WO2004108942A1 - 新規なニトリルヒドラターゼ - Google Patents

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WO2004108942A1
WO2004108942A1 PCT/JP2004/008515 JP2004008515W WO2004108942A1 WO 2004108942 A1 WO2004108942 A1 WO 2004108942A1 JP 2004008515 W JP2004008515 W JP 2004008515W WO 2004108942 A1 WO2004108942 A1 WO 2004108942A1
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dna
subunit
activity
protein
seq
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PCT/JP2004/008515
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kaoru Furuya
Akira Tamaki
Shin-Ichiro Nagasawa
Ayano Suzuki
Original Assignee
Asahi Kasei Kabushiki Kaisha
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Definitions

  • the present invention relates to a technique for producing an amide compound from a tolyl compound by the enzyme-catalyzed action of a novel tolyl hydratase derived from a microorganism newly isolated from nature.
  • the enzyme of the microorganism is used as a catalyst
  • the method used is becoming mainstream.
  • Such enzymes are generally called nitrile hydratases, but since the first report, a large number of enzymes have been discovered from various microorganisms.
  • the genus Arthropacter Agricultural and Biological Chemistry Vol. 4 p. 2251-2252, 1980
  • the genus Agrobacterium Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Rhodococcus genus Japanese Patent Laid-Open No. 63-137688
  • Hei 02-227069 JP 2002-369697, JP Hei 2-470
  • Rhizobium lhizobium genus JP 05-23 6 9 7 7
  • genus Pseudonocardia JP Hei 5-56684 Etc.
  • These enzymes are diverse in their physicochemical properties based on the diversity of their amino acid sequences, and research has been conducted in line with various purposes.
  • physicochemical properties as an example for which the elucidation of the stability to heat or an amidated compound or a nitrile compound etc. is progressing, there is a document related to a strain of Rhodococcus rhodochrous J1.
  • the physicochemical properties of the enzyme it is desirable to have thermal stability, ditolyl hydratase as a substrate, and ditolyl hydratase which maintains high activity even in the presence of a high concentration of an amide compound as a product.
  • the absolute value of these may vary depending on the embodiment of the enzyme used for the reaction and the kind of the tolyl compound, and an enzyme having all of them has not been found. Also, as a subject of improvement of physicochemical properties using evolutionary engineering etc. in the future, development of various enzymes with an unprecedented origin is desired.
  • the object of the present invention is to isolate ditolyl hydratase having high stability to heat and high concentration compounds from the natural world, a method for producing the enzyme, and a corresponding amide compound from a nitril compound using the enzyme. It is to provide a manufacturing method. Further, the present invention provides the amino acid sequence and gene sequence of the enzyme, a recombinant plasmid containing the gene, a transformed strain containing the recombinant plasmid, a method of producing the enzyme using the transformed strain, and the trait It is an object of the present invention to provide a process for producing a corresponding amide compound from a ditolyl compound using a transformed strain. In addition, the amino acid sequence and gene sequence of a protein having an action of further activating the recombinant tolyl hydratase enzyme are also provided.
  • the present inventors have studied diopylol as a microorganism having ditolylhydratase activity from the soil near the hot spring in Saitama Prefecture. It was found that Tinores ⁇ Samoglucosidesius (Geobacillus thermoglucosidasius).
  • the microorganism of the genus Diobacterium has ditolyl hydratase and exhibits ditolyl hydratase activity, and the temperature of 65 ° C., which is usually used for culturing this microorganism, is the conventional ditolyl hydratase. This is above the normal culture temperature (45 ° C to 60 ° C) of the thermophilic bacterium carrying hydratase.
  • a ditolyl hydratase enzyme was purified from the microorganism, and it was shown that its ditolyl hydratase activity has high stability to heat, high concentration ditryl compounds and amide compounds.
  • the ditolyl hydratase gene was isolated from the chromosomal DNA of the microorganism, and the amino acid sequence and gene sequence were clarified for the first time. The homology with ditolyl hydratase was found to be very low.
  • by simultaneously expressing an activation protein and a putative gene sequence existing downstream of the gene it has succeeded in creating a genetically modified strain that expresses a large amount of the enzyme, and the present invention is achieved. It came to
  • the present invention provides the following.
  • Molecular weight A protein composed of at least the following two types of subunits, and the molecular weight of each subunit by reduced SDS-polyacrylamide electrophoresis is as follows.
  • the (f) 35 weight 0/0 of Akurironitoriru even acrylamide in an aqueous solution having an activity as a substrate.
  • (C) A combination of a DNA containing the sequence of positions 695 to 1312 of the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, and a DNA containing the sequence of position 1 681 of the base sequence of SEQ ID NO: 3 of the sequence listing. DNA characterized by consisting of.
  • (D) A DNA comprising the sequence at positions 695-1312 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing, or one of the DNAs which hybridize under stringent conditions to the DNA.
  • (C) A DNA comprising the sequence at positions 695-1312 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing, or one of the DNAs which hybridize under stringent conditions to the DNA.
  • a DNA containing the sequence of positions 1255-1663 of the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, or hybridizing to the DNA under stringent conditions and involved in the activation of nitrylhydratase Any one of the DNAs encoding the protein characterized by the feature is further characterized in that
  • a method for producing a protein, or a treated product of a bacterial cell containing the protein which comprises culturing in a culture medium a microorganism which belongs to the genus Geobacillus and is capable of producing a protein having the following physicochemical properties. .
  • Substrate specificity Activity is shown using acrylonitrile, adiponitrile, acetonitrile, isopropylonitrile, n -paleronitrile, n -butyronitrile, benzonitrile, hexaneditolyl as a substrate.
  • Molecular weight A protein composed of at least the following two types of subunits, and the molecular weight of each subunit by reduced SDS-polyacrylamide electrophoresis is as follows.
  • Molecular weight A protein composed of at least the following two types of subunits, and the molecular weight of each subunit by reduced SDS-polyacrylamide electrophoresis is as follows.
  • the (f) 35 weight 0/0 of Akurironitoriru even acrylamide in an aqueous solution having an activity as a substrate.
  • a protein comprising: an ⁇ -subunit containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, and a ⁇ -subunit containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing .
  • a protein comprising: and a ⁇ -subunit encoded by one of the DNAs to be hybridized and having a tolyl hydratase activity.
  • (C) above except in the case of (C) above.
  • Molecular weight A protein composed of at least the following two types of subunits, which is a reduced SDS-polyacrylamide gel of each subunit: The molecular weight by motion is as follows
  • Molecular weight A protein composed of at least the following two types of subunits, wherein the molecular weight of each subunit by reduced SDS-polyacrylamide electrophoresis is as follows:
  • FIG. 1 shows the gene composition and the restriction enzyme map of the nitril hydratase / 3subunit, the ⁇ -subunit and the downstream gene group of the strain Diobacillus' thermo Dalcosidesius Q-6 (Geobacillus thermoglucosidas Q-6).
  • having a tolyl hydratase activity means adding a water molecule to a tolyl compound, such as acetoamide in the case of acetonitrile, n-propioamide in the case of n-propioditolyl, and such as acrylamide in the case of acrylonitrile. It has an activity of converting it into an amide compound.
  • the formed compound is separated by liquid chromatography, and then identified using gas chromatography Z mass spectrometry (GC, MS), infrared absorption spectrum (IR), nuclear magnetic resonance spectrum (NMR), etc. Do.
  • Dorataze activity in the present invention include, for example, 0.1 weight 0/0 of nitrile compound solution (0. 0 5M-phosphate buffer pH7. 7) lm l in nitrile hydratase enzyme solution 1
  • the reaction was stopped by adding 0 ⁇ l and keeping the reaction temperature at 27 to 60 ° C for 1 minute to 60 minutes, then adding 0.1 ml of IN HC1 to stop the reaction, and a portion of the reaction mixture was subjected to liquid chromatography. It can be analyzed graphically and the presence or absence of an amide compound can be assayed.
  • the ditrilyl compound to be a substrate in the present invention is, for example, aliphatic 2-tolyl compounds such as acetonitrile, n-propioditolyl, n-butyronitrile, iso-peptronitrile, n-valeronitril, n-hexaneditolyl and the like 2-tolyl compounds containing a halogen atom such as 2-chloropropionitrile, acrylonitrile, crotononite Aliphatic ditolyl compounds containing unsaturated bonds such as lyl and metatallyronitrile, hydroxy tolyl compounds such as lactitol 2 trilyl and mandelonitrile, aminonitrile compounds such as 2-phenyldarinonitrile, and aromatic compounds such as benzonitrile and cyanopyridine And trinitrilyl compounds such as dinitrile compounds such as malonoditolyl, succinonitrile, adiponitrile and the
  • the substrate specificity of the ditolyl hydratase of the present invention can be determined by measuring whether or not the substrate has ditolyl hydratase activity with respect to each substrate under various measurement conditions under the above-mentioned measurement conditions. it can. If substrate specificity is wide, increased the range of the corresponding amide compound kills with production, preferred, this enzyme is at least, ⁇ Tarironitoriru, adiponitrile, Asetonitoriru, I Su Wu Ciro nitrile, n - bar Reronitoriru, n- butyronitrile, benzonitrile Hexaneditolyl can be used as a substrate. .
  • the tolyl hydratase of the present invention can be prepared by reducing SDS (sodium-dodecyl-sulfate) -polyacrylamide gel electrophoresis and using a molecular weight of 250 500 ⁇ 20 00 and a molecular weight of 280 800 ⁇ 20 0 Two subunits of 0 are detected by staining with Coomassie single blue, the former being called the ⁇ subunit and the latter being called the subunit.
  • SDS sodium-dodecyl-sulfate
  • the ditolyl hydratase of the present invention Prior to the activity measurement, the ditolyl hydratase of the present invention, even after heat treatment at 70 ° C. for 30 minutes in the state of an aqueous solution not containing a stabilizer such as an organic acid, the activity before heating 3 It can retain 5% activity.
  • the ditolyl hydratase of the present invention the ⁇ -substitute shown by the sequence of 250 amino acids shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and the SEQ ID NO: 2 in the sequence listing It is mentioned as a preferable example that it is constituted by / 3 subunit represented by a sequence of 6 amino acids.
