブロス（Ｄｉｆ ｃｏ Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）３０ｇ、１２１℃で２５分間オー
トクレーブ処理］１０ｍＬに接種し、振とう（３００ｒｐｍ）しながら２８℃で
４８〜７２時間保持した。
【０１１０】 ７．１．２．ストレプトミセスからの染色体ＤＮＡ単離 前記のように増殖させた菌糸体のアリコート（０．２５ｍＬ又は０．５ｍＬ）
を１．５ｍＬの微小遠沈管に入れ、１２，０００ｘｇで６０秒間の遠心処理によ
り細胞を濃縮した。この上澄みを捨て、細胞を、２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含
むＴＳＥバッファー［１．５Ｍショ糖２０ｍＬ，１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）２．５ｍＬ，１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２．５ｍＬ，及びｄＨ2Ｏ７５ ｍＬ］０．２５ｍＬ中に再懸濁させた。このサンプルを振とうしながら３７℃で
２０分間インキュベートし、オートゲン（ＡｕｔｏＧｅｎ）５４０TM自動核酸単
離装置［インテグレイティド・セパレーション・システム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ
ｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ），マサッチューセッツ州ネイティッ
ク（Ｎａｔｉｃｋ）］にかけ、そしてサイクル（Ｃｙｃｌｅ）１５９（装置ソフ
トウェアー）を製造業者の取扱説明書に従って用いてゲノムＤＮＡを分離した。
【０１１１】 これに代えて、菌糸体５ｍＬを１７ｍｍｘ１００ｍｍの試験管に入れ、細胞を
３，０００ｒｐｍで５分間の遠心処理によって濃縮し、その上澄みを除去した。
細胞をＴＳＥバッファー１ｍＬ中に再懸濁させ、３，０００ｒｐｍで５分間の遠
心処理によって濃縮し、その上澄みを除去した。細胞を、２ｍｇ／ｍＬのリゾチ
ームを含むＴＳＥバッファー１ｍＬ中に再懸濁させ、振とうしながら３７℃で３
０〜６０分間インキュベートした。インキュベーション後、１０％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）０．５ｍＬを添加し、溶解（ｌｙｓｉｓ）が完了するまで
細胞を３７℃でインキュベートした。そのライセートを６５℃で１０分間インキ
ュベートし、室温まで冷却し、１．５ｍＬ容のエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ
ｒｆ）管２本に分けて入れ、フェノール／クロロホルム［０．５Ｍトリス（ｐＨ
８．０）で予め平衡化した５０％フェノール；５０％クロロホルム］０．５ｍＬ
で１回（１ｘ）抽出した。その水性相を取り出し、クロロホルム：イソアミルア
ルコール（２４：１）で２〜５回（２〜５ｘ）抽出した。１／１０容量の３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を添加することによりＤＮＡを沈殿させ、この混合
物を氷上で１０分間インキュベートし、この混合物を５℃で１５，０００ｒｐｍ
で１０分間の遠心処理を行い、その上澄みを清潔な試験管に取り出し、そこに１
容量のイソプロパノールを添加した。次いで、その上澄みとイソプロパノールと
の混合物を、氷上で２０分間インキュベートし、５℃で１５，０００ｒｐｍで２
０分間の遠心処理を行い、その上澄みを除去し、そしてＤＮＡペレットを７０％
エタノールで１回（１ｘ）洗浄した。ペレットを乾燥させた後、ＤＮＡをＴＥバ
ッファー［１０ｍＭトリス，１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］中に再懸濁させ
た。
【０１１２】 ７．１．３．ストレプトミセスからのプラスミドＤＮＡ単離 菌糸体のアリコート（１．０ｍＬ）を１．５ｍＬ容の微小遠沈管に入れ、１２
，０００ｘｇで６０秒間の遠心処理により細胞を濃縮した。この上澄みを捨て、
細胞を、１０．３％ショ糖１．０ｍＬ中に再懸濁させ、１２，０００ｘｇで６０
秒間の遠心処理により濃縮し、その上澄みを捨てた。次いで、細胞を、２ｍｇ／
ｍＬのリゾチームを含むＴＳＥバッファー中に再懸濁させ、振とうしながら３７
℃で２０分間インキュベートし、オートゲン５４０TM自動核酸単離装置にかけた
。サイクル１０６（装置ソフトウェアー）を製造業者の取扱説明書に従って用い
てプラスミドＤＮＡを分離した。
【０１１３】 これに代えて、菌糸体１．５ｍＬを１．５ｍＬ容の微小遠沈管に入れ、１２，
０００ｘｇで６０秒間の遠心処理により細胞を濃縮した。この上澄みを捨て、細
胞を、１０．３％ショ糖１．０ｍＬ中に再懸濁させ、１２，０００ｘｇで６０秒
間の遠心処理により濃縮し、その上澄みを捨てた。細胞を、２ｍｇ／ｍＬのリゾ
チームを含むＴＳＥバッファー０．５ｍＬ中に再懸濁させ、３７℃で１５〜３０
分間インキュベートした。インキュベーション後、アルカリ性ＳＤＳ（０．３Ｎ
−ＮａＯＨ，２％ＳＤＳ）０．２５ｍＬを添加し、細胞を、５５℃で１５〜３０
分間、あるいは、溶液が透明になるまでインキュベートした。酢酸ナトリウム（
０．１ｍＬ，３Ｍ，ｐＨ４．８）をこのＤＮＡ溶液に添加し、次いで、氷上で１
０分間インキュベートした。このＤＮＡサンプルを、５℃で１４，０００ｒｐｍ
で１０分間の遠心処理を行った。その上澄みを清潔な試験管に取り出し、そこに
フェノール：クロロホルム（５０％フェノール：５０％クロロホルム）０．２ｍ
Ｌを添加し、穏やかに混合した。このＤＮＡ溶液を、５℃で１４，０００ｒｐｍ
で１０分間遠心処理し、その上層を清潔なエッペンドルフ管に取り出した。イソ
プロパノール（０．７５ｍＬ）を添加し、この溶液を穏やかに混合し、次いで室
温で２０分間インキュベートした。このＤＮＡ溶液を、５℃で１４，０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心処理し、その上澄みを除去し、ＤＮＡペレットを７０％エタノ
ールで洗浄し、乾燥させ、ＴＥバッファー中に再懸濁させた。
【０１１４】 ７．１．４．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのプラスミドＤＮＡ単離 形質転換した単一の大腸菌コロニーを、ルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅ
ｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地［ｄＨ2Ｏ１リットル中、バクト−トリプトン（Ｂａ ｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）１０ｇ、バクト−イースト・エキストラクト（Ｂａ
ｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ、及びＮａＣｌ１０ｇ（ｐＨ７．０
），１２１℃で２５分間オートクレーブ処理，及び１００μｇ／ｍＬアンピシリ
ンを補充］５ｍＬに接種した。この培養物を一晩インキュベートし、１ｍＬアリ
コートを１．５ｍＬ容の微小遠沈管に入れた。この培養サンプルを、オートゲン
５４０TM自動核酸単離装置にかけ、サイクル３（装置ソフトウェアー）を製造業
者の取扱説明書に従って用いてプラスミドＤＮＡを単離した。
【０１１５】 ７．１．５．ストレプトミセス・アベルミチリスのプロトプラストの調製及び形
質転換 ストレプトミセス・アベルミチリスの単一のコロニーを、１／２強度のＹＰＤ
−６上で単離した。その菌糸体を、２５ｍｍｘ１５０ｍｍ試験管中のＴＳＢ培地
１０ｍＬに接種し、次いで、振とう（３００ｒｐｍ）しながら２８℃で４８時間
インキュベートした。菌糸体１ｍＬをＹＥＭＥ培地５０ｍＬに接種した。ＹＥＭ
Ｅ培地は、１リットル当たり、ディフコ・イースト・エキストラクト３ｇ；ディ
フコ・バクト−ペプトン５ｇ；ディフコ・モルト・エキストラクト（Ｄｉｆｃｏ Ｍａｌｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）３ｇ；シュークロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）３００
ｇを含んでいる。１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した後、次の成分を添
加した：２．５Ｍ−ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（別途、１２１℃で２５分間オートクレ
ーブ処理済み）２ｍＬ；及びグリシン（２０％）（濾過滅菌済み）２５ｍＬ。
【０１１６】 菌糸体を３０℃で４８〜７２時間増殖させ、３，０００ｒｐｍで２０分間の遠
心処理により５０ｍＬ容の遠沈管［ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）］に集めた。上
澄みを捨て、菌糸体をＰバッファー中に再懸濁させた。Ｐバッファーは、ショ糖
２０５ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ２．０２ｇ；Ｈ2Ｏ６００ ｍＬ；Ｋ2ＰＯ4（０．５％）１０ｍＬ；微量元素溶液２０ｍＬ；ＣａＣｌ2・２ Ｈ2Ｏ（３．６８％）１００ｍＬ；及びＭＥＳバッファー（１．０Ｍ，ｐＨ６． ５）１０ｍＬを含んでいる（微量元素溶液は１リットル当たり、ＺｎＣｌ2４０ ｍｇ；ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ２００ｍｇ；ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ１０ｍｇ；ＭｎＣｌ 2 ・４Ｈ2Ｏ１０ｍｇ；Ｎａ2Ｂ4Ｏ7・１０Ｈ2Ｏ１０ｍｇ；（ＮＨ4）６Ｍｏ7Ｏ24 ・４Ｈ2Ｏ１０ｍｇを含んでいる）。ｐＨは６．５に調整し、最終容量は１リッ トルに調整し、そして培地は０．４５ミクロンフィルターで熱濾過した。
【０１１７】 菌糸体を３，０００ｒｐｍで２０分間でペレット化し、上澄みを捨て、菌糸体
を２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含むＰバッファー２０ｍＬ中に再懸濁させた。こ
の菌糸体を、振とうしながら３５℃で１５分間インキュベートし、プロトプラス
ト形成の程度を顕微鏡で測定して調べた。プロトプラスト形成が完了した時、プ
ロトプラストを８，０００ｒｐｍで１０分間の遠心処理に付した。上澄みを除去
し、プロトプラストをＰバッファー１０ｍＬ中に再懸濁させた。プロトプラスト
を、８，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し、上澄みを除去し、プロトプラスト
をＰバッファー２ｍＬ中に再懸濁させ、そして約１ｘ１０9個のプロトプラスト を、２．０ｍＬ容の極低温用バイアル瓶［ナルジェン（Ｎａｌｇｅｎｅ）］に分
配した。
【０１１８】 １ｘ１０9個のプロトプラストを含むバイアル瓶を８，０００ｒｐｍで１０分 間遠心処理し、上澄みを除去し、プロトプラストをＰバッファー０．１ｍＬ中に
再懸濁させた。２〜５μｇの形質転換ＤＮＡをプロトプラストに添加し、その後
直ちにワーキングＴバッファー０．５ｍＬを添加した。Ｔバッファーベースは、
ＰＥＧ−１０００［シグマ（Ｓｉｇｍａ）］２５ｇ；ショ糖２．５ｇ；Ｈ2Ｏ８ ３ｍＬを含んでいる。ｐＨは１Ｎ−ＮａＯＨ（濾過滅菌済み）を用いて８．８に
調整し、そしてＴバッファーベースを濾過滅菌して４℃で保存した。使用当日に
調製したワーキングＴバッファーは、Ｔバッファーベース８．３ｍＬ；Ｋ2ＰＯ4 （４ｍＭ）１．０ｍＬ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（５Ｍ）０．２ｍＬ；及びＴＥＳ（
１Ｍ、ｐＨ８）０．５ｍＬであった。ワーキングＴバッファーの各成分は個々に
濾過滅菌した。
【０１１９】 プロトプラストにＴバッファーを添加して２０秒以内に、Ｐバッファー１．０
ｍＬも添加し、そしてプロトプラストを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心処理し
た。上澄みを捨て、プロトプラストをＰバッファー０．１ｍＬ中に再懸濁させた
。次いで、プロトプラストをＲＭ１４培地で平板培養（ｐｌａｔｅ）した。この
ＲＭ１４培地は、ショ糖２０５ｇ；Ｋ2ＳＯ4０．２５ｇ；ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ１
０．１２ｇ；グルコース１０ｇ；ディフコ・キャスアミノ・アシッズ（Ｄｉｆｃ
ｏ Ｃａｓａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ）０．１ｇ；ディフコ・イースト・エキスト
ラクト５ｇ；ディフコ・オートミール・アガー（Ｄｉｆｃｏ Ｏａｔｍｅａｌ
Ａｇａｒ）３ｇ；ディフコ・バクト・アガー（Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ Ａｇａ
ｒ）２２ｇ；ｄＨ2Ｏ８００ｍＬを含んでいる。この溶液を１２１℃で２５分間 オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理後、以下の滅菌ストックを添加し
た：Ｋ2ＰＯ4（０．５％）１０ｍＬ；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（５Ｍ）５ｍＬ；Ｌ−
プロリン（２０％）１５ｍＬ；ＭＥＳバッファー（１．０Ｍ，ｐＨ６．５）１０
ｍＬ；微量元素溶液（前記に同じ）２ｍＬ；シクロヘキシミド・ストック（２５
ｍｇ／ｍＬ）４０ｍＬ；及び１Ｎ−ＮａＯＨ２ｍＬ。ＲＭ１４培地２５ｍＬをプ
レ−ト当たりに分取し、プレートを使用前２４時間乾燥させた。
【０１２０】 プロトプラストを湿度９５％、３０℃で２０〜２４時間インキュベートした。
チオストレプトン耐性の形質転換体を選択するため、１２５μｇ／ｍＬのチオス
トレプトンを含むオーバーレイバッファー１ｍＬをＲＭ１４再生プレート上に均
一になるように広げた。オーバーレイバッファーは、１００ｍＬ当たり、ショ糖
１０．３ｇ；微量元素溶液（前記に同じ）０．２ｍＬ；及びＭＥＳ（１Ｍ，ｐＨ
６．５）１ｍＬを含んでいる。このプロトプラストを、チオストレプトン耐性（
Ｔｈｉｏr）コロニーが見えてくるまで、湿度９５％、３０℃で７〜１４日間イ ンキュベートした。
【０１２１】 ７．１．６．ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）プロトプラストの形質転換 ストレプトミセス・リビダンスＴＫ６４［ジョン・インズ・インスティチュー
ト（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ノーリッジ（Ｎｏｒｗｉｃ
ｈ）、英国（Ｕ．Ｋ）により供給］を、ある場合に形質転換に用いた。ストレプ
トミセス・リビダンスの増殖、プロトプラスト形成、及び形質転換のための方法
及び構成は、Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５年，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ノーリッジ，英国
に記載されており、その本に記載のように実施した。前記セクション７．１．３
に記載のように、プラスミドＤＮＡをストレプトミセス・リビダンス形質転換体
から分離した。
【０１２２】 ７．１．７．ストレプトミセス・アベルミチリス菌株の発酵分析 １／２強度のＹＰＤ−６で４〜７日間増殖させたストレプトミセス・アベルミ
チリスの菌糸体を、プレフォーム培地８ｍＬ及び２個の５ｍｍガラスビーズを含
む１ｘ６インチの試験管に接種した。プレフォーム培地は、可溶性デンプン［弱
く煮た（ｔｈｉｎ ｂｏｉｌｅｄ）デンプン又はコソ（ＫＯＳＯ）；ジャパン・
コーン・スターチ社（Ｊａｐａｎ Ｃｏｒｎ Ｓｔａｒｃｈ Ｃｏ．），名古屋
］２０ｇ／Ｌ；ファーマメディア１５ｇ／Ｌ；アルダミン（Ａｒｄａｍｉｎｅ）
ｐＨ５ｇ／Ｌ［シャンプラン・インド．（Ｃｈａｍｐｌａｉｎ Ｉｎｄ．）、ク
リフトン（Ｃｌｉｆｔｏｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ）］；ＣａＣＯ3２ｇ ／Ｌ；培地中の最終濃度５０ｐｐｍの２−（＋／−）−メチル酪酸、６０ｐｐｍ
のイソ酪酸、及び２０ｐｐｍのイソ吉草酸を含有する２ｘｂｃｆａ（「ｂｃｆａ
」とは、分枝鎖の脂肪酸をいう）を含んでいる。ｐＨを７．２に調整し、培地を
１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１２３】 試験管を１７゜の角度にして２１５ｒｐｍにおいて２９℃で３日間振とうした
。この種培養液の２ｍＬアリコートを、生産培地２５ｍＬを含む３００ｍＬ容の
アーレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコに接種した。この生産培地
は、デンプン［弱く煮たデンプンまたはコソ］１６０ｇ／Ｌ；ニュトリソイ（Ｎ
ｕｔｒｉｓｏｙ）［アーチャー・ダニエルズ・ミッドランド（Ａｒｃｈａｒ Ｄ
ａｎｉｅｌｓ Ｍｉｄｌａｎｄ）、デカーチャー（Ｄｅｃａｔｕｒ）、イリノイ
州（ＩＬ）］１０ｇ／Ｌ；アルダミンｐＨ１０ｇ／Ｌ；Ｋ2ＨＰＯ4２ｇ／Ｌ；Ｍ
ｇＳＯ4・４Ｈ2Ｏ２ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．０２ｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ2０ ．００２ｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ０．００２ｇ／Ｌ；ＣａＣＯ3１４ｇ／Ｌ ；２ｘｂｃｆａ（前記に同じ）；及びシクロヘキサンカルボン酸（ＣＨＣ）（ｐ
Ｈ７．０の２０％溶液として調製済み）８００ｐｐｍを含んでいる。ｐＨを６．
９に調整し、培地を１２１℃で２５分間オートクレーブ処理した。
【０１２４】 接種後、フラスコを２００ｒｐｍで振とうしながら２９℃で１２日間インキュ
ベートした。インキュベーション後、サンプル２ｍＬをフラスコから取り出し、
メタノール８ｍＬで希釈し、混合し、この混合物を１，２５０ｘｇで１０分間遠
心処理して破片をペレット化した。次いで、この上澄みを、ベックマン・ウルト
ラスフィアＯＤＳカラム（２５ｃｍｘ直径４．６ｍｍ）を用いて、流速０．７５
ｍＬ／ｍｉｎ及び２４０ｎｍ吸収による検出でＨＰＬＣによって分析した。移動
相は、８６／８．９／５．１のメタノール／水／アセトニトリルであった。
【０１２５】 ７．１．８．ストレプトミセス・アベルミチリスＰＫＳ遺伝子の単離 ストレプトミセス・アベルミチリス（ＡＴＣＣ３１２７２，ＳＣ−２）染色体
ＤＮＡのコスミドライブラリーを調製し、サッカロポリスポラ・エリスレア（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ポリケチドシンター
ゼ（ＰＫＳ）遺伝子のフラグメントから調製したケトシンターゼ（ＫＳ）プロー
ブとハイブリッドした。コスミドライブラリーの調製の詳細な記述は、前記のサ
ムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等，１９８９年に見いだすことができる。スト
レプトミセス染色体ＤＮＡライブラリーの調製の詳細な記述は、前記のホップウ
ッド等，１９８５年に示されている。ケトシンターゼ−ハイブリッド形成領域を
