CN113604445B

CN113604445B - 一种酪氨酸酶及其制备与应用

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Publication number: CN113604445B
Application number: CN202111068005.4A
Authority: CN
Inventors: 刘逸寒; 王琛; 王凤华; 王洪彬; 路福平
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-09-13
Filing date: 2021-09-13
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2041-09-13
Also published as: CN113604445A

Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种酶活力提高的酪氨酸酶突变体及其制备。本发明通过分子生物学技术手段获得阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)野生型的酪氨酸酶基因，利用易错PCR技术对野生型酪氨酸酶基因进行随机突变，得到酪氨酸酶突变体G43R，及其编码基因tyrm，重新构建重组质粒，并实现了其在枯草芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得高活力的酪氨酸酶。

Description

一种酪氨酸酶及其制备与应用

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及通过易错PCR技术体外定向进化获得酶活力提高的酪氨酸酶突变体及其制备。

背景技术：

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR,EC 1.14.18.1)是一种双核铜离子氧化还原酶，又称多酚氧化酶，是酚氧化酶的一种，属于单加氧酶。酪氨酸酶利用分子氧催化两种不同的酶反应:(1)催化酪氨酸羟基化生成多巴(单酚酶活性)和(2)催化多巴氧化成多巴醌(双酚酶活性)，分子氧用作电子受体，在两种反应中都被还原成水，而活性醌类化合物可自发聚合生成黑色素，已在多个领域中具有广泛应用。在染料脱色方面，酪氨酸酶可以被用于芳香族化合物的降解，催化有机污染物的脱色，还可以催化许多底物变成毒性较小甚至无毒的化合物，从而更方便地从废水中提取；在生产左旋多巴中方面，目前L-DOPA大多是以化学方法合成，涉及多个步骤，费时、不环保且经济效益低，而L-DOPA也是酪氨酸酶与酪氨酸反应的第一个产物，因此，可以通过氧化酪氨酸催化L-DOPA的合成；在合成黑色素方面，酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶。在生物体中，黑色素的合成始于L-酪氨酸的氧化，最关键的一步就是酪氨酸在酪氨酸酶的作用下氧化生成多巴醌，作为氧化生成黑色素的前体物质；在蛋白交联方面，酪氨酸酶交联蛋白对于维持某些蛋白质的正确构象至关重要，蛋白质的交联在改变食品的结构化和溶解度、发泡和乳化特性等方面也有很大作用。不同来源的酪氨酸酶作为交联剂已在牛奶、肉类和谷物中的多种蛋白质上进行了试验。与传统的交联剂相比，酪氨酸酶在其催化的反应中具有广泛的底物特异性。

酪氨酸酶几乎存在于自然界的各个领域，参与各种生物学功能。目前已经有多种不同来源的酪氨酸酶被分离纯化，比较最近发表的酪氨酸酶的氨基酸序列发现其长度和整体特性具有高度异质性。研究发现，不同来源的酪氨酸酶氨基酸残基数目相差较大，分子量在60-70kDa不等，但成熟的酪氨酸酶蛋白的分子量为35-50kDa左右。

酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性进化，是改善蛋白质功能和活性的重要手段之一，属于蛋白质工程的范畴。在事先不了解蛋白质的高级结构以及催化位点等因素的情况下，可以人为创造条件模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速得到符合某些预期效果的蛋白突变体。定向进化的核心步骤主要包括构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错PCR、饱和突变、DNA改组、交错延伸PCR等。与之不同，当已知蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素时，在此基础上有的放矢对基因进行改造的是定点突变，即理性设计。因它只能对天然酶蛋白质中的少数氨基酸进行替换、删除或插入，对酶功能的改造有限。因此，对于结构与功能未知的酶，定向进化可在一定程度上弥补理性设计的不足。

芽孢杆菌表达系统作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。它与常用的大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等均可作为表达宿主菌。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究也十分清楚，具有密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、不产生致病毒素、对培养基无特殊要求等优点。随着分子生物学技术的发展和芽孢杆菌研究的深入，使用芽孢杆菌表达系统已经克隆和表达了大量基因，有些已进行大规模工业生产，多种酶和临床需要的化学药品或者工业产品都通过芽孢杆菌来表达生产。

