KR20070085922A

KR20070085922A - 니트릴히드라타제를 발현하는 형질 전환체

Info

Publication number: KR20070085922A
Application number: KR1020077012947A
Authority: KR
Inventors: 가오루 후루야; 아끼라 다마끼; 신이찌로 나가사와; 아야노 스즈끼
Original assignee: 아사히 가세이 가부시키가이샤; 동서석유화학주식회사
Priority date: 2004-12-09
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2007-08-27
Also published as: TW200634151A; WO2006062189A1; TWI327596B; JPWO2006062189A1

Abstract

본 발명의 목적은 열안정성에 추가로 기질인 니트릴 화합물이나 생성물인 아미드 화합물의 고농도 존재하에서도 높은 활성을 유지한 니트릴히드라타제를 이용한 아미드 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서는 자연계로부터 목적으로 하는 니트릴히드라타제를 발현하는 신규한 미생물을 탐색하고, 상기 효소 유전자를 유전자 도입한 로도코커스속의 형질 전환균체 및 그의 균체 처리물을 제조에 사용된다.

형질 전환체, 로도코커스속

Description

니트릴히드라타제를 발현하는 형질 전환체{TRANSFORMANT EXPRESSING NITRILE HYDRATASE}

본 발명은 니트릴히드라타제 유전자로 형질 전환된 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물, 및 상기 미생물이 유지되는 니트릴히드라타제의 효소 촉매 작용을 이용하여 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

니트릴 화합물의 니트릴기를 수화하여 아미드기로 변환하고 대응하는 아미드 화합물을 제조하는 기술에서는, 종래의 구리 촉매에 의한 화학적인 방법 대신에 미생물의 효소를 촉매로서 이용하는 방법이 주류를 이루고 있다. 이러한 효소는 일반적으로 니트릴히드라타제라 불리지만, 최초의 보고 이래 다수개의 효소가 여러 가지 미생물로부터 발견되어 있다. 예를 들면, 아스로박터(Arthrobacter)속(Agricultural and Biological Chemistry Vol.44 p.2251-2252, 1980), 아그로박테리움(Agrobacterium)속(일본 특허 공개 (평)05-103681), 아시네토박터(Acinetobacter)속(일본 특허 공개 (소)61-282089), 에로모나스(Aeromonas)속(일본 특허 공개 (평)05-030983), 엔테로박터(Enterobacter)속(일본 특허 공개 (평)05-236975), 에르위니아(Erwinia)속(일본 특허 공개 (평)05-161496), 크산토박 터(Xanthobacter)속(일본 특허 공개 (평)05-161495), 클렙시엘라(Klebsiella)속(일본 특허 공개 (평)05-030982), 코리네박테리움(Corynebacterium)속(일본 특허 공개 (소)54-129190, 이후에 로도코커스속으로 판명), 슈도모나스(Pseudomonas)속(일본 특허 공개 (소)58-86093), 시트로박터(Citrobacter)속(일본 특허 공개 (평)05-030984), 스트렙토마이세스(Streptomyces)속(일본 특허 공개 (평)05-236976), 바실루스(Bacillus)속(일본 특허 공개 (소)51-86186, 및 일본 특허 공개 (평)7-255494),푸사리움속(일본 특허 공개 (평)01-086889), 로도코커스(Rhodococcus)속(일본 특허 공개 (소)63-137688, 일본 특허 공개 (평)02-227069, 일본 특허 공개 제2002-369697, 및 일본 특허 공개 (평)2-470), 리조븀(Rhizobium)속(일본 특허 공개 (평)05-236977), 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속(일본 특허 공개 (평)8-56684) 등을 들 수 있다. 이들 효소는 그 아미노산 서열의 다양성에 기초하여 그 이화학적 성질도 다양하고, 각종 목적에 따라서 연구가 진행되어 왔다. 이화학적 성질 중에서도 열, 또는 아미드 화합물 및 니트릴 화합물 등에의 안정성에 관한 해명이 진전되고 있는 예로는, 로도코커스·로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) J1주에 관한 문헌(European Journal of Biochemistry Vol.196 p.581-589, 1991. Applied and Microbiology Biotechnology Vol.40 p.189-195, 1993, 일본 특허 공개 제2004-215513, 및 일본 특허 공개 제2004-222538), 슈도노카르디아·서모필라(Pseudonocardia thermophila) JCM3095주에 관한 문헌(일본 특허 공개 (평)8-187092, 및 Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.83 p.474-477, 1997), 바실루스(Bacillus)속 BR449주에 관한 문헌(WO 99/55719, 및 Applied Biochemistry and Biotechnology Vol.77-79 P.671-679, 1999), 바실루스(Bacillus)속 RAPc8주에 관한 문헌(Enzyme and Microbial Technology Vol.26 p.368-373, 2000, 및 Extremophiles Vol.2 p.347-357, 1998), 바실루스·파리더스(Bacillus palidus) Dac521주에 관한 문헌(Biochimica et Biophysica Acta Vol.1431 p.249-260, 1999), SC-JO5-1주에 관한 문헌(Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Vol.20220-226, 1998), 코마모나스·테스토스테로니(Comamonas testosteroni) 5-MGAM-4D주에 관한 문헌(WO 2004/101768), 로도코커스·피리디노보란스(Rhodococcus pyridinovorans) MW3주에 관한 문헌(Biotechnology Letters 26:1379-1384, 2004)을 들 수 있다.

한편, 이들 고유한 니트릴히드라타제는 효소 자체로는 우수하여도, 공업적으로 제조에 이용할 때에는 효소를 생산하는 미생물에 결점이 있는 경우도 많아서 유전자 공학의 수법에 의해 숙주를 변경할 필요가 있다. 그 제1 단계로서, 유전자를 클로닝하는 시도가 다수개 검토되고 있다. 예를 들면, 슈도모나스속(일본 특허 공개 (평)3-251184), 로도코커스속(일본 특허 공개 (평)2-119778, 일본 특허 공개 (평)4-211379, 일본 특허 공개 (평)09-00973, 일본 특허 공개 (평)07-099980, 및 일본 특허 공개 제2001-069978), 리조븀속(일본 특허 공개 (평)6-25296), 클렙시엘라속(일본 특허 공개 (평)6-303971), 아크로모박터속(일본 특허 공개 (평)08-266277), 슈도노카르디아속(일본 특허 공개 (평)9-275978), 바실루스속(일본 특허 공개 (평)09-248188) 등을 들 수 있다. 다음 단계로서, 공업적인 생산에 최적인 숙주로 상기 유전자를 발현시킬 필요가 있지만, 대부분의 시도는 유전자 조작계가 확립된 대장균 등에서의 발현이고, 이 때에는 미생물을 배양한 후, 균체 내로부터 효소를 정제나 고정화하는 여분의 공정이 필요해진다. 로도코커스속이나 코리네박테리움속과 같이 세포벽이 딱딱하여 고농도의 아미드 화합물이나 니트릴 화합물 중에서도 세포 내의 효소의 활성을 유지할 수 있는 미생물 중에서 발현함으로써 이 문제를 해결할 수 있지만, 개개의 미생물에서 유전자 조작계를 개발하는 것은 곤란하다.

발현시키는 효소의 이화학적 성질로는 열 안정성 또는 기질인 니트릴 화합물이나 생성물인 아미드 화합물의 고농도 존재하에서도 높은 활성을 유지하는 니트릴히드라타제가 바람직하고, 동일한 목적의 보고도 있지만, 반응에 이용하는 효소의 실시 형태, 니트릴 화합물의 종류에 의해 이들의 절대값은 변동하는 경우도 있어서, 이 모두를 겸비한 효소는 발견되지 않았다.

또한, 니트릴 화합물에 의해 아미드 화합물을 공업적으로 제조할 때에는, 아미드 화합물의 제조 비용에 대해 차지하는 이 효소의 제조 비용이 중요한 문제여서, 보다 저렴하고 보다 단순한 배지에서의 배양법을 확립한 미생물을 이용하여 생산을 행하는 것이 바람직하므로, 이들 미생물을 숙주로서 이용한 유전자 재조합 균의 제조가 요망된다.

이 효소의 제조 비용이라는 과제에서는 배양이 용이할 뿐만 아니라, 균체당 이 효소의 발현량이 높은 유전자 조작계를 개발하는 것도 필수가 된다.

또한, 숙주 미생물의 내부에 존재하는 니트릴히드라타제 효소가 고농도의 아미드 화합물이나 니트릴 화합물 중에서도 안정적으로 존재할 수 있으면, 이 효소를 내부에 유지하는 고정화 담체로서 미생물을 간주할 수 있다. 이 경우, 고농도의 기질(니트릴 화합물) 중에서의 반응이 가능해지고, 최종적인 아미드 화합물의 축적 농도도 상승한다. 또한 효소의 취출이나 고정화 담체에의 결합이라는 조작을 생략하고, 미생물 자체를 반응의 촉매로서 사용할 수 있다.

즉, 본 발명의 목적은 열이나 고농도 화합물에 대한 안정성이 높은 니트릴히드라타제를 자연계로부터 단리하여 그 효소의 아미노산 서열 및 유전자 서열을 제공함으로써, 상기 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 상기 재조합 플라스미드를 이용하여 생산시의 비용적인 우위성을 갖는 숙주에서도 드문 효소의 발현량을 달성하는 형질 전환체를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 별도의 목적은 상기 형질 전환체를 배양·증식시키는 것에 의한 상기 형질 전환체를 이용한 이 효소의 생산 방법, 및 상기 형질 전환체를 이용한 니트릴 화합물로부터의 대응하는 아미드 화합물의 염가인 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 사이타마현의 온천 근방에 있는 토양으로부터 니트릴히드라타제 활성을 갖는 미생물로서, 지오바실루스·서모글루코시다시어스(Geobacillus thermoglucosidasius)를 발견하였다. 또한, 지오바실루스속의 미생물이 니트릴히드라타제를 갖고, 니트릴히드라타제 활성을 나타내는 것은 지금까지 알려져 있지 않으며, 본 미생물의 배양에 통상 이용하는 65 ℃라는 온도는 종래의 니트릴히드라타제를 갖는 호열균의 통상의 배양 온도(45 ℃ 내지 60 ℃)를 초과하는 것이고, 효소로서 아미드 화합물이나 니트릴 화합물에 대한 안정성을 겸비한다.

또한, 상기 미생물로부터 니트릴히드라타제 효소를 정제하니, 그 니트릴히드라타제 활성이 열이나 고농도의 니트릴 화합물 및 아미드 화합물에 대하여 높은 안정성을 겸비하는 것을 나타내었다. 또한, 정제한 효소의 각 서브 유닛의 N 말단의 아미노산 서열을 바탕으로 상기 미생물의 염색체 DNA로부터 니트릴히드라타제 유전자를 단리하고, 그 아미노산 서열 및 유전자 서열을 처음으로 명백하게 한 결과, 기존의 니트릴히드라타제와의 상동성은 매우 낮은 것이 판명되었다. 또한, 그 유전자 하류에 존재하는 활성화 단백질로 추정되는 유전자 서열과 동시에 발현함으로써, 이 효소를 대량으로 발현하는 유전자 재조합 균주를 제조하는 것에도 성공하였다. 또한, 이것을 더욱 완성도가 높은 발명으로 하기 위해서, 세포벽이 딱딱하고 미생물 자체를 효소의 고정화 담체와 같이 사용할 수 있는 로도코커스속에 속하는 미생물에 착안하여, 추가로 염가인 배지에서의 배양도 가능하여 공업 생산에 알맞은 미생물인 로도코커스·로도크로스 M33(Rhodococcus rhodochrous M33)주(VKM Ac-1515D)를 숙주로서, 이 효소를 드물게 대량 발현하는 유전자 재조합주를 제조하는 것에도 성공하였다. 한편, 이 결과로부터 로도코커스·로도크로스 M33주는 이종생물의 니트릴히드라타제를 발현하는 숙주로서 보편적인 가치를 갖는다고 증명할 수도 있었다.

즉, 본 발명에 따르면, 이하의 (1) 내지 (9)에 기재된 발명이 제공된다.

(1) 하기 (A) 또는 (B) 중 어느 하나에 기재된 DNA에 의해 형질 전환된 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물.

(A) 니트릴히드라타제의 α서브 유닛에 대응하는 서열 목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열과, 니트릴히드라타제의 β서브 유닛에 대응하는 서열 목록의 서열 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 목록의 서열 2에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 함유하는 DNA이며, 니트릴히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(B) 니트릴히드라타제의 α서브 유닛을 코드하는 염기 서열에 대응하는 서열 목록의 서열 3의 695 내지 1312번째의 염기 서열, 또는 해당 염기 서열에 대하여 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열과, 니트릴히드라타제의 β서브 유닛을 코드하는 염기 서열에 대응하는 서열 목록의 서열 3의 1 내지 681번째의 염기 서열, 또는 해당 염기 서열에 대하여 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 함유하는 DNA이며, 니트릴히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(2) 형질 전환에 의해 하기의 이화학적 성질을 갖는 단백질을 생산할 수 있는 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물.

(a) 니트릴히드라타제 활성을 갖는다.

(b) 기질 특이성: 아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n-발레로니트릴, n-부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 하여 활성을 나타낸다.

(c) 분자량: 적어도 하기 2종의 서브 유닛으로 구성되는 단백질이며, 각 서브 유닛의 환원형 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같다.

서브 유닛α 분자량: 25000±2000

서브 유닛β 분자량: 28000±2000

(d) 열 안정성: 수액 중의 효소를 70 ℃의 온도에서 30 분간 가열한 후에, 가열 전의 35 ％ 이상의 활성이 잔존한다.

(e) 6 중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 하여도, 그것 이하의 기질 농도시에 비해 활성이 감소하지 않는다.

(f) 35 중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 갖는다.

(3) 상기 (1)에 있어서, 형질 전환에 의해 하기의 이화학적 성질을 갖는 단백질을 생산할 수 있는 미생물.

(a) 니트릴히드라타제 활성을 갖는다.

서브 유닛α 분자량: 25000±2000

서브 유닛β 분자량: 28000±2000

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 로도코커스속에 속하는 미생물이 로도코커스·로도크로스 M33주(Rhodococcus rhodochrous M33)주(VKM Ac-1515D 또는 KCCM-10635) 및/또는 그 변이체인 미생물.

(5) 니트릴히드라타제 유전자에 의해 형질 전환된 로도코커스·로도크로스 M33주(Rhodococcus rhodochrous M33)주(VKM Ac-1515D 또는 KCCM-10635) 및/또는 그 변이체 중 어느 하나의 미생물.

(6) 하기 (A) 또는 (B) 중 어느 하나에 기재된 DNA에 의해 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물을 형질 전환하는 것을 포함하는, 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 미생물의 제조 방법.

(7) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 미생물을 배지에서 배양하는 것을 포함하는 니트릴히드라타제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.

(8) 상기 (7)에 기재된 제조 방법에 의해 제조되는 니트릴히드라타제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물.

(9) 상기 (8)에 기재된 니트릴히드라타제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물을 니트릴 화합물에 작용시켜, 상기 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 합성하는 것을 포함하는 아미드 화합물의 제조 방법.

본 발명의 미생물을 이용함으로써, 열이나 고농도의 니트릴, 아미드 화합물에 대하여 높은 안정성을 나타내는 니트릴히드라타제를 제조하는 것이 가능해지고, 이것을 이용함으로써 니트릴 화합물을 대응하는 아미드 화합물로 효율적이고, 염가로 변환하는 것이 가능해진다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명의 실시 형태에 대해서 상세히 설명한다.

우선, 본 발명에서 발현시키는 니트릴히드라타제에 대해서 설명한다. 본 발명에서 니트릴히드라타제 활성을 갖는다는 것은 아세토니트릴에서는 아세트아미드, n-프로피오니트릴에서는 n-프로피오아미드, 아크릴로니트릴에서는 아크릴아미드와 같이 니트릴 화합물에 수분자를 부가시켜 아미드 화합물로 변환하는 활성을 갖는 것을 의미한다. 또한, 생성된 화합물은 액체 크로마토그래피로 분취한 후, 가스 크로마토그래피/질량 분석(GC/MS), 적외 흡수 스펙트럼(IR) 및 핵 자기 공명 스펙트럼(NMR)을 이용하여 동정할 수 있다.

본 발명에서 니트릴히드라타제 활성을 측정할 때에는, 예를 들면 0.1 중량％의 니트릴 화합물 용액(0.05 M-인산 버퍼 pH 7.7) 1 ㎖에 니트릴히드라타제 효소 용액 10 ㎕를 첨가하고, 반응 온도 27 ℃ 내지 60 ℃에서 10 내지 60 분간 보온한 후, 0.1 ㎖의 1 규정 염산을 첨가함으로써 반응을 정지하고, 반응액의 일부를 액체 크로마토그래피로 분석하여, 아미드 화합물의 생성의 유무를 검정할 수 있다.

본 발명에서 기질이 되는 니트릴 화합물로는, 예를 들면 아세토니트릴, n-프로피오니트릴, n-부티로니트릴, 이소부티로니트릴, n-발레로니트릴, n-헥산니트릴 등의 지방족 니트릴 화합물, 2-클로로프로피오니트릴 등의 할로겐 원자를 포함하는 니트릴 화합물, 아크릴로니트릴, 크로토노니트릴, 메타크릴로니트릴 등의 불포화 결합을 포함하는 지방족 니트릴 화합물, 락토니트릴, 만데로니트릴 등의 히드록시니트릴 화합물, 2-페닐글리시노니트릴 등의 아미노니트릴 화합물, 벤조니트릴, 시아노피리딘 등의 방향족 니트릴 화합물, 말로노니트릴, 숙시노니트릴, 아디포니트릴 등의 디니트릴 화합물 등 및 트리니트릴 화합물을 들 수 있다.