含むコスミドクローンは、［ドクター・ピー．リードレイ（Ｄｒ．Ｐ．Ｌｅａｄ
ｌａｙ），ケンブリッジ，英国から親切に供給された］ｐＥＸ２６由来の２．７
ＫｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７IIIフラグメントへのハイブリダイゼーションによ って同定した。約５ｎｇのｐＥＸ２６は、ＮｄｅＩ及びＥｃｏ４７IIIを用いて 消化した。この反応混合物を、０．８％シープラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）Ｇ
ＴＧアガロースゲル［ＦＭＣバイオプロダクツ（ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ），ロ
ックランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ），メイン州（ＭＥ）］にかけた。電気泳動の後
、ゲルから２．７ＫｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７IIIフラグメントを切り出し、フ ァースト・プロトコル（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いたエピセンター・
テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのＧＥ
Ｌアーゼ（ＧＥＬａｓｅTM）を用いてＤＮＡをゲルから回収した。この２．７Ｋ
ｂのＮｄｅＩ／Ｅｃｏ４７IIIフラグメントに、ＢＲＬニック・トランスレーシ ョン・システム（Ｎｉｃｋ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）［ＢＲＬ
ライフ・テクノロジーズ社（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．），ゲテルスバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ），メリーランド州（Ｍ
Ｄ）］を用い製造業者の取扱説明書に従って、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ［デオキシ
シチジン５’−トリホスフェート，テトラ（トリエチルアンモニウム）塩，［α
−32Ｐ］−］［ＮＥＮ−デュポン（ＮＥＮ−Ｄｕｐｏｎｔ），ボストン，マサチ
ューセッツ州］でラベル付与した。典型的な反応は、０．０５ｍＬ容量で実施し
た。ストップバッファー５μＬ添加後、Ｇ−２５セファデックス・クイック・ス
ピン（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｑｕｉｃｋ ＳｐｉｎTM）カラム［ベーリンガー・マ
ンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］を用い製造業者の取扱
説明書に従って、取り込まれなかったヌクレオチドからラベル付きのＤＮＡを分
離した。
【０１２６】 約１，８００個のコスミドクローンを、コロニーハイブリダイゼーションによ
ってスクリーニングした。サッカロポリスポラ・エリスレアＫＳプローブに強く
ハイブリダイズする１０個のクローンを同定した。コスミドＤＮＡを含有する大
腸菌コロニーをＬＢ液体培地で増殖させ、そしてオートゲン５４０TM自動核酸単
離装置で、サイクル３（装置ソフトウェアー）を製造業者の取扱説明書に従って
用いて、各培養物からコスミドＤＮＡを単離した。制限エンドヌクレアーゼマッ
ピング及びサザンブロットハイブリダイゼーション分析によって、５個のクロー
ンが部分的に重なり合う染色体領域を含んでいることが示された。５個のコスミ
ド（すなわち、ｐＳＥ６５、ｐＳＥ６６、ｐＳＥ６７、ｐＳＥ６８、ｐＳＥ６９
）のストレプトミセス・アベルミチリスのゲノムＢａｍＨＩ制限地図を、部分的
に重なり合うコスミド及びハイブリダイゼーションの分析によって作成した（図
４）。
【０１２７】 ７．１．９．アベルメクチンＢ２：Ｂ１比を調節するＤＮＡの同定及びａｖｅＣ
−ＯＲＦの同定 以下の方法を用いて、ｐＳＥ６６コスミドクローンから得られたサブクローン
化フラグメントを、ＡｖｅＣ突然変異体におけるアベルメクチンのＢ２：Ｂ１比
を調節する能力について試験した。ｐＳＥ６６（５μｇ）をＳａｃＩ及びＢａｍ
ＨＩで消化した。反応混合物を０．８％シープラーク（ＳｅａｐｌａｑｕｅTM）
ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ）にかけ、電気泳動の後、ゲル
から２．９ＫｂのＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを切り出し、ファースト・
プロトコルを用いたＧＥＬアーゼ（ＧＥＬａｓｅTM）（エピセンター・テクノロ
ジーズ）を用いてＤＮＡをゲルから回収した。約５μｇのシャトルベクターｐＷ
ＨＭ３［バラ（Ｖａｒａ）等，１９８９年，ジェイ．バクテリオル．（Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．）１７１：５８７２−５８８１］を、ＳａｃＩ及びＢａｍＨＩ
で消化した。約０．５μｇの２．９Ｋｂインサート及び０．５μｇの消化された
ｐＷＨＭ３を一緒にして混合し、１単位のリガーゼ［ニューイングランド・バイ
オラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．），ベバリー
（Ｂｅｖｅｒｌｙ），マサチューセッツ州］と、総容量２０μＬにして、製造業
者の取扱説明書に従い、１５℃で一晩インキュベートした。インキュベーション
後、５μＬの連結混合物は７０℃で１０分間インキュベートし、室温まで冷却し
、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞（ＢＲＬ）を
形質転換するのに用いた。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体か
ら分離し、制限分析によって２．９ＫｂのＳａｃＩ／ＢａｍＨＩインサートの存
在を確認した。このプラスミドは、ｐＳＥ１１９として表示した。
【０１２８】 ストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８（ファイザー自社
菌株）のプロトプラストを調製し、前記セクション７．１．５に記載のｐＳＥ１
１９を用いて形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８は、シクロヘキサンカルボ
ン酸を補充した場合にアベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ１型に比べ有意に多量
のアベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ２型を生産する（約３０：１のＢ２：Ｂ１
）突然変異体である。ストレプトミセス・アベルミチリスのプロトプラストを形
質転換するために用いたｐＳＥ１１９は、大腸菌株ＧＭ２１６３［ドクター・ビ
ー．ジェイ．バックマン（Ｄｒ．Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｈｍａｎｎ），キュレーター（
Ｃｕｒａｔｏｒ），イー．コリ・ジェネティック・ストック・センター（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ），エール大学］、大腸菌
株ＤＭ１（ＢＲＬ）、又はストレプトミセス・リビダンス菌株ＴＫ６４から分離
したものである。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性の形質転換体
を単離し、発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１１９を含有す
るストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８の形質転換体は、
約３．７：１の変化比のアベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ２：シクロヘキシル
−Ｂ１を生産した（表２）。
【０１２９】 ｐＳＥ１１９は、ＡｖｅＣ突然変異体におけるアベルメクチンＢ２：Ｂ１の比
を調節できるということが確かめられた後、インサートＤＮＡの配列を決定した
。約１０μｇのｐＳＥ１１９を、プラスミドＤＮＡ単離キット［キアジェン（Ｑ
ｉａｇｅｎ），バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ），カリフォルニア州（ＣＡ）］
を製造業者の取扱説明書に従って用いて分離し、ＡＢＩ３７３Ａ自動ＤＮＡシー
クェンサー（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）［パーキン・
エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ），フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ
ｉｔｙ），カリフォルニア州］を用いて配列を決定した。配列データは、ジェネ
ティック・コンピューター・グループ・プログラムス（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｇｒａｍｓ）［ＧＣＧ，マディソン（Ｍａｄｉ
ｓｏｎ），ウィスコンシン州（ＷＩ）］を用いてアセンブルし編集した。ＤＮＡ
配列及びａｖｅＣ−ＯＲＦは、図１（配列表の配列番号１）に示す。
【０１３０】 ｐＳＥ１１８と表示する新規なプラスミドは、以下のように構築した。約５μ
ｇのｐＳＥ６６をＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化した。この反応混合物を
０．８％シープラークＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ）にかけ
、２．８ＫｂのＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを電気泳動の後にゲルから切
り出し、ファースト・プロトコルを用いたＧＥＬアーゼ（ＧＥＬａｓｅTM）（エ
ピセンター・テクノロジーズ）を用いてＤＮＡをゲルから回収した。約５μｇの
シャトルベクターｐＷＨＭ３を、ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化した。約０．５
μｇの２．８Ｋｂインサート及び０．５μｇの消化されたｐＷＨＭ３を一緒にし
て混合し、１単位のリガーゼ（ニューイングランド・バイオラブス社）と、総容
量２０μＬにして、製造業者の取扱説明書に従い、１５℃で一晩インキュベート
した。インキュベーション後、５μＬの連結混合物は７０℃で１０分間インキュ
ベートし、室温まで冷却し、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌
ＤＨ５α細胞を形質転換するのに用いた。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性
の形質転換体から単離し、制限分析によって２．８ＫｂのＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩ
インサートの存在を確認した。このプラスミドは、ｐＳＥ１１８として表示した
。ｐＳＥ１１８及びｐＳＥ１１９中のインサートＤＮＡは、約８３８個のヌクレ
オチドによって部分的に重なっている（図４）。
【０１３１】 ストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラスト
を前記のｐＳＥ１１８で形質転換した。菌株１１００−ＳＣ３８のチオストレプ
トン耐性の形質転換体を単離し、発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。
ｐＳＥ１１８を含有するストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ
３８の形質転換体は、菌株１１００−ＳＣ３８と比較して、アベルメクチンシク
ロヘキシル−Ｂ２：アベルメクチンシクロヘキシル−Ｂ１の比における変化がな
かった（表２）。
【０１３２】 ７．１．１０．ストレプトミセス・アベルミチリス染色体ＤＮＡ由来のａｖｅＣ
遺伝子のＰＣＲ増幅 ａｖｅＣ−ＯＲＦを含有する〜１．２Ｋｂのフラグメントを、先に得られたａ
ｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅す
ることにより、ストレプトミセス・アベルミチリス染色体ＤＮＡから分離した。
ＰＣＲプライマーは、ジェノシス・バイオテクノロジーズ社（Ｇｅｎｏｓｙｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．），テキサス（Ｔｅｘａｓ）から供
給を受けた。右向き（ｒｉｇｈｔｗａｒｄ）のプライマーは、５’−ＴＣＡＣＧ
ＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡＣＡＣ−３’（配列表の配列番号６）であり、左向き（ｌ
ｅｆｔｗａｒｄ）のプライマーは、５’−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡ
Ｇ−３’（配列表の配列番号７）であった。ＰＣＲ反応は、製造業者により供給
されたバッファー中ディープ・ベント（Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔTM）ポリメラーゼ（
ニューイングランド・バイオラブス社）を用い、３００μＭのｄＮＴＰ、１０％
グリセロール、２００ビコモルの各プライマー、０．１μｇの鋳型、及び２．５
単位の酵素の存在下に、最終容量１００μで、パーキン−エルマー・シータス（
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）サーマルサイクラーを用いて実施した
。最初のサイクルの熱履歴は、９５℃で５分間（変性工程）、６０℃で２分間（
アニーリング工程）、及び７２℃で２分間（伸長工程）であった。引き続きの２
４サイクルは、変性工程を４５秒間に短縮し及びアニーリング工程を１分間に短
縮した以外は、同様の熱履歴であった。
【０１３３】 このＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル中で電気泳動させ、〜１．２Ｋｂの単
一のＤＮＡバンドを検出した。このＤＮＡをゲルから精製し、製造業者の取扱説
明書に従い、２５ｎｇの線状化された（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）ブラントのｐＣ
Ｒ−ブラント（Ｂｌｕｎｔ）ベクター［インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）］と、１：１０のベクター対インサートのモル比で連結した。この連結混合
物を用いて、製造業者の取扱説明書に従い、ワン・ショット（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ TM ）コンピテント（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌細胞（インビトロジェン）を形
質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、〜
１．２Ｋｂのインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドを
ｐＳＥ１７９と表示した。
【０１３４】 ｐＳＥ１７９由来のインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化して単離
し、電気泳動によって分離し、ゲルから精製し、そして同様にＢａｍＨＩ／Ｘｂ
ａＩで消化しておいたシャトルベクターｐＷＨＭ３と、全ＤＮＡ濃度１μｇにお
いて、１：５のベクター対インサートのモル比で連結した。この連結混合物を用
いて、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転
換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、〜１．
２Ｋｂのインサートの存在を制限分析によって確認した。ｐＳＥ１８６（図２，
ＡＴＣＣ２０９６０４）と表示したこのプラスミドを、大腸菌ＤＭ１中に形質転
換し、そしてプラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離した。
【０１３５】 ７．２．結果 ｐＳＥ１１９由来の２．９ＫｂのＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントは、スト
レプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８中に形質転換された場合
、有意にＢ２：Ｂ１アベルメクチン生産の比を変化させることが確認された。ス
トレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８は、通常、約３０：１
のＢ２：Ｂ１比を有しているが、２．９ＫｂのＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメン
トを含むベクターで形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベルメクチンの比が約３
．７：１まで減少した。形質転換体培養物の発酵後分析により、形質転換ＤＮＡ
の存在が確認された。
【０１３６】 ２．９ＫｂのｐＳＥ１１９フラグメントの配列を決定し、〜０．９ＫｂのＯＲ
Ｆを同定した（図１）（配列表の配列番号１）。これは、予め他で突然変異処理
を受け、Ｂ２生産物のみを生産するＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントを包含して
いる［イケダ（Ｉｋｅｄａ）等，１９９５年，前記］。このＯＲＦ又はその対応
する推定ポリペプチドの、既知のデータベース（ＧｅｎＥＭＢＬ，ＳＷＩＳＳ−
ＰＲＯＴ）に照らした比較では、既知のＤＮＡ又はタンパク質配列との強い相同
性はいずれも示されなかった。
【０１３７】 表２は、種々のプラスミドにより形質転換されたストレプトミセス・アベルミ
チリス菌株１１００−ＳＣ３８の発酵分析を示す。
【０１３８】 《表２》 ストレプトミセス・アベルミチリス菌株 試験した形質 Ｂ２：Ｂ１比 （形質転換プラスミド） 転換体数 の平均 １１００−ＳＣ３８（なし） ９ ３０．６６ １１００−ＳＣ３８（ｐＷＨＭ３） ２１ ３１．３ １１００−ＳＣ３８（ｐＳＥ１１９） １２ ３．７ １１００−ＳＣ３８（ｐＳＥ１１８） １２ ３０．４１１００−ＳＣ３８（ｐＳＥ１８５） １４ ２７．９
【０１３９】 ８．実施例：ストレプトミセス・アベルミチリスＡｖｅＣ突然変異体の構築 本実施例では、前記の組成及び方法を用いた数種の異なるストレプトミセス・
アベルミチリスＡｖｅＣ突然変異体の構築を述べる。ストレプトミセスの遺伝子
に突然変異を導入するための技法の一般的な記載は、キーサー（Ｋｉｅｓｅｒ）