在本发明中，对原酪氨酸酶基因定向进化获得高活力的酪氨酸酶突变基因，并且实现了其在枯草芽孢杆菌表达系统中的高效表达，得到了产高活力酪氨酸酶的突变体菌株。

发明内容：

基于现有技术存在的问题，为了进一步推动酪氨酸酶在工业领域的应用，需对其现有性质进一步的提升，本发明的目的在于提供一种高活力酪氨酸酶的突变体。

实现本发明目的的技术路线概述如下：

通过基本的分子生物学技术手段获得来自阿耶波多氏杆菌(Bacillusaryabhattai)TCCC111983的野生型酪氨酸酶TYR，通过酶切、连接等构建重组载体之后，经测序获得野生型酪氨酸酶TYR编码基因tyr(序列如SEQ ID NO.2所示)，利用易错PCR技术对野生型tyr基因进行随机突变，利用枯草芽孢杆菌表达系统筛选得到TYR突变体G43R，及其编码基因tyrm，重新构建重组载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得酶活力提高的TYR突变体。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.酪氨酸酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示TYR突变体中突变的氨基酸。如Gly43Arg，表示位置43的氨基酸由野生型TYR的Gly替换成Arg，位置的编号对应于SEQ IDNo.1中野生型TYR的氨基酸序列编号。

在本发明中，小写斜体tyr表示野生型TYR的编码基因，小写斜体tyrm表示突变体G43R的编码基因，信息如下表。

酪氨酸酶	氨基酸突变位点	基因突变位点	氨基酸SEQ ID No.	核苷酸SEQ ID No.
					野生型	—	—	1	2
G43R	Gly43Arg	<u>G</u>G<u>T</u>→<u>C</u>G<u>G</u>	3	4

本发明还提供包含所述突变体编码基因的重组质粒或重组菌；

优选地，所述的TYR突变体G43R编码基因的表达载体为pBSA43；宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。

本发明的实验方案具体如下：

1、所述TYR突变体编码基因的获得，包括如下步骤：

(1)以阿耶波多氏芽孢杆菌野生型TYR编码基因tyr(SEQ ID No.2)为模板进行易错PCR随机突变野生型TYR编码基因；

(2)将随机突变后的TYR编码基因，通过酶切、连接等构建重组质粒后转入枯草芽孢杆菌WB600中，经筛选获得酶活力提高的TYR突变体，经测序获得TYR突变体编码基因tyrm，将含有酶活力提高的TYR突变体编码基因的质粒pET22b-tyrm保存。

2、一株含有酪氨酸酶编码基因的枯草芽孢杆菌重组菌株及以其制备酶活力提高的酪氨酸酶酶的过程，包括如下步骤：

(1)将TYR突变体编码基因tyrm与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43通过连接得到新的重组质粒pBSA43-tyrm；

(2)将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600中，经卡那霉素(Kan)抗性筛选，酶切验证得到重组菌株，之后将重组菌株进行培养发酵，得到酪氨酸酶。

3、所述TYR野生型及其突变体G43R的酶学特性如下：

(1)比活：野生型的比活为0.736U/mg，TYR突变体G43R的比活为1.386U/mg。

(2)最适反应温度：60℃。

(3)温度稳定性：在pH 7.0条件下，分别于30、35和40℃水浴保温1h。在30和35保温1h后，TYR突变体G43R及野生型的残余活力均保持在70％以上；在40℃保温1h后，TYR突变体G43R的残余活力为35.06％，与之对应，野生型的残余活力为34.81％。

(4)最适pH：5.0。

(5)pH稳定性：在4℃下，分别于pH 3.0、7.0和9.0的缓冲液中保温5d，野生型和TYR突变体G43R在pH 7.0条件下的稳定性较好，TYR突变体G43R的残余活力为96.42％，而野生型的残余活力分别为97.04％。在pH 3.0和pH 9.0条件下，TYR突变体G43R的残余活力分别为78.61％和72.15％，与之对应，野生型的残余活力分别为77.89％和71.53％。