본 발명에서의 니트릴히드라타제의 기질 특이성은 상술한 측정 조건에서 기질을 각종 변경하여 각각의 기질에 대하여 니트릴히드라타제 활성을 갖는지의 여부를 측정함으로써 판단할 수 있다. 기질 특이성이 넓으면, 제조할 수 있는 대응하는 아미드 화합물의 종류도 증가되어 바람직하지만, 본 효소는 적어도 아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n-발레로니트릴, n-부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 할 수 있다.

본 발명에서의 니트릴히드라타제로서, 보다 바람직하게는 서열 목록의 서열 1에 표시되는 205개의 아미노산 서열에 의해 표시되는 α서브 유닛 및 서열 목록의 서열 2에 표시되는 226개의 아미노산 서열에 의해 표시되는 β서브 유닛에 의해 구성되는 것을 바람직한 예로서 들 수 있다. 이 둘의 서브 유닛 이외에도 금속이나 다른 펩티드 등을 함유할 수도 있다. 금속으로는 특히 철이나 코발트를 함유하는 경우가 많다. 또한, 이 서브 유닛 중 어느 하나를 함유하는 단백질일 수도 있다. 또한, 각각의 서브 유닛의 아미노산 서열로는 다른 서브 유닛과 복합체를 형성하여 니트릴히드라타제 활성을 갖는 한, 상기한 서열 목록의 서열 1 또는 2에 기재한 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 가질 수도 있고, 숙주의 종류에 따라 번역 후에 수식을 받는 것도 당연히 예상된다. 특히, 니트릴히드라타제의 α서브 유닛에서는 시스테인 잔기가 번역 후, 시스테인술핀산 또는 시스테인술펜산으로 수식되는 경우가 많다. 상기 아미노산 서열 중 1 내지 30개 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 또는 번역 후 수식되어 있는 아미노산 서열도 바람직한 예로서 들 수 있고, 치환, 결실, 삽입, 또는 번역 후 수식을 받는 아미노산의 개수는, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 가장 바람직하게는 1 내지 3개이다. 또한, 이러한 치환, 결실, 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 갖는 니트릴히드라타제 효소는 공지된 부위 특이적 변이 도입법, 예를 들면 문헌 [Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]에 기재된 방법에 의해, 염기 서열의 대응하는 부위에 치환, 결실, 또는 삽입을 도입시킨 DNA를 이용하여, 후술한 바와 같이 숙주 미생물에 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있고, 열 안정성이나 유기 용매 내성의 향상이나 기질 특이성의 변화 등의 산업상 바람직한 성질을 부가한 변이 효소를 제조하는 시도도 가능하다. 이러한 기술 수준을 감안하여 이들이 니트릴히드라타제 활성을 갖고 있는 경우는 본 발명에 포함하게 된다.

본 발명에서의 니트릴히드라타제로는 환원형 SDS(소듐도데실술페이트)-폴리아크릴아미드 전기 영동법에 의해 분자량 25000±2000과 분자량 28000±2000의 둘의 서브 유닛이 쿠마시 브릴리언트 블루에 의한 염색에 의해서 검출되는 것이 예시되고, 전자를 α서브 유닛, 후자를 β서브 유닛이라 부른다.

니트릴히드라타제는 활성 측정에 앞서서 유기산 등의 안정화제가 없는 상태로 70 ℃에서 30 분간 가열 처리한 후에도, 가열 전의 활성의 35 ％의 활성을 유지할 수 있다.

또한, 고농도의 니트릴 기질은 화학적으로 효소를 실활시키는 것이 보고되고 있지만, 본 발명에서의 니트릴히드라타제는 6 중량％의 아크릴로니트릴을 기질로서 이용하여도 이러한 현상이 관찰되지 않는다.

또한, 고농도의 반응 생성물인 아미드 화합물이 반응을 저해하는 것이 보고되어 고농도의 반응산물을 얻을 때에 큰 문제가 되지만, 상기 니트릴히드라타제는 35 중량％의 아크릴아미드를 활성 측정 용액에 첨가하여도 기질인 아크릴로니트릴 농도의 감소가 유의하게 보여 활성을 유지한다.

상기한 바와 같은 이화학적 성질을 갖는 니트릴히드라타제는, 예를 들면 지오바실루스속에 속하는 미생물을 배양함으로써 취득할 수 있고, 지오바실루스속에 속하는 미생물로는, 지오바실루스·칼독시로실리티커스(Geobacillus caldoxylosilyticus), 지오바실루스·카우스토필러스(Geobacillus kaustophilus), 지오바실루스·리투아니커스(Geobacillus lituanicus), 지오바실루스·스테아로서모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 지오바실루스·서브테라네우스(Geobacillus subteraneus), 지오바실루스·서모카테눌라터스(Geobacillus thermocatenulatus), 지오바실루스·서모데니트리피칸스(Geobacillus thermodenitrificans), 지오바실루스·서모글루코시다시어스(Geobacillus thermoglucosidasius, 지오바실루스·서모레오보란스(Geobacillus thermoleovorans), 지오바실루스·토에비(Geobacillus toebii), 지오바실루스·유제넨시스(Geobacillus uzenensis)를 들 수 있다. 또한, 지오바실루스속 유래의 미생물에 특별히 한정되는 것은 아니고, 다른 미생물주 유래의 니트릴히드라타제 유전자도 포함된다. 이러한 미생물주로는 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 에로모나스(Aeromonas)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 에르위니아(Erwinia)속, 크산토박터(Xanthobacter)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 시노리조븀(sinorhizobium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 바실루스(Bacillus)속, 마이크로코커스(Micrococcus)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속, 리조븀(Rhizobium)속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에서는 하기의 수법으로 스크리닝을 행하였다. 우선, 여러 가지 장소에서 채취한 토양을 소량 취하여, 물 또는 생리 식염수를 넣은 시험관 내에 넣고 2일부터 14일간 65 ℃의 진탕 배양기 중에서 진탕 배양한다. 이 배양액의 일부를 취하여 범용적인 미생물 생육용 배지, 예를 들면 글리세롤, 폴리펩톤, 효모 추출물 등을 주성분으로 한 액체 배지에 넣고, 65 ℃의 배양 온도에서 1일부터 7일간 정도 배양한다. 이에 따라 얻어지는 배양액의 일부를 상술한 미생물 생육용 배지 성분을 포함하는 한천 평판 배지에 펼쳐서 65 ℃에서 추가로 배양하여 콜로니를 형성시킴으로써 미생물을 단리할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 미생물을, 상기 배지 성분에 추가로 n-발레로니트릴 등의 니트릴 화합물 또는 메타크릴아미드 등의 아미드 화합물을 첨가한 액체 배지를 넣은 시험관 또는 플라스크를 이용하기 적당한 기간, 예를 들면 약 12 시간부터 7일 정도간, 65 ℃의 배양 온도에서 진탕 배양함으로써 증식시키고, 상기한 니트릴히드라타제 활성 측정법에 기초하여 목적으로 하는 미생물을 선택한다. 이러한 미생물의 대표적 균주의 동정을 16 SrRNA 및 하기의 생화학적 성질로부터 행한 바, 지오바실루스· 서모글루코시다시어스(Geobacillus thermoglucosidasius)인 것이 판명되었다. 이 균주는 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6(Geobacillus thermoglucosidasius Q-6)의 명칭으로, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-1-1 주오 다이6(우편 번호 305-8566))에 번호 FERM P-19351(수리일 2003년 5월 16일)로서 기탁되고, FERM BP-08658로서 부타페스트 조약에 기초하는 기탁으로 이관되었다(수령일 2004년 3월 11일). 여러 가지 특허·문헌 조사를 행했지만, 지오바실루스·서모글루코시다시어스에 속하는 미생물에 관해서 니트릴히드라타제 활성을 갖는 것에 관해서는 아무런 기재도 없었다. 이에 따라 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주는 신균주라 인정된다. 또한, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 성질은 하기와 같다.

(a) 형태적 성질

배양 조건: Nutrient Agar(Oxoid, England, UK) 배지 60 ℃

1. 세포의 형태 및 크기

형태: 간균(桿菌)

크기: 0.8×2.0 내지 3.0 ㎛

2. 세포의 다형성의 유무: -

3. 운동성의 유무: +

편모의 착생 상태: 주모

4. 포자의 유무: -

포자의 부위: 단립

(b) 배양적 성질

배양 조건: Nutrient Agar(Oxoid, England, UK) 배지 60 ℃

1. 색: 크림색

2. 광택: +

3. 색소 생산: -

배양 조건: Nutrient broth(Oxoid, England, UK) 배지 60 ℃

1. 표면 발육의 유무: -

2. 배지의 혼탁의 유무: +

배양 조건: 젤라틴 천공 배양 60 ℃

1. 생육 상태: +

2. 젤라틴 액화: +

배양 조건: 리트머스·밀크 60 ℃

1. 응고: -

2. 액화: -

(c) 생리학적 성질

1. 그람 염색: 부정

2. 질산염의 환원: -

2. 탈질 반응: -

3. MR 테스트: -

4. VP 테스트: -

5. 인돌의 생성: -

6. 황화수소의 생성: -

7. 전분의 가수분해: -

8. 시트르산의 이용

Koser: -

Christensen: -

9. 무기 질소원의 이용

질산염: -

암모늄염: +

10. 색소의 생성: -

11. 우레아제 활성: -

12. 옥시다아제: +

13. 카탈라제: +

14. 생육의 범위

pH: 5.5 내지 8.0

온도: 45 ℃ 내지 72 ℃

15. 산소에 대한 태도: 통성 혐기성

16. O-F 테스트: -/-

(d) 당류로부터의 산 생산/가스 생산

1. L-아라비노스 -/-

2. D-크실로스 +/-

3. D-글루코스 +/-

4. D-만노스 +/-

5. D-플루투스 +/-

6. D-갈락토스 -/-

7. 말토스 +/-

8. 수크로스 +/-

9. 락토스 -/-

10. 트레할로스 +/-

11. D-소르비톨 -/-

12. D-만니톨 +/-

13. 이노시톨 -/-

14. 글리세린 -/-

(e) 그 밖의 성질

1. β-갈락토시다제 활성: -

2. 아르기닌디히드롤라제 활성: -

3. 리신데카르복시라제 활성: -

4. 트립토판디아미나제 활성: -

5. 젤라티나제 활성: +

본 발명에서의 니트릴히드라타제의 아미노산 서열 정보를 취득하기 위해서는, 이 효소를 미생물로부터 정제한 후, 환원형 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 각 서브 유닛을 분리한 후, 겔로부터 각 밴드를 잘라내어 단백질 시퀀서에 의해 아미노산 서열의 일부를 결정할 수 있다.

구체적으로는, 서열 목록의 서열 3의 염기 서열의 695-1312위치를 포함하는 DNA와 서열 목록의 서열 3의 염기 서열의 1-681위치를 포함하는 DNA가 예시되고, 각각이 α서브 유닛과 β서브 유닛을 코드하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니고, 이 염기 서열을 포함하는 DNA이면 된다. 또한 이들 배열과 상보적인 염기 서열을 포함하는 DNA에 대하여, 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA여도 니트릴히드라타제 활성을 갖는 한 본 발명에 포함된다. 즉, 이들 DNA를 이용하여 본 발명의 니트릴히드라타제를 발현할 수 있다. 엄격한 조건하로서는, 예를 들면 ECL 직접 핵산 표지 및 검출 시스템(아마샴 파마시아 바이오테크사 제조)을 이용하여 메뉴얼에 기재된 조건(세정: 42 ℃, 0.5xSSC를 포함하는 1차 세정 버퍼)이 예시된다. 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA로는, 예를 들면 상술한 엄격한 조건하에 서열 목록의 서열 3의 염기 서열의 695-1312위치를 포함하는 DNA 또는 서열 목록의 서열 3의 염기 서열의 1-681위치를 포함하는 DNA에서의 상보적인 염기 서열의 임의의, 통상은 20개 이상, 바람직하게는 50개 이상, 특히 바람직하게는 100개 이상의 연속한 염기 서열을 검출시료로 하고 이것에 하이브리다이즈하는 DNA가 예시된다.

본 발명에 이용하는 니트릴히드라타제를 코드하는 DNA는 이하의 방법에 의해서 얻을 수 있다. 본 명세서에서 특별히 기재가 없는 한 해당 분야에서 공지된 유전자 재조합 기술, 재조합 단백질의 생산 기술, 분석법이 채용된다.

본 발명에 이용하는 니트릴히드라타제를 코드하는 DNA는 본원 명세서에서 개시되는 염기 서열, 또는 아미노산 서열, 경우에 따르면 상기한 정제 효소로부터 결정한 아미노산 서열 등의 배열 정보에 따라서, 본 발명의 니트릴히드라타제를 함유하는 미생물, 예를 들면 서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 취득할 수 있다. 아미노산 서열에 따라서 합성된 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 이용하고, 니트릴히드라타제를 함유하는 미생물의 염색체 DNA를 제한 효소에 의해 소화한 DNA 단편을 파지나 플라스미드에 도입하고, 숙주를 형질 전환하여 얻어지는 라이브러리로부터 플라크 하이브리다이제이션이나 콜로니 하이브리다이제이션 등에 의해 본 발명의 니트릴히드라타제를 코드하는 DNA를 얻을 수도 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드를 프로브로 하지 않고, 상기한 정제 효소로부터 결정한 양 서브 유닛의 N 말단의 아미노산 서열 정보 등에 따라서 프라이머를 제조하여 니트릴히드라타제 유전자의 일부를 PCR 반응에 의해 증폭한 것을 프로브로 하여 동일한 과정을 행할 수도 있다. 얻어진 DNA는 플라스미드 벡터, 예를 들면 pUC118에 삽입하여 클로닝하고, 디데옥시·터미네이터법(Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 74: 5463-5467, 1977) 등의 주지된 방법에 의해 염기 서열의 결정을 행할 수 있다. 이와 같이 하여 제조된 유전자는, 상기 유전자를 이용하여 형질 전환한 대장균 숙주 중 발현 산물에 상기에 기재한 활성 측정법을 이용함으로써, 니트릴히드라타제를 코드하는 DNA인 것을 확인할 수 있다.

이러한 성질을 갖는 니트릴히드라타제를 코드하는 DNA를 이용하여 공업 생산에 알맞은 미생물을 형질 전환한다. 보다 생산에 적합한 공업 미생물로는 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물이 바람직하다. 형질 전환에는 상기한 DNA가 벡터에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 이용한다.

본 발명에 이용하는 재조합 벡터는, 숙주 미생물에 알맞은 프로모터 영역의 하류에 상기 방법으로 얻어진 DNA의 5' 말단측이 기능할 수 있도록 연결하고, 필요에 따라서 그 하류에 전사 종결 배열을 삽입하고, 적절한 발현용 벡터로 조립하여 제조할 수 있다.

적절한 발현 벡터는 숙주 미생물 내에서 복제 가능하면 특별히 한정되지 않는다. 벡터는 pK4, pRF30, pBS305, pRE-7 등, 통상 로도코커스에서 사용되는 벡터 중으로부터 선택할 수 있다. 발현 벡터에 이용하는 프로모터로는 니트릴라제 유전자, 니트릴히드라타제 유전자 등의 높은 발현량을 기대할 수 있는 프로모터가 바람직하지만 이것으로 한정되지 않는다. 또한, 염색체에 유전자 삽입이 가능한 숙주이면, 상기 숙주에서 자율 복제 가능한 영역을 가질 필요는 없다. 또한, α서브 유닛 유전자 및 β서브 유닛 유전자가 각각의 프로모터로부터 독립적인 시스트론으로서 발현되거나, 공통의 프로모터에 의해 폴리시스트론으로서 발현될 수도 있다. 또한, 독립적인 시스트론의 경우, 각각의 서브 유닛 유전자가 별도의 벡터 상에 있을 수도 있다. 이 경우에는 α서브 유닛 유전자를 포함하는 제1 발현 벡터와 β서브 유닛 유전자를 포함하는 제2 발현 벡터의 2종의 발현 벡터를 이용하여 숙주의 형질 전환을 행하게 된다. 또한 상기한 재조합 벡터에, 필요에 따라서 니트릴히드라타제의 활성화에 필요한 아미노산 서열(일본 특허 제3408737호, 및 문헌[Journal of Biochemistry 125:696-704(1999)])을 발현하는 DNA를 공존시키는 경우도 있다. 구체적으로는, 상기와 마찬가지로 발현에 필요한 프로모터나 전사 종결 인자 등을 포함하는 플라스미드 벡터를 이용하고, 니트릴히드라타제의 활성화에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자, 니트릴히드라타제의 α서브 유닛 유전자 및 β서브 유닛 유전자가 각각 독립적인 시스트론으로서 발현되거나, 공통의 제어 영역에 의해 폴리시스트론으로서 발현될 수도 있다. 마찬가지로 각각의 유전자가 별도의 벡터 상에 있을 수도 있다.

상기 방법으로 제조한 발현 벡터를 이용하여 숙주 미생물을 형질 전환함으로써, 목적으로 하는 니트릴히드라타제를 발현시킬 수 있다. 숙주 미생물에의 유전자의 도입법으로는, 예를 들면 형질 전환, 형질 도입, 접합 전달, 또는 전기 천공 등의 당 기술 분야에서 주지된 임의의 통상법에 의해서 바람직한 숙주에 도입할 수 있다.

또한, 니트릴히드라타제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법으로는, 상술한 바와 같이 상기 니트릴히드라타제를 생산할 수 있는 형질 전환된 미생물, 즉 로도코커스속의 미생물, 특히 바람직하게는 로도코커스·로도크로스 M33(Rhodococcus rhodochrous M33)주(VKM Ac-1515D 또는 KCCM-10635)를 배양에 의해 증식시키고, 그 배양물 중으로부터 니트릴히드라타제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물을 취득할 수 있다.

