CN112391364B

CN112391364B - 一种高活力谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法

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Publication number: CN112391364B
Application number: CN202011202199.8A
Authority: CN
Inventors: 刘逸寒; 路福平; 张元夫; 王洪彬
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-11-02
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2040-11-02
Also published as: CN112391364A

Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种高活力谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法。通过分子生物学技术手段获得短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)TCCC 11568野生型的谷氨酰胺转氨酶基因，利用易错PCR技术对野生型谷氨酰胺转氨酶基因进行随机突变，通过高通量筛选得到高活力谷氨酰胺转氨酶突变体BPTGM及其编码基因bptgm，并实现了其在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的高效表达，进一步通过发酵、提取等技术获得高活力谷氨酰胺转氨酶。

Description

一种高活力谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种高活力谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法。

背景技术：

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13)可催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团与赖氨酸的ε-氨基或其他伯胺之间发生酰基转移反应，形成ε-(γ-谷氨酰胺)-赖氨酸异肽键，在蛋白质分子间或分子内发生交联，从而改善其结构和功能特性。由于其卓越的交联特性，被誉为“21世纪超级粘合剂”，在食品、医药、纺织、皮革加工等领域均有广泛应用。在食品加工中，TGase能够交联蛋白质谷氨酰胺的氨基酸残基和赖氨酸，从而在各种食物蛋白质中形成分子外和分子内异肽键。如，TGase可催化乳清蛋白、酪蛋白、肌球蛋白等蛋白的体外交联，具有改善食物风味、外观和质地等特性。在肉制品加工中添加TGase，可以改善肉制品的粘性、乳化稳定性、持水性、质构等特征，减少储藏损失和烹饪损失。在医药领域中，特异性结合肿瘤表面抗原的抗体是有效治疗癌症的治疗剂，TGase可用于连接药物接头或药物上的胺基和抗体上的工程化谷氨酰胺残基，现已应用于抗体药物缀合物的生产。在皮革制品中，将经过TGase改性后的工业蛋白副产物作为皮革的填充剂，发现酶处理后的样品比未处理的其胶原纤维分布更规则、更紧密。

谷氨酰胺转氨酶来源广泛，存在于动物、植物以及微生物中，其中微生物来源的谷氨酰胺转氨酶具有分子量小、非钙离子依赖性、底物特异性且催化效率高等优点，同时，生产周期短，分离纯化工艺简单，成本低，因此被广泛用于大规模工业化生产。微生物来源的TGase主要来自于链霉菌属(Streptomyces spp.)和芽孢杆菌属(Bacillus spp.)。尽管多种微生物能发酵产TGase，然而目前仅S.mobaraensis来源的TGase(MTG)实现了商业化生产。由于茂源链霉菌生长慢、发酵周期长、酶活力收率低，从而造成MTG价格较高，此外，MTG作为目前唯一生产和应用的TGase酶种，其在底物特异性、热稳定性等方面已经不能很好地满足一些加工底物和加工过程的需求，因此，亟需开发不同特性的TGase。芽孢杆菌属TGase与链霉菌属的TGase基因同源性较低，并且酶学特性也存在着一定的差别，因此，对芽孢杆菌属的TGase进行开发有望能弥补MTG所存在的缺陷。然而，目前芽孢杆菌属TGase研究较多的主要是来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis transglutaminase)，而其它芽孢杆菌来源TGase的研究报道极少，由于枯草芽孢杆菌TGase存在表达量及酶活力不高等问题，从而限制了其在工业上的生产及应用，因此，从其它芽孢杆菌来源中开发高活力及不同特性的TGase具有重要意义。通过对短小芽孢杆菌的TGase基因进行异源表达，发现其具有较高的表达量及酶活力，具有潜在的开发价值，但其比活力依然达不到工业标准，因此，提高该酶的比活力对其实现工业化生产及应用具有重要意义。