有益效果：

1、本发明利用易错PCR技术对野生型TYR进行随机突变，得到酶活力提高的突变体G43R。高活力酪氨酸酶在枯草芽孢杆菌表达系统内发酵酶活最高值为6.12U/mL。

2、本发明使用了枯草芽孢杆菌表达系统实现酶活力提高的TYR突变体的高效表达。

附图说明：

图1为本发明野生型tyr基因的PCR扩增电泳图

其中：M为DNA Marker，1为tyr基因；

图2为本发明重组质粒pBSA43-tyrm酶切验证图

其中：M为DNA Marker，1为枯草芽孢杆菌中重组质粒pBSA43-tyrm经EcoRI和NotI双酶切电泳图；

图3为野生型TYR及本发明突变体G43R蛋白纯化样品的SDS-PAGE图

其中：M为Protein Marker，1为野生型TYR超滤浓缩样品，2为突变体G43R超滤浓缩样品；

图4为本发明野生型TYR与突变体G43R最适温度曲线

其中：WT为本发明野生型TYR，G43R为本发明突变体；

图5为本发明野生型TYR与突变体G43R最适pH曲线

其中：WT为本发明野生型TYR，G43R为本发明突变体；

图6为温度稳定性曲线

其中：WT为本发明野生型TYR，G43R为本发明突变体；

图7为pH稳定性曲线

其中：WT为本发明野生型TYR，G43R为本发明突变体。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明实施例所用培养基如下：

LB培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，其余为水。

10×SP盐溶液(g/L)：K₂HPO₄ 91.7，KH₂PO₄ 30，(NH₄)₂SO₄ 10，柠檬酸钠5，MgSO₄·7H₂O 10。

SP I培养基：1×SP 97.6mL，5％酪蛋白水解物400μL，10％酵母汁1mL，50％葡萄糖1mL。(5％酪蛋白水解物：0.5g酸水解酪蛋白溶于10mL ddH₂O；10％酵母汁：1g酵母提取物溶于10mL ddH₂O；50％葡萄糖：5g葡萄糖溶于10mL ddH₂O)。

SP II培养基：SP I培养基99mL，100mM CaCl₂ 500μL，500mM MgCl₂ 500μL。

培养基的固态培养基添加2％琼脂。

以下将通过具体实施例对本发明作进一步解释说明。

实施例1：野生型TYR编码基因tyr的获得

1.野生型TYR编码基因tyr来自实验室保存的阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillusaryabhattai)TCCC 111983菌株，利用美国OMEGA公司的Bacterial DNA Kit提取基因组。

(1)菌株活化：用接种环从甘油管中蘸取阿耶波多氏芽孢杆菌菌液，接种于LB固体培养基平板，三区划线，37℃恒温培养12h；

(2)转接：从培养菌体的平板上挑取边缘整齐、表面光滑的单菌落接种于5mL液体LB培养基中，220r/min、37℃条件下培养12h；

(3)收集菌体：取适量培养菌液分装于1.5mL EP管，12000r/min离心2min，弃上清；

(4)加入250μL ddH₂O重悬菌体，并加入50μL的50mg/mL溶菌酶，37℃水浴10min；

(5)加入100μL BTL Buffer和20μL蛋白酶K，旋涡振荡；

(6)55℃水浴40-50min，每隔20-30min，振荡混匀；

(7)加入5μL RNA酶，颠倒混匀数次，室温放置5min；

(8)12000rpm离心2min，去掉未消化部分，将上清部分转移至新的1.5mL EP管；

(9)加入220μL BDLBuffer，振荡混匀，65℃水浴10min；

(10)加入220μL无水乙醇，吹吸混匀；

(11)转移至吸附柱，静置1min，12000rpm离心1min，弃滤液；

(12)加入500μLHBC Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(13)加入700μLDNAWash Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(14)加入500μL DNA Wash Buffer，12000rpm，离心1min，弃滤液；

(15)12000rpm，空离2min，55℃金属浴10min，晾干；

(16)加入40μL ddH₂O洗脱基因组。

2.扩增野生型TYR编码基因tyr

设计野生型TYR编码基因tyr的扩增引物，序列如下：

上游P1(SEQ ID No.5)：

CCGGAATTCGATGAGTAACAAGTACAAAGTTAGAAAAAACGT(划线部分为EcoRI酶切位点)

下游P2(SEQ ID No.6)：

AAGGAAAAAAGCGGCCGCTGAGGAACGTTTTGATTTTCTTA(划线部分为NotI酶切位点)