及びホップウッド，１９９１年，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２０４：４３０−４
５８にある。一層詳細な記載は、アンザイ（Ａｎｚａｉ）ら，１９８８年，Ｊ．
Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，ＸＬＩ（２）：２２６−２３３及びストゥツマン−エング
ウォール（Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ）ら，１９９２年，Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１７４（１）：１４４−１５４により提供される。これらの参考
文献は、その全体を参考のため本明細書に引用する。
【０１４０】 ８．１．ストレプトミセス・アベルミチリスａｖｅＣ遺伝子の不活性化 不活性化されたａｖｅＣ遺伝子を含有するＡｖｅＣ突然変異体を、以下に記載
のように、いくつかの方法を用いて構築した。
【０１４１】 最初の方法では、ｐＳＥ１１９（前記セクション７．１．９に記載のプラスミ
ド）中のａｖｅＣ遺伝子に内在する６４０ｂｐのＳｐｈＩ／ＰｓｔＩフラグメン
トをサッカロポリスポラ・エリスレア由来の（エリスロマイシン耐性に対する）
ｅｒｍＥ遺伝子と置き換えた。ｅｒｍＥ遺伝子は、ＢｇｌII及びＥｃｏＲＩによ
る制限酵素消化、それに続く電気泳動によってｐＩＪ４０２６［ジョン・インズ
・インスティチュート，ノーリッジ，英国により供給された；ビブ（Ｂｉｂｂ）
等，１９８５年，Ｇｅｎｅ，４１：３５７−３６８も参照］から単離し、そして
ゲルから精製した。〜１．７Ｋｂのフラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ
で消化しておいたｐＧＥＭ７Ｚｆ［プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）］中に連結し、
この連結混合物を、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α
細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から
単離し、〜１．７Ｋｂのインサートの存在を制限分析によって確認した。このプ
ラスミドをｐＳＥ２７と表示した。
【０１４２】 ｐＳＥ１１８（前記セクション７．１．９に記載）をＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩ
で消化し、その消化産物を電気泳動して、〜２．８ＫｂのＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩ
インサートをゲルから精製した。ｐＳＥ１１９をＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化
し、その消化産物を電気泳動して、〜１．５ＫｂのＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩインサ
ートをゲルから精製した。シャトルベクターｐＷＨＭ３をＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩで消化した。ｐＳＥ２７をＰｓｔＩ及びＳｐｈＩで消化し、その消化物を電
気泳動して、〜１．７ＫｂのＰｓｔＩ／ＳｐｈＩインサートをゲルから精製した
。４つのフラグメント（すなわち、〜２．８Ｋｂ、〜１．５Ｋｂ、〜７．２Ｋｂ
、〜１．７Ｋｂ）すべてを、４通りの連結法により、一緒に連結した。この連結
混合物を、製造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に
形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、
正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ
１８０（図３；ＡＴＣＣ２０９６０５）と表示した。
【０１４３】 ｐＳＥ１８０をストレプトミセス・リビダンス菌株ＴＫ６４中に形質転換し、
形質転換したコロニーをチオストレプトン及びエリスロマイシンに対する耐性に
より同定した。ｐＳＥ１８０をストレプトミセス・リビダンスから単離し、スト
レプトミセス・アベルミチリスのプロトプラストを形質転換するのに用いた。４
つのチオストレプトン耐性のストレプトミセス・アベルミチリス形質転換体を同
定し、それらのプロトプラストを調製し、ＲＭ１４培地上で非選択的条件下に平
板培養した。プロトプラストが再生した後、不活性化されたａｖｅＣ遺伝子の染
色体組込み及び自由レプリコンの欠損を示す、エリスロマイシン耐性の存在及び
チオストレプトン耐性の不在について、単一のコロニーをスクリーニングした。
１つのＥｒｍrＴｈｉｏs形質転換体を同定し、菌株ＳＥ１８０−１１と表示した
。染色体ＤＮＡの全体を、菌株ＳＥ１８０−１１から単離し、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ、ＨｉｎｄIII、ＰｓｔＩ、又はＳｐｈＩを用いて消化し、０．８％アガロー スゲルで電気泳動することによって分離し、ナイロン製の膜に移し、ｅｒｍＥプ
ローブにハイブリダイズさせた。これらの分析により、ｅｒｍＥ耐性遺伝子の染
色体組込み、及び６４０ｂｐのＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントの付随的欠失が
二重の交差事象により引き起こされたことが示された。菌株ＳＥ１８０−１１の
発酵生産物のＨＰＬＣ分析は、通常の（ｎｏｒｍａｌ）アベルメクチンがもはや
生産されないということを示した（図５Ａ）。
【０１４４】 ａｖｅＣ遺伝子を不活性化する第二の方法では、ストレプトミセス・アベルミ
チリス菌株ＳＥ１８０−１１の染色体から、ａｖｅＣ遺伝子中に６４０ｂｐのＰ
ｓｔＩ／ＳｐｈＩ欠失を残して、１．７ＫｂのｅｒｍＥ遺伝子を取り出した。遺
伝子置き換えプラスミドを以下のように構築した。すなわち、ｐＳＥ１８０をＸ
ｂａＩで部分的に消化し、〜１１．４Ｋｂのフラグメントをゲルから精製した。
この〜１１．４Ｋｂのバンドは、１．７ＫｂのｅｒｍＥ耐性遺伝子を欠いている
。次いで、このＤＮＡを連結し、大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラス
ミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存
在を制限分析によって確認した。このｐＳＥ１８４と表示したプラスミドを大腸
菌ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体か
ら単離した。このプラスミドを用いて、ストレプトミセス・アベルミチリス菌株
ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。プロトプラストは、菌株Ｓ
Ｅ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体から調製し、ＲＭ１４培地
上で単一のコロニーとして平板培養した。プロトプラストを再生した後、不活性
化されたａｖｅＣ遺伝子の染色体組込み及びｅｒｍＥ遺伝子を含有する自由レプ
リコンの欠損を示す、エリスロマイシン耐性及びチオストレプトン耐性の両方の
不在について、単一のコロニーをスクリーニングした。１つのＥｒｍsＴｈｉｏs 形質転換体を同定し、ＳＥ１８４−１−１３と表示した。ＳＥ１８４−１−１３
の発酵分析によって、通常のアベルメクチンが生産されないこと及びＳＥ１８４
−１−１３がＳＥ１８０−１１と同じ発酵の特徴を有していることが示された。
【０１４５】 ａｖｅＣ遺伝子を不活性化する第三の方法では、ＰＣＲを用いてｎｔ位４７１
のＣの後ろに２個のＧを付加してＢｓｐＥ１部位を作ることにより、染色体ａｖ
ｅＣ遺伝子中にフレームシフトを導入した。作られたＢｓｐＥ１部位の存在は、
遺伝子置き換え事象を検出するのに有効であった。ＰＣＲプライマーは、フレー
ムシフト突然変異をａｖｅＣ遺伝子中に導入するように設計し、これは、ジェノ
シス・バイオテクノロジーズ社により供給された。右向きのプライマーは、５’
−ＧＧＴＴＣＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＣＧ−３’（配列表の配列番号８）で
あり、左向きのプライマーは、５’−ＡＡＣＴＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＣＣＣＴ
ＴＣ−３’（配列表の配列番号９）であった。ＰＣＲ条件は、前記セクション７
．１．１０に記載の通りであった。その６６６ｂｐＰＣＲ産物をＳｐｈＩで消化
し、それぞれ２７８ｂｐ及び３８８ｂｐの２つのフラグメントを得た。３８８ｂ
ｐのフラグメントをゲルから精製した。
【０１４６】 遺伝子置き換えプラスミドを以下のように構築した。すなわち、シャトルベク
ターｐＷＨＭ３をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ｐＳＥ１１９をＢａｍ
ＨＩ及びＳｐｈＩを用いて消化し、その消化産物を電気泳動し、〜８４０ｂｐの
フラグメントをゲルから精製した。ｐＳＥ１１９をＥｃｏＲＩ及びＸｍｎＩで消
化し、その消化産物を電気泳動によって分離し、〜１．７Ｋｂのフラグメントを
ゲルから精製した。４つのフラグメント（すなわち、〜７．２Ｋｂ、〜８４０ｂ
ｐ、〜１．７Ｋｂ、及び３８８ｂｐ）すべてを、４通りの連結法で一緒に連結し
た。この連結混合物を、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プ
ラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサート
の存在を制限分析及びＤＮＡ配列分析によって確認した。このｐＳＥ１８５と表
示したプラスミドを大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換
体からプラスミドＤＮＡを単離した。このプラスミドを用いてストレプトミセス
・アベルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８のプロトプラストを形質転換した。菌
株１１００−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、発酵生産
物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１８５は、ストレプトミセス・アベ
ルミチリス菌株１１００−ＳＣ３８中に形質転換された場合、Ｂ２：Ｂ１アベル
メクチンの比を有意に変えなかった（表２）。
【０１４７】 ｐＳＥ１８５を用いてストレプトミセス・アベルミチリスのプロトプラストを
形質転換し、染色体ａｖｅＣ遺伝子にフレームシフト突然変異を引き起こした。
チオストレプトン耐性の形質転換体からプロトスラストを調製し、ＲＭ１４上で
単一のコロニーとして平板培養した。プロトプラストを再生した後、チオストレ
プトン耐性の不在について、単一のコロニーをスクリーニングした。チオストレ
プトン感受性コロニーから染色体ＤＮＡを単離し、染色体中に組込まれたフレー
ムシフト突然変異の存在についてＰＣＲによりスクリーニングした。このＰＣＲ
プライマーは、ａｖｅＣヌクレオチド配列に基づいて設計し、ジェノシス・バイ
オテクノロジーズ社（テキサス）により供給された。右向きのＰＣＲプライマー
は、５’−ＧＣＡＡＧＧＡＴＡＣＧＧＧＧＡＣＴＡＣ−３’（配列表の配列番号
１０）であり、左向きのプライマーは、５’−ＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡ
ＴＡＣ−３’（配列表の配列番号１１）であり、ＰＣＲ条件は前記セクション７
．１．１０に記載の通りであった。得られたＰＣＲ産物は５４３ｂｐであり、Ｂ
ｓｐＥ１で消化した場合、不活性化されたａｖｅＣ遺伝子の染色体組込み及び自
由レプリコンの欠損を示す、３６８ｂｐ、９６ｂｐ、及び７９ｂｐの３つのフラ
グメントが観察された。
【０１４８】 ａｖｅＣ遺伝子中にフレームシフト突然変異を含有するストレプトミセス・ア
ベルミチリス突然変異体の発酵分析は、通常のアベルメクチンがもはや生産され
ないこと、及びこれらの突然変異体が菌株ＳＥ１８０−１１及びＳＥ１８４−１
−１３と同じ発酵ＨＰＬＣの特徴を有していることを示した。１つのＴｈｉｏs 突然変異体を同定し、菌株ＳＥ１８５−５ａと表示した。
【０１４９】 更に、ｎｔ位５２０をＧからＡに変え、この結果、位１１６でトリプトファン
（Ｗ）をコードするコドンを終止コドンに変える、ａｖｅＣ遺伝子における突然
変異を行った。この突然変異を持ったストレプトミセス・アベルミチリス菌株は
、通常のアベルメクチンを生産せず、そして菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１８４
−１−１３、及びＳＥ１８５−５ａと同じ発酵の特徴を有していた。
【０１５０】 さらに、（ｉ）位２５６でアミノ酸をグリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ
）に変える、ｎｔ位９７０でのＧからＡへの変更、及び（ii）位２７５でアミノ
酸をチロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）に変える、ｎｔ位９９６でのＴからＣ
への変更の両方を行うａｖｅＣ遺伝子における突然変異を行った。これらの突然
変異（Ｇ２５６Ｄ／Ｙ２７５Ｈ）を持ったストレプトミセス・アベルミチリス菌
株は、通常のアベルメクチンを生産せず、そして菌株ＳＥ１８０−１１、ＳＥ１
８４−１−１３、及びＳＥ１８５−５ａと同じ発酵の特徴を有していた。
【０１５１】 ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ不活性化突然変異体菌株ＳＥ１
８０−１１、ＳＥ１８４−１−１３、ＳＥ１８５−５ａ、及び本明細書で記載し
た他の菌株は、ａｖｅＣ遺伝子中の他の突然変異の影響を評価するためのスクリ
ーニングツールを提供する。ａｖｅＣ遺伝子の野生型のコピーを含んでいるｐＳ
Ｅ１８６を、大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐
性の形質転換体から単離した。このｐＳＥ１８６ＤＮＡを用いてストレプトミセ
ス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌
株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマ
イシン耐性の存在を確認し、ＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬ
Ｃ分析によって分析した。機能的なａｖｅＣ遺伝子［イン・トランス（ｉｎ ｔ
ｒａｎｓ）］の存在により、菌株ＳＥ１８０−１１は通常のアベルメクチン生産
を回復することができた（図５Ｂ）。
【０１５２】 ８．２．クラスＢ２：Ｂ１の比を変えるａｖｅＣ遺伝子における突然変異の分析 前記のように、不活性なａｖｅＣ遺伝子を含有するストレプトミセス・アベル
ミチリス菌株ＳＥ１８０−１１は、機能的なａｖｅＣ遺伝子（ｐＳＥ１８６）を
含有するプラスミドを用いて形質転換することにより補完した。菌株ＳＥ１８０
−１１も、下記のように、ａｖｅＣ遺伝子における他の突然変異を特徴付けるた
めに宿主菌株として用いた。
【０１５３】 染色体ＤＮＡを菌株１１００−ＳＣ３８から単離し、ａｖｅＣ遺伝子のＰＣＲ
増幅のための鋳型として用いた。１．２ＫｂのＯＲＦを、ａｖｅＣヌクレオチド
配列を基礎として設計したプライマーを用いたＰＣＲ増幅によって単離した。右
向きのプライマーは、配列表の配列番号６であり、左向きのプライマーは、配列
表の配列番号７であった（前記セクション７．１．１０参照）。ＰＣＲ及びサブ
クローニング条件は、セクション７．１．１０に記載の通りであった。１．２Ｋ
ｂのＯＲＦのＤＮＡ配列分析は、ｎｔ位３３７をＣからＴに変えるａｖｅＣ遺伝
子における突然変異であって、位５５のアミノ酸をセリン（Ｓ）からフェニルア
ラニン（Ｆ）に変える突然変異を示している。Ｓ５５Ｆ突然変異を含有するａｖ
ｅＣ遺伝子をｐＷＨＭ３中にサブクローニングしてｐＳＥ１８７と表示したプラ
スミドを形成し、これを用いてストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８
０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレ
プトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、Ｔｈ
ｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ
酸残基５５（Ｓ５５Ｆ）における変化をコードするａｖｅＣ遺伝子の存在により
、菌株ＳＥ１８０−１１は通常のアベルメクチン生産を回復することができた（
図５Ｃ）。しかしながら、そのシクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の比は
、約１．６：１のＢ２：Ｂ１の比を有する、ｐＳＥ１８６を用いて形質転換した
菌株ＳＥ１８０−１１と比較して、約２６：１であり（表３）、このことは、単
一の突然変異（Ｓ５５Ｆ）がシクロヘキシル−Ｂ１に対して生産されるシクロヘ
キシル−Ｂ２の量を調節していることを示している。
【０１５４】 ｎｔ位８６２をＧからＡに変える、ａｖｅＣ遺伝子における別の突然変異であ
って、位２３０のアミノ酸をグリシン（Ｇ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変える
突然変異を同定した。この突然変異（Ｇ２３０Ｄ）を有するストレプトミセス・
アベルミチリス菌株は、約３０：１のＢ２：Ｂ１比でアベルメクチンを生産する
。
【０１５５】 ８．３．Ｂ２：Ｂ１比を低下させる突然変異 シクロヘキシル−Ｂ１に対して生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量を低下さ
せる数種の突然変異を、以下のように構築した。
【０１５６】 ｎｔ位５８８をＧからＡに変える、ａｖｅＣ遺伝子における突然変異であって
、位１３９のアミノ酸をアラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）に変える突然変異
を同定した。このＡ１３９Ｔ突然変異を含有するａｖｅＣ遺伝子をｐＷＨＭ３中
にサブクローニングしてｐＳＥ１８８と表示したプラスミドを形成し、これを用
いてストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラスト
を形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を
単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、ＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を
発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。アミノ酸残基１３９（Ａ１３９Ｔ
）における変化をコードする、突然変異ａｖｅＣ遺伝子の存在により、菌株ＳＥ
１８０−１１はアベルメクチン生産を回復することができた（図５Ｄ）。しかし