본 발명의 형질 전환체는 이들 미생물이 자화 가능한 영양원을 포함하는 배지에서 배양하는 것이 바람직하고, 예를 들면 효소나 항생 물질 등을 생산하는 통상의 방법으로 배양할 수 있다. 배양은 통상 액체 배양이거나 고체 배양일 수도 있다. 예를 들면, 글루코스, 수크로스 등의 탄수화물; 소르비톨, 글리세롤 등의 알코올; 시트르산, 아세트산 등의 유기산; 대두유 등의 탄소원 또는 이들 혼합물; 효모 추출물, 육류 추출물, 황산암모늄, 암모니아 등의 질소 함유 무기 유기 질소원; 인산염, 마그네슘, 철, 코발트, 망간, 칼륨 등의 무기 영양원; 및 비오틴, 타이민 등의 비타민류를 적절하게 혼합한 배지가 이용된다. 보다 바람직하게는 이러한 배지 성분에 Fe 이온 또는 Co 이온을 0.1 ㎍/㎖ 이상 존재시킬 수 있다. 배양 조건은 통상 호기 조건하에서 행하는 것이 바람직하다. 배양 온도는 숙주 미생물을 생육할 수 있는 온도이면 특별히 제한은 없지만, 통상 5 ℃ 내지 80 ℃, 바람직하게는 20 내지 70 ℃, 더욱 바람직하게는 약 37 ℃에서 행하는 것이 예시된다. 또한, 배양 도중의 pH는 숙주 미생물이 생육할 수 있는 pH이면 특별히 제한은 없지만, 통상 pH 3 내지 9, 바람직하게는 pH 5 내지 8, 더욱 바람직하게는 pH 6 내지 7로 행하는 것이 예시된다.

본 발명에서는, 숙주 미생물로서 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물을 사용한다. 숙주 미생물로서 사용하는 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 로도코커스·로도크로스(Rhodococcus rhodochrous), 로도코커스·루버(Rhodococcus ruber), 로도코커스·에리스로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 로도코커스·루브로퍼팅터스(Rhodococcus rubropertinctus) 등을 들 수 있다.

로도코커스·로도크로스 M33(Rhodococcus rhodochrous M33)주(VKM Ac-1515D 또는 VKPM S-1268)를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 숙주 미생물로서 로도코커스·로도크로스 M33주(Rhodococcus rhodochrous M33)주(VKM Ac-1515D 또는 VKPM S-1268)가 특히 바람직한 이유는 로도코커스속 전반의 특징으로서 세포벽이 두껍고, 상기한 아미드 화합물의 제조에서, 배양으로 얻은 균체를 그대로 니트릴 화합물과 반응시킴으로써 동일한 균을 가진 니트릴히드라타제의 작용으로 46 ％(중량/액량)의 아크릴아미드의 축적이 보고되고 있기 때문이다(미국 특허 제5,827,699호). 또한, 로도코커스·로도크로스 J1주을 비롯하여 통상의 미생물은 효모 추출물, 육류 추출물, 비타민이라는 고가의 영양소를 포함하는 배지를 충분한 생육에 필요로 하는 것에 비하여 로도코커스·로도크로스 M33주는 간단하고 염가인 합성 배지로 배양할 수 있다는 큰 이점을 갖고 있다. 또한, 편의상 본 특허에서는 러시아 과학 아카데미 미생물 생화학 및 생리학 연구소(Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of The Russian Academy of Science(IBFM))에 기탁시(1993년 12월 6일)의 로도코커스·로도크로스라는 명칭을 M33주에 이용하고 있지만, DNA-DAN 하이브리다이제이션(일본 세균 학회지 55(3) 545-584, 2000)의 결과, 본주는 로도코커스·로도크로스종이 아니고, 로도코커스·루버종에 가까운 신종일 가능성이 높다. 본주는 한국 미생물 배양소(Korean Culture Center of Microorganisms)(대한민국 120-091 서울시 서대문구 홍제1동 유림 빌딩 361-221)에 수탁번호 KCCM-10635(수령일: 2004년 12월 10일)로서 부타페스트 조약에 기초하여 기탁되었다.

본 발명에서는, 로도코커스·로도크로스 M33주(Rhodococcus rhodochrous M33)주(VKM Ac-1515D, VKPM S-1268 또는 KCCM-10635)의 변이체를 숙주 미생물로서 사용할 수도 있다. 변이체로는 니트릴히드라타제 유전자에 의한 형질 전환을 행한 경우에, 도입된 니트릴히드라타제 유전자를 발현하여 니트릴히드라타제를 생산할 수 있는 한, 상기 로도코커스·로도크로스 M33주로부터 유도되는 임의의 변이체를 사용할 수 있다. 구체적으로는 자연 변이, 또는 화학적 변이제 또는 자외선 등에 의한 인공 변이를 받은 변이체 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에서는 본 발명의 형질 전환체를 배지에서 배양함으로써 제조되는 니트릴히드라타제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물을 니트릴 화합물에 작용시키고, 상기 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 합성할 수 있다. 이 경우, 상술한 효소를 이용할 때에는, 해당 효소의 작용을 저해하지 않는 한 특별히 정제 정도 등은 한정되지 않고, 정제된 본 발명의 효소 이외에 그 효소 함유물이 이용되고, 또한 그 효소를 생산하는 미생물이나 그 효소의 유전자를 도입하여 형질 전환된 형질 전환체 등을 사용할 수도 있다. 미생물이나 형질 전환체 등을 사용하는 경우에는 균체를 이용할 수도 있고, 균체로는 생균체, 또는 아세톤이나 톨루엔 등의 용매 처리 또는 동결 건조 등의 처리를 실시하여 화합물의 투과성을 증가시킨 균체를 사용할 수 있다. 경우에 따라서는 균체 파쇄물이나 균체 추출물 등의 효소 함유물로 되어 있을 수도 있다. 이 효소를 함유하는 균체 처리물의 제조 방법을 예시하면, 우선 배양물을 고액 분리하고, 얻어지는 습균체를 필요에 따라서 인산 완충액이나 트리스염산 완충액 등의 완충액에 현탁시키고, 이어서 초음파 처리, 프렌치 프레스 처리나 유리 비드를 이용하는 분쇄 처리, 또는 리소자임이나 프로테아제 등의 세포벽 용해 효소에 의한 처리 등의 균체 파쇄 처리를 적절하게 조합하여 균체 내에서 이 효소를 추출하여, 조제(粗製)의 니트릴히드라타제 함유액을 얻을 수 있다. 이 조제의 효소 함유액을 필요에 따라 공지된 단백질, 효소 등의 단리, 정제 수단을 이용함으로써 추가로 정제할 수 있다. 예를 들면, 조제의 효소 함유액에 아세톤, 에탄올 등의 유기 용매를 첨가하여 분별 침전시키거나, 황산암모늄 등을 첨가하여 염석시켜, 수용액으로부터 니트릴히드라타제를 함유하는 구분을 침전시켜 회수하는 방법이 예시된다. 또한, 음이온 교환, 양이온 교환, 겔 여과, 항체나 킬레이트를 이용한 어피니티-크로마토그래피 등을 적절하게 조합하여 정제할 수 있다. 물론, 효소나 균체, 효소를 함유하는 균체 처리물 등은 공지된 방법에 의해 칼럼에 충전되어 있거나, 담체에 고정화되어 있거나, 특히 균체의 경우는 폴리아크릴아미드겔 등의 고분자 중에 포매(抱埋)되어 있을 수도 있다. 균체 또는 균체 처리물을 물 또는 인산 완충액 등의 완충액 등의 수성 수용액에 현탁하고, 이것에 니트릴 화합물을 첨가함으로써 반응을 진행시킨다. 사용하는 균체 또는 균체 처리물의 농도는 0.01 중량％ 내지 20 중량％, 바람직하게는 0.1 중량％ 내지 10 중량％이다. 반응 온도의 상한은 바람직하게는 90 ℃, 더욱 바람직하게는 85 ℃, 한층 바람직하게는 70 ℃를, 반응 온도의 하한은 예를 들면 1 ℃, 바람직하게는 4 ℃, 더욱 바람직하게는 10 ℃를, 반응 pH는 예를 들면 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 8을, 반응 시간은 예를 들면 10 분간 내지 72 시간을 들 수 있다. 또한, 니트릴 화합물을 서서히 적하함으로써, 아미드 화합물을 고농도로 생성 축적시킬 수도 있다. 반응액으로부터 아미드 화합물을 회수하는 것에는 균체나 균체 처리물 등을 여과나 원심 분리 등으로 제거한 후, 결정 석출 등의 수법으로 취출하는 방법 등이 있다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: 균체 분리

사이타마현의 온천 근방에서 채취한 토양을 소량(약 1 g) 취해서 생리식염수를 5 ㎖ 넣은 시험관 내에 넣고, 3 일간 65 ℃의 진탕 배양기 중에서 진탕 배양하였다. 이 배양액의 일부(0.5 ㎖)를 취하여, 글루코스 1.0 중량％, 폴리펩톤 0.5 중량％, 효모 추출물 0.3 중량％를 포함하는 배지(pH 7.0)에 첨가하고, 2일간 65 ℃에서 왕복 진탕 배양하였다. 이에 따라 얻어지는 배양액의 일부(0.1 ㎖)를 상술한 배지 성분을 포함하는 한천 평판 배지에 펼쳐서 65 ℃에서 추가로 2일간 배양하여 콜로니를 형성시킴으로써 미생물을 단리하였다. 단리한 미생물을 상기와 동일한 조성의 배지에 0.1 중량％의 n-발레로니트릴을 첨가한 액체 배지에 접종한 후, 65 ℃에서 24 시간 동안 배양함으로써, 니트릴 자화성이 높은 미생물을 갖는 배양액을 얻었다. 이 배양액 1 ㎖를 9 ㎖의 1.1 중량％의 아크릴로니트릴 용액(0.05 M-인산 버퍼 pH 7.7)에 첨가하고 반응 온도 27 ℃에서 반응을 개시하였다. 10 분 후, 1 ㎖의 1 규정 염산을 첨가함으로써 반응을 정지하였다. 반응액의 일부를 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하여 아크릴아미드 생성의 유무를 검정함으로써, 니트릴히드라타제 활성을 갖는 미생물을 스크리닝하였다. 이와 같이 하여 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 변환시키는 수화 활성을 갖는 미생물로서 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주를 얻었다.

(액체 크로마토그래피 분석 조건)

본체: HITACHI D-7000(히따찌사 제조)

칼럼: Inertsil ODS-3(GL 사이언스사 제조)

길이: 200 mm

칼럼 온도: 35 ℃

유량: 1 ㎖/분

샘플 주입량: 10 ㎕

용액: 0.1 중량％ 인산 수용액

실시예 2: 지오바실루스 · 서모글루코시다시어스 Q-6주 균체 중 니트릴히드라타제 활성의 측정과 그 온도 의존성

글리세롤 0.2 중량％, 시트르산3나트륨2수화물 0.2 중량％, 인산2수소칼륨 0.1 중량％, 인산수소2칼륨 0.1 중량％, 폴리펩톤 0.1 중량％, 효모 추출물 0.1 중량％, 염화나트륨 0.1 중량％, n-발레로니트릴 0.1 중량％, 황산마그네슘7수화물 0.02 중량％, 황산철(II)7수화물 0.003 중량％, 염화코발트6수화물 0.0002 ％를 포함하는 멸균된 배지(pH 7.0) 100 ㎖를 500 ㎖ 3각 플라스크에 넣은 것에 미리 동일한 배지에서 배양한 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 배양액 1 ㎖를 식균하였다. 이것을 65 ℃에서 1일간, 200 스트로크/분으로 회전 진탕 배양하여 균체 배양액을 얻었다. 이 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 균체 배양액 300 ㎖로부터 원심 분리(10000×g, 15 분)에 의해서 균체를 모으고, 0.05 M 인산 완충액(pH 7.5)으로 세정한 후, 동일한 완충액 50 ㎖에 현탁하였다. 이와 같이 해서 제조한 균체 현탁액에 대해서, 하기 표 1에 나타낸 반응 온도에서 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 변환시키는 수화 활성을 측정하였다. 효소 활성의 단위(유닛)를 1 분간 1 ㎛ol의 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환하는 활성을 1 유닛(이하, U라 기재함)이라 정하면, 27 ℃에서의 습균체 중량당 니트릴히드라타제 활성(U/mg)은 9.37 U/mg이었다. 또한 10 ℃에서 5 U/㎖가 되도록 0.5 중량％의 아크릴로니트릴을 포함하는 균체 현탁액을 조정하고, 이 균체 현탁액을 이용하여 30 ℃, 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃의 조건에서 마찬가지로 니트릴히드라타제 활성을 구하여 표 1에 나타내었다. 그 결과, 균체를 반응에 이용했을 때의 지적 온도는 60 ℃ 근방에 있고, 고온 영역에서 특히 높은 활성을 나타내었다.

실시예 3: 지오바실루스 · 서모글루코시다시어스 Q-6주 균체 중 니트릴히드라타제의 열 안정성

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 균체 중에 있는 니트릴히드라타제의 활성의 열 안정성을 조사하기 위해서, 실시예 2의 배양법에서 얻은 균체를 10 U/㎖가 되도록 증류수에 현탁하고, 30 분간 소정 온도에서의 보온 처리를 행하고 잔존 활성을 측정하였다. 0.5 ㎖의 1 중량％ 아크릴로니트릴 용액(0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.5)에 0.5 ㎖의 보온 처리 후의 균체액을 첨가하고, 27 ℃에서 교반하면서 반응을 개시하였다. 5 분 후, 100 ㎕의 1 규정 염산을 첨가함으로써 반응을 정지하였다. 보존 처리 전의 활성에 대한 보존 처리 후의 활성을 산출하여, 보존 처리 전의 활성을 기준(100)으로 한 환산값으로서 하기 표 2에 나타낸다. 이 결과에 따르면 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 균체 중 니트릴히드라타제의 효소 활성은 고온하에서도 안정적으로 유지되고, 70 ℃라는 고온하에서도 80 ％ 이상의 활성을 유지할 수 있고, 80 ℃의 고온하에서도 30 ％ 이상의 활성을 유지할 수 있다.

실시예 4: 각종 니트릴 화합물에 대한 반응

하기 표 3에 나타내고 있는 각종 니트릴 화합물을 대응하는 아미드 화합물로 변환시키는 니트릴히드라타제 활성에 대해서 조사하였다. 9 ㎖의 1.1 ％ 니트릴 용액(0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.5)에 1 ㎖의 균체 현탁액을 첨가하고 반응 온도 30 ℃에서 반응을 개시하였다. 10 분 후, 1 ㎖의 1 규정 염산을 첨가함으로써 반응을 정지하였다. 그 결과, 모두 니트릴히드라타제 활성을 갖고 있었다.

실시예 5 이후에 기재된 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주 유래의 니트릴히드라타제 α서브 유닛(ORF2), β서브 유닛(ORF1) 및 니트릴히드라타제 활성화 인자(ORF3)의 아미노산 서열 및 염기 서열을 해명하는 것에 이른 본 발명의 흐름을 이하에 요약하였다.

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주를 배양하여 얻어진 균체를 파쇄후, 황산암모늄 침전, 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, DEAE 칼럼, 히드록시아파타이트 칼럼에 제공하고, 겔 여과 크로마토그래피 투석을 행하여 니트릴히드라타제 효소를 정제하였다.

정제한 니트릴히드라타제의 α서브 유닛 및 β서브 유닛의 N 말단 약 30 잔기의 아미노산 서열을 결정하고, 상기 균의 속에 기초하는 아미노산의 코돈 사용을 고려하여 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 축중 프라이머를 제조하고, 상기 균체로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로서 축중 PCR을 행하여 증폭 DNA 단편을 취득하였다. 증폭된 DNA 단편을 클로닝하여 삽입 단편의 염기 서열을 결정하였다. 상기 염기 서열로부터 추정되는 아미노산 서열과, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 정제한 니트릴히드라타제 α서브 유닛 및 β서브 유닛의 N 말단 아미노산 서열을 비교하여 클로닝된 배열이 니트릴히드라타제를 코드하고 있는 것을 확인하였다.

그 결과, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주에서, 5' 말단측 상류로부터 니트릴히드라타제 유전자는 β서브 유닛, α서브 유닛의 순서대로 인접하여 존재하는 것이 명백해졌다.

공지된 여러 가지 니트릴히드라타제 α서브 유닛의 하류 유전자에서의 상동성이 높은 배열로부터, 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 축중 프라이머를 제조하고, 상기 균체로부터 추출한 염색체 DNA를 주형으로서 축중 PCR을 행하여 증폭 DNA 단편을 취득하였다. 얻어진 상기 균의 α서브 유닛 부분의 증폭 DNA 단편을 클로닝하여 염기 서열을 결정하였다.

이상으로부터 취득된 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛 및 β서브 유닛을 적당한 발현 벡터에 도입하였다. 구축한 발현 플라스미드를 이용하여 적당한 숙주균을 형질 전환하였다. 숙주의 예로는, 로도코커스속, 코리네속, 대장균 등을 들 수 있다. 바람직하게는 아미다제를 갖고 있지 않은 숙주가 좋다. 또한, 얻어진 형질 전환체를 배양하여 얻은 균체와 아크릴로니트릴을 수성 매체 중에서 접촉시킴으로써 아크릴아미드가 생성되는 것을 확인하고, 그 생성 효율 및 니트릴히드라타제 활성을 비교하였다.

이어서, 상기로부터 얻어진 DNA 단편을 프로브로 하여 콜로니 하이브리다이제이션을 행하고, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛 및 β서브 유닛의 하류 유전자를 포함하는 주변 유전자를 클로닝하였다.

하류 유전자를 니트릴히드라타제 α서브 유닛 및 β서브 유닛과 함께 발현시켜 니트릴히드라타제 활성을 비교하였다. 그 결과, 하류 유전자가 니트릴히드라타제 활성을 현저히 상승시키는 활성화에 관여하는 유전자인 것을 발견하였다.

실시예 5: 정제 효소의 이화학적 성질

〔공정 1〕니트릴히드라타제 효소의 정제

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주를 배양하여 여러 가지 칼럼에 제공함으로써 니트릴히드라타제 활성 획분을 정제하였다.