  • Metals and other peptides may be contained in addition to these two subunits. In particular, iron and cobalt are often contained as the metal.
  • proteins containing either one of these subunits may also be used.
  • amino acid sequences of individual subunits one or more amino acid substitutions, deletions or insertions may be made in the amino acid sequence as long as they form a complex with other subunits and have dithiolhydratase activity.
  • post-translational modification is also expected depending on the type of host.
  • the cysteine residue is often modified to cysteine sulfinic acid or cysteine sulfenic acid after translation.
  • An amino acid sequence in which 1 to 30 amino acids of the amino acid sequence are substituted, deleted, inserted or post-translationally modified is also mentioned as a preferred example, more preferably 1 to 10, still more preferably One to five, most preferably one to three.
  • the ditolyl hydratase enzyme having an amino acid sequence having such substitution, deletion or insertion is described in known site-directed mutagenesis methods, for example, in Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). It can be obtained by introducing it into a host microorganism and expressing it, as described later, using DNA in which substitution, deletion or insertion has been introduced at the corresponding site of the base sequence by the method of It is also possible to try to create mutant enzymes with industrially desirable properties such as improved organic solvent resistance and changes in substrate specificity. In view of the state of the art, when they have ditolylhydratase activity, they are intended to be included in the present invention.
  • the ditrinorehydratase having the above-mentioned physicochemical properties is, for example, It can be obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Tillus.
  • the microorganism used in the present invention may be any microorganism which belongs to the genus Diobacterium and has a hydration activity to convert a ditolyl compound into an amide compound.
  • the microorganism is not particularly limited to microorganisms derived from the genus Diobacillus, and includes the gene for nitryl hydratase derived from other microorganism strains, such as the Agrobacterium (Agrobacterium) genus, and the like. Achromobactei spp., Acacia spp. /. ⁇ Kacti (Acinetobacter) sp., Air mouth monas (Aeromonas sp.), Erterobacter sp., Erwinia sp., Xanthobacter sp., Klebsiella sp.
  • Corynebacterium Corynebacterium
  • Sinorhizobium Pseudomonas, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Bacillus, Micrococcus, Rhodococcus (Rhodococcus) genus, Rhodopseudomonas (Rhodopseudomonas) genus, Rhizobimu (Rhizobiu) m) genus, such as the genus Pseudonocardia.
  • screening was performed by the following method.
  • a culture vessel A portion of the culture broth is taken and placed in a general-purpose culture medium for growing microorganisms, for example, a liquid medium containing glycerol, polypeptone, yeast extract and the like as a main component, and at a culture temperature of 65 ° C. Incubate for about 7 days.
  • a general-purpose culture medium for growing microorganisms for example, a liquid medium containing glycerol, polypeptone, yeast extract and the like as a main component, and at a culture temperature of 65 ° C. Incubate for about 7 days.
  • Microorganisms can be isolated by spreading a part of the culture solution thus obtained on an agar plate medium containing the above-mentioned microorganism growth medium components and further culturing at 65 ° C. to form colonies. .
  • the microorganism thus obtained is used as a test tube or a flask containing a liquid medium obtained by further adding a nitrile compound such as n-valeroditolyl or an amide compound such as methacrylamide to the above-mentioned medium components, for a suitable period of time. For example, it is grown by shaking culture at a culture temperature of 65.degree. C. for about 12 hours to about 7 days, and the target microorganism is grown based on the above-mentioned method for determining ditolyl hydratase activity.
  • a nitrile compound such as n-valeroditolyl or an amide compound such as methacrylamide
  • the strain D. dichobacillus thermodulcosicius Q-6 is recognized as a new strain.
  • the properties of the strain Ziobacillus thermodulcosidisus Q-6 are as follows.
  • Attitudes towards oxygen facultative anaerobic.
  • the method for culturing the microorganism used in the method of the present invention is carried out according to a general method for culturing a microorganism, and either solid culture or liquid culture is possible.
  • Bacillus thermodulcosicius (Geobacillus thermoglucosidasius) Since the microorganism is a facultative anaerobic microorganism, it can be cultured under the same culture conditions as a normal facultative anaerobe
  • the culture temperature can be appropriately changed within the growth range of the microorganism, for example,
  • the pH of the culture medium can be, for example, 4 to 9.
  • H can be raised at a culture temperature in the range of 45 ° C. to 72 ° C., preferably, '55 ° C. to 70 ° C.
  • the culture time varies depending on various conditions. , Usually about 1 day to about 7 days
  • various culture media appropriately used include common carbon sources, nitrogen sources, organic or inorganic salts, etc. used for general microorganisms etc.
  • carbon sources glycerol, glucose, sucrose, Sugar-tight, organic acids, animal and vegetable oils, etc.
  • Nitrogen sources include yeast extract, peptone, malt extract, meat extract, urea, sodium nitrate, etc.
  • ditolyl compounds such as n-valeronitrile, isovaleronitrile, crotononitrile and the like, and ad compounds such as methacrylamide and the like.
  • an addition amount for example, an appropriate amount in the range of 0.01 g to 10 g may be added to the culture medium 11.
  • Fe ions or Co ions be present at not less than 0.1.times.ug zml.
  • each subunit is separated by reduced SDS-polyacrylamide electrophoresis, and then each band is cut out from the gel to obtain amino acids by protein sequencing. It is possible to determine part of the sequence.
  • the present invention relates to DNA encoding ditolyl hydratase.
  • a DNA containing the position 695-1 132 of the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing and a DNA containing the position 1- 6 8 1 of the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing For example, each of them encodes the ⁇ subunit and the] 3 subunit, but is not limited thereto, and it may be a DNA containing this nucleotide sequence.
  • the present invention can be applied to a DNA consisting of a complementary nucleotide sequence to these sequences, as long as the DNA can be hybridized under stringent conditions as long as it has 2-tolyl hydratase activity.
  • these DNAs can be used to express the nitril hydratase of the present invention.
  • stringent conditions for example, conditions described in the manual (wash: 42 ° C., 0.5 ⁇ SSC) using ECL direct nucleic acid labeling and detection system, manufactured by Amman Pharmacia Biotech, Inc., for example. Primary wash buffer) is included.
  • DNA that can be hybridized under stringent conditions include, for example, the 695 of the base sequence of SEQ ID NO: 3 of the sequence listing under the above-mentioned stringent conditions.
  • 50 or 50, particularly preferably at least 100 consecutive base sequence sequences are exemplified as DNAs that are hybridized.
  • the DNA encoding ditolyl hydrolase of the present invention can be obtained by the following method.
  • genetic recombination technology, recombinant protein production technology, analysis methods known in the art are employed.
  • the DNA encoding the ditolyl hydratase of the present invention may be prepared according to the sequence information such as the base sequence or amino acid sequence disclosed in the present specification, and optionally the amino acid sequence determined from the above-mentioned purified enzyme. It can be obtained from a microorganism containing the tolyl hydratase of the present invention, for example, Thermo-Dalcosidesius strain Q-6. An oligonucleotide synthesized according to the amino acid sequence is used as a probe, and a DNA fragment obtained by digesting chromosomal DNA of a microorganism containing ditolylhydratase with a restriction enzyme is introduced into a phage plasmid to transform the host.
  • sequence information such as the base sequence or amino acid sequence disclosed in the present specification, and optionally the amino acid sequence determined from the above-mentioned purified enzyme. It can be obtained from a microorganism containing the tolyl hydratase of the present invention, for
  • primers are prepared according to the amino acid sequence information and the like of the N-terminus of both subunits determined from the above-mentioned purified enzymes, and a part of the nitrylhydratase gene is subjected to Polymerase Chain Reaction (PCR).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the obtained DNA is inserted into a plasmid vector, for example, pUC118, cloned and cloned, and the base sequence is prepared by a known method such as the procedure of Dideoxy 'terminator (Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 74: 5463-5467, 1977). Can make decisions.
  • the gene thus prepared is one which encodes the expression product in an E. coli host transformed with said gene using the activity measurement method described above to code for nitryl hydratase D It can confirm that it is NA.
  • the present invention provides a recombinant vector characterized in that the above-mentioned DNA is linked to the vector.
  • the recombinant vector is linked downstream of one region of a promoter suitable for the host microorganism so that the 5 'end of the DNA obtained by the above method can function, and if necessary, downstream thereof.
  • a transcription termination sequence can be inserted and prepared into an appropriate expression vector.
  • Suitable expression vectors are not particularly limited as long as they can be replicated and grown in a host microorganism.
  • a host capable of inserting a gene into a chromosome it is not necessary to have an autonomously replicable region in the host.
  • strong promoters such as lac, trp, tac, trc, T7, PL or the promoter of pinolevin acid oxidase gene (Patent Publication No. 2 575 0 6), etc.
  • the including pUC based, pGEX series, pET series, pT7 series, pBluescript series, pKK system, P BS type, pBC system, including pCAL system can be selected from any vectors usually used in E. coli.
  • the alpha subunit gene and the subunit gene may be expressed as cistrons independent of the respective promoters, or may be expressed as polycistrons by a common promoter.
  • each variant gene may be on a separate batter.
  • the activity of ditolyl hydratase is further enhanced by incorporating DN DN expressing the gene downstream of the ditolyl hydratase gene of the present invention into the above-mentioned ditolyl hydratase exchange vector.
  • DN DN expressing the gene downstream of the ditolyl hydratase gene of the present invention
  • each gene may be on a separate vector. Good.
  • the present invention relates to a protein involved in the activation of ditolyl hydratase.
  • Provide a coding DNA Specifically, although positions 1 to 3 of positions 5 to 5 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing are exemplified, it is not limited thereto, and it may be any DNA containing this base sequence. Just do it. Moreover, it is a DNA which can be hybridized under stringent conditions to DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to these sequences, and as long as it is involved in ⁇ -conversion of ditolyl hydratase, Included in the invention. That is, these DNAs can be used to further activate ditolyl hydratase of the present invention.
  • the protein involved in the activation of the ditolyl hydratase of the present invention is a protein represented by the sequence of 112 amino acids shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing, but the protein of ditolyl hydratase
  • the amino acid sequence may have an amino acid sequence having one or more amino acid substitutions, deletions or insertions in the amino acid sequence as long as it has the ability to be involved in activation, and depending on the type of host It is naturally expected that they will receive modifications.