ながら、そのＢ２：Ｂ１の比は、約０．９４：１であり、このことは、この突然
変異がシクロヘキシル−Ｂ１に対して生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量を低
下させることを示している。この結果は予期できないものであった。なぜならば
、刊行物に記載されている結果、並びに前記の突然変異の結果は、ａｖｅＣ遺伝
子の不活性化またはアベルメクチンのＢ１型に対するＢ２型の生産の増加を示し
ていたに過ぎないからである。
【０１５７】 Ａ１３９Ｔ突然変異は、Ｂ２：Ｂ１の比をより有利なＢ１方向に変えたので、
アミノ酸位１３８でセリンの代わりにスレオニンをコードする突然変異が構築さ
れた。このように、ｐＳＥ１８６をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで消化され
ているｐＧＥＭ３Ｚｆ（プロメガ）中にクローニングした。このｐＳＥ１８６ａ
と表示したプラスミドをＡｐａＩ及びＫｐｎＩで消化し、そのＤＮＡフラグメン
トをアガロースゲルで分離し、そして〜３．８Ｋｂ及び〜０．４Ｋｂの２つのフ
ラグメントをゲルから精製した。ｐＳＥ１８６由来の〜１．２Ｋｂのインサート
ＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いて、ｎｔ位５８５に単一の塩基変化を導入した。
このＰＣＲプライマーは、ｎｔ位５８５に突然変異を導入するように設計し、ジ
ェノシス・バイオテクノロジーズ社（テキサス）により供給を受けた。右向きの
ＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧ
ＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＧＡＣＧ−３’（配列表の配列番号１２）で
あり、左向きのＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＡＡＣＣＧＡＣＣＧＣＣＴＧＡ
ＴＡＣＡ−３’（配列表の配列番号１３）であった。ＰＣＲ反応は、アドバンテ
ージＧＣゲノムＰＣＲキット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＧＣ ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐ
ＣＲ ｋｉｔ）［クローンテック・ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），パロ・アルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ），カリフォル
ニア州］を用いて、製造業者によって供給されたバッファー中、２００μＭのｄ
ＮＴＰｓ、２００ピコモルの各プライマー、５０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１．０Ｍの
ＧＣ−メルト（ＧＣ−Ｍｅｌｔ）及び１ユニットのクレンタック・ポリメラーゼ
・ミックス（ＫｌｅｎＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ）の存在下に最終
容量５０μＬで実施した。最初のサイクルの熱履歴は、９４℃で１分間であり、
それに続いて９４℃で３０秒間及び６８℃で２分間の２５サイクル、そして６８
℃で３分間の１サイクルであった。２９５ｂｐのＰＣＲ産物をＡｐａＩ及びＫｐ
ｎＩを用いて消化して２５４ｂｐフラグメントを放出させ、これを電気泳動によ
り分離しそしてゲルから精製した。３個のフラグメント（〜３．８Ｋｂ、〜０．
４Ｋｂ及び２５４ｂｐ）すべてを３通りの連結法で一緒に連結した。この連結混
合物を、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡ
をアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分
析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ１９８と表示した。
【０１５８】 ｐＳＥ１９８をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで消化されているｐＷＨＭ３
中にクローニングし、そして大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミド
ＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を
制限分析及びＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを大腸菌
ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から
単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このｐＳ
Ｅ１９９と表示したプラスミドを用いて、ストレプトミセス・アベルミチリス菌
株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１の
チオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確
認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって
分析した。アミノ酸残基１３８（Ｓ１３８Ｔ）における変化をコードする、突然
変異ａｖｅＣ遺伝子の存在により、菌株ＳＥ１８０−１１は通常のアベルメクチ
ン生産を回復することができた。しかしながら、そのＢ２：Ｂ１の比は、約０．
８８：１であり、このことは、この突然変異がシクロヘキシル−Ｂ１に対して生
産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量を低下させることを示している（表３）。こ
のＢ２：Ｂ１の比は、前記の、ｐＳＥ１８８を用いた菌株ＳＥ１８０−１１の形
質転換により形成されたＡ１３９Ｔ突然変異について観察された０．９４：１の
比より低くさえある。
【０１５９】 アミノ酸位１３８及び１３９の両方にスレオニンを導入するように、別の突然
変異を構築した。ｐＳＥ１８６由来の〜１．２ＫｂのインサートＤＮＡをＰＣＲ
鋳型として用いた。ＰＣＲプライマーは、ｎｔ位５８５及び５８８に突然変異を
導入するように設計し、ジェノシス・バイオテクノロジーズ社（テキサス）によ
り供給を受けた。右向きのＰＣＲプライマーは、５’−ＧＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣ
ＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣ−
３’（配列表の配列番号１４）であり、左向きのＰＣＲプライマーは、５’−Ｇ
ＧＡＡＣＡＴＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＡＣＣ−３’（配列表の配列番号１５）であ
った。ＰＣＲ反応は、本セクションにおいて直前に記載した条件を用いて実施し
た。４４９ｂｐのＰＣＲ産物をＡｐａＩ及びＫｐｎＩを用いて消化して２５４ｂ
ｐのフラグメントを放出させ、これを電気泳動により分離しそしてゲルから精製
した。ｐＳＥ１８６ａをＡｐａＩ及びＫｐｎＩを用いて消化し、そのＤＮＡフラ
グメントをアガロースゲルで分離し、そして〜３．８Ｋｂ及び〜０．４Ｋｂの２
つのフラグメントをゲルから精製した。３つのフラグメント（〜３．８Ｋｂ、〜
０．４Ｋｂ及び２５４ｂｐ）すべてを３通りの連結法で一緒に連結し、この連結
混合物をコンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡ
をアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分
析によって確認した。このプラスミドをｐＳＥ２３０と表示した。
【０１６０】 ｐＳＥ２３０をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで消化されているｐＷＨＭ３
中にクローニングし、そして大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した。プラスミド
ＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在を
制限分析及びＤＮＡ配列分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを大腸菌
ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から
単離し、そして正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。このプラ
スミドをｐＳＥ２３１と表示し、このプラスミドを用いて、ストレプトミセス・
アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。ＳＥ１
８０−１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐
性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵によって分析した
。Ｓ１３８Ｔ／Ａ１３９Ｔをコードする、二重に突然変異されたａｖｅＣ遺伝子
の存在により、菌株ＳＥ１８０−１１は通常のアベルメクチン生産を回復するこ
とができた。しかしながら、そのＢ２：Ｂ１の比は、約０．８４：１であり、こ
のことは、この突然変異が、前記のｐＳＥ１８８またはｐＳＥ１９９を用いた菌
株ＳＥ１８０−１１の形質転換によりもたらされた低下よりさらに、シクロヘキ
シル−Ｂ１に対して生産されるシクロヘキシル−Ｂ２の量を低下させることを示
している（表３）。
【０１６１】 《表３》 ストレプトミセス・ 試験した 相対的 相対的 Ｂ２：Ｂ１ アベルミチリス菌株 形質転 Ｂ２ Ｂ１ 比平均 （形質転換プラスミド） 換体数 濃度 濃度 ＳＥ１８０−１１（なし） ３０ ０ ０ ０ ＳＥ１８０−１１（ｐＷＨＭ３） ３０ ０ ０ ０ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ１８６） ２６ ２２２ １４０ １．５９ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ１８７） １２ ２８３ １１ ２６．３ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ１８８） ２４ １９３ ２０６ ０．９４ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ１９９） １８ １５５ １７１ ０．８８ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ２３１） ６ ２５９ ３０９ ０．８４
【０１６２】 これらの結果は、クラス２のアベルメクチンに対してより商業的に望ましいク
ラス１の生産を増加させる結果をもたらす、ａｖｅＣ遺伝子における特異的な突
然変異を示す最初のものである。
【０１６３】 ９．実施例：５’欠失突然変異体の構築 前記セクション５．１において説明したように、図１に示したストレプトミセ
ス・アベルミチリスのヌクレオチド配列（配列表の配列番号１）は、潜在的な開
始位置であるｂｐ位４２、１７４、１７７及び１８０において４つの異なるＧＴ
Ｇコドンを含んでいる。本セクションは、ａｖｅＣ−ＯＲＦ（図１；配列表の配
列番号１）の５’領域の複数の欠失の構成を説明し、これらのコドンのうちどれ
がタンパク質発現のためのａｖｅＣ−ＯＲＦにおける開始位置として機能するこ
とができたかを規定するのに資するものである。
【０１６４】 ５’末端において種々に欠失したａｖｅＣ遺伝子のフラグメントを、ＰＣＲ増
幅によりストレプトミセス・アベルミチリスの染色体ＤＮＡから単離した。ＰＣ
Ｒプライマーは、ａｖｅＣのＤＮＡ配列に基づいて設計し、これは、ジェノシス
・バイオテクノロジーズ社により供給を受けた。右向きのプライマーは、５'− ＡＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣＴＣ−３'（配列表の配列番号１６）（Ｄ１ Ｆ１）；５'−ＴＣＧＧＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＡＡＣ−３'（配列表の配列番号１
７）（Ｄ１Ｆ２）；５'−ＣＣＡＡＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡＧＴＡＧ−３'（配列表
の配列番号１８）（Ｄ１Ｆ３）；及び５'−ＴＧＣＡＧＧＣＧＴＡＣＧＴＧＴＴ ＣＡＧＣ―３'（配列表の配列番号１９）（Ｄ２Ｆ２）；であった。左向きのプ ライマーは、５'−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡ−３'（配列表の配列番
号２０）；５'−ＣＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡＧＧＡ−３'（配列表の配
列番号２１）；及び５'−ＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡ―３'（配
配列表の配列番号２２）であった。このＰＣＲ反応は前記セクション８．３に記
載の通りに実施した。
【０１６５】 このＰＣＲ産物を１％アガロースゲル中での電気泳動により分離し、〜１．０
Ｋｂまたは〜１．１Ｋｂの単一のＤＮＡバンドを検出した。このＰＣＲ産物をゲ
ルから精製し、２５ｎｇの線状化されたｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェ
ン）と１：１０モルのベクター対インサートの比で、製造業者の取扱説明書に従
って連結した。この連結混合物を用いて、製造業者の取扱説明書に従い、ワン・
ショット（Ｏｎｅ ＳｈｏｔTM）コンピテント（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）大腸菌細
胞（インビトロジェン）を形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性
の形質転換体から単離し、インサートの存在を制限分析及びＤＮＡ配列分析によ
って確認した。これらのプラスミドをｐＳＥ１９０（プライマーＤ１Ｆ１を用い
て得られた）、ｐＳＥ１９１（プライマーＤ１Ｆ２を用いて得られた）、ｐＳＥ
１９２（プライマーＤ１Ｆ３を用いて得られた）、及びｐＳＥ１９３（プライマ
ーＤ２Ｆ２を用いて得られた）と表示した。
【０１６６】 これらのインサートＤＮＡをそれぞれＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化し、電気泳
動により分離し、ゲルから精製し、そして別々に、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩで消化
されているシャトルベクターｐＷＨＭ３と、１：５のベクター対インサートのモ
ル比で総ＤＮＡ濃度１μｇにして連結した。この連結混合物を用いてコンピテン
ト大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の
形質転換体から分離し、インサートの存在を制限分析によって確認した。これら
のプラスミドは、ｐＳＥ１９４（Ｄ１Ｆ１）、ｐＳＥ１９５（Ｄ１Ｆ２）、ｐＳ
Ｅ１９６（Ｄ１Ｆ３）及びｐＳＥ１９７（Ｄ２Ｆ２）と表示し、それぞれを別々
に大腸菌菌株ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形
質転換体から単離し、正しいインサートの存在を制限分析によって確認した。こ
のＤＮＡを用いてストレプトミセス・アベルミチリス菌株ＳＥ１８０−１１のプ
ロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−１１のチオストレプトン耐性の
形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存在を確認し、そしてＴｈｉｏr Ｅｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析し、どのＧＴＧ部 位がａｖｅＣ発現に必要であるかを特定した。この結果は、それぞれ位４２にお
いてＧＴＧ部位を欠いているが位１７４、位１７７及び位１８０においてはすべ
てが３つのＧＴＧ部位を含んでいるｐＳＥ１９４、ｐＳＥ１９５及びｐＳＥ１９
６は、それぞれがＳＥ１８０−１１中に形質転換された場合に通常のアベルメク
チン生産を回復することができたので、位４２のＧＴＧコドンを、ａｖｅＣ発現
に影響を与えることなしに除去することができるということを示している。通常
のアベルメクチン生産は、菌株ＳＥ１８０−１１を、４つのＧＴＧ部位のすべて
を欠いているｐＳＥ１９７で形質転換した場合には、回復がなかった（表４）。
【０１６７】 《表４》 ストレプトミセス・ 試験した 相対的 相対的 Ｂ２：Ｂ１ アベルミチリス菌株 形質転 Ｂ２ Ｂ１ 比平均 （形質転換プラスミド） 換体数 濃度 濃度 ＳＥ１８０−１１（なし） ６ ０ ０ ０ ＳＥ１８０−１１（ｐＷＨＭ３） ６ ０ ０ ０ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ１８６） ６ ２４１ １５２ １．５８ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ１９４） ６ ３５ １５ ２．４３ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ１９５） ６ ７４ ３８ １．９７ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ１９６） ６ ３２８ ２０８ １．５８ ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ１９７） １２ ０ ０ ０
【０１６８】 １０．実施例：ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐ
ｉｃｕｓ）及びストレプトミセス・グリセオクロモゲネス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のａｖｅＣ相同体のクローニング 本発明は、他のアベルメクチンまたはミルベマイシン（ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎ
）を生産するストレプトミセスの種由来のａｖｅＣ相同遺伝子を同定しそしてク
ローニングすることを可能にするものである。例えば、ストレプトミセス・ヒグ
ロスコピカス（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９０１）のコスミドライブラリーを、前記ス
トレプトミセス・アベルミチリス由来の１．２ＫｂのａｖｅＣプローブとハイブ
リダイズさせた。強くハイブリダイズしたいくつかのコスミドクローンを同定し
た。染色体ＤＮＡをこれらのコスミドから分離し、ａｖｅＣプローブとハイブリ
ッドした４．９ＫｂのＫｐｎＩフラグメントを同定した。このＤＮＡの配列を決