酶的体外定向进化，不需要提前对酶的空间结构以及催化机制进行详细地了解和掌握，只需要通过人为改变基因突变过程中的反应条件，模拟自然进化过程(随机突变、重组和自然选择)，在体外进行基因突变、基因重组等操作，构建基因突变体库，根据不同基因的特性来建立高通量筛选方法，最终获得理想的突变酶，是目前应用最多、最有前途的提高酶性能的一种方法。近年来，通过定向进化技术对酶分子进行改造，使其在催化活性、稳定性(半衰期、温度、pH等)、底物特异性等方面都有很大的提高，极大地促进了酶在各工业领域中的广泛应用。易错PCR(Error-prone PCR)是定向进化中应用广泛的体外随机突变技术，其原理主要是在常规PCR基础上，通过改变PCR反应体系及反应条件来调节PCR反应中碱基的错配概率，以致聚合酶原来的突变序列偏好性下降，各种基因突变的多样性提高，促使错配碱基按某一概率随机地加入到扩增的基因中，最终获得随机突变的DNA文库，再通过一定的筛选方法进行筛选，从而获得理想的突变体。

芽孢杆菌属被认为是有前景的革兰氏阳性宿主菌株，芽孢杆菌作为基因工程表达系统得到了越来越广泛的应用，该系统可表达耐热性酶制剂、多肽类药物和杀虫蛋白等外源蛋白，有的已经投入大规模生产，具有良好的应用前景。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究十分清楚，具有密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、不产生致病毒素、对培养基无特殊要求等优点。此外，芽孢杆菌表达系统具有很强的蛋白质分泌功能，分泌的外源蛋白不易形成包涵体，无显著的密码子偏爱性，外源蛋白可直接分泌，易于分离纯化。目前已报道可以用作表达外源蛋白的芽孢杆菌属宿主菌株有枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌等。随着分子生物学技术的发展和芽孢杆菌研究的深入，使用芽孢杆菌表达系统已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，因此，以芽孢杆菌属作为宿主表达菌株具有一定优势。

因此，在本发明中，将短小芽孢杆菌基因组中的谷氨酰胺转氨酶基因进行克隆及表达，并通过易错PCR技术对其基因进行分子改造，再利用枯草芽孢杆菌表达系统进行高通量筛选，得到酶活力提高的谷氨酰胺转氨酶突变体基因，并在解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌体系中成功表达。

发明内容：

基于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种酶活力提高的新型谷氨酰胺转氨酶及其制备方法。

实现本发明目的的技术路线概述如下：

通过基本的分子生物学技术手段获得短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)野生型谷氨酰胺转氨酶基因，通过酶切、连接等构建重组载体之后，经测序获得该野生型谷氨酰胺转氨酶序列(如SEQ ID NO.3所示)，利用易错PCR技术对该谷氨酰胺转氨酶基因进行随机突变，利用枯草芽孢杆菌表达系统筛选得到该谷氨酰胺转氨酶突变体及其编码基因，并实现了其在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得高酶活力的谷氨酰胺转氨酶突变体。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.谷氨酰胺转氨酶突变体的标识

在本发明中，以大写正体的BPTG表示短小芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶，其编码基因以小写斜体bptg进行表示；BPTGM表示该谷氨酰胺转氨酶突变体，其编码基因以小写斜体bptgm进行表示。

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示该谷氨酰胺转氨酶突变体中突变的氨基酸。如Ala226Phe，表示位置226的氨基酸由野生型BPTG的Ala替换成Phe，位置的编号对应于SEQ ID No.4中BPTG的氨基酸序列编号，也可用氨基酸单字母简称进行表示，如A226F；核苷酸表示方法与氨基酸表示方法类似，如A300，表示位置300位的碱基为A，位置的编号对应于SEQ ID NO.3中BPTG的核苷酸序列编号。

本发明谷氨酰胺转氨酶突变前后的碱基及氨基酸对照如下表：

	基因突变位点	氨基酸突变位点	核苷酸SEQ ID No.	氨基酸SEQ ID No.
					BPTG	—	—	3	4
BPTGM	<u>GC</u>T→<u>TT</u>T	A226F	5	6

本发明还提供包含所述突变体编码基因的重组载体或重组菌株；

进一步地，所述重组载体的表达载体为pBSA43；

进一步地，所述重组菌株的宿主细胞可以为枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218或地衣芽孢杆菌TCCC11965。

本发明的实验方案具体如下：

1、所述高活力谷氨酰胺转氨酶突变体编码基因的获得，包括如下步骤：

(1)以短小芽孢杆菌野生型BPTG编码基因bptg(SEQ ID No.3)为模板，通过易错PCR对野生型BPTG编码基因进行随机突变；

(2)将随机突变后的谷氨酰胺转氨酶编码基因，与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43连接后转化至枯草芽孢杆菌WB600中进行高通量筛选，通过筛选获得酶活力提高的谷氨酰胺转氨酶突变体，经测序获得谷氨酰胺转氨酶突变体编码基因bptgm。