크로마토그래피에서의 니트릴히드라타제 활성 획분의 측정 방법은 이하와 같이 행하였다. HEPES 버퍼(100 mM, pH 7.2)에 의해 희석한 각 획분의 용출액에 1 중량％의 아크릴로니트릴을 첨가하여 27 ℃에서 1 분간 반응시켰다. 1 N HCl을 10 액량％ 반응액에 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 생성된 아크릴아미드 농도를 상술한 HPLC 분석법에 의해 측정하였다.

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주 유래 니트릴히드라타제 효소를 정제하기 위해서, 우선 0.1 중량％의 n-발레로니트릴을 함유하는 V/F 배지(글리세롤 0.2 중량％, 시트르산3나트륨2수화물 0.2 중량％, 인산2수소칼륨 0.1 중량％, 인산수소2칼륨 0.1 중량％, 폴리펩톤 0.1 중량％, 효모 추출물 0.1 중량％, 염화나트륨 0.1 중량％, n-발레로니트릴 0.1 중량％, 황산마그네슘7수화물 0.02 중량％, 황산철(II)7수화물 0.003 중량％, 염화코발트6수화물 0.0002 중량％)에 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주를 식균하고, 65 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양에는, 96개의 구멍이 있는 2 ㎖의 심저 플레이트(COSTAR사)를 이용하였다. 배양 종료 후, 8000 g, 10 분간의 원심 분리에 의해 집균하고, 얻어진 습균체 3 g를 20 ㎖의 HEPES 버퍼(100 mM, pH 7.2)에 재현탁하였다. 균체를 냉각하에서 초음파 파쇄기를 이용하여 파쇄하고, 균체 파쇄액에 황산암모늄(30 중량％ 포화 농도)을 첨가하여 4 ℃에서 30 분간 천천히 교반하고, 20000 g, 10 분간의 원심 분리를 행하여 상청을 얻었다. 원심 상청액에 황산암모늄(70 중량％ 포화 농도)을 첨가하고 4 ℃에서 30 분간 천천히 교반한 후, 20000 g, 10 분간의 원심 분리에 의해 얻어진 침전물을 9 ㎖의 HEPES 버퍼(100 mM, pH 7.2)에 재용해시키고, 1 ℓ의 동일한 액 중에서 4 ℃에서 24 시간 동안 투석하고, 음이온 교환 크로마토그래피(아마샴 바이오사이언시즈사; HiTrap DEAE FF(칼럼 부피 5 ㎖×5개))에 제공하였다. 전개액은 HEPES 버퍼(100 mM, pH 7.2)를 이용하고, 염화칼륨 농도를 0.0 M부터 0.5 M까지 직선적으로 증가시킴으로써 분획을 용출하여 니트릴히드라타제 활성을 포함하는 획분을 얻었다. 그 획분을 아파타이트 칼럼 크로마토그래피(BIO-RAD사 제조; CHT2-I(칼럼 부피 2 ㎖))에 제공하였다. 0.01 M 인산칼륨 수용액(pH 7.2)을 전개액으로 하고, 인산칼륨을 0.01 M부터 0.3 M까지 직선적으로 증가시킴으로써 분획을 용출하여 니트릴히드라타제 활성을 포함하는 획분을 얻었다. 그 획분을 0.15 M NaCl을 포함하는 0.05 M 인산나트륨 수용액(pH 7.2)을 전개액으로 한 겔 여과 크로마토그래피(아마샴 바이오사이언시즈사; Superdex 200 HR 10/30)에 제공하여 니트릴히드라타제 활성 획분을 취득하였다. 이와 같이 하여 얻어진 겔 여과 크로마토그래피의 니트릴히드라타제 활성 획분을 이용하여 이하의 실시예를 행하였다.

〔공정 2〕정제한 니트릴히드라타제의 반응 온도 의존성

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주 유래의 니트릴히드라타제 활성 획분 용액(3.2 mg/㎖, 0.05 M 인산 완충액(pH 7.5))에 대해서 하기 표 4에 나타낸 반응 온도에서 니트릴 화합물을 아미드 화합물로 변환시키는 니트릴히드라타제 활성을 측정하였다. 1 ㎖의 0.5 중량％ 아크릴로니트릴 용액(0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.5)에 니트릴히드라타제 활성 획분 용액을 첨가하고, 각 온도에서 교반하면서 반응을 개시하였다. 2 분 후, 100 ㎕의 1 N 염산을 첨가함으로써 반응을 정지하였다. 효소 활성의 단위(유닛)는 1 분에 1 ㎛ol의 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환하는 활성을 1 유닛(이하, U라 기재함)이라 정하고, 효소 중량당 수화 활성(U/mg)을 표 4에 나타내었다. 이 결과에 따르면, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 정제한 니트릴히드라타제 활성 획분에서의 니트릴히드라타제의 활성은 60 ℃라는 고온까지 반응 온도의 상승에 따라 상승하고 있다. 최적 온도는 균체를 반응에 이용했을 때와 마찬가지로 60 ℃ 근방에 있다고 생각되고, 70도라는 고온하에서도 매우 높은 니트릴히드라타제 활성을 나타내고 있다.

〔공정 3〕정제한 니트릴히드라타제의 열 안정성

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 정제한 니트릴히드라타제의 활성의 열 안정성을 조사하기 위해서, 니트릴히드라타제 활성 획분 용액(3.2 mg/㎖, 0.05 M 인산 완충액(pH 7.5))에 30 분간 소정 온도에서의 보온 처리를 행하고, 잔존 활성을 측정하였다. 1 ㎖의 0.5 중량％ 아크릴로니트릴 용액(0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.5)에 보온 처리 후의 니트릴히드라타제 용액을 5 ㎕ 첨가하고, 27 ℃에서 교반하면서 반응을 개시하였다. 2 분 후, 100 ㎕의 1 규정 염산을 첨가함으로써 반응을 정지하였다. 보존 처리 전의 활성에 대한 보존 처리 후의 활성(잔존 활성)을 산출하여, 보존 처리 전의 활성을 기준(100)으로 한 환산값으로서 하기 표 5에 나타낸다. 이 결과에 따르면, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 정제한 니트릴히드라타제 활성 획분에서의 수용액 중 니트릴히드라타제의 효소 활성은 고온하에서도 안정적으로 유지되고, 60 ℃라는 고온하에서도 60 ％ 이상의 활성을 유지할 수 있으며, 70 ℃의 고온하에서도 35 ％ 이상의 활성을 유지할 수 있다.

〔공정 4〕정제한 니트릴히드라타제의 아크릴로니트릴 농도 의존성과 농도 내성

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 정제한 니트릴히드라타제에 대해서, 기질인 아크릴로니트릴 농도에의 의존성과 내성을 조사하기 위해서 4 ㎕의 니트릴히드라타제 활성 획분 용액(3.2 mg/㎖, 0.05 M 인산 완충액(pH 7.5))을 각종 중량％의 아크릴로니트릴을 포함하는 5 ㎖ 용액(0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.5)에 첨가하고, 27 ℃에서 교반하면서 반응을 개시하였다. 5 분, 10 분, 20 분, 40 분 후에 1 ㎖를 취출하고, 100 ㎕의 1 규정 염산을 첨가함으로써 반응을 정지하고, 생성된 아크릴아미드의 농도를 HPLC에 의해 정량하여 하기 표 6에 나타내었다. 이 결과에 따르면, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 정제한 니트릴히드라타제 활성 획분에서의 수용액 중 니트릴히드라타제의 효소 활성은 높은 아크릴로니트릴 농도에서도 안정적으로 유지된다. 6 ％라는 고농도의 아크릴로니트릴 용액 중에서 40 분간 반응시켜도 보다 낮은 아크릴로니트릴 농도의 경우에 비해 활성의 저하는 관찰되지 않고, 반대로 기질 농도의 상승에 따라 활성은 상승하였다.

〔공정 5〕지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 정제한 니트릴히드라타제의 아크릴아미드 농도 내성

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 정제한 니트릴히드라타제에 대해서, 생성물인 아크릴아미드의 저해를 조사하기 위해서 10 ㎕의 니트릴히드라타제 활성 획분 용액(3.2 mg/㎖, 0.05 M 인산 완충액(pH 7.5))을 0.5 중량％ 아크릴로니트릴과 35 중량％ 아크릴아미드를 포함하는 용액(0.05 M 인산칼륨 완충액, pH 7.5) 1 ㎖에 대하여 첨가하고, 27 ℃에서 교반하면서 10 분간 반응을 행하고, 반응 후 액 중의 아크릴로니트릴 농도를 HPLC에서 정량한 바, 모든 아크릴로니트릴이 아크릴아미드로 변환되어 있었다. 이 결과로부터 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터 정제한 니트릴히드라타제 활성 획분에서의 수용액 중 니트릴히드라타제의 효소 활성은 35 ％라는 높은 아크릴아미드 농도에서도 활성이 유지된다고 할 수 있다.

실시예 6: 지오바실루스 · 서모글루코시다시어스 Q-6주 유래의 니트릴히드라타제 β서브 유닛, α서브 유닛 및 ORF3 부분의 유전자의 클로닝

〔공정 1〕지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주 유래의 니트릴히드라타제 효소의 확인 및 N 말단 아미노산 서열 결정

실시예 5에 의해 얻어진 겔 여과 크로마토그래피에서의 니트릴히드라타제 활성 획분 용출액을 환원 조건하에서 환원형 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 제공하였다. 영동 후, 쿠마시 브릴언트 블루(CBB)에 의한 단백질 염색을 행하고, 탈색한 결과, 약 25 K 달톤 및 약 28 K 달톤의 분자량을 갖는 2개의 주요한 밴드가 확인되었다. 이 2개의 주요한 정제 단백질을 블로팅 장치(BIO-RAD사)를 이용하여 PVDF막(MILLIPORE사 제조)에 전사하고, CBB 염색하고, 목적으로 하는 2개의 밴드가 흡착되어 있는 부분을 PVDF막으로부터 잘라내었다. 이어서, 전자동 단백질 1차 구조 분석 장치 PPSQ-23A(시마즈 세이사꾸쇼)를 이용하여 2종의 단백질의 N 말단 아미노산 서열을 해독하였다. 그 결과, 분자량 25 K 달톤의 단백질의 N 말단 아미노산 서열은, 서열 목록의 서열 23에 기재된 아미노산 서열이고, 분자량 28 K 달톤의 단백질의 N 말단 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 24에 기재된 아미노산 서열이었다.

이미 알려진 니트릴히드라타제 효소의 아미노산 서열과 비교한 결과, 25 K 달톤의 폴리펩티드쇄가 니트릴히드라타제 α서브 유닛, 28 K 달톤의 폴리펩티드쇄가 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 낮으면서도 호몰로지를 나타내어, 상기 단백질을 코드하는 것이 시사되었다.

〔공정 2〕N 말단 아미노산 서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 합성

상기에서 해독한 2종의 단백질의 N 말단의 아미노산 서열로부터, 상기 균속의 코돈 사용에 기초하여 축중 PCR용 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이하의 12 종류 합성하였다. 서열 목록의 서열 5에 기재된 프라이머 1(αF1), 서열 목록의 서열 6에 기재된 프라이머 2(αF2), 서열 목록의 서열 7에 기재된 프라이머 3(αF3), 서열 목록의 서열 8에 기재된 프라이머 4(αR1), 서열 목록의 서열 9에 기재된 프라이머 5(αR2), 서열 목록의 서열 10에 기재된 프라이머 6(αR3), 서열 목록의 서열 11에 기재된 프라이머 7(βF1), 서열 목록의 서열 12에 기재된 프라이머 8(βF2), 서열 목록의 서열 13에 기재된 프라이머 9(βF3), 서열 목록의 서열 14에 기재된 프라이머 10(βR1), 서열 목록의 서열 15에 기재된 프라이머 11(βR2), 서열 목록의 서열 16에 기재된 프라이머 12(βR3)이다. 또한, y는 c 또는 t를 나타내고, r은 a 또는 g를 나타내고, m은 a 또는 c를 나타내고, k는 g 또는 t를 나타내고, s는 c 또는 g를 나타내고, w는 a 또는 t를 나타내고, d는 a, g 또는 t를 나타내고, n은 a, c, g 또는 t를 나타내고 있다. α서브 유닛 및 β서브 유닛을 코드하는 유전자의 염색체 상에서의 위치를 고려하여 프라이머를 제조하였다.

〔공정 3〕지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주로부터의 염색체 DNA의 추출 및 축중 PCR

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주를 실시예 2와 동일한 방법에 의해 배양, 회수하고, QIAGEN사의 Genomic-tip System(500/G) 키트를 이용하여 균체로부터 염색체 DNA를 추출하였다. TE 용액에 용해시킨 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 염색체 DNA 0.1 ㎍을 주형으로서 축중 PCR을 행하였다. 축중 PCR 반응은 서열 목록의 서열 5 내지 10에 기재된 프라이머 1 내지 6과 서열 목록의 서열 11 내지 16에 기재된 프라이머 7 내지 12의 조합 36 가지를 행하였다. 100 pmol의 프라이머 2종을 각각, 5 U의 Takara사의 Ex Taq DNA 폴리머라제 및 버퍼를 포함하는 전량 100 ㎕의 반응액을 이용하여 축중 PCR 반응을 행하여 DNA 단편의 증폭을 시도하였다. 반응 조건은 이하와 같다. 96 ℃, 3 분간의 열변성 후, 96 ℃, 30 초간 열변성, 42 ℃, 30 초간 어닐링, 72 ℃, 1 분 30 초간 신장 반응을 35 사이클 행한 후, 72 ℃에서 5 분간 신장 반응을 시키고, 4 ℃에서 차갑게 보존하였다. 각각의 PCR 산물을 1 중량％ 아가로스 전기 영동에 제공하여 DNA의 증폭을 확인한 바, 서열 목록의 서열 9에 기재된 프라이머 5(αR2)와 서열 목록의 서열 11에 기재된 프라이머 7(βF1)의 조합 및 서열 목록의 서열 9에 기재된 프라이머 5(αR2)와 서열 목록의 서열 12에 기재된 프라이머 8(βF2)의 조합으로 행한 PCR 반응의 경우만 약 700 bp의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다.

〔공정 4〕축중 PCR 산물의 클로닝 및 증폭 DNA 단편의 염기 서열 해독

증폭된 DNA 단편을 겔로부터 잘라내고, QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN사)를 이용하여 추출하고, pGEM-T 벡터(Promega사)에 T4 DNA 리가제를 이용하여 라이게이션하였다. Ex Taq에 의한 PCR 반응의 결과 3' 말단에 A가 1 염기 부가되는 성질을 이용하고 있다. 라이게이션 반응 후, 대장균 JM109주를 형질 전환하고, LB 한천 배지(50 ㎍/㎖ 암피실린, 0.5 중량％ 박토 효모 추출물, 1 중량％ 박토 트립톤, 0.5 중량％ NaCl, 2.0 중량％ 박토 아가(pH 7.5))로 37 ℃에서 밤새 배양하고, 암피실린으로 형질 전환체를 선택하였다. 암피실린을 포함하는 LB 배지로 배양한 형질 전환체로부터 정법에 의해 플라스미드 DNA를 추출하고, 약 700 bp의 인서트 배열을 벡터 상에 있는 SP6 및 T7 프로모터의 서열을 프라이머로서 이용하여 염기 서열을 해독하였다.

그 결과, 증폭 DNA 단편 내에 681 bp의 오픈 리딩 프레임(이후 ORF1이라 함)이 확인되었다. ORF1의 번역 종료 코돈과 다음 번역 시작 코돈 ATG의 사이는 13 bp였다. ORF1의 염기 서열로부터 추정되는 N 말단측 25개의 아미노산 서열과 상기 정제한 28 K 달톤의 폴리펩티드쇄의 N 말단측의 25개의 아미노산 서열은 완전히 일치하고 있고, 서열 목록의 서열 2에 기재된 아미노산 서열의 1번째부터 25번째까지의 배열에 상당하고 있다. ORF1의 아미노산 서열은 이미 알려진 니트릴히드라타제의 β서브 유닛의 아미노산 서열과 낮으면서도 호몰로지를 나타내어, 상기 단백질을 코드하는 것이 시사되었다.

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛은 226 아미노산을 코드하고 있고, 기존의 데이터베이스 중에서 상동성이 높은 단백질과의 아미노산 서열의 일치도는 높은 쪽으로부터 순서대로 클렙시엘라속 MC12609주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 43 ％, 아그로박테리움속의 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 42 ％, 로도슈도모나스속 JCM3095주 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 40 ％로 매우 낮다. 또한, 지오바실루스속과 근연의 속인 바실루스속 유래의 단백질과의 아미노산의 일치도도, 호열균 바실루스 BR449주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 35.0 ％, 호열균 바실루스 스미시(Bacillus smithii) SC-J05-1주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 34.5 ％로 매우 낮았다. 한편, 호열균 바실루스 BR449주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 호열균 바실루스 스미시 SC-J05-1주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛은 85.6 ％라는 높은 일치도를 갖고 있다.

〔공정 5〕지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주니트릴히드라타제 α서브 유닛 부분의 유전자의 클로닝

상기에서 얻어진 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛 부분의 유전자의 주변 유전자 및 α서브 유닛 부분의 유전자를 클로닝하기 위해서 축중 PCR을 행하였다. 이미 알려진 니트릴히드라타제 α서브 유닛의 하류에 위치하는 유전자를 참고로 하여, 이하의 축중 PCR용 올리고뉴클레오티드 프라이머 이하 2종을 제조하였다. 서열 목록의 서열 17에 기재된 프라이머 13(pR1), 서열 목록의 서열 18에 기재된 프라이머 14(pR2)이다.

