CN111269296B

CN111269296B - 一种nLsA蛋白及其结构基因和应用

Info

Publication number: CN111269296B
Application number: CN202010151094.8A
Authority: CN
Inventors: 朱希强; 黄硕; 张金华; 刘飞; 张兆倩
Original assignee: Shandong University; Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences
Current assignee: Shandong University; Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2040-03-06
Also published as: CN111269296A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体提供一种nLsA蛋白及其结构基因和应用。该nLsA蛋白为a1)或a2)：a1)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；a2)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与a1)序列相同功能的蛋白质。本发明的nLsA蛋白相比于常用的商品化乳酸链球菌素，具有更好的杀菌效果，能在同等使用量的情况下获得更好的使用效果，有巨大的潜在应用价值。

Description

一种nLsA蛋白及其结构基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种nLsA蛋白及其结构基因和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

乳酸菌素是由乳酸菌产生的一种抑菌物质，其结构一般为短链肽。常见的乳酸菌素如Nisin，抑菌谱比较广，可以抑制革兰氏阳性菌。与柠檬酸、聚赖氨酸、甘氨酸等物质复配使用时也可以有效抑制革兰氏阴性菌。世界卫生组织在1969年批准了Nisin的使用，美国FDA在1988年批准其作为食品防腐剂，认定乳酸菌素Nisin为GRAS(Generally recognizedas safe)公认安全物质。发明人发现，与人工合成的化学防腐剂相比，乳酸菌素更为安全，在消化道内能够被胰蛋白酶迅速分解，不影响消化道内菌落环境。以及，乳酸菌素在医用领域也很有潜力，因为它不会与医用抗生素产生交叉耐药性，可以协助应对某些复杂的感染性疾病，增强治愈效果；乳酸菌素应用潜力很大，若能发掘一类新型、高效价的乳酸菌素，可以在同等使用量的情况下获得更好的使用效果，将会有巨大的潜在应用价值。

发明内容

因此，本发明的目的是在于提供一种nLsA蛋白及其结构基因和应用，所述nLsA蛋白为一种新型乳酸菌素，其由nLsA基因编码得到具有优异的杀灭和/或抑制细菌的作用，其在相同作用浓度下的效果明显优于目前已经商品化的常用乳酸链球菌素。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种nLsA蛋白，所述nLsA蛋白为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

a2)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有与a1)序列相同功能的蛋白质。

所述nLsA蛋白的分子量为5-10kDa，优选为约7kDa。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种编码所述nLsA蛋白的基因。

其中，所述基因具有b1)、b2)或b3)所述的核苷酸序列：

b1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

b2)与b1)互补的核苷酸序列；

b3)与b1)或b2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，所述核苷酸序列具有≥90％一致性可以为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列一致性。

在本发明的第三方面，本发明提供了扩增所述编码nLsA蛋白的基因(即如上文第二方面中所述的基因)的引物对，其命名为nLsA-F和nLsA-R，其中，nLsA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，nLsA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明的第四方面，本发明提供了含有所述编码nLsA蛋白的基因(即如上文第二方面中所述的基因)的生物材料，所述生物材料为表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种构建重组菌株的方法，所述重组菌株含有所述编码nLsA蛋白的基因(即如上文第二方面中所述的基因)，该方法包括步骤：

载体构建：以nLsA-F和nLsA-R为引物对(即如上文第三方面中所述的引物对)，以泡菜菌的基因组为模板，扩增得到nLsA基因，双酶切后重组连接，得到nLsA表达载体；

载体转化：将nLsA表达载体转入感受态细胞中在含有氯霉素的选择培养基上进行培养；

阳性克隆筛选：选取测序正确的转化子，使用基因上下游引物测序进行验证，测序正确即为获得的重组菌株。

在本发明的一些实施方式中，所述方法包括步骤：

设计引物nLsA-F和nLsA-R，引物序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

以泡菜菌的基因组为模板，扩增得到含有基因序列SEQ ID No.1的片段；

对扩增片段和载体(比如pNZ8148质粒)进行双酶切后，连接在组成型启动子下游，构建nLsA表达载体；

制备乳酸链球菌感受态细胞，取50uL感受态细胞，加入1ug前述构建的质粒，冰上静置一段时间使其混匀，之后按照电转化条件进行电击。电击后加入复苏培养基培养，充分复苏培养后，离心去上清，调整至原体积的10％后重悬并涂布到含有20ug/mL氯霉素抗性的选择培养基上进行培养；所述选择培养基可以为GM17培养基，比如所述GM17培养基是在M17培养基中添加10g/L的灭菌葡萄糖溶液得到的，其中M17培养基为商品化产品，其成分为大豆胨5.0g/L、蛋白胨2.5g/L、酪蛋白胨2.5g/L、酵母浸粉2.5g/L、牛肉浸粉5.0g/L、乳糖5.0g/L、抗坏血酸钠0.5g/L、β-甘油磷酸钠19.0g/L、硫酸镁0.25g/L、pH值7.2±0.2。