  • amino acid sequences amino acid sequences in which 1 to 25 amino acids are substituted, deleted, inserted or post-translationally modified are also mentioned as a preferred example, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 10. The number is five, and most preferably 1 to 3.
  • the present invention also provides a transformant characterized in that the above-mentioned DNA is introduced into a host cell and transformed.
  • the transformant is transformed with the host cell using the expression vector prepared by the above method. It can be acquired by replacing it.
  • Host cells include microorganisms, mammalian cells, and plant cells, but it is preferable to use microorganisms.
  • Examples of the microorganism include E. coli as in the examples described later, but not particularly limited thereto. Bacillus, Pseudomonas, Corynebacterium, Prebibacterium, Streptococcus, Rhodococcus, Actinomycetes Yeast etc. are exemplified.
  • a gene into a host microorganism for example, it may be introduced into a preferable host by any conventional method known in the art, such as transformation, transduction, junctional transfer, or electroporation. it can.
  • a microorganism capable of producing the nitrile hydratase for example, a microorganism of the genus Geobacillus, particularly preferably
  • the enzyme can be obtained by appropriately combining known purification methods from the culture of 'Sammo cholecystis strain Q-6.
  • the gene for nitrylhydratase may be transformed or transformed. It can also be obtained from transformants.
  • the transformant is generally cultured in a medium containing a nutrient source that can be assimilated by these microorganisms,
  • a medium containing a nutrient source that can be assimilated by these microorganisms
  • it can be cultured by the usual method for producing enzymes and antibiotics.
  • Culture may usually be liquid culture or solid culture.
  • carbohydrates such as glucose and sucrose; alcohols such as sorbitol and glycerol; organic acids such as citric acid and acetic acid; carbon sources such as soybean oil or mixtures thereof; nitrogenous such as yeast extract, meat extract, ammonium sulfate and ammonia Inorganic organic nitrogen sources; inorganic nutrient sources such as phosphate, magnesium, iron, cobalt, manganese, potassium and the like; and a medium in which vitamins such as biotin and thiamine are appropriately mixed are used. More preferably, Fe or Co ions should be present at 0.1 ⁇ g or more in such a medium component. Culture conditions are usually preferably performed under aerobic conditions. The culture temperature is not particularly limited as long as the host microorganism can grow.
  • the reaction is carried out at 5 ° C. to 80 ° C., preferably 20 to 70 ° C., and more preferably 25 to 42.
  • the pH during culture is not particularly limited as long as the host microorganism can grow. However, it is usually 113 to 9, preferably 115 to 8, and more preferably pH 6 to 7. What is done is illustrated.
  • a ditolyl compound can be produced using the enzyme of the present invention.
  • the degree of purification is not particularly limited unless the action of the enzyme of the present invention is inhibited, and in addition to the purified enzyme of the present invention, the enzyme-containing material
  • microorganisms that produce the enzyme or transformants transformed by introducing the gene of the enzyme may be used.
  • cells may be used, and the cells may be viable cells, or may be treated with a solvent such as acetone or toluene or subjected to a treatment such as lyophilization to obtain a compound.
  • cells with increased permeability may be an enzyme-containing material such as bacterial cell breakage or bacterial cell extract.
  • the culture is separated into solid and liquid, and the obtained wet cells are subjected to buffer solution such as phosphate buffer or Tris-HCl buffer as needed.
  • buffer solution such as phosphate buffer or Tris-HCl buffer as needed.
  • the cells are suspended in water and then sonicated, treated with French press or powder treatment with glass beads, or treated with cell lysis enzymes such as lysozyme and the like, and the cell breakage treatment such as treatment is appropriately combined with the treatment.
  • the enzyme can be extracted to obtain a crude solution containing nitrile hydratase. This crude enzyme-containing solution can be further purified, if necessary, by using known protein, enzyme isolation and purification means.
  • an organic solvent such as acetone or ethanol is added to a crude enzyme-containing solution for fractional precipitation, or ammonium sulfate or the like is added for salting out, and a section containing nitrylhydratase is precipitated from an aqueous solution and recovered.
  • An example is shown.
  • purification can be performed by appropriately combining anion exchange, cation exchange, gel filtration, affinity chromatography using antibody and chelate, and the like.
  • the cells or the treated product of the cells is suspended in an aqueous solution such as water or a buffer solution such as a phosphate buffer, and the reaction is allowed to proceed by adding an ethyl compound thereto.
  • the concentration of the cells or treated cells thereof is 0.1% to 20% by weight, preferably 0.1% to 10% by weight.
  • the upper limit of the reaction temperature is preferably 90 ° C., more preferably 85 ° C., more preferably 70 ° C.
  • the lower limit of the reaction temperature is, for example, 1 ° C., preferably 4 ° C.
  • the reaction pH can be, for example, 5 to 10, preferably 6 to 8, and the reaction time can be, for example, 1 to 72 hours.
  • the amide compound can be formed and accumulated at a high concentration by gradually dropping the ditriyl compound.
  • Example 1 Cell separation
  • Isolated Isolated microorganism, was inoculated into liquid medium supplemented with n- Valero nitrile of 0.1 weight 0/0 to the medium of the same composition, by culturing for 24 hours at 6 5 ° C, two Trill assimilation A culture broth having high microorganisms was obtained. One ml of this culture broth was added to 9 ml of a 1.1 wt% acrylonitrile solution (0.05 M-phosphate buffer pH 7.7) to initiate a reaction at a reaction temperature of 27 ° C. After 10 minutes, the reaction was stopped by adding 1 ml of IN HC 1.
  • a portion of the reaction mixture was analyzed by liquid chromatography (HPLC), and the presence or absence of acrylamide formation was assayed to screen microorganisms having nitrylhydratase activity.
  • HPLC liquid chromatography
  • a strain of D. subtilis S. modalicosidisus strain Q1 6 was obtained as a microorganism having a hydration activity for converting a two-tolyl compound into an amide compound.
  • HITACHI D-7000 made by Hitachi
  • the strain of the strain Diacillus thermochalcosidesius Q-6 obtained in Example 1 is applied to the agar plate medium containing the medium components used in Example 1, and culture is carried out at a plurality of different temperatures. I examined. The results are shown in Table 1.
  • the strain D. dichobacillus' Thermo Dalcosidesius Q-6 showed normal breeding up to 70 ° C., and was able to grow at 72 ° C. table 1
  • Example 3 Measurement of nitryl hydratase activity in the cells of Diobacillus thermodulcosicius Q-6 strain and its temperature dependency
  • a sterile culture medium pH 7.0
  • a culture solution of the strain Diobacillus thermodulcosicius Q-6 100 ml of a sterile culture medium (pH 7.0) containing 50 ⁇ l was placed in a 50 ml Erlenmeyer flask with 1 ml of a culture solution of the strain Diobacillus thermodulcosicius Q-6. Inoculated. This is cultured by rotary shaking at 20 ° O stroke / min for 1 day at 65 ° C. Body culture fluid was obtained. The cells are collected by centrifugation (10000 X g, 15 minutes) from 30 Om 1 of the cell culture of this D.bacillus thermoglucosidisius Q-6 strain, and the cells are collected with a 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5). After washing, it was suspended in 5 Oml of the same buffer.
  • the cell suspension thus prepared was reacted for 5 minutes according to the above-mentioned method to measure the hydration activity for converting the ditolyl compound into an amide compound.
  • the unit of enzyme activity (unit) is defined as 1 unit (hereinafter referred to as U) of converting acrylonitrile to acrylamide in 1 minute.
  • the activity (UZ mg) was 9.37 U / mg.
  • the ditolyl hydratase activity was similarly determined under the conditions of 50 ° C., 60 ° C. and 70 ° C., and is shown in Table 2. As a result, when the cells were used in the reaction, the optimum temperature was around 60 ° C., and it showed particularly high activity at high temperatures.
  • Table 2 Table 2
  • Example 4 Thermostability of nitryl hydratase in cells of Diobacillus thermodulcosicius Q-6 strain
  • the cells obtained by the culture method of Example 3 were used. It was suspended in distilled water so as to be U / ml, kept warm at a predetermined temperature for 30 minutes, and the residual activity was measured. Add 0.5 ml of incubation solution to 0.5 ml of 1 wt.% Solution in aqueous solution (0. 05 M potassium phosphate buffer, H7.5) and stir at 27 ° C. While the reaction started. After 5 minutes, the reaction was stopped by adding 100 / x L of 1 N hydrochloric acid.
  • the activity after storage treatment with respect to the activity before storage treatment was calculated, and is shown in Table 3 as a conversion value based on the activity before storage treatment (100). From the results, it can be said that the enzyme activity of nitryl hydratase in the cells of the strain Diobacillus thermodulcosicius Q-6 is stably maintained even at high temperature, and 80% even at high temperature of 70 ° C. The above activity can be maintained, and even at a high temperature of 80 ° C., 30% or more activity can be maintained.
  • Example 5 Reaction using various nitrile compounds as a substrate
  • ORF 2 tolyl hydratase alpha subunit
  • ORF 1 j3 subunit
  • ORF 3 nitryl hydratase activating factor
  • the cells obtained by cultivating D. bacillus thermodulcosicius Q-6 are cleaved, precipitated with ammonium sulfate, anion exchange column chromatography, D EAE column, hydroxyapatite column, gel filtration It was dialyzed by romatography, and the ditolyl hydratase enzyme was purified.
  • Oligonucleotide degeneracy for gene amplification Primers were prepared, and degenerate PCR was performed using chromosome DNA extracted from the cells as a template to perform amplified PCR, to obtain an amplified DNA fragment. The amplified DNA fragment was cloned, and the nucleotide sequence of the insert fragment was determined.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence is compared with the N-terminal amino acid sequence of the tolyl hydratase ⁇ - subunit and the sub-unit purified from the Bacillus subtilis Thermodulcosicius Q-6 strain, and the cloned sequence is a tortrylhydrator I confirmed that I was working on Ze.