또한, 앞서 염기 서열을 해독한 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛 내에 PCR 증폭용의 올리고뉴클레오티드 프라이머 이하 2종을 제조하였다. 서열 목록의 서열 19에 기재된 프라이머 15(Q6AposF), 서열 목록의 서열 20에 기재된 프라이머 16(Q6abF1)이다. 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 염색체 DNA 0.1 ㎍을 주형으로서 축중 PCR을 행하였다. 축중 PCR 반응은 어닐링 온도 50 ℃에서, 서열 목록의 서열 17, 18에 기재된 프라이머 13, 14와 서열 목록의 서열 18, 19에 기재된 프라이머 15, 16의 조합 4 가지를 행하였다. 그 결과, 서열 목록의 서열 17에 기재된 프라이머 13(pR1)과 서열 목록의 서열 18에 기재된 프라이머 15(Q6AposF)의 조합으로 행한 PCR 반응에서 약 0.8 kb의 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 있었다. 또한, 서열 목록의 서열 16에 기재된 프라이머 13(pR1)과 서열 목록의 서열 19에 기재된 프라이머 16(Q6abF1)의 조합으로 행한 PCR 반응에서 1.5 kb의 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 있었다. 또한, 그 밖의 조합으로 행한 PCR 반응의 경우는 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 없었다.

서열 목록의 서열 16에 기재된 프라이머 13(pR1)과 서열 목록의 서열 19에 기재된 프라이머 15(Q6AposF)의 조합으로 행한 축중 PCR 반응에 의해 증폭된 0.8 kb의 DNA 단편을 아가로스겔로부터 잘라내고, 정법에 의해 아가로스겔로부터 추출하여 pGEM-T 벡터(Promega사)에 조립하고, 대장균 JM109주를 형질 전환하고, 50 ㎍/㎖의 암피실린에 의해 재조합체를 선택하였다. 암피실린을 포함하는 LB 배지에서 형질 전환체를 배양하고, 통상법에 의해 플라스미드 DNA를 추출하여, 약 0.8 kb의 인서트 부분의 염기 서열을 해독하였다. 그 결과, 618 bp의 오픈 리딩 프레임(이후 ORF2라 함)이 확인되었다. ORF2의 염기 서열로부터 추정되는 N 말단측 29개의 아미노산 서열과 상기에서 정제한 25 K 달톤의 폴리펩티드쇄의 N 말단측의 29개의 아미노산 서열은 완전히 일치하고 있고, 서열 목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열의 1번째부터 29번째까지의 배열에 상당한다. ORF2의 아미노산 서열은 이미 알려진 니트릴히드라타제 α서브 유닛의 아미노산 서열과 낮으면서도 호몰로지를 나타내어, 상기 단백질을 코드하는 것이 시사되었다.

지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛은 205 아미노산을 코드하고 있고, 기존의 데이터베이스 중에서 상동성이 높은 단백질과의 아미노산 서열의 일치도는 높은 쪽으로부터 순서대로 호열균 바실루스 BR449의 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 66.3 ％, 호열균 바실루스 스미시 SC-JO5-1의 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 63.9 ％로 낮다. 한편, 호열균 바실루스 BR449의 니트릴히드라타제 β서브 유닛과 호열균 바실루스 스미시 SC-JO5-1의 니트릴히드라타제 β서브 유닛은 88.8 ％라는 높은 상동성을 갖고 있다.

이상으로부터, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주에서는 5' 말단측 상류로부터 28 K 달톤의 니트릴히드라타제 β서브 유닛을 코드하는 유전자, 25 K 달톤의 니트릴히드라타제 α서브 유닛을 코드하는 유전자가 이 순서로 인접하여 존재하고 있는 것이 판명되었다.

〔공정 6〕지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛 및 β서브 유닛 부분의 pET28a(+) 벡터에의 조립

상기에서 해독한 염기 서열을 바탕으로 니트릴히드라타제 α서브 유닛 및 β서브 유닛 부분을 PCR에서 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 이하 2종을 제조하였다. 서열 목록의 서열 21에 기재된 프라이머 17(Q6ab-F1-T), 서열 목록의 서열 22에 기재된 프라이머 18(Q6ABall-R1-BglII-T)이다. 서열 목록의 서열 21에 기재된 프라이머 17은 제한 효소 부위 NdeI 중에 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛의 번역 시작 코돈을 설계하였다. 서열 목록의 서열 22에 기재된 프라이머 18에는 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛의 번역 종료 코돈의 바로 아래에 제한 효소 BglII 사이트를 도입하였다. 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열 목록의 서열 21, 22에 기재된 프라이머 17, 18을 각각100 pmol 이용하여 PCR 반응을 행하였다. Ex Taq DNA 폴리머라제를 이용하고, 전체량 100 ㎕로써 96 ℃에서 3 분간 열변성한 후, 96 ℃에서 30 초간 열변성, 60 ℃에서 30 초간 어닐링, 72 ℃에서 1 분 30 초간 신장 반응의 조건으로 PCR을 30 사이클 행한 후, 72 ℃에서 5 분간 신장 반응시킨 후, 4 ℃로 냉각하였다. PCR 반응 후의 용액을 1.5 중량％ 아가로스 전기 영동에 제공한 바, 약 1.3 kb의 DNA 단편 증폭이 확인되었다. 이 증폭 DNA 산물을 아가로스겔에 의해 통상법으로 추출하고, Promega사의 pGEM-T 이지 벡터에 라이게이션하고, 대장균 JM109주를 형질 전환하였다. 형질 전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 인서트 부분의 염기 서열을 해독하여, PCR에 의한 증폭 오류가 없다는 것을 확인하였다.

이어서, 이 플라스미드를 NdeI, EcoRI 제한 효소로 소화하여 1.5 중량％ 아가로스 전기 영동에 제공하고, 약 1.3 kb의 인서트 DNA를 아가로스겔로부터 잘라내고 통상법에 의해 추출하였다. 발현 벡터에는 Novagene사의 pET-28a(+) 벡터를 이용하였다. 이 DNA를 NdeI, EcoRI 제한 효소로 소화하여 1 중량％ 아가로스 전기 영동에 제공하고, 약 5.3 kb의 DNA 단편을 통상법에 의해 추출하였다. 이들 인서트와 벡터를 통상법에 따라서 라이게이션 반응을 행하고, 대장균 JM109주를 형질 전환하고, 카나마이신 내성으로 선택한 형질 전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 인서트가 도입된 플라스미드를 선출하였다. 이상으로부터 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛 및 β서브 유닛 부분이 인서트로서 도입된 발현 플라스미드를 취득하였다. 완성된 플라스미드를 이하 pET-28a(+)-βα라 부른다.

〔공정 7〕콜로니 하이브리다이제이션에 의한 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주 유래의 니트릴히드라타제 주변 유전자의 취득

(1) 형광 표지 DIG 프로브의 제조

서열 목록의 서열 25에 기재된 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛 부분의 DNA를 주형으로 이용하여, 로슈사 제조의 DIG-DNA 라벨링 키트에 의해 형광 표지 프로브를 제조하였다. 제조 방법은 로슈사의 DIG 메뉴얼에 따른다.

(2) 염색체 서던 하이브리다이제이션

실시예 6의 공정 3에서 제조한 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 염색체 DNA를 여러 가지 제한 효소를 이용하여 소화하여 1 중량％ 아가로스겔 전기 영동에 제공하였다. 아가로스겔 내의 DNA를 나일론 멤브레인 Hybond-N+(아마샴사)에 전사한 후, 앞서 제조한 형광 표지 DIG 프로브를 이용하여 염색체 서던 하이브리다이제이션을 행하였다. DNA가 전사, 고정된 멤브레인을 1매당 10 ㎖의 하이브리다이제이션 버퍼(1 중량％ 스킴밀크, 0.1 중량％ N-라우로일자르코신, 0.02 중량％ SDS, 50 중량％ 포름아미드를 함유하는 5×SSC)에 침지하고, 42 ℃에서 2 시간 동안 프리하이브리다이제이션을 행하였다. 상기와 마찬가지로 제조한 형광 표지 프로브 100 ng를 95 ℃에서 10 분간의 자비(煮沸) 및 급냉 처리에 의해 열변성을 시키고, 프리하이브리다이제이션 버퍼에 첨가하고, 42 ℃에서 밤새 하이브리다이제이션을 행하였다. 하이브리다이제이션 후의 멤브레인을 150 ㎖의 0.1 중량％ SDS를 포함하는 2×SSC에서 실온에서 2회 세정하였다. 이어서 65 ℃로 가열한 150 ㎖의 0.1 중량％ SDS를 포함하는 1×SSC 중에서 5 분간의 세정을 2회 행하였다. 계속해서 100 ㎖의 말레산 버퍼(0.1 M 말레산, 0.15 M NaCl, NaOH를 이용하여 pH 7.5로 조정 완료)에서 5 분간 세정한 후, 50 ㎖의 블로킹 용액(0.3 중량％ Tween 20, 0.15 M NaCl 및 1 중량％ 스킴밀크를 포함하는 0.1 M 말레산 버퍼; pH 7.5) 중에서 실온에서 30 분간 블로킹 처리를 행하였다. 항디곡시게닌-AP를 75 mU/㎖가 되도록 20 ㎖의 블로킹 용액으로 희석하고, 실온에서 30 분간의 항체 반응을 행한 후, 100 ㎖의 세정 버퍼(0.3 중량％ Tween 20, 0.15 M NaCl을 포함하는 0.1 M 말레산 버퍼; pH 7.5) 중에서 멤브레인을 5회 세정하여 결합하지 않은 항체를 씻어 버렸다. 20 ㎖의 검출 버퍼(0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5) 중에서 5 분간 평형화 처리를 행한 후, 10 ㎖의 검출 버퍼에 100 mg/㎖의 NBT(니트로블루테트라졸륨클로라이드) 용액을 34 ㎕, 50 mg/㎖의 BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트) 용액을 35 ㎕ 희석한 발색 기질 용액 NBT/BCIP를 제조하여 멤브레인이 완전히 잠기도록 덮고, 차광하여 배양을 1 분부터 16 시간 동안 행하였다. 배양 중에는 디스크를 움직이거나 흔들지 않고 발색의 확인을 행하였다. 그 결과, 제한 효소 HindIII에 의해 소화되는 약 2.3 kb 유전자 단편 중에 니트릴히드라타제 α서브 유닛 부분의 하류 유전자가 포함되는 것이 명백해졌다.

(3) 콜로니 하이브리다이제이션에 의한 목적 클론의 취득

(i) 콜로니 하이브리다이제이션용 플라스미드 라이브러리의 제조

이어서, 동일한 형광 표지 DIG 프로브를 이용하여 콜로니 하이브리다이제이션을 행하였다. 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 염색체 DNA 10 ㎍을 1 중량％ 아가로스겔 전기 영동에 제공하고, 아가로스겔로부터 약 2.0 kb로부터 2.6 kb의 DNA 단편을 포함하는 부분을 잘라내고, 상기와 마찬가지의 방법으로 DNA 단편을 추출 및 정제하였다. 얻어진 DNA 단편을 DNA 라이게이션 키트(다까라 슈조사 제조)를 이용하여 pUC118 플라스미드 벡터(다까라 슈조사 제조)의 멀티클로닝 사이트 내에 있는 HindIII 제한 효소 부위에 도입하였다. 라이게이션에 이용한 pUC118 플라스미드 벡터 DNA는 제한 효소 HindIII로 소화한 후에 페놀/클로로포름 처리 및 에탄올 침전에 의한 정제를 행하고, 계속해서 알칼리포스파타제(Takara사 제조)를 이용한 5' 말단의 탈 인산화 처리 후에 재차 페놀/클로로포름 처리 및 에탄올 침전을 행하고, 아가로스 전기 영동에 제공하고, 아가로스겔로부터 추출에 의한 재 정제를 행한 것을 사용하였다.

약 2.0 kb로부터 2.6 kb로 단편화된 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 염색체 DNA를 pUC118 플라스미드 벡터와 HindIII 제한 효소 부위로써 라이게이션한 용액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하고, 50 ㎍/㎖의 암피실린, 1 mM의 IPTG 및 2 중량％ X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드)을 함유하는 LB 한천 배지(0.5 중량％ 박토 효모 추출물, 1 중량％ 박토 트립톤, 0.5 중량％ NaCl, 2.0 중량％ 한천; pH 7.5) 상에 뿌려, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 그 결과, 1매당 50개 내지 500개의 백콜로니가 출현하고 있는 샬레를 다수매 취득할 수 있었다.

이들 염색체 DNA의 플라스미드 라이브러리에 대하여, 앞서 제조한 형광 표지 DIG 프로브를 이용하여 콜로니 하이브리다이제이션을 행하고, 목적으로 하는 니트릴히드라타제 α서브 유닛의 하류 유전자를 포함하는 클론을 스크리닝하였다.

(ii) 콜로니 하이브리다이제이션에 의한 목적 클론의 취득

우선 출현한 백콜로니 약 1000 클론을 멸균된 이쑤시개를 이용하여 새로운 LB 한천 배지에 다시 스트리킹하였다. 이 때, 멤브레인을 하이브리다이즈시키는 LB 한천 배지와 보존용 LB 한천 배지에 마찬가지로 스트리킹하여 30 ℃에서 밤새 배양하였다.

이어서, 콜로니가 생긴 샬레 상에 아마샴사 제조의 나일론 멤브레인 Hybond-N+을 가만히 놓고, 1 분 후 끝으로부터 핀셋을 이용하여 천천히 제거하였다. 박리한 멤브레인을 균체를 부착하고 있는 면을 위로 하여 변성 용액(1.5 M의 NaCl을 포함하는 0.5 M의 NaOH 수용액)에 7 분간 침지한 후, 중화 용액(1.5 M의 NaCl과 1 mM의 EDTA·2Na를 포함하는 0.5 M 트리스염산 수용액; pH 7.2)에 3 분간 침지하고, 새로운 중화 용액에 3 분간 더 침지하였다. 이어서, 2×SSC 용액(1×SSC 1 ℓ 중에 NaCl 8.76 g, 시트르산나트륨 4.41 g를 포함함)에서 1회 세정을 행한 후, 건조된 여과지 상에서 멤브레인을 풍건하였다. 또한 120 mJ/㎠의 UV 조사를 행함으로써 멤브레인 상에 DNA를 고정시켰다.

(iii) DIG 항체에 의한 검출 및 목적 클론의 단리

상기에서 처리한 DNA가 고정된 멤브레인을 1매당 10 ㎖의 하이브리다이제이션 버퍼(1 중량％ 스킴밀크, 0.1 중량％ N-라우로일자르코신, 0.02 중량％ SDS, 50 중량％ 포름아미드를 함유하는 5×SSC)에 침지하고, 42 ℃에서 2 시간 동안 프리하이브리다이제이션을 행하였다. 상기와 마찬가지로 제조한 형광 표지 프로브 100 ng를 95 ℃에서 10 분간 자비 및 급냉 처리에 의해 열변성시키고, 프리하이브리다이제이션 버퍼에 첨가하고, 42 ℃에서 밤새 하이브리다이제이션을 행하였다. 하이브리다이제이션 후의 멤브레인을 150 ㎖의 0.1 중량％ SDS를 포함하는 2×SSC에서 실온에서 2회 세정하였다. 이어서 65 ℃로 가열한 150 ㎖의 0.1 중량％ SDS를 포함하는 1×SSC 중에서 5 분간의 세정을 2회 행하였다. 계속해서 100 ㎖의 말레산 버퍼(0.1 M 말레산, 0.15 M NaCl, NaOH를 이용하여 pH 7.5로 제조함)로 5 분간 세정한 후, 50 ㎖의 블로킹 용액(0.3 중량％ Tween 20, 0.15 M NaCl 및 1 중량％ 스킴밀크를 포함하는 0.1 M 말레산 버퍼; pH 7.5) 중에서 실온에서 30 분간 블로킹 처리를 행하였다. 항디곡시게닌-AP를 75 mU/㎖가 되도록 20 ㎖의 블로킹 용액으로 희석하고, 실온에서 30 분간 항체 반응을 행한 후, 100 ㎖의 세정 버퍼(0.3 중량％ Tween 20, 0.15 M NaCl을 포함하는 0.1 M 말레산 버퍼; pH 7.5) 중에서 멤브레인을 5회 세정하여 결합하지 않은 항체를 씻어 버렸다. 20 ㎖의 검출 버퍼(0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, pH 9.5) 중에서 5 분간 평형화 처리를 행한 후, 10 ㎖의 검출 버퍼에 100 mg/㎖의 NBT 용액을 34 ㎕, 50 mg/㎖의 BCIP 용액을 35 ㎕ 희석한 발색 기질 용액 NBT/BCIP를 제조하여 멤브레인이 완전히 잠기도록 덮고, 차광하여 배양을 1 분 내지 16 시간 동안 행하였다. 배양 중에는 디스크를 움직이거나 흔들지 않고 발색의 확인을 행하였다. 그 결과, 상기 멤브레인 상의 1000 클론 중, 포지티브한 시그날을 4곳 발견하여, 그 위치와 중첩되는 포지티브 클론을 본래의 샬레 위에서 확인하였다.

(4) 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛 부분의 하류 유전자를 포함하는 포지티브 클론의 해석

확인된 포지티브 클론을 샬레로부터 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지에 식균하고, 37 ℃·250 rpm으로 밤새 진탕 배양을 행하고, 균체를 원심에 의해 회수하고, 통상법에 의해 플라스미드 DNA를 추출하였다. 플라스미드 DNA를 제한 효소 HindIII로 소화한 후에, 1.5 중량％ 아가로스 전기 영동에 제공하고, 삽입 단편의 크기를 확인한 바, 약 2.3 kb의 크기였다. 또한, 삽입 단편이 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛 부분을 포함하는 것을 수 패턴의 PCR 및 제한 효소에 의한 소화 패턴에 의해 확인하였다.

이상으로부터 취득된 본 플라스미드를 pUC118-Q6Hin2.3으로 명명하고, 삽입 단편의 전체 염기 서열을 결정하였다. 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 및 하류 유전자군의 제한 효소 지도 및 유전자 구성을 도 1에 나타내었다.