定し、ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ−ＯＲＦと有意な相同性を
持つＯＲＦ（配列表の配列番号３）を同定した。ストレプトミセス・ヒグロスコ
ピカスのａｖｅＣ相同ＯＲＦから推定されたアミノ酸配列（配列表の配列番号４
）を図６に示す。
【０１６９】 更に、ストレプトミセス・グリセオクロモゲネスのゲノムＤＮＡのコスミドラ
イブラリーを、前記したストレプトミセス・アベルミチリス由来の１．２Ｋｂの
ａｖｅＣプローブとハイブリダイズした。強くハイブリダイズしたいくつかのコ
スミドクローンを同定した。染色体ＤＮＡをこれらのコスミドから分離し、ａｖ
ｅＣプローブとハイブリダイズした５．４ＫｂのＰｓｔＩフラグメントを同定し
た。このＤＮＡの配列を決定し、ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ
−ＯＲＦと有意な相同性を持つａｖｅＣ相同体の部分的ＯＲＦを同定した。推定
された部分的アミノ酸配列（配列表の配列番号５）を図６に示す。
【０１７０】 ストレプトミセス・ヒグロスコピカス及びストレプトミセス・グリセオクロモ
ゲネス由来のａｖｅＣ相同体のＤＮＡ及びアミノ酸配列分析は、これらの領域が
、両方とも互いに対して及びストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ−Ｏ
ＲＦ及びＡｖｅＣ遺伝子産物に対して有意な相同性（アミノ酸レベルで〜５０％
の配列一致）を共有していることを示している（図６）。
【０１７１】 １１．実施例：ｅｒｍＥプロモーターの後にａｖｅＣ遺伝子を用いたプラスミド
の構築 ｐＳＥ１８６由来の１．２ＫｂのａｖｅＣ−ＯＲＦを、ｐＷＨＭ３のＫｐｎＩ
／ＢａｍＨＩ部位中にＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてインサートされ
た３００ｂｐのｅｒｍＥプロモーターを有するシャトルベクターｐＷＨＭ３であ
るｐＳＥ３４中にサブクローニングした［ウォード（Ｗａｒｄ）ら，１９８６年
，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０３：４６８−４７８参照］。ｐＳＥ１８
６をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIIIで消化し、その消化産物を電気泳動により分離 し、そして１．２Ｋｂフラグメントをアガロースゲルから分離し、ＢａｍＨＩ及
びＨｉｎｄIIIで消化されているｐＳＥ３４と連結した。この連結混合物を、製 造業者の取扱説明書に従い、コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換した
。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から単離し、１．２Ｋｂの
インサートの存在を制限分析によって確認した。このプラスミドは、ｐＳＥ１８
９と表示し、大腸菌ＤＭ１中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐
性の形質転換体から単離した。ストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００
−ＳＣ３８のプロトプラストをｐＳＥ１８９を用いて形質転換した。菌株１１０
０−ＳＣ３８のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、発酵生産物のＨＰ
ＬＣ分析によって分析した。
【０１７２】 ｐＳＥ１８９を含有するストレプトミセス・アベルミチリス菌株１１００−Ｓ
Ｃ３８の形質転換体は、生産されるアベルメクチン・シクロヘキシル−Ｂ２：ア
ベルメクチン・シクロヘキシル−Ｂ１の比（約３：１）において菌株１１００−
ＳＣ３８（約３４：１）と比較して変化が生じ、アベルメクチンの総生産量が、
ｐＳＥ１１９を用いて形質転換された菌株１１００−ＳＣ３８と比べ約２．４倍
増加した（表５）。
【０１７３】 ｐＳＥ１８９を、同様に、野生型のストレプトミセス・アベルミチリス菌株の
プロトプラスト中に形質転換した。チオストレプトン耐性の形質転換体を単離し
、発酵生産物のＨＰＬＣ分析によって分析した。ｐＳＥ１８９を用いて形質転換
された野生型のストレプトミセス・アベルミチリスにより生産されたアベルメク
チン総量は、ｐＳＥ１１９を用いて形質転換された野生型のストレプトミセス・
アベルミチリスに比べて約２．２倍増加した（表５）。
【０１７４】 《表５》 ストレプトミセス・ 試験した 相対値 相対値 相対値 B2:B1 アベルミチリス菌株 形質転 [Ｂ２] [Ｂ１] 合計アベル 比(形質転換プラスミド) 換体数 メクチン 平均 １１００−ＳＣ３８ ６ １５５ ４．８ １７６ ３３．９ １１００−ＳＣ３８ ９ ２３９ ５０．３ ３５７ ４．７ （ｐＳＥ１１９） １１００−ＳＣ３８ １６ ５４６ １６６ ８４９ ３．３ （ｐＳＥ１８９） 野生型 ６ ５９ ４２ １１３ １．４１ 野生型 ６ ２４８ １５１ ４８１ １．６４ （ｐＳＥ１１９） 野生型 ５ ５４５ ３４５ １０７１ １．５８ （ｐＳＥ１８９）
【０１７５】 １２．実施例：ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ及びスト
レプトミセス・ヒグロスコピカスのａｖｅＣ相同体の両方に由来する配列を含ん
でいるキメラプラスミド ストレプトミセス・アベルミチリスのａｖｅＣ−ＯＲＦの５６４ｂｐ相同性部
分をストレプトミセス・ヒグロスコピカスのａｖｅＣ相同体の５６４ｂｐ部分に
置き換えて含んでいる、ｐＳＥ３５０と表示したハイブリッドプラスミド（図７
）を、以下のように構築した。ｐＳＥ３５０は、両方の配列中に保存されている
ＢｓａＡＩ制限部位（ａｖｅＣ位２２５）、及びストレプトミセス・アベルミチ
リスのａｖｅＣ遺伝子中に存在するＫｐｎＩ制限部位（ａｖｅＣ位８１０）を用
いて構築した。ＫｐｎＩ部位は、前記セクション７．１．１０に記載のＰＣＲ条
件を用い、右向きのプライマー５’−ＣＴＴＣＡＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧＴＴＣＧ
−３’（配列表の配列番号２３）及び左向きのプライマー５’−ＧＡＡＣＴＧＧ
ＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＣ−３’（配列表の配列番号２４）（ジェノシス・バイオ
テクノロジーズ社により供給された）を用いたＰＣＲによって、ストレプトミセ
ス・ヒグロスコピカスのＤＮＡ中に導入した。このＰＣＲ産物をＢｓａＡＩ及び
ＫｐｎＩで消化し、そのフラグメントを１％アガロースゲル中の電気泳動により
分離し、そして５６４ｂｐのＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩフラグメントをゲルから分離
した。ｐＳＥ１７９（前記セクション７．１．１０に記載）をＫｐｎＩ及びＨｉ
ｎｄIIIで消化し、そのフラグメントを１％アガロースゲル中の電気泳動により 分離し、そして〜４．５Ｋｂのフラグメントをゲルから分離した。ｐＳＥ１７９
をＨｉｎｄIII及びＢｓａＡＩで消化し、そのフラグメントを１％アガロースゲ ル中の電気泳動により分離し、そして〜０．２ＫｂのＢｓａＡＩ／ＨｉｎｄIII フラグメントをゲルから分離した。ストレプトミセス・ヒグロスコピカス由来の
〜４．５ＫｂのＨｉｎｄIII／ＫｐｎＩフラグメント、〜０．２ＫｂのＢｓａＡ Ｉ／ＨｉｎｄIIIフラグメント及び５６４ｂｐのＢｓａＡＩ／ＫｐｎＩフラグメ ントを３通りの連結法で一緒に連結し、この連結混合物をコンピテント大腸菌Ｄ
Ｈ５α細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換
体から単離し、正しいインサートの存在をＫｐｎＩ及びＡｖａＩを用いた制限分
析によって確認した。このプラスミドをＨｉｎｄIII及びＸｂａＩで消化して、 １．２Ｋｂのインサートを放出させ、次いでこのインサートを、ＨｉｎｄIII及 びＸｂａＩで消化しておいたｐＷＨＭ３と連結した。この連結混合物をコンピテ
ント大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性
の形質転換体から単離し、正しいインサートの存在をＨｉｎｄIII及びＡｖａＩ を用いた制限分析によって確認した。このプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＭ１中に
形質転換し、プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性の形質転換体から分離し、正
しいインサートの存在を制限分析及びＤＮＡ配列分析によって確認した。このプ
ラスミドをｐＳＥ３５０と表示し、これを用いてストレプトミセス・アベルミチ
リス菌株ＳＥ１８０−１１のプロトプラストを形質転換した。菌株ＳＥ１８０−
１１のチオストレプトン耐性の形質転換体を単離し、エリスロマイシン耐性の存
在を確認し、そしてＴｈｉｏrＥｒｍr形質転換体を発酵生産物のＨＰＬＣ分析に
よって分析した。その結果は、ストレプトミセス・アベルミチリス／ストレプト
ミセス・ヒグロスコピカスのハイブリッドプラスミドを含有する形質転換体は平
均で約１０９：１のＢ２：Ｂ１比を有していることを示している。
【０１７６】 《表６》 ストレプトミセス・ 試験した 相対的 相対的 Ｂ２：Ｂ１ アベルミチリス菌株 形質転 Ｂ２ Ｂ１ 比平均 （形質転換プラスミド） 換体数 濃度 濃度 ＳＥ１８０−１１（なし） ８ ０ ０ ０ ＳＥ１８０−１１（ｐＷＨＭ３） ８ ０ ０ ０ＳＥ１８０−１１（ｐＳＥ３５０） １６ ２３３ ２ １０９
【０１７７】 生物学的材料の寄託 下記の生物学的材料を、米国、２０８５２、メリーランド州、ロックビル（Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ）、パークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ
）１２３０１在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に、
１９９８年１月２９日に寄託し、下記の受託番号を付与された。 プラスミド 受託番号 プラスミドｐＳＥ１８０ ２０９６０５ プラスミドｐＳＥ１８６ ２０９６０４
【０１７８】 前記したすべての特許、特許出願及び刊行物は、その全体を参考までに本明細
書に引用するものである。 本発明は、本明細書に記した特定の態様により発明の範囲を限定することを意
図するものではなく、これらの態様は本発明の個々の観点の単独の説明を意図し
て設けたものであり、機能的に等価な方法及び要素は本発明の範囲内にある。実
際、本明細書に示し記載した態様の他に、本発明の種々の態様があることは、本
明細書の記載内容及び添付の図面から当業者には明白なことであろう。かかる態
様が、請求の範囲内に包含されることは意図するところである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦを含むＤＮＡ配列（配
列表の配列番号１）及び推定されるアミノ酸配列（配列表の配列番号２）。
【図２】 ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ遺伝子の完全ＯＲＦを含むプ
ラスミドベクターｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）。
【図３】 ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦ中に挿入された、サ
ッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒ
ｙｔｈｒａｅａ）のｅｒｍＥ遺伝子を含む遺伝子置換ベクターｐＳＥ１８６（Ａ
ＴＣＣ２０９６０５）。
【図４】 ストレプトミセス・アベルミティリス由来のアベルメクチンポリケチドシンタ
ーゼ遺伝子クラスターのＢａｍＨＩ制限地図、及び同定された５種の重複コスミ
ドクローン（すなわち、ｐＳＥ６５、ｐＳＥ６６、ｐＳＥ６７、ｐＳＥ６８、ｐ
ＳＥ６９）。ｐＳＥ１１８とｐＳＥ１１９との関係も示す。
【図５Ａ】 ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物のＨＰＬ
Ｃ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実施した
。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシルＢ１
の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。不活性ａｖｅＣ−ＯＲＦを有するスト
レプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。
【図５Ｂ】 ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物のＨＰＬ
Ｃ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実施した
。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシルＢ１
の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。ｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４
）で形質転換されたストレプトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。
【図５Ｃ】 ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物のＨＰＬ
Ｃ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実施した
。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシルＢ１
の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。ｐＳＥ１８７で形質転換されたストレ
プトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。
【図５Ｄ】 ストレプトミセス・アベルミティリス株により生成された発酵生成物のＨＰＬ
Ｃ分析。ピークの定量は、シクロヘキシルＢ１の標準量との比較により実施した
。シクロヘキシルＢ２の保持時間は、７．４〜７．７分間；シクロヘキシルＢ１
の保持時間は、１１．９〜１２．３分間。ｐＳＥ１８８で形質転換されたストレ
プトミセス・アベルミティリスＳＥ１８０−１１株。
【図６】 ストレプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦでコードされる推定
アミノ酸配列（ＳＥＣ ＩＤ ＮＯ：２）と、ストレプトミセス・グリセオクロ
モゲネス（ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のａｖｅＣ相同部分的Ｏ
ＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（配列表の配列番号５）と、ストレプトミ
セス・ヒグロスコピカス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来のａｖｅＣ相同Ｏ
ＲＦでコードされる推定アミノ酸配列（配列表の配列番号４）との比較。太字（
ｂｏｌｄ）のバリン残基が、タンパク質の推定上のスタート部位である。保存さ
れている残基を、３種の全ての配列で相同であれば大文字で示し、３種の配列の
内、２つが相同であれば小文字で示す。アミノ酸配列は、約５０％の配列一致を
含む。
【図７】 ストレプトミセス・アベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦ中のＢｓａＡｌ／Ｋｐ
ｎｌ部位に挿入された、ストレプトミセス・ヒグロスコピカスａｖｅＣ相同遺伝
子由来の５６４ｂｐのＢｓａＡｌ／Ｋｐｎｌフラグメントを含むハイブリッドプ
ラスミド構築物。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月２７日（２０００．４．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２】 ストレプトミセス・アベルミティリスの生体内でＡｖｅ
Ｃ遺伝子に天然に隣接するヌクレオチド配列を更に含む、請求項１に記載の単離
ポリヌクレオチド分子。
【請求項３】 ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産
物をコードする図１（配列表の配列番号１）に示すａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実
体部分のヌクレオチド配列に対して、相同なヌクレオチド配列を含む、単離ポリ
ヌクレオチド分子。
【請求項４】 配列表の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体部
分、あるいは、配列表の配列番号３のヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配
列を含む、単離ポリヌクレオチド分子。
【請求項５】 図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３の
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対して、あるいは、図１（配
列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対して、高度にストリンジェント
な条件下でハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド分子。
【請求項６】 図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３の
ヌクレオチド配列に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号１）又は配列表
の配列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチド分子に対して、相補的である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド分
子。
【請求項７】 図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦ又はそ
の実体部分のヌクレオチド配列；及び ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする図１（配
列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部分のヌクレオチド配列に
対して、相同であるヌクレオチド配列 か らなる群から選んだヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む、組
換えベクター。