2、一株含高活力谷氨酰胺转氨酶编码基因的枯草芽孢杆菌重组菌株及以其制备高活力谷氨酰胺转氨酶的过程，包括如下步骤：

(1)将谷氨酰胺转氨酶突变体编码基因bptgm与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43通过连接得到新的重组质粒pBSA43-bptgm；

(2)将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌WB600中，经卡那霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到重组菌株，之后将重组菌株进行培养发酵及纯化，得到高活力谷氨酰胺转氨酶。

3、一株含有高活力谷氨酰胺转氨酶编码基因的解淀粉芽孢杆菌菌株及以其制备高活力谷氨酰胺转氨酶的过程，包括如下步骤：

(1)将重组质粒pBSA43-bptgm转化至解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218，经过Kan抗性筛选及酶切验证，得到高活力谷氨酰胺转氨酶重组菌株；

(2)再将该重组菌株进行发酵，纯化后制备得到高活力谷氨酰胺转氨酶。

4、一株含有高活力谷氨酰胺转氨酶编码基因的地衣芽孢杆菌菌株及以其制备高活力谷氨酰胺转氨酶的过程，包括如下步骤：

(1)将重组质粒pBSA43-bptgm转化至宿主菌株地衣芽孢杆菌TCCC11965中，经过Kan抗性筛选及酶切验证，得到高活力谷氨酰胺转氨酶重组菌株；

有益效果：

1、本发明利用易错PCR技术对野生型BPTG进行随机突变，通过高通量筛选后得到酶活力提高的谷氨酰胺转氨酶突变体BPTGM，其比酶活是野生型谷氨酰胺转氨酶比酶活的2.6倍。

2、本发明高活力谷氨酰胺转氨酶突变体基因分别在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌表达系统中进行了表达，实现高活力谷氨酰胺转氨酶突变体不同方式的高效表达，并经过一系列处理后制备得到高活力谷氨酰胺转氨酶。

附图说明：

图1为本发明野生型BPTG基因的PCR扩增电泳图

其中：M为DNA Marker，1为BPTG编码基因；

图2为本发明重组质粒pBSA43-bptg酶切验证图其中：M为DNA Marker，1为重组质粒pBSA43-bptg经BamH I和Hind III双酶切电泳图；

图3为本发明BPTG突变体基因易错PCR扩增电泳图

其中：M为DNA Marker，1为随机突变基因bptgmx；

图4为本发明重组质粒pBSA43-bptgm酶切验证图其中：M为DNA Marker，1、2为枯草芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-bptg和pBSA43-bptgm经BamH I和Hind III双酶切电泳图，3、4为地衣芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-bptg和pBSA43-bptgm经BamH I和Hind III双酶切电泳图，5、6为解淀粉芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-bptg和pBSA43-bptgm经BamH I和Hind III双酶切电泳图；

图5为本发明野生型BPTG与突变体BPTGM最适温度曲线

其中：WT为本发明野生型BPTG，A226F为本发明突变体BPTGM；

图6为本发明野生型BPTG与突变体BPTGM最适pH曲线

其中：WT为本发明野生型BPTG，A226F为本发明突变体BPTGM；

图7为热稳定性曲线其中：A为30℃下分别保温30、60、90、120min的热稳定性曲线；B为40℃下分别保温30、60、90、120min的热稳定性曲线；C为50℃下分别保温30、60、90、120min的热稳定性曲线；WT为本发明野生型BPTG，A226F为本发明突变体BPTGM；

图8为pH 6.0时的稳定性曲线

其中：WT为本发明野生型BPTG，A226F为本发明突变体BPTGM。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明所使用的地衣芽胞杆菌为TCCC11965，公开于：Development andapplication of a CRISPR/Cas9 system for Bacillus licheniformis genome editing[J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,122:329-337，目前保存于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可从该中心获取菌种。