PCR扩增的反应体系为50μL，其组成为：

PrimeSTAR Max	25μL
		上游引物P1(20μmol/L)	2μL
下游引物P2(20μmol/L)	2μL
		基因组	2μL
ddH<sub>2</sub>O	19μL
		总体积	50μL

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

扩增程序的设置为：

a.预变性:98℃30s；

b.变性：98℃10s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃10s；

e.b-d反应30个循环；

f.延伸:72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到阿耶波多氏芽孢杆菌野生型TYR编码基因tyr的条带，约900bp(见图1)，再由DNA切胶回收试剂盒回收PCR产物，通过酶切、连接构建重组质粒pET22b-tyr，送测序公司进行测序，获得野生型tyr基因序列(SEQ ID NO.2所示)。

实施例2：TYR突变体G43R的获得

1.易错PCR：以野生型编码基因tyr为模板进行易错PCR，其反应体系如下：

ddH<sub>2</sub>O	10μL
		重组质粒pET22b-tyr(5ng/μL)	2μL
上游引物P1(10μmol/L)	2μL
		下游引物P2(10μmol/L)	2μL
Taq DNA聚合酶	0.5μL
		10×Taq buffer	5μL
dATP(10mmol/L)	1μL
		dGTP(10mmol/L)	1μL
dTTP(10mmol/L)	4μL
		dCTP(10mmol/L)	4μL
MgCl<sub>2</sub>(25mmol/L)	12μL
		MnCl<sub>2</sub>(10mmol/L)	2.0μL

注：上述所需试剂来自宝生物工程有限公司Takara。

体系完成后，进行易错PCR反应，程序设置如下：

a.预变性:95℃5min；

b.变性：95℃30s；

c.退火：56℃45s；

d.延伸：72℃90s；

e.b-d反应35个循环；

f.延伸:72℃10min。

PCR反应结束后，将PCR产物与载体质粒进行EcoRI和NotI双酶切，经过纯化回收，易错PCR产物与同样经过双酶切的载体质粒pBSA43进行连接，通过转化枯草芽孢杆菌WB600，涂布于含Kan(100μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子。

3.筛选方法：采用分光光度法进行活性检测。L-酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下，首先形成多巴，多巴会继续氧化生成多巴醌。生成的多巴醌是一种红色物质，它的最大光吸收波长是475nm。因此在一定范围内多巴醌的生成量与反应液的颜色强度具有一定的比例关系，只要利用分光光度法测定出多巴醌的生成量就可测定出酪氨酸酶的酶活力。由于发酵上清存在目的蛋白，可以直接用发酵上清进行筛选。

4.突变体文库的筛选：在96孔板1中每个孔中加入200μL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基，随后，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至96孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将96孔板转移至摇床培养，160rpm，37℃培养48h。然后采用低温离心机(4℃)，4000rpm离心10min，取10μL发酵上清加入到200μL反应液的96孔板1中，60℃反应5min，检测475nm处的吸光值。

反应液：2mmol/L L-酪氨酸溶液：准确称取36mg L-酪氨酸，用Tris-HCl(pH7.0)溶解并定容至100mL，4℃冰箱保藏。

5.选取酶活力提高的突变体。根据板1的情况，计算每个突变体的残余酶活，选取相较于野生型酶活力提高的突变体，将该突变体接入平板，并送出菌样进行测序。

经过上述步骤的易错PCR，选取出酶活力提高的突变体，测序后得到其中含有一个氨基酸突变，即G43R(GGT→CGG)，从而获TYR突变体G43R(氨基酸序列SEQ ID NO.3)，及其编码基因tyrm(SEQ ID NO.4)。