그 결과, 삽입 단편 중에 339 bp의 염기 서열을 포함하는 오픈 리딩 프레임(이하, ORF3이라 함)이 니트릴히드라타제 α서브 유닛(ORF2)의 5' 말단측 하류에 동일한 방향으로 존재하는 것이 확인되었다. ORF2의 번역 종료 코돈과 ORF3의 번역 시작 코돈 사이는 12 bp이고, ORF3의 번역 종료 코돈과 더욱 하류에 위치하는 ORF의 번역 시작 코돈 사이는 145 bp였다. ORF3은 112 아미노산을 코드하고 있고, 기존의 데이터베이스 중 이하의 단백질과 매우 낮으면서도 상동성을 갖고 있었다. 기존의 데이터베이스 중에서 상동성이 높은 배열과의 아미노산이 일치하는 비율은 바실루스속 BR449주의 P12K와 31.0 ％, 로도코커스·로도크로스 J1주의 NhhG와 31.0 ％, 로도코커스·로도크로스 J1주의 NhlE와 21.0 ％, 슈도노카르디아·서모필라 JCM3095주의 P16과 23.2 ％였다.

〔공정 8〕지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛 및 β서브 유닛 및 하류 유전자 ORF3의 대장균 플라스미드 상에서의 재구축

pET-28a(+)-βα 플라스미드를 제한 효소 HindIII에 의해 소화하고, 탈 인산화 반응을 행하고, 페놀클로로포름으로 추출함으로써, 탈 인산화 처리를 행하였다. 이 소화산물을 1 중량％ 아가로스 전기 영동에 제공하고, 약 6.1 kb의 DNA 단편을 통상법에 의해 추출하였다. 이 DNA 단편에는 pET 벡터 및 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛 및 α서브 유닛의 60번째의 아미노산에 위치하는 HindIII 제한 효소 부위까지 포함되어 있다.

이어서, pUC118-Q6Hin2.3 플라스미드를 제한 효소 HindIII에 의해 소화하여 1 중량％ 아가로스 전기 영동에 제공하고, 약 2.3 kb의 인서트 DNA를 추출하였다. 이 인서트를 앞서 추출한 단편과 라이게이션을 행하고, 대장균 JM109주를 형질 전환하고, 카나마이신 내성으로 선택한 형질 전환체로부터 인서트 DNA를 포함하는 플라스미드를 선출하였다. 인서트의 방향을 PCR에 의해 확인함으로써, pET-28a(+) 벡터에 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6주의 니트릴히드라타제 α서브 유닛 및 β서브 유닛 및 하류 유전자 ORF3과 추가로 하류 영역이 포함된 플라스미드를 취득하였다. 이렇게 해서 완성한 플라스미드를 이하 pET-28a(+)-βα12라 한다.

실시예 7: 니트릴히드라타제 유전자 프로모터를 이용한 Q6 주의 니트릴히드라타제 유전자의 로도코커스 · 로도크로스 M33 주에서의 발현

〔공정 1〕 M33주의 니트릴히드라타제 유전자 영역의 클로닝

M33주 중에서 Q6주의 니트릴히드라타제를 발현시키기 위해서, M33주의 니트릴히드라타제 유전자 영역을 클로닝하였다.

(1) M33주로부터 염색체 DNA의 추출

로도코커스·로도크로스 M33주를 YMPD 배지(글루코스 1.O 중량％, 폴리펩톤 0.5 중량％, 효모 추출물 0.3 중량％, 말토익스트랙트 0.3 중량％, pH 7.2)에서 배양하고, 회수한 균체로부터 QIAGEN사의 Genomic-tip System(500/G) 키트를 이용하여 염색체 DNA를 추출하였다.

(2) M33주의 람다 파지 라이브러리의 제조

로도코커스·로도크로스 M33주의 염색체 DNA 30 ㎍을 제한 효소 Sau3A1에 의해 부분 소화한 후, 0.7 중량％ 아가로스겔 전기 영동에 제공하고, 아가로스겔로부터 약 20 kb의 DNA 단편을 포함하는 부분을 잘라내고, 추출 및 정제하였다. 이 염색체 DNA를 DNA 라이게이션 키트 Ver.1(다까라 슈조사 제조)을 이용하여 Lamda DASH II/BamHI Vector kits(Stratagene사 제조) 중의 벡터 DNA와 결합시키고, 동일한 키트의 메뉴얼에 따라서 코스미드 라이브러리를 제조하였다. 이들 염색체 DNA의 람다 파지 라이브러리에 대하여, 이하에 제조한 형광 표지 DIG 프로브를 이용하여 플라크 하이브리다이제이션을 행하였다.

(3) 형광 표지 DIG 프로브의 제조

서열 목록의 서열 32에 기재된 프라이머 NH5와 서열 목록의 서열 33에 기재된 프라이머 NH3를 이용하여, 로도코커스·로도크로스 M33주의 염색체 DNA로부터 니트릴히드라타제 유전자의 약 530 bp의 DNA를 PCR 반응에 의해 증폭한 후, 로슈사 제조의 DIG-DNA 라벨링 키트에 의해 형광 표지 프로브를 제조하였다. 제조 방법은 로슈사의 DIG 메뉴얼에 따랐다.

(4) 플라크 서던 하이브라다이제이션에 의한 목적 클론의 취득

이어서, 동일한 DIG 메뉴얼에 따라서, 플라크 하이브리다이제이션을 행하였다. 우선 출현한 약 1000 플라크를 멤브레인 필터에 찍고, 상기에서 조정된 형광 표지 DIG 프로브를 이용하여 하이브리다이제이션를 행하여 포지티브 시그널을 나타내는 파지 플라크를 3개 취득하였다.

(5) 니트릴히드라타제 유전자 상류를 포함하는 포지티브 클론의 해석

각각의 플라크를 단리, 순화한 후, Wizard Lamda Prep(프로메가사 제조)을 이용하여 파지 DNA를 조정하였다. 얻어진 3개의 파지 DNA를 각종 제한 효소로 절단한 후, 니트릴히드라타제 유전자의 상류 부분을 최장으로 포함하는 λ311을 선택하였다.

〔공정 2〕니트릴히드라타제 발현 벡터의 구축

(1) M33KpnISacI/pGEM3zf의 제조

M33주의 니트릴히드라타제 유전자 및 그 주변 영역을 플라스미드 벡터에 서브클로닝하기 위해서, 상기에서 얻어진 λ311을 KpnI와 SacI으로 절단함으로써 얻어지는 약 5.4 Kbp 단편을 아가로스 전기 영동 후 회수한 것과, pGEM3zf(+)(프로메가사 제조)를 KpnI와 SacI으로 절단한 것을 혼합하고, T4DNA 리가제로 연결하였다. 이 플라스미드를 M33KpnISacI/pGEM3zf라 명명하고, 삽입 단편의 전체 염기 서열을 결정하여 서열 목록의 서열 4에 나타내었다. 또한, 그 제한 효소 지도 및 유전자 구성을 도 2에 나타내었다.

(2) KSNH-pGEM3z의 제조

M33 KpnISacI/pGEM3zf 상에 M33주의 니트릴히드라타제 유전자의 프로모터 및 터미네이터 부분을 남기고, 그 사이에 발현 유전자 삽입을 위한 NdeI, BglII, ClaI 사이트를 삽입한 벡터로서 KSNH-pGEM3z를 이하의 절차로 제조하였다. M33 KpnISacI/pGEM3zf를 이용하여 INV101주에 형질 전환을 행하여 dam 메틸화하지 않는 플라스미드를 얻어 ClaI로 절단한 후 PstI으로 부분 분해를 행하고, 니트릴히드라타제 구조 유전자를 포함하는 PstI-ClaI 단편을 제외한 6545 bp 단편을 아가로스 전기 영동 후 회수하였다. 한편, M33 KpnISacI/pGEM3zf를 주형으로 서열 목록의 서열 26에 기재된 프라이머 M33-F05와 서열 27에 기재된 M33-R18을 이용하여 PCR 증폭하고, 707 bp 단편을 아가로스 전기 영동 후 회수하였다. M33-R18은 M33주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛 단백질의 번역 시작점에 제한 효소 NdeI, BglII, ClaI 사이트가 이 순서대로 나열되도록 설계되어 있다. 이 PCR 산물을 PstI과 ClaI으로 절단한 후에 재차 아가로스 전기 영동 후, 400 bp의 단편을 회수하여 상기 6545 bp의 단편과 혼합하고, T4DNA 리가제로 연결하여 KSNH-pGEM3z를 얻었다.

(3) M33 KSNH-pHSG298의 제조

KSNH-pG3z로부터 벡터를 pHSG298(다카라 바이오사 제조)로 치환하기 위해서, KSNH-pHSG298을 이하의 요령으로 제조하였다. KSNH-pG3z를 KpnI과 SacI으로 절단하여 3774 bp의 단편을 아가로스 전기 영동 회수한 것과, KPnI과 SacI으로 절단한 pHSG298을 T4DNA 리가제로 연결하여, 약 6.44 kb의 플라스미드 M33 KSNH-pHSG298을 취득하였다.

(4) 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q6주의 니트릴히드라타제 β, α서브 유닛 및 하류 유전자 orf3의 M33 KSNH-pHSG298에의 도입

서열 목록의 서열 28에 기재된 alpha-maeF1 및 서열 목록의 서열 29에 기재된 orf1-atoR1을 프라이머로서 이용하고, 실시예 6에서 제조한 pET-28a(+)-βα 12를 주형 DNA로 하여, 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q6주의 니트릴히드라타제 β, α서브 유닛 및 그 하류 유전자 orf3을 포함하는 약 1.5 kb 단편을 증폭하였다. 증폭에 의한 오류가 없는 것을 확인하고, β서브 유닛의 번역 시작 코돈 상에 설계한 NdeI 제한 효소 부위 및 orf3 유전자의 번역 시종 코돈 직후에 위치하는 제한 효소 BglII에서 소화하여 약 1.5 kb DNA 단편을 회수하였다. 한편, 약 6.44 kb의 플라스미드 M33 KSNH-pHSG298을 제한 효소 NdeI으로 소화한 후 BglII로 소화하고, 아가로스겔 전기 영동에 제공하여 DNA 단편을 회수하였다. 이 약 6.44 kb의 M33 KSNH-pHSG298의 벡터 영역과, 약 1.5 kb의 Q6 유래 니트릴히드라타제 β, α서브 유닛, 하류 유전자 orf1 부분의 인서트 영역을 라이게이션하여, 약 7.94 kb의 M33 KSNH-pHSG298-Q6βαorf3 플라스미드를 제조하였다.

이 M33 KSNH-pHSG298-Q6βαorf3 플라스미드는 벡터 부분이 약 2.64 kb, 인서트 부분은 M33주의 니트릴히드라타제의 프로모터 영역 약 3.8 kb와 Q6주의 니트릴히드라타제 α, β서브 유닛, 하류 유전자 orf3 약 1.5 kb를 합친 약 5.3 kb로 구성된다. 이 결과, M33주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛의 번역 시작 코돈 ATG 부분이 Q6주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛의 번역 시작 코돈으로 바꿔 지고, M33주의 니트릴히드라타제의 프로모터를 이용하여 Q6주의 니트릴히드라타제 및 하류 유전자 orf3이 발현하는 유전자 유닛이 구축되었다.

(5) 대장균과 로도코커스속 사이의 셔틀 벡터 pRE-7 상에서의 니트릴히드라타제 발현 유닛의 구축

상기에서 구축한 발현 유닛을 카나마이신 내성을 갖는 약 5.9 kb의 대장균과 로도코커스속 사이용 셔틀 벡터 pRE-7에 이하의 요령으로 도입하였다.

또한, pRE-7은 Zheng 등의 방법(Plasmid 38 180-187, 1997)으로 pBluescript(Stratagne사 제조), pACYC177(New England Biolabs사 제조) 및 pOTS로 제조된다. 이 pOTS는 TAKAI 등의 문헌(Infection and Imunity, Dec.2000, p6848-6847)에 기재된 p103과 동일하고, 또한 동일한 문헌 중 p33701과 거의 동일하고, 특히 pRE-7의 제조에 이용되는 부분은 완전히 동일하며, p33701은 로도코커스·이퀴(Rhodococcus equi) ATCC33701주로부터 단리할 수 있다.

우선, 서열 목록의 서열 30에 기재된 Ad5F-SacKpnNotI(5'-pCCGGTACCGC-3') 및 서열 목록의 서열 31에 기재된 Ad5R-SacKpnNotI(5'-pGGCCGCGGTACCGGAGCT-3')(p는 5' 말단의 인산화를 나타냄)의 2종의 1개쇄 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켜 제한 효소 부위 SacI를 NotI 부위로 변환하기 위한 어댑터 Ad5-SacKpnNotI를 제조하였다.

상기에서 구축한 약 7.94 kb의 M33 KSNH-pHSG298-Q6βα orf3 플라스미드를 제한 효소 SacI, KpnI으로 소화하여 약 5.3 kb의 인서트 부분을 잘라냄으로써 DNA 단편을 추출하였다. 이 SacI 제한 효소 부위에 어댑터 Ad5-SacKpnNotI를 연결하였다. 셔틀 벡터 pRE-7의 멀티클로닝 사이트를 이용하고, 제한 효소 KpnI, NotI으로 소화하여 아가로스겔 전기 영동에 제공하고, 약 5.9 kb의 벡터 부분의 DNA 단편을 취득하였다. 제한 효소 부위 NotI, KpnI에서 벡터와 인서트를 라이게이션하고, 대장균 JM109주를 형질 전환하고, 카나마이신 포함 LB 배지로 형질 전환체를 선택하였다.

그 결과, 셔틀 벡터 pRE-7(5.9 kb)에 M33주의 니트릴히드라타제 프로모터 영역(3.8 kb) 및 Q6주의 니트릴히드라타제 β, α서브 유닛 및 하류 유전자 orf3 영역(1.5 kb)이 도입된 약 11.2 kb의 pRE-7-M33pro-Q6βα orf3 플라스미드를 취득하였다.

〔공정 3〕pRE-7-M33pro-Q6βα orf3 플라스미드를 이용한 M33주의 형질 전환

LB 액체 배지(0.5 중량％ 박토 효모 추출물, 1 중량％ 박토 트립톤, 0.5 중량％ NaCl(pH 7.5)) 100 ㎖를 포함하는 500 ㎖ 용적의 3각 플라스크에 로도코커스·로도크로스 M33주를 1백 금 가장자리에 식균하고 30 ℃에서 17 시간 동안 배양한 후, 4 ℃에서 10,000×g로 15 분간 원심 분리함으로써 집균하였다. 동일한 균체를 빙냉한 증류수 25 ㎖에서 2회 원심 분리(4 ℃에서 10,000×g로 15 분간)함으로써 세정하고, 필터 멸균한 10 중량％의 글리세롤을 이용하여 파장 600 nm의 탁도가 40이 되도록 현탁하였다. 동일한 글리세롤 현탁액 50 ㎕를 1 ㎕의 물에 현탁한 2 ㎍의 pRE-7-M33pro-Q6βα orf3과 혼합하고, 빠르게 1 mm 폭의 일렉트로포레이션용의 배양기에 넣고, 1.5 KV, 25 μF, 800 Ω의 조건으로 BTX사 제조의 ECM630을 이용하여 유전자 도입을 행하였다. 그 후, 10 분간 얼음 중에서 유지하고, 전량을 1 ㎖의 LB 액체 배지에 첨가하여 30 ℃, 4 시간 동안 배양하고, 100 ㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 LB 한천 배지에 뿌려, 30 ℃에서 3일 내지 5일간 배양하고, 출현하는 카나마이신 내성 콜로니를 선택하여 로도코커스·로도크로스 M33주의 형질 전환체를 얻었다.

〔공정 4〕 M33주 형질 전환체의 배양

생산용 배지(KH₂PO₄ 0.5 g/ℓ, K₂HPO₄ 0.4 g/ℓ, CoCl₂6H₂O 0.02 g/ℓ, FeSO₄7H₂O 0.003 g/ℓ, EDTA-2Na 0.006 g/ℓ, NaCl 0.01 g/ℓ, CaCl₂2H₂O 0.01 g/ℓ, 글루코스 20 g/ℓ, MgSO₄7H₂O 1.2 g/ℓ, 요소 7.5 g/ℓ, 카나마이신 10 mg/ℓ) 100 ㎖를 넣은 500 ㎖ 용량의 3각 플라스크에 로도코커스·로도크로스 M33주의 형질 전환체를 1백 금 가장자리에 식균하고, 30 ℃에서 2 일간 배양하였다. 이것으로부터 얻어지는 배양액 90 ㎖를 생산용 배지 3 ℓ를 포함하는 5 ℓ 용적의 단지 발효기에 이식하고, pH 7.2, 교반 속도 500 rpm, 30 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 배양액을 25 ℃에서 10,000×g로 15 분간 원심 분리함으로써 집균하였다. 동일한 균체를 물 25 ㎖에서 2회, 25 ℃에서 10,000×g로 15 분간 원심 분리함으로써 세정하여 생산 반응용 균체를 얻었다.

〔공정 5〕M33주 형질 전환체를 이용한 아크릴아미드 생산 반응

상기한 공정 4의 배양으로 얻어진 로도코커스·로도크로스 M33주의 형질 전환체 0.9 g(균체 건조 중량 상당량)을 포함하는 증류수 800 ㎖를 1.5 ℓ 반응기에 넣고, 20 ℃에서 25 ℃로 용기 내 온도를 조정하면서 교반하였다. 여기에 액체인 아크릴로니트릴을 농도가 2 ％를 초과하지 않도록 적하하고, 적절하게 샘플을 취출하고, 원심 분리 후의 상청을 희석하고, 고속 액체 크로마토그래피로 아크릴아미드 농도를 측정하였다. 그 결과, Q6주의 니트릴히드라타제 유전자를 갖는 로도코커스·로도크로스 M33주의 형질 전환체는 52 ％(중량/용액)의 아크릴아미드를 축적하였다.