本发明实施例所用培养基如下：

LB培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0。

10×SP盐溶液(g/L)：K₂HPO₄ 91.7，KH₂PO₄ 30，(NH4)₂SO₄ 10，柠檬酸钠5，MgSO_4·7H₂O10。

SP I培养基：1×SP 97.6mL，5％酪蛋白水解物400μL，10％酵母汁1mL，50％葡萄糖1mL。(5％酪蛋白水解物：0.5g酸水解酪蛋白溶于10mL ddH₂O；10％酵母汁：1g酵母提取物溶于10mL ddH₂O；50％葡萄糖：5g葡萄糖溶于10mL ddH₂O。

SP II培养基：SP I培养基99mL，100mM CaCl₂ 500μL，500mM MgCl₂ 500μL。

LBS培养基(g/L)：山梨醇91.085，NaCl 10，酵母抽提物5，胰蛋白胨10。

上述培养基的固态培养基均添加2％琼脂。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。

实施例1：野生型BPTG编码基因的获得

1.野生型BPTG编码基因来自实验室保存的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)TCCC11568菌株，利用试剂盒(OMEGA:Bacterial DNA Kit)提取其基因组DNA，其中短小芽孢杆菌基因组DNA的提取步骤如下：

(1)菌株活化：用接种环从甘油管中蘸取少许菌液接种于LB固体培养基平板上，三区划线，37℃恒温培养12h；

(2)转接：从培养菌体的平板上挑取单菌落接种于含5mL液体LB培养基中，于220rpm，37℃条件下振荡培养12h；

(3)收集菌体：取适量培养菌液分装于已灭菌的1.5mL EP管中，12000rpm离心1min收集菌体，弃上清；

(4)加入100μL ddH₂O重悬菌体，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴10min；

(5)加入100μL BTL Buffer和20μL蛋白酶K，旋涡振荡，55℃水浴40-50min，每隔20-30min，振荡混匀；

(6)加入5μL RNA酶，颠倒混匀数次，室温放置5min；

(7)12000rpm离心2min，去掉未消化部分，将上清部分转移至新的1.5mL EP管中，加入220μL BDL Buffer，振荡混匀，65℃水浴10min；

(8)加入220μL无水乙醇，吹吸混匀；

(9)将EP管中的液体转移至吸附柱中静止2min，12000rpm离心1min，将滤液重新倒入吸附柱中静置、离心，重复两次，弃滤液；

(10)加入500μL HBC Buffer，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(11)加入700μL DNA Wash Buffer，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(12)加入500μL DNA Wash Buffer，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(13)12000rpm空离2min，将吸附柱放到一个新的EP管上，置于55℃金属浴10min，晾干；

(14)加入50μL的55℃分子水，室温静置3-5min，12000rpm离心2min收集基因组。

2.扩增野生型BPTG编码基因

通过NCBI基因库查找，根据已报道的短小芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因，分析其保守序列，设计本发明的谷氨酰胺转氨酶编码基因的扩增引物如下：

上游P1(SEQ ID No.1)：

5’-CGCGGATCCATGATTATCCTTTCAGGACAGCC-3’(划线部分为BamH I酶切位点)

下游P2(SEQ ID No.2)：

5’-CCCAAGCTTGCTGCCAAACATTTGCCTG-3’(划线部分为Hind III酶切位点)

PCR扩增的反应体系组成为：

PrimeSTAR Max	25μL
		上游引物P1(10μmol/L)	2μL
下游引物P2(10μmol/L)	2μL
		基因组	2μL
ddH<sub>2</sub>O	19μL
		总体积	50μL

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

扩增程序的设置为：

a.预变性:98℃30s；

b.变性：98℃10s；

c.退火：55℃45s；

d.延伸：72℃10s；

e.b-d反应30个循环；

f.延伸:72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到约750bp左右的基因条带(见图1)，再由DNA切胶回收试剂盒回收PCR产物，将其送测序公司进行测序，获得野生型bptg基因序列(738bp，如SEQ ID NO.3所示)，将bptg与pBSA43载体进行连接并转化至大肠杆菌JM109及枯草芽孢杆菌WB600中，重组质粒pBSA43-bptg酶切验证如图2所示，条带大小正确，说明连接转化成功，获得重组菌株JM109/pBSA43-bptg和WB600/pBSA43-bptg。