【請求項８】 調節要素１又はそれ以上をコードするヌクレオチド配列
を更に含み、そして、前記の調節要素をコードするヌクレオチド配列と、請求項 ７ に記載のベクターのポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列とが、影響を及
ぼす関係にある、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項９】 選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を更に含む
、請求項８に記載の組換えベクター。
【請求項１０】 プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）で
ある、請求項９に記載の組換えベクター。
【請求項１１】 請求項９に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２】 ストレプトミセス・アベルミティリスである、請求項 １１ に記載の宿主細胞。
【請求項１３】 配列表の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体
部分；配列表の配列番号３のヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列；及び
配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列からなる群から選択したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子
を含む、組換えベクター。
【請求項１４】 調節要素１又はそれ以上をコードするヌクレオチド配
列を更に含み、そして、前記の調節要素をコードするヌクレオチド配列と、請求
項１３に記載のベクターのポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列とが、影響
を及ぼす関係にある、請求項１３に記載の組換えベクター。
【請求項１５】 選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を更に含
む、請求項１４に記載の組換えベクター。
【請求項１６】 請求項１５に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞
。
【請求項１７】 ストレプトミセス・ヒグロスコピカスである、請求項 １６ に記載の宿主細胞。
【請求項１８】 プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）の
ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオ
チド配列によってコードされるアミノ酸配列、あるいは、配列表の配列番号２の
アミノ酸配列又はその実体部分を有する、単離されたストレプトミセス・アベル
ミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物、又はその相同ポリペプチド。
【請求項１９】 配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有する、単離さ れた ストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物。
【請求項２０】 組換え発現ベクター［但し、前記組換え発現ベクター
は、配列表の配列番号２のアミノ酸配列又はその実体部分をコードするヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子と、
宿主細胞中におけるポリヌクレオチド分子の発現を制御する調節要素１又はそれ
以上とが、影響を及ぼす関係にある］で形質転換した宿主細胞を、組換えＡｖｅ
Ｃ遺伝子産物の生成を促す条件下で培養し、その細胞培養物からＡｖｅＣ遺伝子
産物を回収することを含む、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の製造方法。
【請求項２１】 組換え発現ベクター［但し、前記組換え発現ベクター
は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列又はその実体部分をコードするヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子と、
宿主細胞中におけるポリヌクレオチド分子の発現を制御する調節要素１又はそれ
以上とが、影響を及ぼす関係にある］で形質転換した宿主細胞を、組換えＡｖｅ
Ｃ相同遺伝子産物の生成を促す条件下で培養し、その細胞培養物からＡｖｅＣ相
同遺伝子産物を回収することを含む、組換えＡｖｅＣ相同遺伝子産物の製造方法
。
【請求項２２】 野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が不活化されており、しか
も、突然変異１又はそれ以上を更に含むヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ド分子が発現されるストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株
の細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス
・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株の細胞によって生成されるアベルメク
チンと比較して、シクロヘキサンカルボン酸の存在下で発酵した場合にシクロヘ キシルＢ２：シクロヘキシルＢ１が減少した アベルメクチンを生成するような前
記突然変異ヌクレオチド配列を更に含むこと以外は、プラスミドｐＳＥ１８６（
ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子
産物をコードする配列と、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に記載のスト
レプトミセス・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列と、あ るいは、その縮重変異体と 同じヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子
。
【請求項２３】 シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した
比が、１．６：１未満である、請求項２２に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２４】 シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した
比が、約０．９４：１である、請求項２３に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２５】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・ア
ベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦに対する突然変異が、ＡｖｅＣ遺伝子産物の残
基１３９におけるアラニンからトレオニンへのアミノ酸置換をコードする、請求
項２４に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２６】 シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した
比が、約０．８８：１である、請求項２３に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２７】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・ア
ベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦに対する突然変異が、ＡｖｅＣ遺伝子産物の残
基１３８におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸置換をコードする、請求項 ２６ に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２８】 シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した
比が、約０．８４：１である、請求項２３に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項２９】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・ア
ベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦに対する突然変異が、ＡｖｅＣ遺伝子産物の残
基１３８におけるセリンからトレオニンへの第１のアミノ酸置換と、ＡｖｅＣ遺
伝子産物の残基１３９におけるアラニンからトレオニンへの第２のアミノ酸置換
とをコードする、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３０】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・ア
ベルミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦと影響を及ぼす関係にある強力なプロモーター
を含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項３１】 強力なプロモーターが、サッカロポリスポラ・エリス
ラエア由来のｅｒｍＥプロモーターである、請求項３０に記載のポリヌクレオチ
ド分子。
【請求項３２】 ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする図１（配列表の配列 番号１）のＯＲＦをコードする ヌクレオチド配列中への外来性ヌクレオチド配列
の挿入によって不活性化された前記ヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド
分子。
【請求項３３】 図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦから
６４０ｂｐのＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントを欠失することによって不活性化
したａｖｅＣ対立遺伝子を含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項３４】 図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ対立遺伝子中
にフレームシフト突然変異を導入することによって不活化されたａｖｅＣ対立遺
伝子を含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項３５】 図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦのヌ
クレオチド位置４７１におけるＣヌクレオチドの後に、Ｇヌクレオチド２個を加
えることによってフレームシフト突然変異が導入された、請求項３４に記載のポ
リヌクレオチド分子。
【請求項３６】 図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦによ りコードされる ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物のアミ
ノ酸１１６をコードするヌクレオチド位置に、終止コドンを導入することによっ
て不活性化されたａｖｅＣ対立遺伝子を含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項３７】 ＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸位置２５６においてグ
リシンをアスパラギン酸に変える第１の突然変異と、ＡｖｅＣ遺伝子産物の２５
７位置においてチロシンをヒスチジンに変える第２の突然変異とを導入すること
によって不活性化させたａｖｅＣ対立遺伝子を含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項３８】 ストレプトミセス・アベルミティリス染色体において
、生体内でＡｖｅＣ−ＯＲＦに天然に隣接するヌクレオチド配列を含むポリヌク
レオチド分子を含む、遺伝子置換ベクター。
【請求項３９】 請求項２２〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレ
オチド分子を含む、組換えベクター。
【請求項４０】 請求項３２に記載のポリヌクレオチド分子を含み、ｐ
ＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）である、組換えベクター。
【請求項４１】 請求項３９に記載の組換えベクターを含む、宿主スト
レプトミセス細胞。
【請求項４２】 （ａ）天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されてお
り、しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を
含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現しているストレプトミセス・アベル
ミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を決定
し； （ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列、あるいは、そ
れに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現す
ること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞
によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を決定し；そして、 （ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成され
るアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベル
ミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比とを比較し
；工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるア
ベルメクチンのクラス２：１比が、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミテ
ィリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比より低い場合に
、アベルメクチンのクラス２：１比を減少させることのできるａｖｅＣ−ＯＲＦ
の突然変異を同定する ことを含む、生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を減少させることので
きるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定する方法。
【請求項４３】 突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも
、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベル
ミティリスの同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が減少したアベルメクチ
ンを生成する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法
であって、 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅＣ対立遺
伝子（但し、前記遺伝子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する
同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプ
トミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラ
ス２：１比を減少させる遺伝子産物をコードする）を担持するベクターによって
形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する株の細
胞により生成されるクラス２：１比と比較して、クラス２：１比が減少したアベ
ルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法。
【請求項４４】 細胞が、不活性化されたａｖｅＣ対立遺伝子を含むス
トレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、ａｖｅＣ対立遺伝子を不活性
化させるベクターで形質転換し、そして、ａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化された
形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法。
【請求項４５】 ベクターがｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）で
ある、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】 突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子［但し、前記遺伝子
は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して
、減少したクラス２：１比のアベルメクチンの生成（細胞による）を引き起こす
］を発現する細胞を含む、ストレプトミセス・アベルミティリス株。
【請求項４７】 細胞が、１．６：１未満の比でシクロヘキシルＢ２：
シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する、請求項４６に記載の株。
【請求項４８】 細胞が、約０．９４：１の比でシクロヘキシルＢ２：
シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する、請求項４６に記載の株。
【請求項４９】 細胞が、約０．８８：１の比でシクロヘキシルＢ２：
シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する、請求項４６に記載の株。
【請求項５０】 細胞が、約０．８４：１の比でシクロヘキシルＢ２：
シクロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する、請求項４６に記載の株。
【請求項５１】 ａｖｅＣ遺伝子が不活性化された細胞を含む、ストレ