实施例3：酪氨酸酶枯草芽孢杆菌重组菌的构建

1.表达质粒pBSA43-tyrm的提取

从上述筛选获得突变体G43R的菌株中提取质粒，即获得重组表达质粒pBSA43-tyrm。

2.表达质粒pBSA43-tyrm转化枯草芽孢杆菌WB600

(1)枯草芽孢杆菌WB600菌种活化，在无抗LB平板上三区划线，培养12h；

(2)挑取单菌落，接种于含有5mL LB培养基的试管中，37℃，220rpm培养12h；

(3)按2％的接种量，取100μL种子液接种于含有5mL SPI培养基的试管中，37℃，220rpm，培养3-4h至OD₆₀₀＝1.2；

(4)快速取200μL接种于2mL SPII培养基，37℃，100rpm，培养1.5h；

(5)加入20μL的10mM EGTA，37℃，100rpm，培养10min；

(6)加入1-2μL重组质粒pBSA43-tyrm，37℃，100rpm，培养30min后，转速调至220rpm，继续培养1-2h；

(7)将菌液转移至已灭菌的1.5mL EP管中，5000rpm离心5min，弃上清，留50μL培养液重悬菌体，菌液涂布于含Kan的平板；

(8)挑转化子，提质粒、酶切验证(如图2中1泳道所示)，得到枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-tyrm。

实施例4：酶活力提高的酪氨酸酶在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备

1.将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-tyrm接种于含卡纳霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；

2.按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，离心收集发酵上清，即得到酶活力提高的G43R粗酶液；

3.将收集到的发酵液上清，经超滤管浓缩得到粗酶液，用冷冻干燥机将粗酶液冻干得到粗酶粉。

4、采用实施例3、4同样的方式构建野生型重组菌株并进行发酵，获得野生型TYR粗酶液和粗酶粉。

实施例5：酪氨酸酶酶活力测定

1.酪氨酸酶酶活测定原理

是L-酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下，首先形成多巴，多巴会继续氧化生成红色物质多巴醌，多巴醌在475nm波长下有最大吸光系数可被检测到，进而计算出酪氨酸酶的酶活力。

2.酪氨酸酶活的定义

在一定反应条件下(如未特别说明，条件为：60℃，pH7.0)，每分钟产生1μmol的多巴醌所需要的酶量定义为一个酶活力单位，记为U/mL。

酶活公式：U/mL＝(ΔOD×V₁)/(Δt×V₂×ε×d)

注：ΔOD:代表从反应开始到结束，吸光度的变化量；

V1:代表反应体系的总体积；

Δt:代表从反应开始到结束所用时间；

V2:代表在反应体系中酶液的体积；

ε:代表以酪氨酸为底物时，其产物在475nm处摩尔吸光系数3600M^-1cm^-1；

d:代表吸光杯的内径或光程厚度(cm)。

比酶活(U/mg)＝酶活力/蛋白浓度。

3.本发明采用的酪氨酸酶酶活测定方法与步骤

200μL反应液于60℃，pH7.0下保温1min，吸取10μL酶液加入其中，60℃反应5min后采用酶标仪在475nm检测OD值。样品均含有3组平行实验。

空白对照：100℃处理酶液10min使酶失活，使用热失活的酶液作为对照，反应体系及方法同上。

注：反应液：2mmol/L L-酪氨酸溶液：准确称取36mg L-酪氨酸，用Tris-HCl(pH7.0)溶解并定容至100mL，4℃冰箱保藏。

4.对实施例4枯草芽孢杆菌表达系统所得发酵液酶活进行测定，野生型酶活为3.46U/mL，G43R突变体酶活为6.12U/mL。

实施例6：酶学性质测定

以实施例4所采用枯草芽孢杆菌表达系统制备的酶粉作为测定样品，及实施例5的酶活测定方法，测定野生型TYR以及突变体G43R的酶学性质，结果如下，详见附图4-7：

(2)最适反应温度：60℃。

(4)最适pH：5.0。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种酪氨酸酶及其制备与应用

<130> 1

<141> 2021-09-13

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 297

<212> PRT

<213> 阿耶波多氏杆菌(Bacillus aryabhattai)