实施例2：BPTG突变体基因的获得

1.易错PCR：以野生型BPTG编码基因为模板进行易错PCR，其反应体系如下：

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

体系完成后，进行易错PCR反应，程序设置如下：

a.预变性:95℃10min；

b.变性：98℃10s；

c.退火：55℃30s；

d.延伸：72℃1min；

e.b-d反应30个循环；

f.延伸:72℃10min。

PCR扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳(图3)，用小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到若干随机突变的谷氨酰胺转氨酶的基因bptgmx(x表示不同的突变基因产物)。

2.突变体文库的构建及筛选：将获得的若干个谷氨酰胺转氨酶随机突变基因bptgmx与pBSA43载体进行连接并转化至大肠杆菌JM109中，将所有转化子菌落用无菌水洗脱下来并收集菌液提取质粒，得到重组质粒pBSA43-bptgmx，再将重组质粒pBSA43-bptgmx转化至枯草芽孢杆菌WB600中，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至装有500μL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)的48孔板中，放入孔板振荡摇床在37℃，750rpm条件下培养48h。培养完成后利用低温离心机(4℃)，4000rpm离心10min，取发酵上清即得谷氨酰胺转氨酶粗酶液，测定每个转化子的酶活力大小，以野生型作为对照，从中挑选出酶活力比野生型高的转化子进行揺瓶复筛。经过上述步骤的筛选，得到一株产酶活力比野生型高2.6倍的菌株，提取该菌株质粒经测序后，获得含有一个氨基酸突变的突变体，即A226F(GCT→TTT)，从而获得BPTG突变体A226F(SEQ ID NO.6)及其编码基因bptgm(SEQ ID NO.5)。

3.谷氨酰胺转氨酶酶活的测定：配制含有0.2％N，N-二甲基酪蛋白、12.5μΜ丹磺尸胺(MDC)、4.5mM DTT的Tris-HCl(50mM，pH 7.5)缓冲液作为反应液。取180μL的反应液于黑色96孔板中，40℃保温1min，加入20μL的稀释适当倍数的酶液，以加入不含酶的Tris-HCl缓冲液为对照，40℃反应10min后，记录激发波长350nm和发射波长500nm下检测的荧光强度。每分钟催化1nmol的MDC插入到N，N-二甲基酪蛋白所需的酶量定义为一个活力单位U/ml。

酶活力计算：

其中：

I代表反应后产物的荧光强度。

I₀代表不加酶对照的荧光强度。

[MDC]为反应体系中MDC的浓度。

t为反应时间。

V为加入的酶液体积ml

比酶活(U/g)＝酶活力/蛋白浓度。

实施例3：高活力谷氨酰胺转氨酶在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达、制备及酶学性质测定

将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-bptg和WB600/pBSA43-bptgm接种于5mL的LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220r/min培养过夜，按2％接种量转接于50mL的LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220r/min培养48h，离心收集发酵上清，即得到野生型BPTG及突变体BPTGM的粗酶液，再采用实施例2步骤3酶活测定方法测定粗酶液酶活，结果显示，野生型BPTG酶活力为60U/ml，突变体BPTGM酶活力为162U/ml。

将上述粗酶液先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将透析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度NaCl(0～1mol/L)的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡，上样至sephadex g25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化后的酶液，经冷冻干燥制得野生型BPTG及突变体BPTGM纯酶酶粉。

将野生型BPTG及突变体BPTGM酶粉经纯净水溶解后采用实施例2步骤3酶活测定方法测定酶活，结果显示，野生型BPTG的比酶活力为220U/g，突变体BPTGM的比酶活力为572U/g，突变体比野生型比酶活力提高了2.6倍。

最适温度测定：将野生型BPTG与突变体BPTGM的纯酶酶液分别于30、40、50、60和70℃条件下按实施例2步骤3酶活测定方法在pH6.0处测定酶活力，野生型BPTG的最高活力为0.22U，突变体BPTGM的最高活力为0.57U，分别以各自的最高活力作为100％，计算其在各个温度下的相对活力，结果如图5所示，野生型及突变体最适温度均为50℃。

最适pH测定：将野生型BPTG与突变体BPTGM的纯酶酶液置于由pH 5.0、pH 6.0、pH7.0、pH 8.0、pH 9.0的磷酸盐缓冲液制备的底物中在50℃条件下按实施例2步骤3酶活测定方法测定酶活力，野生型BPTG的最高活力为0.22U，突变体BPTGM的最高活力为0.57U，分别以各自的最高活力作为100％，计算其在各个pH下的相对活力，结果如图6所示，野生型及突变体最适pH均为6.0。