プトミセス・アベルミティリス株。
【請求項５２】 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し
、前記細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野生型ａｖ
ｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異した
ａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞に
よって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を減少させる遺伝子産物をコ
ードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）を、その細胞によるアベ
ルメクチンの生成を許容又は誘発する条件下で、培養培地中で培養し、そして、
培養物からアベルメクチンを回収することを含む、アベルメクチンの製造方法。
【請求項５３】 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し
、前記細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野生型ａｖ
ｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異した
ａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞に
よって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を減少させる遺伝子産物をコ
ードする突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）により生成されたアベル
メクチンの組成物であって、 前記アベルメクチンが、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野
生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミテ
ィリスの同じ株の細胞により生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と比較
して、減少したクラス２：１比で生成される、前記組成物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/527 (Ｃ１２Ｎ 1/21 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マッカーサー，ハーミッシュ アラスター アーヴィン アメリカ合衆国 06335 コネチカット州 ゲイルズ・フェリー市 フィーザント・ ラン・ドライブ 19 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA10 BA80 CA01 DA08 FA02 GA11 GA19 GA25 4B050 CC03 DD02 LL01 4B063 QA17 QQ06 QS10 QX01 4B064 AF53 CA04 CA19 CB29 CC24 CD18 DA01 DA12 4B065 AA50X AA50Y AB01 AC14 BA01 BA16 CA22 CA27 CA34 CA43 CA44

Claims (71)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ストレプトミセス・アベルミティリスの完全ａｖｅＣ−ＯＲ
    Ｆ又はその実体部分を含む、単離ポリヌクレオチド分子であって、 前記単離ポリヌクレオチド分子が、ストレプトミセス・アベルミティリス染色体
    において、生体内でａｖｅＣ−ＯＲＦの下流に位置する次の完全ＯＲＦを欠失す
    る、前記単離ポリヌクレオチド分子。
  2. 【請求項２】 プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレ
    プトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と同じであ
    るか、あるいは、図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体
    部分のヌクレオチド配列と同じであるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載
    の単離ポリヌクレオチド分子。
  3. 【請求項３】 ストレプトミセス・アベルミティリスの生体内でＡｖｅＣ遺
    伝子に天然に隣接するヌクレオチド配列を更に含む、請求項２に記載の単離ポリ
    ヌクレオチド分子。
  4. 【請求項４】 プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレ
    プトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列に対して、
    あるいは、図１（配列表の配列番号１）に示すａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部
    分のヌクレオチド配列に対して、相同なヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌク
    レオチド分子。
  5. 【請求項５】 プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅ
    Ｃ遺伝子産物をコードする配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、ある
    いは、図１（配列表の配列番号２）のアミノ酸配列又はその実体部分に対して、
    相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
    、単離ポリヌクレオチド分子。
  6. 【請求項６】 配列表の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体部分、
    あるいは、配列表の配列番号３のヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を
    含む、単離ポリヌクレオチド分子。
  7. 【請求項７】 配列表の配列番号４のアミノ酸配列と相同なポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド分子。
  8. 【請求項８】 図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌク
    レオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に対して、あるいは、図１（配列表
    の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオ
    チド配列を有するポリヌクレオチド分子に対して、高度にストリンジェントな条
    件下でハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド分子。
  9. 【請求項９】 図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配列番号３のヌク
    レオチド配列に対して、あるいは、図１（配列表の配列番号１）又は配列表の配
    列番号３のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
    チド分子に対して、相補的である、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド分子。
  10. 【請求項１０】 （ａ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）
    のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列と
    同じであるか、あるいは、図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦ又は
    その実体部分のヌクレオチド配列と同じであるヌクレオチド配列； （ｂ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・
    アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードする配列に対して、あるいは、図
    １（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦ又はその実体部分のヌクレオチド
    配列に対して、相同であるヌクレオチド配列；及び （ｃ）プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のＡｖｅＣ遺伝子産物
    をコードする配列によりコードされるアミノ酸配列に対して、あるいは、図１（
    配列表の配列番号２）のアミノ酸配列又はその実体部分に対して、相同なアミノ
    酸配列を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列 からなる群から選んだヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む、組
    換えベクター。
  11. 【請求項１１】 調節要素１又はそれ以上をコードするヌクレオチド配列を
    更に含み、そして、前記の調節要素をコードするヌクレオチド配列と、請求項１
    ０に記載のヌクレオチド配列とが、影響を及ぼす関係にある、請求項１０に記載
    の組換えベクター。
  12. 【請求項１２】 選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を更に含む、
    請求項１１に記載の組換えベクター。
  13. 【請求項１３】 プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）である
    、請求項１２に記載の組換えベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 ストレプトミセス・アベルミティリスである、請求項１４
    に記載の宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 配列表の配列番号３のヌクレオチド配列又はその実体部分
    ；配列表の配列番号３のヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列；及び配列
    表の配列番号４のアミノ酸配列と相同なポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列からなる群から選択したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含
    む、組換えベクター。
  17. 【請求項１７】 調節要素１又はそれ以上をコードするヌクレオチド配列を
    更に含み、そして、前記の調節要素をコードするヌクレオチド配列と、請求項１
    ６に記載のヌクレオチド配列とが、影響を及ぼす関係にある、請求項１６に記載
    の組換えベクター。
  18. 【請求項１８】 選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を更に含む、
    請求項１７に記載の組換えベクター。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
  20. 【請求項２０】 ストレプトミセス・ヒグロスコピカスである、請求項１９
    に記載の宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のスト
    レプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド
    配列によってコードされるアミノ酸配列、あるいは、配列表の配列番号２のアミ
    ノ酸配列又はその実体部分を有する、組換え発現ストレプトミセス・アベルミテ
    ィリスＡｖｅＣ遺伝子産物、又はその相同ポリペプチド。
  22. 【請求項２２】 配列表の配列番号４のアミノ酸配列を有する、組換え発現
    ストレプトミセス・ヒグロスコピカスＡｖｅＣ相同遺伝子産物、又はその相同ポ
    リペプチド。
  23. 【請求項２３】 組換え発現ベクター［但し、前記組換え発現ベクターは、
    プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０９６０４）のストレプトミセス・アベル
    ミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列によってコードさ
    れるアミノ酸配列をコードするか、あるいは、配列表の配列番号２のアミノ酸配
    列又はその実体部分をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分
    子を含み、前記ポリヌクレオチド分子と、宿主細胞中におけるポリヌクレオチド
    分子の発現を制御する調節要素１又はそれ以上とが、影響を及ぼす関係にある］
    で形質転換した宿主細胞を、組換えＡｖｅＣ遺伝子産物の生成を促す条件下で培
    養し、その細胞培養物からＡｖｅＣ遺伝子産物を回収することを含む、組換えＡ
    ｖｅＣ遺伝子産物の製造方法。
  24. 【請求項２４】 組換え発現ベクター［但し、前記組換え発現ベクターは、
    配列表の配列番号４のアミノ酸配列又はその実体部分をコードするヌクレオチド
    配列を有するポリヌクレオチド分子を含み、前記ポリヌクレオチド分子と、宿主
    細胞中におけるポリヌクレオチド分子の発現を制御する調節要素１又はそれ以上
    とが、影響を及ぼす関係にある］で形質転換した宿主細胞を、組換えＡｖｅＣ相
    同遺伝子産物の生成を促す条件下で培養し、その細胞培養物からＡｖｅＣ相同遺
    伝子産物を回収することを含む、組換えＡｖｅＣ相同遺伝子産物の製造方法。
  25. 【請求項２５】 野生型ａｖｅＣ対立遺伝子が不活化されており、しかも、
    突然変異１又はそれ以上を更に含むヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分
    子が発現されるストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株の細
    胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・ア
    ベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株の細胞によって生成されるアベルメクチン
    と比較して、異なる比又は量のアベルメクチンを生成するような前記突然変異ヌ
    クレオチド配列を更に含むこと以外は、プラスミドｐＳＥ１８６（ＡＴＣＣ２０
    ９６０４）のストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物をコード
    する配列と、あるいは、図１（配列表の配列番号１）に記載のストレプトミセス
    ・アベルミティリスのａｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレオチド配列と同じヌクレオチド
    配列を含む、ポリヌクレオチド分子。
  26. 【請求項２６】 アベルメクチン生成を調整することにより、野生型ａｖｅ
    Ｃ対立遺伝子が不活化されており、しかも、請求項２５に記載のポリヌクレオチ
    ド分子が発現されるストレプトミセス・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株
    の細胞が、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス
    ・アベルミティリスＡＴＣＣ５３６９２株の細胞と比較して、クラス２：１比が
    減少した状態でアベルメクチンを生成する、請求項２５に記載のポリヌクレオチ
    ド分子。
  27. 【請求項２７】 クラス２：１アベルメクチンが、シクロヘキシルＢ２：シ
    クロヘキシルＢ１アベルメクチンである、請求項２６に記載のポリヌクレオチド
    分子。
  28. 【請求項２８】 シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した比が
    、１．６：１未満である、請求項２７に記載のポリヌクレオチド分子。
  29. 【請求項２９】 シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した比が
    、約０．９４：１である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
  30. 【請求項３０】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・アベル
    ミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦに対する突然変異が、ＡｖｅＣ遺伝子産物の残基１
    ３９におけるアラニンからトレオニンへのアミノ酸置換をコードする、請求項２
    ９に記載のポリヌクレオチド分子。
  31. 【請求項３１】 シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した比が
    、約０．８８：１である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
  32. 【請求項３２】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・アベル
    ミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦに対する突然変異が、ＡｖｅＣ遺伝子産物の残基１
    ３８におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸置換をコードする、請求項３１
    に記載のポリヌクレオチド分子。
  33. 【請求項３３】 シクロヘキシルＢ２：シクロヘキシルＢ１の減少した比が
    、約０．８４：１である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド分子。
  34. 【請求項３４】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・アベル
    ミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦに対する突然変異が、ＡｖｅＣ遺伝子産物の残基１