  • Oligonucleotide degenerate primers for gene amplification were prepared from sequences with high homology in downstream genes of various known ditolyl hydratase ⁇ subunits, and degenerate PCR was performed using chromosomal DN ⁇ extracted from the cells as a template. , Amplified DNA fragments were obtained. Amplified DNA fragment of the ⁇ subunit of the resulting strain was cloned and the nucleotide sequence was determined.
  • the ditolyl hydratase alpha subunit and the j3 subunit of the strain Diobacillus thermochalcosidesius Q-6 obtained as described above were introduced into an appropriate expression vector.
  • Appropriate host bacteria were transformed using the constructed expression plasmid. Examples of hosts include Rhodococcus, Coryne, and E. coli. Preferably, a host without an amidase is preferred. Furthermore, it was confirmed that acrylamide was formed by contacting atarironitrile with cells obtained by culturing the obtained transformant, and comparing the formation efficiency and nitrylhydratase activity.
  • colony hybridization is performed using the DNA fragment obtained above as a probe to clone peripheral genes including downstream genes of ditolyl hydratase alpha subunit and subunit of the strain of Diobacillus thermochalcosidesius Q-6. did.
  • downstream genes were coexpressed with nitryl hydratase alpha subunit and subunit and compared for nitryl hydratase activity. As a result, it was found that the downstream gene is a gene involved in activation that significantly increases di-yl hydratase activity.
  • Example 6 Dibacillus thermothalcosideus Q-Purification of a ditolyl hydratase enzyme from strain 6-
  • the ditolyl hydratase active fraction was purified by cultivating Dibacillus thermochalcosidesius Q-6 and applying it to various columns.
  • the method for measuring the ditolylhydratase activity fraction in chromatography was performed as follows. To the eluate of each fraction diluted with HEPES buffer (100 mM, H 7.2), 1% by weight of phthalonitrile was added and reacted at 27 for 1 minute. The reaction was stopped by adding IN HC1 to a 10 liquid% reaction solution, and the formed acrylamide concentration was measured by the HPLC analysis method described in Example 1.
  • n-parellonitrile glycerol 0.2% by weight, citric acid trisodium dihydrate 0.2 0/0, potassium dihydrogen phosphate 0.1% by weight, potassium hydrogen phosphate 0.1 wt%, Poripe Easthampton 0.1 wt 0/0, yeast extract 0.1 weight 0/0 sodium chloride 0.1 weight 0/0, n - Valero nitrile 0.1 wt 0/0, 0.02 wt% of magnesium sulfate heptahydrate, iron sulfate
  • n-parellonitrile glycerol 0.2% by weight, citric acid trisodium dihydrate 0.2 0/0, potassium dihydrogen phosphate 0.1% by weight, potassium hydrogen phosphate 0.1 wt%, Poripe Easthampton 0.1 wt 0/0, yeast extract 0.1 weight 0/0 sodium chloride 0.1 weight 0/0, n - Valero nitrile 0.1 wt 0
  • (F) bacillus thermothalcosidesius strain Q-6 was inoculated in 0.003% by weight of heptahydrate and 0.002% by weight of cobalt chloride hexahydrate, and cultured at 65 ° C. for 24 hours.
  • a 96 well 2 ml deep bottom plate (CO STAR) was used. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation at 8000 g for 10 minutes, and 3 g of the obtained wet cells were resuspended in 20 mL of HEPES buffer (100 mM, pH 7.2).
  • the cells were disrupted using an ultrasonic disrupter under cooling, and ammonium sulfate (30% saturation concentration) was added to the disrupted cells and gently stirred at 4 ° C. for 30 minutes, 20000 g, 10 minutes. Centrifugation was performed to obtain a supernatant. Ammonium sulfate (70% saturation concentration) was added to the supernatant of the centrifugation and gently stirred for 30 minutes at 4 ° C, and then the precipitate obtained by centrifugation at 20000 g for 10 minutes was added to 9 ml of HE PES buffer (100 mM) , PH
  • 0.1 M phosphate aqueous solution (PH 7.2) was used as a developing solution, and the fraction was eluted by increasing potassium phosphate linearly from 0.01 M to 0.3 M, and the ditolyl hydratase activity was A fraction containing was obtained.
  • Gel filtration chromatography (Pharmacs Biosciences, Inc .; Superde X 200 HR 10 /) using the fraction as a developing solution of 0.5 M aqueous sodium phosphate solution (PH 7.2) containing 0.1 M of 15 30) to obtain a ditolyl hydratase active fraction.
  • the following example was carried out using the ditolyl hydratase active fraction of gel filtration chromatography thus obtained.
  • Example 7 Reaction temperature dependency of ditolyl hydratase in ditolyl hydratase active fraction purified from Diobacillus thermodulcosidesius Q-6 strain
  • tolyl hydratase active fraction solution (3.2 mg ZmL, 0.05 M phosphate buffer (pH 7.5)) derived from D. dichobacillus thermodulcosidesius strain Q-6, the reaction temperature shown in Table 5 was used.
  • the nitril hydratase activity to convert the trileucine compound into an amide compound was measured. 1 mL of 0.5 wt 0/0 Akuriro nitriles solution (0. 05M potassium phosphate buffer, pH 7. 5) was added with nitrile hydratase active fraction solution, the reaction with stirring at the temperature It started. After 2 minutes, the reaction was stopped by adding 100 / x L 1 N hydrochloric acid.
  • the unit of enzyme activity is defined as the activity to convert 1 ⁇ umol of acrylonitrile to acrylamide in 1 minute as 1 unit (hereinafter referred to as U), and the hydration activity per unit weight of enzyme (UZmg) Is shown in Table 5. From this result, the activity of ditolyl hydratase in the ditolyl hydratase active fraction purified from Diobacillus' Thermo Dalcosidesius Q-6 strain increases with the increase of the reaction temperature up to a high temperature of 60 ° C. The optimum temperature is considered to be in the vicinity of 60 ° C., as in the case of using the cells in the reaction, and exhibits a very high ditolyl hydratase activity even at a high temperature of 70 ° C. Table 5
  • Example 8 Thermostability of ditolyl hydratase purified from Diobacillus thermodulcosidesius Q-6 strain
  • the activity (residual activity) after storage treatment relative to the activity before storage treatment is calculated, and is shown in Table 6 as a conversion value based on the activity before storage treatment (100). From this result, the enzyme activity of nitryl hydratase in the aqueous solution in the nitril hydratase active fraction purified from Dibacillus * salmon glucosidisius Q-6 strain is stably retained even at high temperature. However, the activity of 60% or more can be maintained even at a high temperature of 60 ° C., and the activity of 35% or more can be maintained even at a high temperature of 70 ° C. Table 6
  • Example 9 Atalilonitrile concentration dependence and concentration tolerance of ditolyl hydratase purified from Diobacillus thermodulcosidesius Q-6 strain
  • Example 10 Acrylamide tolerance of nitril hydratase purified from Diobacillus thermodulcosidesius Q-6 strain
  • ditolyl hydratase active fraction solution (3.2 mg / mL, 0.05 M phosphate buffer ( ⁇ 7 ⁇ 5)) of 0.5 weight 0/0 acrylonitrile and 35 weight 0/0 Akurirua including Mi de solution (0. 05 ⁇ potassium phosphate buffer, ⁇ 7. 5) of the The reaction solution was added to 1 ml, and the reaction was carried out for 10 minutes while stirring at 27 ° C., and the concentration of acrylate in the reaction solution was quantified by HPLC, and all acrylates were converted to acrylates.
  • the eluate of the dibutyl hydratase active fraction in gel filtration chromatography obtained according to Example 6 was subjected to reduction type SDS-polyacrylamide electrophoresis under reducing conditions. After electrophoresis, protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CB B) was carried out, and as a result of decolorization, two major bands having molecular weights of about 25 K Dalton and about 28 K Dalton were confirmed. These two major purified proteins are transferred to a PVDF membrane (MILLI PORE) using a blotter (BIO-RAD), and stained with CBB to adsorb the two bands of interest. Portions were cut from the PVD F membrane.
  • MILLI PORE a PVDF membrane
  • BIO-RAD blotter
  • the N-terminal amino acid sequences of the two proteins were decoded using a fully automatic protein primary structure analyzer P P S Q 2 3 A (Shimadzu Corporation).
  • P P S Q 2 3 A a fully automatic protein primary structure analyzer
  • the N-terminal amino acid sequence of a protein having a molecular weight of 25 K daltons is the sequence described in SEQ ID NO: 23 in the sequence listing
  • the N-terminal amino acid sequence of a protein having a molecular weight of 28 K daltons is The sequence of SEQ ID NO: 24 in the sequence listing.
  • the polypeptide chain of 25K Dalton is ditolyl hydratase ⁇ -subunit and the polypeptide chain of 28 2 Dalton is ditolylhydratase] 3 subunit It showed homozygosity at a low level, suggesting that it encodes the protein.
  • Primer 1 (a F 1) described in SEQ ID NO: 5 in Sequence Listing, Primer 2 (a F 2) described in SEQ ID NO: 6 in Sequence Listing, Primer 1 described in SEQ ID NO: 7 in Sequence Listing (a F 3) Primer 4 (o; R 1) described in SEQ ID NO: 8 in Sequence Listing, Primer 5 (a R 2) described in SEQ ID NO: 9 in Sequence Listing, SEQ ID NO: 10 in Sequence Listing Primer 6 (aR 3) described in SEQ ID NO: 11; Primer 7 ( ⁇ : 1) described in SEQ ID NO: 11; Primer 8 (/ 3 F 2) described in SEQ ID NO: 12 in Sequence Listing; Sequence number of sequence listing: Primer 9 F 3 listed in 1 3; Bra listed in sequence listing SEQ ID NO: 1 4 1 1 (j3 R 1), Primer 1 1 (/ 3 R 2) described in SEQ ID NO: 15 in the Sequence Listing, Primer 1 2 (/ 3 R 3) described in Sequence Listing SEQ ID NO: 16 ).
  • y represents c or t
  • r represents a or g
  • m represents a or c
  • k represents g or t
  • s represents c or g
  • w represents a or t
  • d represents a, g or t
  • n represents a, c, g or t.
  • primers were prepared in consideration of the chromosomal position of the gene encoding the ⁇ subunit and the [3 subunit].