热稳定性能测定：将相同酶活力的野生型BPTG与突变体BPTGM的酶液分别保存于0.05M的pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，分别在30、40、50℃条件下保温30、60、90、120min，每个时间点测一次残余酶活力，在最适反应条件下按实施例2步骤3酶活测定方法测定酶活力，以未经过处理时的酶活定为100％，计算处理后的残余酶活力，结果如图7所示。结果显示，在30℃时，保温120min，野生型与突变体的残余酶活均保持在90％左右；在40℃时，保温120min，野生型与突变体的残余酶活均保持在85％左右；在50℃，保温120min，野生型与突变体的残余酶活均在30％左右。

pH稳定性测定：以相同酶活力的野生型与突变体的酶粉分别溶解于0.05M的pH6.0的磷酸盐缓冲液中，于4℃分别保温5d，每隔24h测一次残余酶活，以未保温的酶活为100％，计算处理后的残余酶活力，结果如图8所示。结果显示，野生型及突变体在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中保温5d后，两者残余酶活均保持在85％左右。

实施例4：构建地衣芽孢杆菌高活力谷氨酰胺转氨酶重组菌株

分别向预冷的1mm电转杯中加入60μL地衣芽孢杆菌TCCC11965感受态细胞和1μL(50ng/μL)重组质粒pBSA43-bptg和pBSA43-bptgm，混匀并冰浴5min，设置参数(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)，电击一次，随后立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.5mol/L甘露醇)，混匀后吸取至1.5mLEP管中，37℃摇床震荡培养3h，离心后留取200μL复苏物涂布在具有Kan抗性的LB平板上，37℃培养24h，挑取转化子，提质粒、酶切验证(酶切验证如图4中3、4泳道所示)，得到地衣芽孢杆菌重组菌株TCCC11965/pBSA43-bptg和TCCC11965/pBSA43-bptgm。

实施例5：构建解淀粉芽孢杆菌高活力谷氨酰胺转氨酶重组菌株

(1)制备解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218感受态

①菌种活化，在无抗LB固体培养基上三区划线，37℃培养24h；

②挑单菌落接种于LBS培养基，37℃，220rpm，培养12h；

③以2％的接种量，将种子液接种于100mL LBS培养基中，37℃，220rpm，培养2-3h至OD₆₀₀＝0.4-0.6；

④用低温离心机(4℃)，5000rpm，离心10min，弃上清；

⑤菌体用30mL洗涤缓冲液(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油)重悬，用低温离心机(4℃)，5000rpm，离心10min，弃上清；

⑥重复步骤⑤，共洗涤3次；

⑦用10mL缓冲液重悬菌体(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油，14％PEG6000)；

⑧分装感受态，每管100μL，-80℃保存备用。

(2)电转解淀粉芽孢杆菌

①75％酒精清洗电转杯；

②分别将1μL(50ng/μL)重组质粒pBSA43-bptg和pBSA43-bptgm和100μL感受态混匀后转移至电转杯中，冰浴2min；

③2100-2500V，电击4-6ms后，立即加入1mL复苏液(LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃，220rpm复苏3h，涂布于含Kan抗性的平板；

④挑转化子，提质粒，酶切验证(如图4中5、6泳道所示)，得到解淀粉芽孢杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-bptg和CGMCC No.11218/pBSA43-bptgm。

实施例6：高活力谷氨酰胺转氨酶在地衣芽孢杆菌中的表达及制备

将地衣芽孢杆菌重组菌株TCCC11965/pBSA43-bptg和TCCC11965/pBSA43-bptgm接种于5mL的LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220r/min培养过夜，按2％接种量转接于50mL的LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220r/min培养48h，离心收集发酵上清，即得到野生型BPTG及突变体BPTGM的粗酶液，再采用实施例2步骤3酶活测定方法测定粗酶液酶活，结果显示，野生型BPTG酶活力为96U/ml，突变体BPTGM酶活力为257U/ml。

将上述野生型及突变体粗酶液先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将透析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度NaCl(0～1mol/L)的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡，上样至sephadex g25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化后的酶液，经冷冻干燥制得野生型BPTG及突变体BPTGM纯酶酶粉。