비교예 1

비교예로서, 배지에 카나마이신을 첨가하지 않는 것 이외에는 상기한 공정 4와 동일한 방법으로 친주인 로도코커스·로도크로스 M33주를 배양하고, 이 배양액에서의 균체를 이용하여 공정 5와 동일한 방법으로 아크릴아미드 생산 반응을 행한 바, 아크릴아미드의 최고 축적량은 43 ％(중량/액량)였다. 이것으로부터 상기한 M33의 형질 전환체에서는 Q6주 유래의 니트릴히드라타제 유전자의 도입에 의해 아크릴아미드 축적량이 현저히 축적된 것이 확인되었다. 실시예와 비교예의 결과를 도 3에서 그래프로 한 도 3의 결과를 표 3에도 나타낸다.

비교예 2: 네이티브 · 폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 의한 각 균체 내 니트릴히드 라타제 양의 확인

비교예 1에서 얻어진 친주인 M33주의 배양액 및 상기한 공정 4에서 얻어진 M33주의 형질 전환체의 배양액을 각각 8,000 g, 10 분간의 원심 분리 집균하고, 얻어진 습균체 80 mg를 2 ㎖의 50 mM 인산나트륨 버퍼(pH 7)에 재현탁하였다. 균체를 냉각하에서 초음파 파쇄기를 이용하여 파쇄하고, 균체 파쇄액에 10 ％(중량/액량)가 되도록 글리세롤을 첨가하고, 각 샘플을 10 ％ 겔을 이용한 네이티브·폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 해석하였다. 영동 후, 쿠마시 브릴리언트 블루에 의한 단백질 염색을 행하고, 탈색한 결과, M33주의 형질 전환체 내에는 친주인 M33주의 니트릴히드라타제와 동일한 위치의 밴드와 동시에, 보다 영동도가 적은 위치에 Q6주의 정제한 니트릴히드라타제와 동일한 위치의 밴드가 존재하고, 각각이 세포 내 전체 단백질의 30 ％ 이상을 차지한다는 드문 고발현을 달성하고 있는 것이 판명되었다. 형질 전환체의 샘플로부터 얻어진 Q6주의 정제한 니트릴히드라타제와 동일한 위치 밴드를 블로팅 장치(BIO-RAD사)를 이용하여 PVDF막(MILLIPORE사 제조)에 전사하고, CBB 염색하고, 목적으로 하는 밴드가 흡착하고 있는 부분을 PVDF막으로부터 잘라내었다. 이어서, 전자동 단백질 1차 구조 분석 장치 PPSQ-23A(시마즈 세이사꾸쇼)를 이용하여 단백질의 N 말단 아미노산 서열을 해독하였다. 그 결과, 서열 목록의 서열 23에 기재된 산 배열과 서열 목록의 서열 24에 기재된 배열이 혼합하여 검출됨으로써, 형질 전환체는 틀림없이 Q6주 유래의 니트릴히드라타제를 현저한 양 생산하고 있는 것이 판명되었다. 한편, 친주인 M33주의 샘플에는 당연하지만 Q6주 유래의 니트릴히드라타제의 위치에 상당하는 밴드는 없었다.

본 발명의 미생물은 고온, 및 고니트릴 화합물 농도나 고아미드 화합물 농도하의 반응에서도 니트릴 화합물을 대응하는 아미드 화합물로 변환하는 분야에서 바람직하게 이용할 수 있다.

도 1은 지오바실루스·서모글루코시다시어스 Q-6(Geobacillus thermoglucosidasius Q-6)주의 니트릴히드라타제 β서브 유닛, α서브 유닛 및 하류 유전자군의 유전자 구성 및 제한 효소 지도를 나타낸다. 콜로니 하이브리다이제이션으로 취득한 단편(Hin 2.3) 및 로도코커스속 세균으로 발현시켰을 때에 도입한 단편(βα1)의 위치를 나타내었다.

도 2는 로도코커스·로도크로스 M33(Rhodococcus rhodochrous M33)주의 니트릴히드라타제 유전자 β서브 유닛, α서브 유닛 및 하류 유전자군의 유전자 구성 및 그 주변 영역의 제한 효소 지도를 나타낸다. 제한 효소 지도의 양쪽 말단이 플라크 하이브리다이제이션에서 얻은 λ311의 DNA로부터 서브클로닝에 이용한 KpnI와 SacI에 상당한다. 굵은선부가 M33 KSNH-pHSG298에 이용한 부분이고, 굵은선의 끊어진 부분에 링커가 삽입되어 있다.

도 3은 로도코커스·로도크로스 M33(Rhodococcus rhodochrous M33)주 및 그 형질 전환체를 이용한 아크릴아미드 생산 반응의 결과를 나타내는 그래프이다.

SEQUENCE LISTING <110> Asahi Kasei Corporation <120> A transformant expressing nitrile hydratase <130> A51842A <160> 33 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223> Nitrile hydratase alpha-subunit <400> 1 Met Ser Val Gln Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro Ala 1 5 10 15 Gln Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Ser Gly Leu 20 25 30 Val Ser Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ile Ile Glu Ala Tyr Glu Asn Asp 35 40 45 Ile Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp Val Asp 50 55 60 Pro Asp Tyr Lys Glu Arg Leu Leu Arg Asp Gly Thr Ser Ala Ile Ala 65 70 75 80 Glu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Gln Gly Glu His MET Val Val Val Glu 85 90 95 Asn Thr Pro Lys Val His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys 100 105 110 Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Ser Trp Tyr Lys Ser Ala 115 120 125 Ser Tyr Arg Ala Arg Ile Val Ser Glu Pro Arg Thr Val Leu Lys Glu 130 135 140 Phe Gly Leu Glu Leu Asp Asp Asp Val Glu Ile Arg Val Trp Asp Ser 145 150 155 160 Ser Ala Glu Ile Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr 165 170 175 Glu Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Thr Arg Asp Ser 180 185 190 Met Ile Gly Val Ala Lys Ile Lys Ser Pro Val Lys Lys 195 200 205 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223> Nitrile hydratase beta-subunit <400> 2 Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro 1 5 10 15 Ile Ile Lys His Asp Gln Glu Pro Leu Phe His Glu Glu Trp Glu 20 25 30 Ala Lys Val Leu Ala Met His Phe Ala Leu Leu Gly Gln Gly Val 35 40 45 Ile Asn Trp Asp Glu Phe Arg His Gly Ile Glu Arg Met Gly Tyr 50 55 60 Val Tyr Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ser 65 70 75 Leu Glu Thr Val Leu Ala Glu Lys Asn Ile Ile Asn Ser Glu Gln 80 85 90 Tyr Arg Lys Arg Ile Arg Glu Ile Glu Tyr Gly Met Ser Val Pro 95 100 105 Val Ser Glu Lys Pro Glu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Ser Glu Val 110 115 120 Ile Tyr Gly Thr Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Glu Ser Thr Val 125 130 135 Ser Pro Arg Phe Arg Pro Gly Asp Arg Val Arg Val Lys His Phe 140 145 150 Tyr Thr Asn Lys His Thr Arg Cys Pro Gln Tyr Val Met Gly Lys 155 160 165 Val Gly Val Val Glu Leu Leu His Gly Asn His Val Phe Pro Asp 170 175 180 Ser Asn Ala His Gly Asp Gly Glu Ala Pro Gln Pro Leu Tyr Asn 185 190 195 Val Arg Phe Glu Ala Arg Glu Leu Trp Gly Gly Glu Ala His Glu 200 205 210 Lys Asp Ser Leu Asn Leu Asp Leu Trp Asp Ser Tyr Leu Thr His 215 220 220 Ala 226 <210> 3 <211> 1663 <212> DNA <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223> Nitrile hydratase beta -subunit, alpha-subunit, orf3 <221> CDS <222> 1..681 <223> Nitrile hydratase beta-subunit <221> CDS <222> 695..1312 <223> Nitrile hydratase alpha-subunit <221> CDS <222> 1325..1663 <223> orf3 <400> 3 atg aac ggc ccg cac gat tta ggt gga aaa cgt gat ttt ggc cca 45 Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro 1 5 10 15 atc att aaa cat gat caa gaa cct ctt ttt cat gaa gaa tgg gaa 90 Ile Ile Lys His Asp Gln Glu Pro Leu Phe His Glu Glu Trp Glu 20 25 30 gca aaa gta ctg gcg atg cat ttt gct tta ctt gga caa gga gta 135 Ala Lys Val Leu Ala Met His Phe Ala Leu Leu Gly Gln Gly Val 35 40 45 atc aac tgg gat gaa ttt agg cat ggt ata gaa cgg atg gga tat 180 Ile Asn Trp Asp Glu Phe Arg His Gly Ile Glu Arg Met Gly Tyr 50 55 60 gtt tat tac ctt act tca agc tat tat gaa cat tgg ctt gct tca 225 Val Tyr Tyr Leu Thr Ser Ser Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ser 65 70 75 cta gaa acc gta ttg gcc gag aaa aat atc att aac agt gaa cag 270 Leu Glu Thr Val Leu Ala Glu Lys Asn Ile Ile Asn Ser Glu Gln 80 85 90 tat aga aag aga att agg gaa ata gaa tat ggc atg agt gta cct 315 Tyr Arg Lys Arg Ile Arg Glu Ile Glu Tyr Gly Met Ser Val Pro 95 100 105 gtc agc gaa aag cct gag tta aaa gag tct ttg tta tcc gaa gtg 360 Val Ser Glu Lys Pro Glu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Ser Glu Val 110 115 120 atc tat ggc acg aaa ata tca tcc gaa cgg aga gaa agc act gta 405 Ile Tyr Gly Thr Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Glu Ser Thr Val 125 130 135 tct ccg cgg ttt cgt cct gga gat aga gtg agg gta aaa cac ttt 450 Ser Pro Arg Phe Arg Pro Gly Asp Arg Val Arg Val Lys His Phe 140 145 150 tat aca aac aag cat act aga tgt cct caa tat gtc atg ggg aaa 495 Tyr Thr Asn Lys His Thr Arg Cys Pro Gln Tyr Val Met Gly Lys 155 160 165 gta gga gtt gta gaa ctt ctt cat ggg aat cat gtt ttc cca gac 540 Val Gly Val Val Glu Leu Leu His Gly Asn His Val Phe Pro Asp 170 175 180 tct aac gct cat ggt gat ggc gag gct ccg caa ccg ctt tac aat 595 Ser Asn Ala His Gly Asp Gly Glu Ala Pro Gln Pro Leu Tyr Asn 185 190 195 gtg cgc ttt gaa gca aga gaa ctg tgg gga ggc gag gct cac gaa 630 Val Arg Phe Glu Ala Arg Glu Leu Trp Gly Gly Glu Ala His Glu 200 205 210 aaa gat agt cta aat ctc gac tta tgg gat agc tat cta act cac 675 Lys Asp Ser Leu Asn Leu Asp Leu Trp Asp Ser Tyr Leu Thr His 215 220 225 gcg taa aggaggaaaa atc 694 Ala 226 atg agt gta caa aaa gtt cat cac aac gtt ctg cct gaa aag cct 739 Met Ser Val Gln Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro 1 5 10 15 gct caa act cgg aca aag gct ttg gaa tcg ctg ttg atc gaa tct 784 Ala Gln Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Ser 20 25 30 gga ttg gtc tcc act gat gcc ctt gat gcg att att gaa gcc tat 829 Gly Leu Val Ser Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ile Ile Glu Ala Tyr 35 40 45 gaa aat gat att ggg cct atg aat ggg gca aaa gtt gtt gca aaa 874 Glu Asn Asp Ile Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys 50 55 60 gct tgg gtt gat cct gat tac aaa gaa aga ttg ctt cgg gat ggg 910 Ala Trp Val Asp Pro Asp Tyr Lys Glu Arg Leu Leu Arg Asp Gly 65 70 75 act tcg gct att gca gag ctt ggc ttt tta ggg ttg cag ggg gag 964 Thr Ser Ala Ile Ala Glu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Gln Gly Glu 80 85 90 cac atg gtt gtt gtc gaa aat acg cct aaa gtt cat aat gta gta 1009 His Met Val Val Val Glu Asn Thr Pro Lys Val His Asn Val Val 95 100 105 gtt tgt acg cta tgt tcc tgc tat ccg tgg cct gtc cta ggc ttg 1054 Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu 110 115 120 cct cct tca tgg tat aaa agt gct tca tac agg gct cga att gtt 1099 Pro Pro Ser Trp Tyr Lys Ser Ala Ser Tyr Arg Ala Arg Ile Val 125 130 135 tca gag cca aga act gta ctt aaa gag ttt ggg ctt gaa ctg gat 1144 Ser Glu Pro Arg Thr Val Leu Lys Glu Phe Gly Leu Glu Leu Asp 140 145 150 gat gat gtt gaa att agg gtt tgg gac agc agt gct gaa att cga 1189 Asp Asp Val Glu Ile Arg Val Trp Asp Ser Ser Ala Glu Ile Arg 155 160 165 tat tta gtt ctt cca gaa aga cct gca ggt act gaa ggg tgg tcg 1234 Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Glu Gly Trp Ser 170 175 180 gaa gag gaa ctg gct aaa ctt gta acg cgt gac tct atg atc ggt 1279 Glu Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly 185 190 195 gtg gcc aag ata aag tcg cct gtt aaa aaa taa ggggggacaa aa 1324 Val Ala Lys Ile Lys Ser Pro Val Lys Lys 200 205 atg gtt caa tca aat ctt caa ata aaa ccg gat gag att cta cct 1369 Met Val Gln Ser Asn Leu Gln Ile Lys Pro Asp Glu Ile Leu Pro 1 5 10 15 gaa cct agg aga aca gaa aat gag ccg gtt ttt aat tcc ccg tgg 1414 Glu Pro Arg Arg Thr Glu Asn Glu Pro Val Phe Asn Ser Pro Trp 20 25 30 gaa gcc cgg att ttt gct atg aca atc aat ttg tat gac aaa aaa 1459 Glu Ala Arg Ile Phe Ala Met Thr Ile Asn Leu Tyr Asp Lys Lys 35 40 45 ttc ttt gat tgg gag gac ttt cga caa gga tta ata gct gaa att 1504 Phe Phe Asp Trp Glu Asp Phe Arg Gln Gly Leu Ile Ala Glu Ile 50 55 60 gca gtt gcg gac agc ctt cct gag aat gaa cga cca acc tac tac 1549 Ala Val Ala Asp Ser Leu Pro Glu Asn Glu Arg Pro Thr Tyr Tyr 65 70 75 gaa agt tgg ctg gcc gct ttg gaa aag ttg tta atc aag gat ggt 1594 Glu Ser Trp Leu Ala Ala Leu Glu Lys Leu Leu Ile Lys Asp Gly 80 85 90 ata tta aca aaa gaa caa ata gat gaa cgc act aaa gaa ttg aaa 1639 Ile Leu Thr Lys Glu Gln Ile Asp Glu Arg Thr Lys Glu Leu Lys 95 100 105 gaa ggt ata aga aaa agt tgc tag 1663 Glu Gly Ile Arg Lys Ser Cys 110 <210> 4 <211> 5374 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous M33 <223> Nitrile hydratase beta -subunit, alpha-subunit, orf3 <221> CDS <222> 3572-4228 <223> Nitrile hydratase beta-subunit <221> CDS <222> 4275-4883 <223> Nitrile hydratase alpha-subunit <221> CDS <222> 4883-5197 <223> orf3 ggtacccgcg gccacggaca gcaccccggc cagcgtcggt cccaggcacg gggtccatcc 60 cagcgcgaac accccgccca acagcggggc gccggcgagg gaggagatgc gccggggcgc 120 gaagcgggtg tccttctgca agaccgggat cagcccgaga aacgccaggg ccatgacgat 180 ggtgaccact ccgccgaggc gttggagcag ctcctgawtg agccgcaacg ccccgatcac 240 cccgaacacc gagaccgtgg ccagcacgaa caccacggtg aatcctgcga cgaacaatgc 300 cgcggctccg gtgacccgcc accgtcctgg agcgtgtacc ccggcggtgc gtacctcggc 360 ggtgagcggt ggagcgtcgg caccggagac gccggccaga tatgacaggt agcccggcac 420 caagggcacc acacacgggg aggcgaagga gatcagtccg gccagtaaac aggcgcccac 480 cgccaagagc agcggcccgg tcgcggctgc cgtctggaaa ctcgagccga ctccttgcgc 540 gagcacggtc accgtcactg ttcggccgcc actcgttcga cgaccggttg caaatcctcg 600 gtcagcagag cccgcagaaa caccgccgcg acgcggtgcc gccggtcgag gacgagtgtg 660 gacgggatga cgctggtggg aaaggcgcca ccgagggcgg tcagggtgcg catcgggggg 720 tcgtagatcg acgggtagga gacattgttg tcgatgacga agtcttgggc cttgtcgcgc 780 tgggggtcgc ggacgttgat gccgagaaac tgcaccccca gcgcccgagt ggcctcgtag 840 gcgcgttcga ggtcgtcggc ctcgctgcgg cacggggcgc accactgacc ccacaggttg 900 agcacgacca cctgtccggc gtagtcggcc aggtcgaccg tggccccgtc ggtcatcaga 960 tccgggccgg ccagcgcccc cagttgtccg cgctcggccg gcggatcgta gaagatgtcg 1020 gtctggccgc cgggagcgac gaagtcgaag gtgccgccct gggcgacggc gtcggtgccg 1080 gtgccgcagg cgccgacccc cagtaccgcc acaagagcca gcaccagcac ctgccacgat 1140 cgtcgacgag gcgctcgctg taccggcggc ctcacccgaa cccggccgcc gcgcaacgca 1200 tcggctggcc ggtccgcgga cgtggctgcg cacacgaggc cggcagccga ctccgtgtgc 1260 tgccccgttc tcaccgacgg tcccgtccgc cggtcgatcc cgagggggca ctgcgctgtc 1320 gtgtcggcgg ctcgaggtgc gtcgtgatca cggcgtcgtc ttcctgtcac ggcccacatc 1380 gccctgcaca cgcagggtcg cggaacgcaa tcgaccctgc gatccgggga cgtgtggacc 1440 ttcggtgttg tcgtccggcc caaatactac ttcacatagt atttatgtcg agcaatgggt 1500 cggcggcaca tccatcacgg cgtacgtccc gggcctccag cgtcgatgtc cgcgcagcgg 1560 gcgaagggtg ctggctcctg ccaccgatgg aaccccagct caccgcactg acatcccggc 1620 gggactctct ccgcggccac tgacattctc gtgacgagag cccctgacat gcactgacga 1680 atccccaggt cgcaaccact gaaattctcg tgcagagtct cacttgcctc ggatgctgga 1740 caaagcctca ggtccgatgg cacaggacaa gtgtcctttg ccattcgatc cgaggtacga 1800 atgggtcgct gaccagcggt gcctcaacaa tgtggcacag cggcgccgcg gcgtttctgc 1860 ccacattgtt gaggcaaagg gacgtcgagc atgcggggtt gtcgacgaga acgtggcagg 1920 tagagcgcct caacttggtg gcagaaaccc tgcctttgcc tcaggtgcgg tggcactgcc 1980 tcaggtctga tggcacagga cagagaacca gaagatccgg ataaatacgg caaaacggtc 2040 acctgggggt ttgtcactcc cggtttgtgc ggtgtcggca acgtaaattc ctgcgatcgg 2100 cgtgatcagg aaggcggaac gccagcgccg cggtgaccag gcgatccaca tgcttcgtcg 2160 ttgtcggcgc aggngagccc agggatcgag cgatctcggt catcgcgatt ccatcgttgc 2220 ggacgatgat gtccaatacg taccactggt ccgcggtcaa cttctcttga tcgaccacgt 2280 tatggattct acgactcagg gaccggctca cggcttccag ggcgcctccg accaaaggtg 2340 atcgaacgac atttccggat tcagccaccg cttccgactc gatcattcct gtccctcccc 2400 gtccacgcgc agttgatctt acctcctcat caagaggata tccactgaac gaattatttc 2460 aagtggaagt acttggagtc gatcctacac gtgagtggac aatgcctggg tgctagtcgg 2520 atgtacgacc cccaccctct cctcccgccc acgtcgaggg caggaaccag cgtcgtccca 2580 gcctgccgtc tcttgcagct gttgtgaacg cccgagcggc ctcacggctc ttcagttggc 2640 gcggatcgcc atggcggacg tcgcccacga cgggacctac gcatcctcgg ccggaaggca 2700 gccgcggtca cgaacgccgt agcggcagtt gcgcacctga gacgaagact gccggcgtcc 2760 tgccccggaa atccgcagcc cagctgtgac agccatgtga cagccaacag tcgtggcggt 2820 tcccttccgt actaggggct ttgactcggc gccaacgcct gcgagggcgc tcgtcgcgga 2880 ccacttgtcc aggtctgtgc cgcaggtcac cgagcgcacc cttcttcgtt ctatgcgcat 2940 cggcctggac tgcgaccgcg gcaacactgc gacgtctgac aatgctgatc accctgccgc 3000 cgttggacga ccacggttgc tacgagtgtg cggagccaac cataggcatc atgcgatcgc 3060 cggagtcttc atcctgtttt gggatgcgca ggattaacac atctacacat tgacatccgt 3120 tccgatgtga agtaaaaatt gtcacgtagg gcggcaggcg aagtctgcag ctcgaacatc 3180 gaagggtggg agccgagaga tcggagacgc agacacccgg agggaaccta gcctcccgga 3240 ccgatgcgtg tcctggcaac gcctcaagat tcagcgcaag cgattcaatc ttgttacttc 3300 cagaaccgaa tcacgtcccc gtagtgtgcg gggagagcgc ccgaacgcag ggatggtatc 3360 catgcgcccc ttctcttttc gaacgagaac cggccgctac agccgacccg gagacactgt 3420 gacgccgttc aacgattgtt gtgctgtgaa ggattcactc aagccaactg atatcgccat 3480 tccgttgccg gaacatttga caccttctcc ctacgagtag aagccagctg gacccctctt 3540 tgagcccagc tccgatgaaa ggaatgagga a atg gat ggt atc cac gac aca 3592 　　　Met Asp Gly Ile His Asp Thr 1 5 ggc ggc atg acc gga tac gga ccg gtc ccc tat cag aag gac gag ccc 3640 Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro 10 15 20 ttc ttc cac tac gag tgg gag ggt cgg acc ctg tcg att ctg acc tgg 3688 Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp 25 30 35 atg cat ctc aag ggc atg tcg tgg tgg gac aag tcg cgg ttc ttc cgg 3736 Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg 40 45 50 55 gag tcg atg ggg aac gaa aac tac gtc aac gag att cgc aac tcg tac 3784 Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr 60 65 70 tac acc cac tgg ctg agt gcg gca gaa cgt atc ctc gtc gcc gac aag 3832 Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys 75 80 85 atc atc acc gaa gaa gag cga aag cac cgt gtg cag gag atc ctc gag 3880 Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu 90 95 100 ggt cgg tac acg gac agg aac ccg tcg cgg aag ttc gat ccg gcc gag 3928 Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu 105 110 115 atc gag aag gcg atc gaa cgg ctt cac gag ccc cac tcc cta gca ctt 3976 Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His Glu Pro His Ser Leu Ala Leu 120 125 130 135 cca gga gcg gag ccg agt ttc tcc ctc ggt gac aag gtc aaa gtg aag 4024 Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu Gly Asp Lys Val Lys Val Lys 140 145 150 aat atg aac ccg ctg gga cac aca cgg tgc ccg aaa tat gtg cgg aac 4072 Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn 155 160 165 aag atc ggg gaa atc gtc acc tcc cac ggc tgc cag atc tat ccc gag 4120 Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu 170 175 180 agc agc tcc gcc ggc ctc ggc gac gat ccc cgc ccg ctc tac acg gtc 4168 Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val 185 190 195 gcg ttt tcc gcc cag gaa ctg tgg ggc gac gac gga aac ggg aaa gac 4216 Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp 200 205 210 215 gta gtg tgc gtc gatctctggg aaccgtacct gatctctgcg tgaaaggaat acgat 4273 Val Val Cys Val 219 a gtg agc gag cac gtc aat aag tac acg gag tac gag gca cgt acc aag 4322 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 gca atc gaa act ttg ctg tac gag cga ggg ctc atc acg ccc gcc gcg 4370 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 gtc gac cga gtc gtt tcg tac tac gag aac gag atc ggc ccg atg ggc 4418 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 ggt gcc aag gtc gtg gcg aag tcc tgg gtg gac cct gag tac cgc aag 4466 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 tgg ctc gaa gag gac gcg acg gcc gcg atg gcg tca ttg ggc tat gcc 4514 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 ggt gag cag gca cac caa att tcg gcg gtc ttc aac gac tcc caa acg 4562 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 cat cac gtg gtg gtg tgc act ctg tgt tcg tgc tat ccg tgg ccg gtg 4610 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 ctt ggt ctc ccg ccc gcc tgg tac aag agc atg gag tac cgg tcc cga 4658 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 gtg gta gca gac cct cgt gga gtg ctc aag cgc gat ttc ggt ttc gac 4706 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 atc ccc gat gag gtg gag gtc agg gtt tgg gac agc agc tcc gaa atc 4754 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 cgc tac atc gtc atc ccg gaa cgg ccg gcc ggc acc gac ggt tgg tcc 4802 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 gag gac gag ctg gcg aag ctg gtg agt cgg gac tcg atg atc ggt gtc 4850 Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 agt aat gcg ctc aca ccc cag gaa gtg atc gta tg agt gaa gac aca 4897 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val Ser Glu Asp Thr 195 200 　　　 2 5 ctc act gat cgg ctc ccg gcg act ggg acc gcc gca ccg ccc cgc gac 4945 Leu Thr Asp Arg Leu Pro Ala Thr Gly Thr Ala Ala Pro Pro Arg Asp 10 15 20 aat ggc gag ctt gta ttc acc gag cct tgg gaa gca acg gca ttc ggg 4993 Asn Gly Glu Leu Val Phe Thr Glu Pro Trp Glu Ala Thr Ala Phe Gly 25 30 35 gtc gcc atc gcg ctt tcg gat cag aag tcg tac gaa tgg gag ttc ttc 5041 Val Ala Ile Ala Leu Ser Asp Gln Lys Ser Tyr Glu Trp Glu Phe Phe 40 45 50 cga cag cgt ctc att cac tcc atc gct gag gcc aac ggt tgc gag gca 5089 Arg Gln Arg Leu Ile His Ser Ile Ala Glu Ala Asn Gly Cys Glu Ala 55 60 65 tac tac gag agc tgg aca aag gcg ctc gag gcc agc gtg gtc gac tcg 5137 Tyr Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Ala Leu Glu Ala Ser Val Val Asp Ser 70 75 80 85 ggg ctg atc agc gaa gat gag atc cgc gag cgc atg gaa tcg atg gcc 5185 Gly Leu Ile Ser Glu Asp Glu Ile Arg Glu Arg Met Glu Ser Met Ala 90 95 100 atc atc gac tgacatcccc tgcgtttcca tccagcagca gtgcgggcgt accccgacg 5243 Ile Ile Asp 103 gggctgagcc gacggggtac gcccgcactt cattcaatga cgttctgagg cacacagcgc 5303 agagtcgagc tgagtgcctc agaacgtcat gacggtggtt ctctaattcg gctgcggtgg 5363 gtactgagct c 5374 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 5 gtncaraarg tncaycayaa yg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 6 ccncaraarc cngcncarac 20 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 7 caycancanc ayytncc 17 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 8 acrttrtgrt gnacyttytg nac 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 9 gtytgngcng gyttytgngg 20 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 10 ggnarrtgnt gntgrtg 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 11 atgaayggnc cncayga 17 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 12 aarmgngayt tyggncc 17 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 13 athathaarc aygaycarga rcc 23 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 14 arrtcrtgng gnccrttcat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 15 thrtcrtgyt tdatdatngg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 16 tcytcytcra araanarngg 20 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 17 gcgraartcy yccca 15 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 18 ccartgytcr tarttcc 17 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 19 agatagtcta aatctcgact tatgg 25 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 20 atgaacggcc cgcacgattt aggtgg 26 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 21 catatgaacg gcccgcacga tttaggtgg 29 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> degenerate PCR primer for amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 22 cagatcttat tttttaacag gcgactttat cttggcg 37 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223> N-terminal amino acid sequence of nitrile hydratase alpha-subunit <400> 23 Met Ser Val Gln Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro 1 5 10 15 Ala Gln Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu 20 25 <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223> N-terminal amino acid sequence of nitrile hydratase beta-subunit <400> 24 Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro 1 5 10 15 Ile Ile Lys His Asp Gln Glu Pro Leu Phe 20 25 <210> 25 <211> 618 <212> DNA <213> Geobacillus thermoglucosidasius <223> probe for colony hybridization (nitrile hydratase alpha-subunit) <400> 25 atgagtgtac aaaaagttca tcacaacgtt ctgcctgaaa agcctgctca aactcggaca 60 aaggctttgg aatcgctgtt gatcgaatct ggattggtct ccactgatgc ccttgatgcg 120 attattgaag cctatgaaaa tgatattggg cctatgaatg gggcaaaagt tgttgcaaaa 180 gcttgggttg atcctgatta caaagaaaga ttgcttcggg atgggacttc ggctattgca 240 gagcttggct ttttagggtt gcagggggag cacatggttg ttgtcgaaaa tacgcctaaa 300 gttcataatg tagtagtttg tacgctatgt tcctgctatc cgtggcctgt cctaggcttg 360 cctccttcat ggtataaaag tgcttcatac agggctcgaa ttgtttcaga gccaagaact 420 gtacttaaag agtttgggct tgaactggat gatgatgttg aaattagggt ttgggacagc 480 agtgctgaaa ttcgatattt agttcttcca gaaagacctg caggtactga agggtggtcg 540 gaagaggaac tggctaaact tgtaacgcgt gactctatga tcggtgtggc caagataaag 600 tcgcctgtta aaaaataa 618 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer for amplification of partial DNA fragment of M33(F05) <400> 26 gaccacttgt ccaggtctg 19 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer for amplification of partial DNA fragment of M33(R18) <400> 27 gggcccatcg atagatctca tatgctcatt cctttcatcg g 41 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> forward primer for PCR amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6(alpha-maeF1) <400> 28 gcccatatga acggcccgca cgatttagg 29 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse primer for PCR amplification of partial DNA fragment of Geobacillus thermoglucosidasius Q6(orf1-atoR1eF1) <400> 29 gcgaggagtt taatatagga agatcta 27 <210> 30 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide sequence for adaptor(Ad５F―SacKpnNotI) <400> 30 ccggtaccgc 10 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide sequence for adaptor (Ad５R―SacKpnNotI) <400> 31 ggccgcggta ccggagct 18 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer for PCR amplification of partial DNA fragment of Rhodococcus rhodochrous M33(NH5) <400> 32 ccgaattccc ggccgctaca gccgacc 27 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> reverse primer for PCR amplification of partial DNA fragment of Rhodococcus rhodochrous M33 (NH3) <400> 33 ggggatcctc ggtgaataca agctcgcc 28