<400> 1

Met Ser Asn Lys Tyr Lys Val Arg Lys Asn Val Leu Ser Leu Thr Asp

1 5 10 15

Ala Glu Lys Arg Asp Phe Ile Arg Ala Val Leu Ile Leu Lys Lys Lys

20 25 30

Gly Ile Tyr Asp Arg Tyr Ile Ala Trp His Gly Ala Ala Gly Lys Phe

35 40 45

His Thr Pro Pro Ser Ser Asp Arg Asn Ala Ala His Met Ser Ser Ala

50 55 60

Phe Leu Pro Trp His Arg Glu Tyr Leu Leu Arg Phe Glu Arg Asp Leu

65 70 75 80

Gln Ser Ile Asp Ser Glu Val Thr Leu Pro Tyr Trp Glu Trp Glu Thr

85 90 95

Asp Ala Gln Leu Gln Asp Pro Ser Gln Ser Gln Ile Trp Ser Ala Asp

100 105 110

Phe Met Gly Gly Asn Gly Asn Pro Lys Lys Asp Phe Ile Val Asp Thr

115 120 125

Gly Pro Phe Val Ala Gly Arg Trp Thr Thr Ile Asp Glu Gln Gly Asn

130 135 140

Pro Ser Gly Gly Leu Lys Arg Asn Phe Gly Ala Thr Lys Glu Ala Pro

145 150 155 160

Thr Leu Pro Thr Arg Asp Asp Val Leu Asn Ala Leu Lys Ile Thr Lys

165 170 175

Tyr Asp Thr Pro Pro Trp Asp Met Thr Ser Gln Asn Ser Phe Arg Asn

180 185 190

Gln Leu Glu Gly Phe Ile Asn Gly Pro Gln Leu His Asn Arg Val His

195 200 205

Arg Trp Val Gly Gly Gln Met Gly Val Val Pro Thr Ala Pro Asn Asp

210 215 220

Pro Val Phe Phe Leu His His Ala Asn Val Asp Arg Ile Trp Ala Val

225 230 235 240

Trp Gln Met Val His Arg Asn Gln Asn Tyr Gln Pro Met Lys Asn Gly

245 250 255

Pro Phe Gly Gln Asn Phe Arg Asp Pro Met Tyr Pro Trp Asn Thr Thr

260 265 270

Pro Glu Asp Val Met Asn His Arg Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Ile

275 280 285

Glu Leu Arg Lys Ser Lys Arg Ser Ser

290 295

<210> 2

<211> 891

<212> DNA

<213> 阿耶波多氏杆菌(Bacillus aryabhattai)

<400> 2

atgagtaaca agtacaaagt tagaaaaaac gtattgtctc ttacagacgc ggaaaaaaga 60

gattttattc gtgccgtgct aatactaaag aaaaaaggaa tatatgaccg ctatatagcc 120

tggcatggtg cagcaggtaa atttcatact cctccgagca gcgatcgaaa tgcagcacat 180

atgagttctg cttttttgcc gtggcatcgt gaataccttt tgcgattcga acgtgacctt 240

cagtccatcg attcagaagt aacccttcct tattgggaat gggaaacgga tgcacagctg 300

caggatccat cacaatcaca aatttggagc gcagatttta tgggaggaaa cggaaaccca 360

aaaaaagatt ttatcgtcga taccggcccc tttgtagctg ggcgctggac gacgatcgat 420

gaacaaggaa atccttccgg tgggctaaaa cgtaattttg gagcaacgaa agaggcacct 480

acactcccta ctcgagatga tgttctcaat gctttaaaaa taactaagta tgatacgccg 540

ccttgggata tgaccagcca aaacagcttt cgtaatcagc ttgaaggatt tattaacggc 600

ccgcagcttc acaatcgcgt acaccgttgg gttgggggac agatgggcgt tgtccctact 660

gctccgaatg atcctgtctt ctttttacac cacgcaaatg tagatcgtat ttgggctgta 720

tggcaaatgg ttcatcgcaa tcaaaactat cagccgatga aaaacgggcc atttggtcaa 780

aactttagag atccgatgta cccttggaat acaacccctg aagacgttat gaaccatcga 840

aagcttgggt acgtatacga tatagaatta agaaaatcaa aacgttcctc a 891

<210> 3

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Ser Asn Lys Tyr Lys Val Arg Lys Asn Val Leu Ser Leu Thr Asp