实施例7：高活力谷氨酰胺转氨酶在解淀粉芽孢杆菌中的表达及制备

将解淀粉芽孢杆菌重组菌株CGMCC No.11218/pBSA43-bptg和CGMCC No.11218/pBSA43-bptgm接种于5mL的LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220r/min培养过夜，按2％接种量转接于50mL的LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，220r/min培养48h，离心收集发酵上清，即得到野生型BPTG及突变体BPTGM的粗酶液，再采用实施例2步骤3酶活测定方法测定粗酶液酶活，结果显示，野生型BPTG酶活力为153U/ml，突变体BPTGM酶活力为396U/ml。

将收集的粗酶液先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将透析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度NaCl(0～1mol/L)的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液平衡，上样至sephadex g25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5mL/min的速度洗脱，获得纯化后的酶液，经冷冻干燥制得野生型BPTG及突变体BPTGM纯酶酶粉。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种高活力谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcggatcca tgattatcct ttcaggacag cc 32

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccaagcttg ctgccaaaca tttgcctg 28

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）

<400> 3

atgattatcc tttcaggaca gccagtgaca aatgagcagc tggcttcatt tcagctagaa 60

ggacaaaagc ggatcatttt gatgcagtta caagcctcaa atgatacgtt ccgctacagg 120

caggcatctg atttgttatt tgaggtcaca ttgagatcga acattatgaa tgctgcaaga 180

gatttgcata aaagtggtgc ctcatttgcc atcttccaaa aatctcgtgc aaatgatgcc 240

ttttggcgtg tatcggaagc aggagcacta gagctgcgct atcaagtgga accatctaga 300

ggaattaaag acatttttga aaatggctca caatatgcat ttgaatgtgc cacagccatt 360

gtgatcgtat tttatatggg ggtcttgcaa acggtaggag acgagaagtt taaccgaagg 420

cttcgcagct taaccctgta tgactggcat tatgatacat tgtcgattta tacagaacgc 480

gggaatgact ttatctatgg ggattgctta tattttgaaa atccagagtt tagctatcag 540

cagtcacagt ggcgcgggga aaatgtgatt tacttaggag aagatcaata ttacggacat 600

ggacttggga ttttaacagc ggcagaaatt atcgacaaat tgaataagag aaggcggcca 660

ggtgctgttc aatctgctta tctattgccg cagaccaccc ggatggatgt gatttatctc 720

aggcaaatgt ttggcagc 738

<210> 4

<211> 246

<212> PRT

<213> 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）

<400> 4

Met Ile Ile Leu Ser Gly Gln Pro Val Thr Asn Glu Gln Leu Ala Ser

1 5 10 15

Phe Gln Leu Glu Gly Gln Lys Arg Ile Ile Leu Met Gln Leu Gln Ala

20 25 30

Ser Asn Asp Thr Phe Arg Tyr Arg Gln Ala Ser Asp Leu Leu Phe Glu

35 40 45

Val Thr Leu Arg Ser Asn Ile Met Asn Ala Ala Arg Asp Leu His Lys

50 55 60

Ser Gly Ala Ser Phe Ala Ile Phe Gln Lys Ser Arg Ala Asn Asp Ala

65 70 75 80

Phe Trp Arg Val Ser Glu Ala Gly Ala Leu Glu Leu Arg Tyr Gln Val

85 90 95

Glu Pro Ser Arg Gly Ile Lys Asp Ile Phe Glu Asn Gly Ser Gln Tyr

100 105 110

Ala Phe Glu Cys Ala Thr Ala Ile Val Ile Val Phe Tyr Met Gly Val

115 120 125

Leu Gln Thr Val Gly Asp Glu Lys Phe Asn Arg Arg Leu Arg Ser Leu

130 135 140

Thr Leu Tyr Asp Trp His Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Tyr Thr Glu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Asp Phe Ile Tyr Gly Asp Cys Leu Tyr Phe Glu Asn Pro Glu

165 170 175

Phe Ser Tyr Gln Gln Ser Gln Trp Arg Gly Glu Asn Val Ile Tyr Leu

180 185 190

Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Gly His Gly Leu Gly Ile Leu Thr Ala Ala