  • Diobacillus ⁇ thermodulcosidesius Q-6 strain was cultured and recovered in the same manner as in Example 6; en om ic-tip S yst em (500 / G) kit was used to extract chromosomal DNA from cells.
  • Degenerate PCR was carried out using 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA of the strain Diobacillus thermodulcosicus Q-6 dissolved in TE solution as a template.
  • the degenerate PCR is a combination of the primers 1 to 6 listed in SEQ ID NO: 5 to 10 in the sequence listing, and the primers 7 to 1 2 listed in SEQ ID NO: 1 1 to 16 in the sequence listing, 36 Did.
  • Primer 5 (aR 2) described in SEQ ID NO: 9 of the Sequence Listing and SEQ ID NO: The combination of primer 7 F 1) described in 1 1 and the sequence of primer 5 (aR 2) described in SEQ ID NO: 9 of the sequence listing and the primer 1 shown in SEQ ID NO: 12 of the sequence listing 8 (F 2 Only in the case of PCR performed by the combination of), amplification of a DNA fragment of about 700 bp was confirmed.
  • the cells were cultured at 37 ° C. in C1, 2.0 weight 0 / o Bacto Ag ar (pH 7.5)), and transformants were selected in ampicillin.
  • Plasmid DNA is extracted by a conventional method from a transformant cultured in LB medium containing ampicillin, and an insert sequence of about 700 bp is used, and the sequences of the SP 6 and T 7 promoters on the vector are used as primers. The nucleotide sequence was decoded using this.
  • ORF 1 an open reading frame of 681 bp (hereinafter referred to as ORF 1) was confirmed in the amplified DNA fragment. It was 13 bp between the translation stop codon of ORF 1 and the translation initiation codon ATG of the next open reading frame (hereinafter referred to as ORF 2).
  • ORF 2 The N-terminal 25 amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of ORF 1 and the 25 amino acid sequence at the N-terminal side of the 28 K Dalton polypeptide chain purified above were completely identical. The sequence corresponds to the 1st to 25th sequences of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing.
  • the amino acid sequence of ORF 1 has a low homology with the amino acid sequence of the [3] subunit of the known ditolyl hydratase, suggesting that it encodes the protein.
  • the ditolyl hydratase subunit of Dichobacillus' Thermo Dalcosidesius Q-6 strain encodes 226 amino acids, and the degree of identity of the amino acid sequence with the protein having homology in the existing data base is in descending order , Klebsiella spp. Strain MC 12609 with ditolyl hydratase subunit and 43%, and aglobobacterium 2 Nytrilhydratase / 3 subunit with 42%, oral Solanum CGAO 09 strain Nitrylhydratase Subunit and 40% and very low ,.
  • thermophilic bacterium Bacillus BR 4 4 9 strain there is a high degree of agreement of 85.6% between dithryl hydratase ⁇ -subunit of the thermophilic bacterium Bacillus BR 4 4 9 strain and ditorinorehydratase / 3 subunit of the thermophilic bacterium Bacillus smithii S C_ J 0 5-1 strain. have. Also, the amino acid sequence of the N-terminus deduced from the nucleotide sequence of ORF 2 and the amino acid sequence of the N-terminus of the 25 K dalton polypeptide chain purified above were completely identical.
  • oligonucleotide primers for PCR amplification were prepared in the ditrinorehydratase j3 subunit of the strain Diobacillus thermodulcosicius Q-6, which had been sequenced in advance.
  • Degenerate PCR was carried out by using 0.1 g of chromosomal DNA of the strain D. dichobacillus thermodulcosicus Q-6 as a template.
  • PCR is carried out under the following conditions: Primers 13 and 14 described in SEQ ID NOs: 17 and 18 in Sequence Listing, and Primers 15 and 16 described in SEQ ID NOs: 18 and 19 in Sequence Listing at an entertaining temperature of 50 degrees. I did four combinations. As a result, it was approximately 0. 0 by PCR performed by a combination of Primer 13 (p R 1) described in SEQ ID NO: 17 in Sequence Listing and Primer 15 (Q 6 Ap os F) described in SEQ ID NO: 18 in Sequence Listing. The presence of the 8 kb amplified DNA product was confirmed.
  • SEQ ID NO: 19 were combined with Primer 15 (Q 6 Ap os F) and amplified by degenerate PCR 0.8
  • the kb DNA fragment is excised from agarose gel, the DNA is extracted by a conventional method, incorporated into pGEM-T Vector (P rome ga), transformed into E. coli strain JM109, and then combined with 50 ⁇ g / ml of ampicillin. I chose a substitute.
  • the transformant was cultured in LB medium containing ampicillin, plasmid DNA was extracted by a conventional method, and the nucleotide sequence of the about 0.8 kb insert portion was decoded. As a result, an 618 bp open reading frame (hereinafter referred to as 0 RF 2) was identified.
  • the 29 amino acid sequence N-terminal side deduced from the nucleotide sequence of ORF 2 and the 29 amino acid sequence N-terminal side of the 25 K Dalton polypeptide chain purified above are completely identical, It corresponds to the 1st to 29th sequences of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 of the column listing.
  • the amino acid sequence of ORF 2 shows low homology with the amino acid sequence of known tolyl hydratase alpha subunit, suggesting that it encodes the protein.
  • the ditolyl hydratase alpha subunit of the strain D. bacillus thermodulcosidisus strain Q-6 encodes 205 amino acids and is homologous in the existing database The degree of identity of the amino acid sequence with the protein having sex is, in order from the highest,
  • Example 1 2 Expression of the expression vector in the expression vector of ditolyl hydratase ⁇ -subunit and / 3 subunit part of Diobacillus thermodulcosidesius Q-6 strain, and expression in E. coli
  • oligonucleotide primers for amplifying dithiol hydratase subunits and subunits by PCR were prepared.
  • Primer 1 7 (Q 6 ab-F 1 1 T) described in the sequence listing SEQ ID NO: 2 1; primer 1 8 described in the sequence listing SEQ ID NO: 2 2 (Q 6 ⁇ a a 1 1 1 R 1 -B g 1 II-T).
  • Primer 17 of SEQ ID NO: 21 in the sequence listing is designed to have a translational initiation codon of ditolylhydratase of Dibacillus thermodulcocisius Q-6 strain and a 3 subunit in restriction enzyme site N de I. did.
  • the primer 18 described in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing is a restriction enzyme B g 1 II immediately below the translation termination codon of the ditolylhydratase ⁇ subunit of Dibacillus ⁇ p. The site has been introduced.
  • the chromosomal DNA of the strain D. bacillus thermochalcosisus Q-6 was used as a template, and PCR was carried out using 100 pmo 1 each of primers 17 and 18 described in SEQ ID NOS: 21 and 22 in the sequence listing.
  • the insert and the vector were subjected to ligation reaction according to a conventional method to transform E. coli JM109 strain, plasmid DNA was extracted from a transformant selected by kanamycin resistance, and a plasmid into which the insert had been introduced was selected. From the above, an expression plasmid was obtained in which the ditolyl hydratase ⁇ subunit and the subunit portion of the strain Diobacillus thermodulcosidesius Q-6 were introduced as inserts. These completed plasmids are hereinafter referred to as pET- 2 6 b (+) '_ and £ 2 _ 2 8 & (+)-jS.
  • E. coli strain BL 21 (DE 3) L ys E of Novagene is transformed with the expression plasmid p ET 2 26 b (+) _ j 3 CK and p ET 2 8 a (+) — ⁇ a Then, the ditolyl hydratase of Dibacillus' thermoglucosidisius Q-6 strain] 3 subunit and the protein of alpha subunit were coexpressed as a polycistron by the ⁇ 7 promoter. Using each expression plasmid, transform E.
  • coli BL 21 (DE 3) Lys E strain manufactured by No Vagene into a competent cell, and use LB agar medium containing SO ⁇ ug / ml force namycin (0.5 wt% Pact yeast extract, 1 wt 0/0 Pact tryptone, 0.5 weight 0/0 N a C 1, 2. 0 weight 0/0 Ag ar;. pH7 5) transformation on The treated bacterial solution was seeded, cultured at 30 ° C. overnight, and selected with kanamycin. The transformant was inoculated into 2 ml of LB medium containing 30 ⁇ g / ml kanamycin, and shake culture was performed at 30 ° C. and 200 rpm.
  • SO ⁇ ug / ml force namycin 0.5 wt% Pact yeast extract, 1 wt 0/0 Pact tryptone, 0.5 weight 0/0 N a C 1, 2. 0 weight 0/0 Ag ar;. pH7
  • TBS buffer pH 7.5
  • E. coli cells expressing ditolyl hydratase derived from D. dichobacillus thermodulcosicius Q-6.
  • the solution was redissolved in and diluted to an OD of 0.2 to prepare a reaction solution of a final concentration of 0.2% by weight acrylonitrile solution.
  • the reaction was carried out with stirring at 27 ° C., and after 30 minutes, the reaction was stopped by adding 100 N hydrochloric acid.
  • the unit of enzyme activity is defined as one unit (hereinafter referred to as U) which converts acrylodithiol of ⁇ ⁇ to acrylamide in 1 minute, and the hydration activity per unit weight of wet cell ( UZmg) is shown in Table 8.
  • U one unit which converts acrylodithiol of ⁇ ⁇ to acrylamide in 1 minute
  • UZmg hydration activity per unit weight of wet cell
  • Example 1 3 Acquisition of a ditolylhydratase peripheral gene from Geobacillus thermoglucosidisius Q-6 strain by colony hybridisation
  • a fluorescently labeled probe was prepared by follows the Roche DIG Manual for the method of preparation.
  • the chromophoric DNA of the strain Diobacillus thermodulcosicus Q-6 prepared in Example 1 was digested with various restriction enzymes and subjected to 1% by weight agarose gel electrophoresis.
  • the DNA in the agarose gel was transferred to a nylon membrane Hybond-N + (Amersham), and then the chromophore Southern hybridization was performed using the previously prepared fluorescence-labeled DIG probe. 1 ml of hybridization buffer (1 ml) per membrane on which DNA has been transferred and immobilized Weight percent skim milk, 0.1 weight.