    ３８におけるセリンからトレオニンへの第１のアミノ酸置換と、ＡｖｅＣ遺伝子
    産物の残基１３９におけるアラニンからトレオニンへの第２のアミノ酸置換とを
    コードする、請求項３３に記載のポリヌクレオチド分子。
  35. 【請求項３５】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・アベル
    ミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦに対する突然変異が、ＡｖｅＣ遺伝子産物の残基５
    ５におけるセリンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換をコードする、請求項
    ２５に記載のポリヌクレオチド分子。
  36. 【請求項３６】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・アベル
    ミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦに対する突然変異が、ＡｖｅＣ遺伝子産物の残基２
    ３０におけるグリシンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換をコードする、請求
    項２５に記載のポリヌクレオチド分子。
  37. 【請求項３７】 図１（配列表の配列番号１）のストレプトミセス・アベル
    ミティリスａｖｅＣ−ＯＲＦと影響を及ぼす関係にある強力なプロモーターを含
    む、ポリヌクレオチド分子。
  38. 【請求項３８】 強力なプロモーターが、サッカロポリスポラ・エリスラエ
    ア由来のｅｒｍＥプロモーターである、請求項３７に記載のポリヌクレオチド分
    子。
  39. 【請求項３９】 ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列中への
    外来性ヌクレオチド配列の挿入によって不活性化された前記ヌクレオチド配列を
    含む、ポリヌクレオチド分子。
  40. 【請求項４０】 図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦから６４
    ０ｂｐのＰｓｔＩ／ＳｐｈＩフラグメントを欠失することによって不活性化した
    ａｖｅＣ対立遺伝子を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド分子。
  41. 【請求項４１】 ａｖｅＣ対立遺伝子中にフレームシフト突然変異を導入す
    ることによって不活化されたａｖｅＣ対立遺伝子を含む、請求項２５に記載のポ
    リヌクレオチド分子。
  42. 【請求項４２】 図１（配列表の配列番号１）のａｖｅＣ−ＯＲＦのヌクレ
    オチド位置４７１におけるＣヌクレオチドの後に、Ｇヌクレオチド２個を加える
    ことによってフレームシフト突然変異が導入された、請求項４１に記載のポリヌ
    クレオチド分子。
  43. 【請求項４３】 ストレプトミセス・アベルミティリスＡｖｅＣ遺伝子産物
    のアミノ酸１１６をコードするヌクレオチド位置に、終止コドンを導入すること
    によって不活性化されたａｖｅＣ対立遺伝子を含む、請求項２５に記載のポリヌ
    クレオチド分子。
  44. 【請求項４４】 ＡｖｅＣ遺伝子産物のアミノ酸位置２５６においてグリシ
    ンをアスパラギン酸に変える第１の突然変異と、ＡｖｅＣ遺伝子産物の２５７位
    置においてチロシンをヒスチジンに変える第２の突然変異とを導入することによ
    って不活性化させたａｖｅＣ対立遺伝子を含む、請求項２５に記載のポリヌクレ
    オチド分子。
  45. 【請求項４５】 ストレプトミセス・アベルミティリス染色体において、生
    体内でＡｖｅＣ−ＯＲＦに天然に隣接するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオ
    チド分子を含む、遺伝子置換ベクター。
  46. 【請求項４６】 請求項２５〜４４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチ
    ド分子を含む、組換えベクター。
  47. 【請求項４７】 請求項３９に記載のポリヌクレオチド分子を含み、ｐＳＥ
    １８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）である、組換えベクター。
  48. 【請求項４８】 請求項４６に記載の組換えベクターを含む、宿主ストレプ
    トミセス細胞。
  49. 【請求項４９】 （ａ）天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されており、
    しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む
    ポリヌクレオチド分子が導入されて発現しているストレプトミセス・アベルミテ
    ィリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を決定し；
    （ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列、あるいは、そ
    れに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現す
    ること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞
    によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を決定し；そして、 （ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成され
    るアベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベル
    ミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比とを比較し
    ；工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるア
    ベルメクチンのクラス２：１比と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミテ
    ィリス細胞によって生成されるアベルメクチンのクラス２：１比とが異なる場合
    に、アベルメクチンのクラス２：１比を変化させることのできるａｖｅＣ−ＯＲ
    Ｆの突然変異を同定する ことを含む、生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させることので
    きるａｖｅＣ−ＯＲＦの突然変異を同定する方法。
  50. 【請求項５０】 アベルメクチンのクラス２：１比が、突然変異によって減
    少する、請求項４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 （ａ）天然のａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化されており、
    しかも、突然変異したＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む
    か、あるいは、ＡｖｅＣ遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子
    構築物を含むポリヌクレオチド分子が導入されて発現しているストレプトミセス
    ・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量を決定し；
    （ｂ）図１（配列表の配列番号１）のＯＲＦのヌクレオチド配列、あるいは、そ
    れに相同なヌクレオチド配列を有するａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現す
    ること以外は、工程（ａ）と同じストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞
    によって生成されるアベルメクチンの量を決定し；そして、 （ｃ）工程（ａ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成され
    るアベルメクチンの量と、工程（ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細
    胞によって生成されるアベルメクチンの量とを比較し；工程（ａ）のストレプト
    ミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメクチンの量と、工程
    （ｂ）のストレプトミセス・アベルミティリス細胞によって生成されるアベルメ
    クチンの量とが異なる場合に、アベルメクチンの量を変化させることのできるａ
    ｖｅＣ−ＯＲＦ又は遺伝子構築物の突然変異を同定する ことを含む、生成されるアベルメクチンの量を変化させることのできるａｖｅＣ
    −ＯＲＦ又はａｖｅＣ−ＯＲＦを含む遺伝子構築物の突然変異を同定する方法。
  52. 【請求項５２】 生成されるアベルメクチンの量が、突然変異によって増加
    する、請求項５１に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現し、しかも、野生
    型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミティ
    リスの同じ株の細胞と比較して、クラス２：１比が異なるアベルメクチンを生成
    する細胞を含むストレプトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって
    、 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅＣ対立遺
    伝子（但し、前記遺伝子は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する
    同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現するストレプ
    トミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンのクラ
    ス２：１比を変化させる遺伝子産物をコードする）を担持するベクターによって
    形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する株の細
    胞により生成されるクラス２：１比と比較して、クラス２：１比が異なるアベル
    メクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法。
  54. 【請求項５４】 アベルメクチンのクラス２：１比が、突然変異によって減
    少する、請求項５３に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 異なる量のアベルメクチンを生成する細胞を含むストレプ
    トミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、突然変異したａｖｅＣ対立遺
    伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝子構築物（但し、その発現の結果、突然
    変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を発現するストレプトミセス・ア
    ベルミティリス株の細胞によって生成されるアベルメクチンの量が、野生型ａｖ
    ｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、変化する）を
    担持するベクターによって形質転換し、そして、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみ
    を代わりに発現する株の細胞により生成されるアベルメクチンの量と比較して、
    異なる量のアベルメクチンを生成する形質転換細胞を選択することを含む、前記
    製造方法。
  56. 【請求項５６】 アベルメクチンの製造量が、突然変異によって増加する、
    請求項５５に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 細胞が、不活性化されたａｖｅＣ対立遺伝子を含むストレ
    プトミセス・アベルミティリス新規株の製造方法であって、 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞を、ａｖｅＣ対立遺伝子を不活性
    化させるベクターで形質転換し、そして、ａｖｅＣ対立遺伝子が不活性化された
    形質転換細胞を選択することを含む、前記製造方法。
  58. 【請求項５８】 ベクターがｐＳＥ１８０（ＡＴＣＣ２０９６０５）である
    、請求項５７に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子［但し、前記遺伝子は、
    野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、異
    なるクラス２：１比のアベルメクチンの生成（細胞による）を引き起こす］を発
    現する細胞を含む、ストレプトミセス・アベルミティリス株。
  60. 【請求項６０】 アベルメクチンのクラス２：１比が、突然変異によって減
    少する、請求項５９に記載の菌株。
  61. 【請求項６１】 細胞が、１．６：１未満の比でシクロヘキシルＢ２：シク
    ロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する、請求項６０に記載の株。
  62. 【請求項６２】 細胞が、約０．９４：１の比でシクロヘキシルＢ２：シク
    ロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する、請求項６１に記載の株。
  63. 【請求項６３】 細胞が、約０．８８：１の比でシクロヘキシルＢ２：シク
    ロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する、請求項６１に記載の株。
  64. 【請求項６４】 細胞が、約０．８４：１の比でシクロヘキシルＢ２：シク
    ロヘキシルＢ１アベルメクチンを生成する、請求項６１に記載の株。
  65. 【請求項６５】 突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物（但し
    、前記遺伝子又は遺伝子構築物は、野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発
    現する同じ株の細胞と比較して、細胞によるアベルメクチン生成量の増加を引き
    起こす）を発現する細胞を含む、ストレプトミセス・アベルミティリス株。
  66. 【請求項６６】 ａｖｅＣ遺伝子が不活性化された細胞を含む、ストレプト
    ミセス・アベルミティリス株。
  67. 【請求項６７】 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前
    記細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野生型ａｖｅＣ
    対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖ
    ｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によっ
    て生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を変化させる遺伝子産物をコード
    する突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）を、その細胞によるアベルメ
    クチンの生成を許容又は誘発する条件下で、培養培地中で培養し、そして、培養
    物からアベルメクチンを回収することを含む、アベルメクチンの製造方法。
  68. 【請求項６８】 クラス２：１比が、突然変異によって減少する、請求項６
    ７に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前
    記細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又はａｖｅＣ対立遺伝子を含む遺伝
    子構築物を発現することなく野生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現する
    同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝子構築物を
    発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によって生成されるアベ
    ルメクチン生成量の変化を引き起こす突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子又は遺伝
    子構築物を発現する）を、その細胞によるアベルメクチンの生成を許容又は誘発
    する条件下で、培養培地中で培養し、そして、培養物からアベルメクチンを回収
    することを含む、アベルメクチンの製造方法。
  70. 【請求項７０】 アベルメクチンの生成量が、突然変異したａｖｅＣ対立遺
    伝子又は遺伝子構築物の発現によって増加する、請求項６９に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 ストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞（但し、前
    記細胞は、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野生型ａｖｅＣ
    対立遺伝子のみを代わりに発現する同じ株の細胞と比較して、突然変異したａｖ
    ｅＣ対立遺伝子を発現するストレプトミセス・アベルミティリス株の細胞によっ
    て生成されるアベルメクチンのクラス２：１比を減少させる遺伝子産物をコード
    する突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現する）により生成されたアベルメク
    チンの組成物であって、 前記アベルメクチンが、突然変異したａｖｅＣ対立遺伝子を発現することなく野
    生型ａｖｅＣ対立遺伝子のみを代わりに発現するストレプトミセス・アベルミテ
    ィリスの同じ株の細胞により生成されるアベルメクチンのクラス２：１比と比較
    して、減少したクラス２：１比で生成される、前記組成物。
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