195 200 205

Glu Ile Ile Asp Lys Leu Asn Lys Arg Arg Arg Pro Gly Ala Val Gln

210 215 220

Ser Ala Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Thr Arg Met Asp Val Ile Tyr Leu

225 230 235 240

Arg Gln Met Phe Gly Ser

245

<210> 5

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgattatcc tttcaggaca gccagtgaca aatgagcagc tggcttcatt tcagctagaa 60

ggacaaaagc ggatcatttt gatgcagtta caagcctcaa atgatacgtt ccgctacagg 120

caggcatctg atttgttatt tgaggtcaca ttgagatcga acattatgaa tgctgcaaga 180

gatttgcata aaagtggtgc ctcatttgcc atcttccaaa aatctcgtgc aaatgatgcc 240

ttttggcgtg tatcggaagc aggagcacta gagctgcgct atcaagtgga accatctaga 300

ggaattaaag acatttttga aaatggctca caatatgcat ttgaatgtgc cacagccatt 360

gtgatcgtat tttatatggg ggtcttgcaa acggtaggag acgagaagtt taaccgaagg 420

cttcgcagct taaccctgta tgactggcat tatgatacat tgtcgattta tacagaacgc 480

gggaatgact ttatctatgg ggattgctta tattttgaaa atccagagtt tagctatcag 540

cagtcacagt ggcgcgggga aaatgtgatt tacttaggag aagatcaata ttacggacat 600

ggacttggga ttttaacagc ggcagaaatt atcgacaaat tgaataagag aaggcggcca 660

ggtgctgttc aatcttttta tctattgccg cagaccaccc ggatggatgt gatttatctc 720

aggcaaatgt ttggcagc 738

<210> 6

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Ile Ile Leu Ser Gly Gln Pro Val Thr Asn Glu Gln Leu Ala Ser

1 5 10 15

Phe Gln Leu Glu Gly Gln Lys Arg Ile Ile Leu Met Gln Leu Gln Ala

20 25 30

Ser Asn Asp Thr Phe Arg Tyr Arg Gln Ala Ser Asp Leu Leu Phe Glu

35 40 45

Val Thr Leu Arg Ser Asn Ile Met Asn Ala Ala Arg Asp Leu His Lys

50 55 60

Ser Gly Ala Ser Phe Ala Ile Phe Gln Lys Ser Arg Ala Asn Asp Ala

65 70 75 80

Phe Trp Arg Val Ser Glu Ala Gly Ala Leu Glu Leu Arg Tyr Gln Val

85 90 95

Glu Pro Ser Arg Gly Ile Lys Asp Ile Phe Glu Asn Gly Ser Gln Tyr

100 105 110

Ala Phe Glu Cys Ala Thr Ala Ile Val Ile Val Phe Tyr Met Gly Val

115 120 125

Leu Gln Thr Val Gly Asp Glu Lys Phe Asn Arg Arg Leu Arg Ser Leu

130 135 140

Thr Leu Tyr Asp Trp His Tyr Asp Thr Leu Ser Ile Tyr Thr Glu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Asp Phe Ile Tyr Gly Asp Cys Leu Tyr Phe Glu Asn Pro Glu

165 170 175

Phe Ser Tyr Gln Gln Ser Gln Trp Arg Gly Glu Asn Val Ile Tyr Leu

180 185 190

Gly Glu Asp Gln Tyr Tyr Gly His Gly Leu Gly Ile Leu Thr Ala Ala

195 200 205

Glu Ile Ile Asp Lys Leu Asn Lys Arg Arg Arg Pro Gly Ala Val Gln

210 215 220

Ser Phe Tyr Leu Leu Pro Gln Thr Thr Arg Met Asp Val Ile Tyr Leu

225 230 235 240

Arg Gln Met Phe Gly Ser

245

Claims

1.一种谷氨酰胺转氨酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQID No.6所示。

2.权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因。

3.权利要求2所述谷氨酰胺转氨酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ IDNo.5所示。

4.一种包含权利要求2或3所述基因的重组载体或重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组载体或重组菌株，其特征在于，表达载体为pBSA43，宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600、解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.11218。

6.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶突变体中的应用。

7.权利要求1所述谷氨酰胺转氨酶突变体在催化谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团与赖氨酸的ε-氨基或其他伯胺之间发生酰基转移反应中的应用。