  • wash buffer (0. 3% by weight with 100m 1) Menprene was washed 5 times in Twaen 20, 0.1 M maleate buffer containing 0.1 M N aCl; pH 5. 5) to wash away unbound antibody.
  • equilibration treatment for 2 minutes in the detection buffer 0.1 M T ris _HC 1, 0.1 M Na C 1, pH 9.5
  • 1 ml of the detection buffer is used.
  • the pUC1 18 plasmid vector DNA used for ligation was digested with the restriction enzyme H ind III and then purified by phenol Z chromatography and ethanol precipitation, followed by alkaline phosphatase (Takara) 5
  • the terminal was subjected to dephosphorylation treatment, phenol-no-mouth-form treatment and ethanol precipitation were again carried out, agarose gel electrophoresis was applied, and agarose gel electrophoresis was carried out, and repurification from agarose gel was used.
  • Amersham's Nying membrane H y b o n d-N + was gently placed on the petri dish on which the colony had been grown, and gently removed from the rear end using a tweezers for 1 minute. After immersing the detached membrane with the cell surface on top for 7 minutes in a denaturing solution (0.5 M NaOH aqueous solution containing 1.5 M NaCI), neutralize the solution (1.5 M). The substrate was immersed for 3 minutes in 0.5 M Tris HCl aqueous solution containing 1 mM Na 2 Cl and 1 mM EDTA ⁇ 2 N a; pH 7.2), and then immersed for a further 3 minutes in fresh neutralization solution. Next, wash the membrane once with 2 X SSC solution (containing 8.
  • hybrida See Chillon buffer (1 weight 0 /. Skim milk per 10 m 1 on one of the fixed Menpuren of DNA, 0. 1 weight 0 / ON_ lauroylsarcosine, 0.02 wt 0 / 0 SDS, 50 weight 0/0 dipped formamide 5 XSSC) containing, was carried out for 2 hours pre hybrida See Chillon at 42 ° C. 100 ng of the fluorescently labeled probe prepared in the same manner as above is heat denatured by boiling at 95 ° C. for 10 minutes and quenching, added to prehybridization buffer, and hybridized overnight at 42 ° C.
  • the hybridized membrane was washed twice at room temperature with 2 X SSC containing 15 Om 1 of 0.1 weight 0 / o SDS. Then 1 x S containing 150 m 1 of 0.1 wt% SDS heated to 65 ° C Two 5 min washes in SC. Then, after washing for 5 minutes with 10 O 1 M maleate buffer (adjusted to pH 7.5 with 0.1 M maleic acid, 0.1 M 5 M N a C l, N a OH), 5 Om 1 Blocking solution (0.3 wt./w. Tw een 20, 0.1 M N a C 1 and 1 wt. 0 / o 0.1 M male acid buffer containing skimming milk; pH 7.5). Blocking at room temperature for 30 minutes.
  • Anti-digoxigenin-AP was diluted with 25 ml of blocking solution to 75 mU / m 1, antibody reaction was performed for 30 minutes at room temperature, and 100 ml of wash buffer (0.3 weight was used. 0/0 Tw een 2 0, 0. 1 5M N a C 1 0. 1M maleate buffer containing; the membrane was washed 5 times in p H 7. 5), to wash away unbound antibody.
  • the confirmed positive clone is inoculated from the petri dish into LB liquid medium containing ampicillin, cultured with shaking at 37 ° C. and 250 rpm, and the cells are recovered by centrifugation. Plasmid DNA was extracted by the method. The plasmid DNA was digested with restriction enzyme HindIII and then subjected to 1.5% by weight agarose gel electrophoresis to confirm the size of the inserted fragment, which was about 2.3 kb in size. In addition, several fragments of PCR and restriction enzymes were used to ensure that the insert fragment contained the di-tolyl hydratase ⁇ subunit portion of the strain Diobacillus thermodulcosicius Q-6. Confirmed by the digestion pattern.
  • the plasmid obtained from the above was named as pUC1 18-Q6Hin 2.3, and the entire base sequence of the inserted fragment was determined.
  • a restriction enzyme map and gene configuration of the ditolyl hydratase and downstream gene group of Diobacillus' thermo Dalcosidesius Q-6 strain are shown in FIG.
  • ORF 3 an open lidin frame consisting of a base sequence of 339 bp is identical to the 5 'end side downstream of the ditolyso rehydratase ⁇ subunit ( ⁇ RF 2). It was confirmed that it exists in the direction. It was 12 bp between the translation stop codon of ORF 2 and the translation start codon of ORF 3 and 145 bp between the translation stop codon of ORF 3 and the translation start codon of OR F located further downstream. ORF 3 encodes 112 amino acids and has very low homology with the following proteins in the existing data base.
  • the matching ratio of amino acids with highly homologous sequences in the existing database is: P 12 K and 31% of Bacillus BR 4 4 9 strains; Rhodococcus rhodochrous; 1 1 111 1 It was 31%, 31% of Nh 1 E and 22% of Phenococci rhodochrous J 1 strain, and P 16 of C. thudnocardia thermophila J CM 3095 strain.
  • Example 14 Construction of expression plasmids of ditolyl hydratase ⁇ -subunit of the strain Diobacillus thermodulcosicius Q-6 and the downstream portion of ORF3
  • p ET-26 b (+) mono- ⁇ and p ET _ 28 a (+)-] 3 ⁇ plasmid is digested with the enzyme P indase H ind III, dephosphorylated and phenol chloroform extracted Dephosphorylation treatment was carried out.
  • the digested product was subjected to 1% by weight agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 6.1 Kb was extracted by a conventional method.
  • This DNA fragment includes the pET vector and the H ind III restriction enzyme site located at the 60th amino acid of ditolyl hydratase subunit of Dibacillus thermodulcosidis strain Q-6 and ⁇ subunit. It is done.
  • the pUC1 18-Q6Hin2.3 plasmid was digested with restriction enzyme HindIII and subjected to 1% by weight agarose electrophoresis to extract an insert DNA of about 2.3 kb.
  • This insert was ligated with the previously extracted fragment to transform E. coli JM 09 strain, and a plasmid containing insert DNA was selected from transformants selected for kanamycin resistance.
  • the pET-26b (+) and pET-28a (+) vectors can be used as vectors for ditolylhydratase alpha subunit and subunit and downstream of the strain Diobacillus thermodulcosicius Q-6.
  • a plasmid containing the gene ORF 3 and the downstream region was obtained.
  • the plasmid thus completed is hereinafter referred to as pET- 26 b (+) —] 3 ⁇ 12 and p ET ⁇ 28 a (+) 1/3 ⁇ 12.
  • Ditolyl hydratase a subunit of Geobacillus thermodulcosicius Q-6 strain, ⁇ -subunit and ⁇ -subunit of the downstream gene ORF 3 translation stop codon are introduced to co-express the three proteins.
  • An expression plasmid was constructed.
  • the previously constructed plasmid pET-26 b (+) — j3 ⁇ ; 12 was digested with restriction enzymes Nde I and B g III and subjected to 1.5% by weight agarose gel electrophoresis, ⁇ - subunit, ⁇
  • the 1. 7 kb gene fragment containing up to the translation stop codon of the subunit and downstream gene ORF 3 was extracted by a conventional method.
  • the expression vector p ET- 26 b a (+) ⁇ Pi p ET- 28 a (+), was digested with Nd e I ⁇ Pi B a mH I, subjected to 1 weight 0/0 Agarosugeru electrophoresis, 5.
  • the gene fragment of the 3 kb vector part was extracted by a conventional method.
  • the ligation reaction was carried out according to a conventional method, using the 1.7 kb gene fragment including the a subunit, the ⁇ subunit and the translation stop codon of the downstream gene ORF 3 which were previously extracted from these vectors as inserts.
  • the end digested with B g 1 II restriction enzyme and the end digested with B am H I restriction enzyme are attached.
  • coli strain JM109 was transformed with the solution after ligation reaction, plasmid DNA was extracted from the transformant selected by kanamycin resistance, and the plasmid into which the insert was introduced was selected. From the above, ditolyl hydratase subunits of the strain Diobacillus' Thermo dal cosidisius Q-6 strain, j3 subunits Partial and downstream gene ORF 3 was introduced as an insert to obtain an expression plasmid in which the three proteins co-expressed.
  • the plasmids of interest are hereinafter referred to as pET- 26 b (+)-j3 ⁇ 1 and p ET-28 a (+)-/ 3 a 1.
  • Example 15 Nitrilhydratase activity of Diobacillus thermodulcosidius Q-6 strain co-expressed with downstream gene in E. coli
  • E. coli strain BL 21 (DE 3) Lys E of Novagene Co. was transformed with the expression plasmid p ET-26 b (+) a and p ET-28 a (+)- ⁇ a
  • the proteins of ditolyl hydratase subunits and alpha subunits of the strain Diobacillus thermodulcosicius Q-6 were coexpressed with the ⁇ 7 promoter.
  • the transformant was inoculated into 2 ml of LB medium containing 30 ⁇ g / ml kanamycin, and shake culture was performed at 30 ° C. and 200 rpm.
  • cells of E. coli having the tolyl hydratase expression from D. bacillus thermodulcosidisus strain Q-6 are expressed as iso-HC 1 and 15 mM Na C of 20 ⁇ ⁇ . Resuspend in 1 TBSS buffer (pH 7.5), dilute to an OD of 0.2, and final concentration. A reaction solution of 2% by weight total solution was prepared. The reaction was carried out with stirring at 27 ° C., and after 10 minutes, the reaction was stopped by adding 10 O ⁇ uL of 1 N hydrochloric acid after 30 minutes.
  • the unit of enzyme activity (unit) is defined as the activity of converting 1 ⁇ of acrylonitrile into acrylamide per minute as 1 unit (hereinafter referred to as U), and the hydration activity per wet cell weight ( U Zmg) is shown in Table 9.
  • U the activity of converting 1 ⁇ of acrylonitrile into acrylamide per minute
  • U Zmg the hydration activity per wet cell weight
  • E. coli solution (2 OmM) which has an expression vector; p ET26 b (+) —] 3 ⁇ and which expresses the ditollhydratase of Dibacillus thermodulcocisius Q-6 strain.