Claims

하기 (A) 또는 (B) 중 어느 하나에 기재된 DNA에 의해 형질 전환된 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물.

(A) 니트릴히드라타제의 α서브 유닛에 대응하는 서열 목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열과, 니트릴히드라타제의 β서브 유닛에 대응하는 서열 목록의 서열 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 목록의 서열 2에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 함유하는 DNA이며, 니트릴히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(B) 니트릴히드라타제의 α서브 유닛을 코드하는 염기 서열에 대응하는 서열 목록의 서열 3의 695 내지 1312번째의 염기 서열, 또는 해당 염기 서열에 대하여 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열과, 니트릴히드라타제의 β서브 유닛을 코드하는 염기 서열에 대응하는 서열 목록의 서열 3의 1 내지 681번째의 염기 서열, 또는 해당 염기 서열에 대하여 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 함유하는 DNA이며, 니트릴히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
형질 전환에 의해 하기의 이화학적 성질을 갖는 단백질을 생산할 수 있는 로 도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물.

(a) 니트릴히드라타제 활성을 갖는다.

(b) 기질 특이성: 아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로니트릴, n-발레로니트릴, n-부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 하여 활성을 나타낸다.

(c) 분자량: 적어도 하기 2종의 서브 유닛으로 구성되는 단백질이며, 각 서브 유닛의 환원형 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같다.

서브 유닛α 분자량: 25000±2000

서브 유닛β 분자량: 28000±2000

(d) 열 안정성: 수액 중의 효소를 70 ℃의 온도에서 30 분간 가열한 후에, 가열 전의 35 ％ 이상의 활성이 잔존한다.

(e) 6 중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 하여도, 그것 이하의 기질 농도시에 비해 활성이 감소하지 않는다.

(f) 35 중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 갖는다.
제1항에 있어서, 형질 전환에 의해 하기의 이화학적 성질을 갖는 단백질을 생산할 수 있는 미생물.

(a) 니트릴히드라타제 활성을 갖는다.

(b) 기질 특이성: 아크릴로니트릴, 아디포니트릴, 아세토니트릴, 이소부티로 니트릴, n-발레로니트릴, n-부티로니트릴, 벤조니트릴, 헥산니트릴을 기질로 하여 활성을 나타낸다.

(c) 분자량: 적어도 하기 2종의 서브 유닛으로 구성되는 단백질이며, 각 서브 유닛의 환원형 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의한 분자량이 이하와 같다.

서브 유닛α 분자량: 25000±2000

서브 유닛β 분자량: 28000±2000

(d) 열 안정성: 수액 중의 효소를 70 ℃의 온도에서 30 분간 가열한 후에, 가열 전의 35 ％ 이상의 활성이 잔존한다.

(e) 6 중량％의 아크릴로니트릴을 기질로 하여도, 그것 이하의 기질 농도시에 비해 활성이 감소하지 않는다.

(f) 35 중량％의 아크릴아미드 수용액 중에서도 아크릴로니트릴을 기질로 한 활성을 갖는다.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 로도코커스속에 속하는 미생물이 로도코커스·로도크로스 M33(Rhodococcus rhodochrous M33)주(VKM Ac-1515D 또는 KCCM-10635) 및/또는 그 변이체인 미생물.
니트릴히드라타제 유전자에 의해 형질 전환된 로도코커스·로도크로스 M33(Rhodococcus rhodochrous M33)주(VKM Ac-1515D 또는 KCCM-10635) 및/또는 그 변이체 중 어느 하나의 미생물.
하기 (A) 또는 (B) 중 어느 하나에 기재된 DNA에 의해 로도코커스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물을 형질 전환하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 미생물의 제조 방법.

(A) 니트릴히드라타제의 α서브 유닛에 대응하는 서열 목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열과, 니트릴히드라타제의 β서브 유닛에 대응하는 서열 목록의 서열 2에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 목록의 서열 2에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 함유하는 DNA이며, 니트릴히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(B) 니트릴히드라타제의 α서브 유닛을 코드하는 염기 서열에 대응하는 서열 목록의 서열 3의 695 내지 1312번째의 염기 서열, 또는 해당 염기 서열에 대하여 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열과, 니트릴히드라타제의 β서브 유닛을 코드하는 염기 서열에 대응하는 서열 목록의 서열 3의 1 내지 681번째의 염기 서열, 또는 해당 염기 서열에 대하여 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기 서열을 함유하는 DNA이며, 니트릴히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 미생물을 배지에서 배양하는 것을 포함하는 니트릴히드라타제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물의 제조 방법.
제7항에 기재된 제조 방법에 의해 제조되는 니트릴히드라타제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물.
제8항에 기재된 니트릴히드라타제 또는 그것을 함유하는 균체 처리물을 니트릴 화합물에 작용시켜, 상기 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 합성하는 것을 포함하는 아미드 화합물의 제조 방법.