30℃条件下倒置培养，并在48～96h后进行阳性转化子筛选，得到的阳性转化子使用基因上下游引物测序进一步进行验证。

在本发明的第六方面，本发明提供了上述第一方面中所述的nLsA蛋白、或上述第二方面中所述的基因、或上述第四方面中所述的生物材料在制备具有杀菌和/或抑菌效果的制品中的应用。

其中，所述杀菌和/或抑菌为杀灭和/或抑制革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，优选为藤黄微球菌。

所述制品，可以为杀菌剂、抑菌剂、消毒剂、洗手液、防腐剂等等，或者可以为含有(比如添加有、涂抹有等等)本发明所述nLsA蛋白的有形物体，比如纺织品、基质等等。

在本发明的第七方面，本发明提供了一种杀灭和/或抑制细菌的方法，所述方法包括细菌与有效量的所述nLsA蛋白或上述第六方面中涉及的制品接触充分的时间，以有效杀死或抑制细菌。

其中，所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，优选为微球菌，尤其为藤黄微球菌。

其中，所述有效量为不低于0.1mg/mL。

本发明所述nLsA蛋白的优势在于相比于常用的商品化乳酸链球菌素，比如NisinA(由nisA基因编码)、NisinZ(由nisZ基因编码)具有更好的杀菌和/或抑菌效果，能在同等使用量的情况下获得更好的使用效果，有巨大的潜在应用价值。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明实施例2中所述的乳酸菌素结构基因nLsA表达产物nLsA蛋白(即乳酸菌素)的Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳图。

图2为nLsA表达产物与乳酸链球菌素NisinA、NisinZ抑菌效果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释，例如参见Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》或《分子克隆实验指南》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1乳酸菌素结构基因nLsA的扩增

将从泡菜缸中得到的泡菜菌扩大培养，取菌液5mL，经溶菌酶处理后，用细菌基因组提取试剂盒进行基因组提取，提取步骤参考试剂盒说明书，得到泡菜菌的基因组。

根据SEQ ID No.1中的nLsA基因序列，设计引物时在5’端分别插入酶切位点XbaI和HindIII(下划线处)，设计一对引物。引物序列如下：

nLsA-F：5’-TGCTCTAGAATGAGTACAAAAGATTTTAAC-3’；

nLsA-R：5’-CCCAAGCTTTTATTTGCTTACGTGAATAC-3’；

以基因组为模板，上述序列为引物，扩增目的基因。扩增过程按照高保真酶说明书进行，并在扩增结束后对产物进行纯化回收。回收产物用XbaI、HindIII(NEB，USA)进行双酶切，并与同样进行双酶切的pNZ8148质粒进行重组连接，重组反应按照产品说明书进行实验。将重组质粒转化入大肠杆菌MC1061感受态细胞中，在含有20ug/mL氯霉素的GM17选择培养基上过夜，对阳性克隆测序验证。

选取测序正确的转化子，扩大培养后提取质粒pNZ8148-nLsA。将质粒与感受态混匀，用电转化法将质粒导入NZ9000乳酸菌中。30℃培养，挑取单克隆进行鉴定，测序正确后即为获得的重组菌株NZ9000-nLsA。

实施例2乳酸菌素基因的表达纯化

将生长良好的重组菌(NZ9000-nLsA，实施例1)接种到50mL含氯霉素的GM17培养基中，过夜培养后以10％接种到200mL GM17培养基中(含氯霉素)，添加诱导量Nisin进行诱导表达。发酵一定时间后，将培养物离心，上清经过0.22um滤膜过滤后，使用SP离子交换柱(GE，USA)进行乳酸菌素蛋白的分离纯化。纯化所用缓冲溶液如下：

平衡缓冲液：乳酸50mmol/L，用NaOH调节pH等于3.0；

洗脱缓冲液：乳酸50mmol/L，NaCl 400mmol/L，NaOH调节pH为3.0；

用Bradford法测试纯化后收集的蛋白浓度。之后将纯化的蛋白溶液进行浓缩，利用Tris-Tricine-SDS-PAGE蛋白电泳进行检测，与未经转化处理的NZ9700作对比，可以确定nLsA蛋白的表达情况。