  • Incubation treatment was carried out at 30, 65, and 70 ° C for 30 minutes with Tris_HC1 and TBS buffer (pH 7.5) containing 15 ⁇ lM NaC1.
  • the solution was cooled on ice and kept at 27 ° C. to make the temperature constant, and then the activity of nitrylhydratase 14 was measured at a reaction temperature of 27 ° C.
  • the composition of the present invention exhibits high stability to heat and high concentrations of ditolyl and amide compounds, and has the effect of efficiently converting the totolyl compounds into the corresponding amide compounds.
  • the composition of the present invention can be suitably used in the field of converting a ditolyl compound into the corresponding amide compound even in reactions under high temperature and high ditolyl compound concentration or high amide compound concentration.

Abstract

　本発明の目的は、熱安定性に加え、且つ基質であるニトリル化合物や生成物であるアミド化合物の高濃度存在下でも高い活性を保つニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物の製造方法を提供することである。本発明では、自然界より目的のニトリルヒドラターゼを発現する新規な微生物を探索し、該微生物菌体およびその菌体処理物を製造に用いるとともに、該遺伝子をクローニングし、異種微生物で発現する組換え微生物を作製した。本発明によれば、高温条件下、および高濃度のニトリル化合物あるいは高濃度のアミド化合物の存在下の反応においてもニトリル化合物を対応するアミド化合物に効率良く変換することが可能となる。

Description

明細書
新規な二トリルヒドラターゼ 技術分野
本発明は、 自然界より新たに単離した微生物を由来とする新規な二トリルヒド ラターゼの酵素触媒作用により、 二トリル化合物からアミド化合物を製造する技 術に関する。 背景技術
二トリル化合物の二 リル基を水和してァミド基に変換し対応するアミド化合 物を製造する技術においては、 従来の銅触媒による化学的な方法にかえて、 微生 物の酵素を触媒として用いる方法が主流となってきている。 そのような酵素は一 般にニトリルヒドラターゼと呼ばれるが、 初めての報告以来、 多数の酵素が様々 な微生物より発見されている。 例えば、 ァルスロパクター （Arthrobacter) 属 (Agricultural and Biological Chemistry Vol. 4 p.2251 - 2252， 1980) ァグロバ クテリゥム（Agrobacterium)属 （特開平 05— 10368 1 )、 ァシネトパクター (Acinetobacter) 属 （特開昭 6 1— 282089)、 エアロモナス（Aeromonas) 属 （特開平 05— 030983)、ェンテロパクター（Enterobacter)属（特開平 0
5— 236975)、エルウイユア（Erwinia)属（特開平 05— 161496)、 キ サントパクター（Xanthobacter)属 （特開平 05— 1 6 1495 )、 クレブシエラ (Klebsiella)属 （特開平 0 5 — 0 3 0 9 8 2 )、 コ リネパクテリ ゥム
(Corynebacterium)属（特開昭 54— 129190、後にロ ドコッカス属と判明）、 シユードモナス（Pseudomonas)属 （特開昭 58— 86093 )、 シトロパクター
(Citrobacter) 属 （特開平 0 5— 0 3 0 9 8 4 )、 ス ト レプトマイセス (Streptomyces)属 (特開平 05— 236976)、 バチルス（Bacillus)属（特開昭 51— 86186、特開平 7— 255494)、 フザリゥム属（特開平 01—08
6889)、 ロドコッッカス（Rhodococcus)属 （特開昭 63— 137688、 特開 平 02— 227069、特開 2002— 369697、特開平 2— 470)、 リゾ ビゥム lhizobium)属 （特開平 0 5— 23 6 9 7 7 )、 シユードノカルディア (Pseudonocardia)属 （特開平 8— 56684) 等が挙げられる。 これらの酵素は そのアミノ酸配列の多様性に基づき、 その理化学的性質も多様であり、 各種目的 に沿って研究が進められて来た。 理化学的性質の中でも、 熱、 あるいはアミド化 合物おょぴニトリル化合物等への安定性に関する解明が進んでいる例としては、 口 ドコッカス . 口 ドク口ウス（Rhodococcus rhodochrous) J 1株に関する文献
(European Journal of Biochemistry Vol.196 p.581 - 589, 1991. Applied and Microbiology Biotechnology Vol.40 p.189—195， 1993.),シユードノカノレディァ ♦ サーモフィラ（Pseudonocardia thermophila) J CM 3095株に関する文献（特 開平 8— 1 87092、 Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.83 p.474-477, 1997 ) , バチルス （Bacillus) 属 B R 449株 関する文献 (WO 9 9/55719. Applied Biochemistry and Biotechnology Vol.77-79 P.671-679, 1999. )、バチルス（Bacillus)属 RAP c 8株に関する文献 (Enzyme and Microbial Technology Vol.26 p.368-373, 2000. Extremophiles Vol.2 p.347-357, 1998)、 バチルス.パリダス（Bacillus palidus) D a c 521株に関する文献 (Biochimica et Biophysica Acta Vol.1431 p.249-260, 1999)、 バチルス ' スミシ一 （Bacillus smithii) SC— J 05— 1株に関する文献 (Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Vol.20 220- 226， 1998)が挙げられる。
一方、 これらユニークな二トリルヒドラターゼを用いて二トリル化合物よりァ ミド化合物を工業的に製造する際には、 アミド化合物の製造コストに占める該酵 素の製造コストが重要な問題であり、 すでに工業レベルで培養法の確立した宿主 を用いて生産を行うことが望ましい。 そこで、 遺伝子工学の手法により二トリル ヒドラターゼを大量に発現させることを目的として、 遺伝子のクローユングする 試みが検討されている。 例えば、 シユードモナス属 (特開平 3— 251 184)、 口ドコッカス属 （特開平 2 _ 1 19778、 特開平 4— 21 1379、 特開平 0
9— 00973、特開平 07— 099980、特開 2001— 069978)、 リ ゾビゥム属（特開平 6 _ 2 5 2 9 6 )、クレブシエラ属（特開平 6— 3 0 3 9 7 1 )、 ァクロモパクター属 （特開平 0 8— 2 6 6 2 7 7 )、 シユードノカルディア属（特 開平 9一 2 7 5 9 7 8 )、 バチルス属（特開平 0 9— 2 4 8 1 8 8 )等を挙げるこ とができる。 発明の開示
酵素の理化学的性質としては熱安定性や基質である二トリル化合物や生成物で あるアミド化合物の高濃度存在下でも高い活性を保つ二トリルヒドラターゼが望 ましく、 その目的の報告もあるが、 反応に用いる酵素の実施形態、 二トリル化合 物の種類によりそれらの絶対値は変動することもあり、 すべてを兼ね備えた酵素 は見出されていない。 また、 今後の進化工学等を用いた理化学的性質の改良の題 材としても、 今までにない起源であり多様な酵素の開発が望まれる。
進化工学を用いた理化学的性質の改良に遺伝子のクローニングと発現が必要な のは言うまでもなく、 上述のアミド化合物製造における酵素の生産にかかわるコ スト的な制約からも培養法の確立された宿主を用いた遺伝子組換え菌の作製が望 まれる。
すなわち、 本発明の目的は、 熱や高濃度化合物に対する安定性の高い二トリル ヒドラターゼを自然界より単離し、 該酵素の生産方法おょぴ該酵素を用いたニト リル化合物からの対応するアミド化合物の製造方法を提供することである。 さら にその酵素のアミノ酸配列および遺伝子配列を提供し、 該遺伝子を含む組換えプ ラスミド、 該組換えプラスミドを含む形質転換菌株、 該形質転換菌株を用いた該 酵素の産生方法おょぴ該形質転換菌株を用いた二トリル化合物からの対応するァ ミド化合物の製造方法を提供することである。 また、 該組み換え体の二トリルヒ ドラターゼ酵素をより活性化する作用を持つタンパク質のァミノ酸配列及ぴ遺伝 子配列も提供する。
本発明者らは、 上記課題を解決するため、 鋭意検討を重ねた結果、 埼玉県の温 泉近傍にある土壌より二トリルヒドラターゼ活性を有する微生物として、 ジォパ チノレス《サ一モグルコシデシウス (Geobacillus thermoglucosidasius ) を見出 した。 なお、 ジォバチルス属の微生物が二トリルヒドラターゼを有し、 二トリル ヒドラターゼ活性を示すことはこれまで知られておらず、 さらに本微生物の培養 に通常用いる 65 °Cという温度は、 従来の二トリルヒドラターゼを持つ好熱菌の 通常の培養温度 （45°C〜60°C) を越えるものである。
また、 該微生物より二トリルヒドラターゼ酵素を精製し、 その二トリルヒドラ ターゼ活性が熱や高濃度の二トリル化合物及び、 アミド化合物に対して高い安定 性を兼ね備えることを示した。 また、 精製した酵素の各サブユニットの N末端の ァミノ酸配列をもとに該微生物の染色体 D NAより二トリルヒドラターゼ遺伝子 を単離し、 そのアミノ酸配列および遺伝子配列を初めて明らかにした結果、 既存 の二トリルヒドラターゼとの相同性は非常に低いことが判明した。 また、 その遺 伝子下流に存在する活性化タンパク質と推定される遺伝子配列を同時に発現する ことにより、 該酵素を大量に発現する遺伝子組換え菌株を作出することにも成功 し、 本発明を成すに至った。
すなわち、 本発明は以下を提供するものである。
( 1 ) 下記の理化学的性質を有することを特徴とする蛋白質をコードする D N A。
(a) 二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b) 基質特異性：アクリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトニトリル、 ィ ソブチロニトリノレ、 n ノ レロニトリノレ、 n -ブチロニトリノレ、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである。
サプュ二ット α 分子量 25000±2000 サプュ二ット 分子量 28000±2000 ( d ) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f ) 35重量0 /0のアクリルアミド水溶液中でもァクリロニトリルを基質とし た活性を有する。
(2) 下記の （A) または （B) のいずれかの DNA。
(A) 配列表の配列番号： 1記載のァミノ酸配列をコードする αサブユエット 遺 ί云子を含有する塩基配列と、 配列表の配列番号： 2記載のアミノ酸配 列をコードする サブュニット遺伝子を含有する塩基配列との組み合わ せからなることを特徴とする DNA。
(B)配列表の配列番号： 1記載のアミノ酸配列を含有するひサブュニットと、 配列表の配列番号： 2記載のァミノ酸配列を含有する βサブュニットの いずれか一方、 または両方のそれぞれにおいて、 1若しくは複数個のァ ミノ酸に置換、 欠損、 付加、 翻訳後修飾がなされており、 その改変、 ま たは改変されていない αサブユニットと、 改変、 または改変されていな い サブュニットとを含有し、 且つ二トリルヒドラターゼ活性を有する タンパク質をコードする DNA。
(3) 下記の （C) または （D) のいずれかの DNA。