1 5 10 15

Ala Glu Lys Arg Asp Phe Ile Arg Ala Val Leu Ile Leu Lys Lys Lys

20 25 30

Gly Ile Tyr Asp Arg Tyr Ile Ala Trp His Arg Ala Ala Gly Lys Phe

35 40 45

His Thr Pro Pro Ser Ser Asp Arg Asn Ala Ala His Met Ser Ser Ala

50 55 60

Phe Leu Pro Trp His Arg Glu Tyr Leu Leu Arg Phe Glu Arg Asp Leu

65 70 75 80

Gln Ser Ile Asp Ser Glu Val Thr Leu Pro Tyr Trp Glu Trp Glu Thr

85 90 95

Asp Ala Gln Leu Gln Asp Pro Ser Gln Ser Gln Ile Trp Ser Ala Asp

100 105 110

Phe Met Gly Gly Asn Gly Asn Pro Lys Lys Asp Phe Ile Val Asp Thr

115 120 125

Gly Pro Phe Val Ala Gly Arg Trp Thr Thr Ile Asp Glu Gln Gly Asn

130 135 140

Pro Ser Gly Gly Leu Lys Arg Asn Phe Gly Ala Thr Lys Glu Ala Pro

145 150 155 160

Thr Leu Pro Thr Arg Asp Asp Val Leu Asn Ala Leu Lys Ile Thr Lys

165 170 175

Tyr Asp Thr Pro Pro Trp Asp Met Thr Ser Gln Asn Ser Phe Arg Asn

180 185 190

Gln Leu Glu Gly Phe Ile Asn Gly Pro Gln Leu His Asn Arg Val His

195 200 205

Arg Trp Val Gly Gly Gln Met Gly Val Val Pro Thr Ala Pro Asn Asp

210 215 220

Pro Val Phe Phe Leu His His Ala Asn Val Asp Arg Ile Trp Ala Val

225 230 235 240

Trp Gln Met Val His Arg Asn Gln Asn Tyr Gln Pro Met Lys Asn Gly

245 250 255

Pro Phe Gly Gln Asn Phe Arg Asp Pro Met Tyr Pro Trp Asn Thr Thr

260 265 270

Pro Glu Asp Val Met Asn His Arg Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Ile

275 280 285

Glu Leu Arg Lys Ser Lys Arg Ser Ser

290 295

<210> 4

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgagtaaca agtacaaagt tagaaaaaac gtattgtctc ttacagacgc ggaaaaaaga 60

gattttattc gtgccgtgct aatactaaag aaaaaaggaa tatatgaccg ctatatagcc 120

tggcatcggg cagcaggtaa atttcatact cctccgagca gcgatcgaaa tgcagcacat 180

atgagttctg cttttttgcc gtggcatcgt gaataccttt tgcgattcga acgtgacctt 240

cagtccatcg attcagaagt aacccttcct tattgggaat gggaaacgga tgcacagctg 300

caggatccat cacaatcaca aatttggagc gcagatttta tgggaggaaa cggaaaccca 360

aaaaaagatt ttatcgtcga taccggcccc tttgtagctg ggcgctggac gacgatcgat 420

gaacaaggaa atccttccgg tgggctaaaa cgtaattttg gagcaacgaa agaggcacct 480

acactcccta ctcgagatga tgttctcaat gctttaaaaa taactaagta tgatacgccg 540

ccttgggata tgaccagcca aaacagcttt cgtaatcagc ttgaaggatt tattaacggc 600

ccgcagcttc acaatcgcgt acaccgttgg gttgggggac agatgggcgt tgtccctact 660

gctccgaatg atcctgtctt ctttttacac cacgcaaatg tagatcgtat ttgggctgta 720

tggcaaatgg ttcatcgcaa tcaaaactat cagccgatga aaaacgggcc atttggtcaa 780

aactttagag atccgatgta cccttggaat acaacccctg aagacgttat gaaccatcga 840

aagcttgggt acgtatacga tatagaatta agaaaatcaa aacgttcctc a 891

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ccggaattcg atgagtaaca agtacaaagt tagaaaaaac gt 42

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aaggaaaaaa gcggccgctg aggaacgttt tgattttctt a 41

Claims

1.一种酪氨酸酶突变体，其特征在于，所述突变体为G43R，氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.3所示。

2.权利要求1所述酪氨酸酶突变体的编码基因。

3.权利要求2所述酪氨酸酶突变体的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQID No.4所示。

4.一种包含权利要求2所述基因的重组载体或重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组载体或重组菌株，其特征在于，表达载体为pBSA43，宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。

6.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产酪氨酸酶中的应用。

7.权利要求1所述酪氨酸酶突变体在酪氨酸催化氧化中的应用。