上述电泳分离胶浓度16.5％，夹层胶浓度10％，浓缩胶浓度4％，电泳结果显示nLsA蛋白成功表达，其蛋白分子量约为7kDa，电泳图如图1所示。

上述GM17培养基是在M17培养基中添加10g/L的灭菌葡萄糖溶液得到的，其中M17培养基为商品化产品，其成分为大豆胨5.0g/L、蛋白胨2.5g/L、酪蛋白胨2.5g/L、酵母浸粉2.5g/L、牛肉浸粉5.0g/L、乳糖5.0g/L、抗坏血酸钠0.5g/L、β-甘油磷酸钠19.0g/L、硫酸镁0.25g/L、pH值7.2±0.2。

实施例3乳酸菌素抑菌效果实验

复苏测试菌，分别将测试菌(藤黄微球菌)接种到10mL LB培养基中，适宜温度下振荡培养过夜。加热对应的固体培养基，待冷却至45℃左右时加入1％体积的测试菌菌液，混匀后倒平板，每板约20g培养基，并在超净台中吹干。共设置3个测试平板，分别测试NisinA、NisinZ、nLsA蛋白，用无菌的打孔器均匀在测试平板上打孔，每板设置4孔，其中1孔作为空白对照，另外3孔测试同一种样品(NisinA、NisinZ或nLsA蛋白)设置3组重复，其中，每孔加入30uL样品。将平板正置放入37℃培养箱，培养48h，用游标卡尺测量抑菌圈大小，比较NisinA、NisinZ和nLsA蛋白的抑菌效果。

其中，根据GenBank ID：L16226.1中记载的nisA基因序列和GenBank ID：AF420259.1中记载的nisZ基因序列，合成对应的片段，构建表达载体。按照实施例2中的办法表达并纯化NisinA、NisinZ。按上述抑菌方法进行测试，对比nLsA蛋白与NisinA、NisinZ的抑菌性能。

抑菌效果见表1，抑菌效果对比图如图2所示。

表1

抑菌结果表明，在相同浓度下，nLsA蛋白比NisinA、NisinZ具有更好的抑菌效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种nLsA蛋白及其结构基因和应用

<130> 202020791

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagtacaa aagattttaa cgtttcgaag aaagatggtc catgctacat actagaacgc 60

aataaaagtt acaatattgc atcaccacgc atttcgctat gtacacccgg cattcgtggt 120

attttgaaaa gtggttgtaa aacaggagct ctgatgggtt gtaacatgaa aacagcaact 180

tgtcattgta gtattcacgt aagcaaataa 210

<210> 2

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Thr Lys Asp Phe Asn Val Ser Lys Lys Asp Gly Pro Cys Tyr

1 5 10 15

Ile Leu Glu Arg Asn Lys Ser Tyr Asn Ile Ala Ser Pro Arg Ile Ser

20 25 30

Leu Cys Thr Pro Gly Ile Arg Gly Ile Leu Lys Ser Gly Cys Lys Thr

35 40 45

Gly Ala Leu Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys His Cys Ser

50 55 60

Ile His Val Ser Lys

65

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgctctagaa tgagtacaaa agattttaac 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagcttt tatttgctta cgtgaatac 29

Claims

1.一种nLsA蛋白，其特征在于，所述nLsA蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的nLsA蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

4.扩增权利要求2或3所述基因的引物对，其命名为nLsA-F和nLsA-R，其中，nLsA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，nLsA-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞。

6.一种构建重组菌株的方法，所述重组菌株含有权利要求2或3所述的基因，其特征在于，包括步骤：

载体构建：以nLsA-F和nLsA-R为引物对，以泡菜菌的基因组为模板，扩增得到nLsA基因，双酶切后重组连接，得到nLsA表达载体；

载体转化：将nLsA表达载体转入感受态细胞中在选择培养基上进行培养；

7.权利要求1所述的nLsA蛋白、或权利要求2或3所述的基因、或权利要求5所述的生物材料在制备具有杀菌和/或抑菌效果的制品中的应用，所述菌为藤黄微球菌。

8.一种杀灭和/或抑制细菌的方法，所述方法包括细菌与有效量的权利要求1所述的nLsA蛋白或根据权利要求7所述的制品接触充分的时间，以有效杀死或抑制细菌；所述方法不包括疾病的诊断和治疗，所述细菌为藤黄微球菌。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述nLsA蛋白有效量为不低于0.1mg/mL。