(C) 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 695- 1312位の配列を含む D N Aと、 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1一 681位の配列を含む DN Aとの組合わせからなることを特徴とする DNA。
(D) 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 695— 1312位の配列を含む D NA、 またはその DN Aに対してストリンジェントな条件下にてハイブ リダイズする DN Aのうちのいずれか一方の DN Aがコードする αサブ ュニットと、 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1一 681位の配列を 含む DNA、 またはその DNAに対してストリンジェントな条件下にて ハイプリダイズする DN Aのうちのいずれか一方の DNAがコードする βサブュニットとを含有し、 且つ二トリルヒドラターゼ活性を有する蛋 白質をコードする DNA。 但し、 上記 （C) となる場合を除く。
(4) 配列表の配列番号： 4記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列を含む DNA，またはそのアミノ酸配列中の 1若しくは複数個のアミノ酸に置換、欠損、 付加、 翻訳後修飾がなされており且つ二トリルヒドラターゼの活性化に関与する ことを特徴とする蛋白質をコードする DNAのいずれかの DNAが、 さらに糸且合 されていることを特徴とする （1) 〜 （3) の何れかに記載の DNA。
( 5 ) 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1325— 1663位の配列を含む DNA、 またはその DNAに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダィ ズし且つ二トリルヒドラターゼ活性化に関与することを特徴とする蛋白質をコ^" ドする DNAのいずれかの DNAが、 さらに組合されていることを特徴とする
(1) 〜 （3) の何れかに記載の DNA。
( 6 ) 配列表の配列番号： 1記載のァミノ酸配列をコードする二トリルヒドラ ターゼの αサブュニット遺伝子を含有する DNA。
( 7 ) 配列表の配列番号： 2記載のァミノ酸配列をコードする二トリルヒドラ ターゼの /3サブュニット遺伝子を含有する DNA。
( 8 ) 配列表の配列番号： 4記載のァミノ酸配列をコードする二トリルヒドラ ターゼの活性化に関与することを特徴とする遺伝子を含有する D N A。
(9) 該 DNAが、 ジォバチルス （Geobacillus) 属由来である （1) 〜 （8) の何れかに記載の D N A。
(10) 該 DNAが、 ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス （Geobacillus thermoglucosidasius) 種由来である （1) 〜 （8) の何れかに記載の DNA。
(1 1) 該 DNAが、 ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス （Geobacillus thermoglucosidasius) Q— 6株（FERM B P— 08658 )由来である （ 1 ) 〜 （8) の何れかに記載の DNA。
(12) (1) から （1 1) の何れかに記載の DN Aを組み込んだ組み換えべ クタ一。 (13) (1) から （1 1) の何れかに記載の DN Aにより形質転換された微 生物、 またはジォバチルス ' サーモダルコシデシウス （ Geobacillus thermoglucosidasius) Q- 6株（FERM B P— 08658 )およびその変異体 のいずれかの微生物。
(14) (1) から （1 1) の何れかに記載の DN Aにより形質転換された微 生物を、 培地において培養することを特徴とする、 該蛋白質、 または該蛋白質を 含有する菌体処理物の製造方法。
(15) ジォバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を生産し得 る微生物を、 培地において培養することを特徴とする、 該蛋白質、 または該蛋白 質を含有する菌体処理物の製造方法。
(a) 二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b) 基質特異性：アクリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトニトリル、 ィ ソプチロニトリル、 n-パレロニトリル、 n-ブチロニトリル、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである。
サブュニット α 分子量 25000±2000
サブュニット /3 分子量 28000±2000
(d) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f ) 35重量％のァクリルアミド水溶液中でもァクリロニトリルを基質とし た活性を有する。
(16) (14) または （1 5) に記載のいずれかの製造方法により培養され た微生物から取得された、 該蛋白質、 または該蛋白質を含有する菌体処理物。 (17) 下記の理ィヒ学的性質を有することを特徴とする蛋白質。
(a) 二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b) 基質特異性：アクリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトュトリル、 ィ ソブチロニトリノレ、 n-バレロエトリル、 n-ブチロニトリノレ、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである。
サブュニットひ 分子量 25000±2000
サブュニット j3 分子量 28000±2000
(d) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f) 35重量0 /0のアクリルアミド水溶液中でもァクリロニトリルを基質とし た活性を有する。
(18) 下記の （A) または （B) のいずれかの蛋白質。
(A)配列表の配列番号： 1記载のァミノ酸配列を含有する αサブュニットと、 配列表の配列番号： 2記載のァミノ酸配列を含有する βサブュニットと を含有することを特徴とする蛋白質。
(Β)配列表の配列番号： 1記載のァミノ酸配列を含有する αサブユニットと、 配列表の配列番号： 2記載のァミノ酸配列を含有する βサブュニットの いずれか一方、 または両方のそれぞれにおいて、 1若しくは複数個のァ ミノ酸の置換、 欠損、 付加、 翻訳後修飾がなされており、 その改変、 ま たは改変されていない ο;サブユニットと、 改変、 または改変されていな い サブュニットとを含有し、 且つ二トリルヒドラターゼ活性を有する 蛋白質。 (19) 下記の （C) または （D) のいずれかの蛋白質。
(C) 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 695— 1312位の配列を含む D N Aがコードする αサブユニットと、 配列表の配列番号： 3の塩基配列 の 1一 681位の配列を含む DNAがコードする サブュニットとを含 有することを特徴とする蛋白質。 、 (D).配列表の配列番号： 3の塩基配列の 695— 1312位の配列を含む DN Α、またはその DN Αに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダ ィズする DN Aのうちのいずれか一方の DN Aがコードする αサブュニ ットと、配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1— 68 1位の配列を含む D ΝΑ、またはその DNAに対してストリンジェントな条件下にてハイプリ ダイズする DNAのうちのいずれか一方の DNAがコードする βサブュ ニットとを含有し、且つ二トリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質。但し、 上記 （C) となる場合を除く。
(20) 少なくとも、 配列表の配列番号： 1記載のアミノ酸配列である αサブ ュニットを含有するポリペプチドまたは翻訳後修飾されたものと、 配列表の配列 番号： 2記載のアミノ酸配列である サブユエットを含有するポリペプチドまた は翻訳後修飾されたもののいずれか一方、 または両方を含有することを特徴とす る蛋白質。
(21) 下記の理化学的性質を有する蛋白質、 または該蛋白質を含有する菌体 処理物に、 二トリル化合物に作用させ該ニトリル化合物から誘導されるアミド化 合物を取得することを特徴とするアミド化合物の製造方法。
(a) 二トリルヒ ドラターゼ活性を有する。
(b) 基質特異性：アクリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトニトリル、 ィ ソブチロニトリノレ、 n -バレロ二トリノレ、 n-ブチロニトリノレ、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS -ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである
サブュニット a 分子量 25000±2000
サブュニット j3 分子量 28000±2000
( d ) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f ) 35重量％のアクリルアミド水溶液中でもァクリロニトリルを基質とし た活·生を有する。
(22) (1) から （1 1) の何れかに記載の DNAにより形質転換された微 生物、 またはジォバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を生産し 得る微生物のいずれかを、 培地において培養して得た蛋白質、 または該蛋白質を 含有する菌体処理物であることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
(a) 二トリルヒ ドラターゼ活性を有する。
(b) 基質特異性：アクリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトニトリル、 ィ ソブチロニトリル、 n-パレロニトリ 7レ、 n-ブチロニトリノレ、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである
サブュニット a 分子量 25000±2000
サブュニット 分子量 28000±2000
(d) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f ) 35重量％のアクリルアミド水溶液中でもァクリロニトリルを基質とし た活性を有する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ジォバチルス ' サーモダルコシデシウス Q— 6 (Geobacillus thermoglucosidasius Q-6) 株の二トリルヒ ドラターゼ /3サブュニット、 αサブュ 二ット及び下流遺伝子群の遺伝子構成及び制限酵素地図を示す。 コ口ニーハイプ リダィゼーシヨンで取得した断片 (H i η 2. 3) 及ぴ、 大腸菌での発現に用い た断片 （β α、 β a 1、 a l 2) の位置を示した。 発明を実施するための最良の形態
先ず本発明の二トリルヒ ドラターゼを説明する。 本発明において、 二トリルヒ ドラターゼ活性を有するとは、 ァセトニトリルではァセトアミ ド、 n—プロピオ 二トリルでは n—プロピオアミ ド、 ァクリロニトリルではァクリルアミ ドのよう に、 二トリル化合物に水分子を付カ卩させて、 アミ ド化合物に変換する活性を有す ることである。 また、 生成した化合物は液体クロマトグラフィーで分取した後、 ガスクロマトグラフィー Z質量分析 （GC,MS)、 赤外吸収スペクトル （I R) および核磁気共鳴スぺク トル （NMR) 等を用いて同定する。
本発明において二トリルヒ ドラターゼ活性を測定するに際しては、例えば、 0. 1重量0 /0の二トリル化合物溶液 （0. 0 5M-リン酸バッファー pH7. 7) lm l に二トリルヒドラターゼ酵素溶液 1 0 μ 1を加え、 反応温度 2 7でから 6 0°Cに て 1分から 6 0分間保温後、 0. 1mlの I N HC 1を加えることにより反応を 停止し、 反応液の一部を液体クロマトグラフィーにて分析し、 アミ ド化合物の生 成の有無を検定することができる。
本発明において基質となる二トリルイ匕合物とは、 例えば、 ァセトニトリル、 n —プロピオ二トリル、 n—プチロニトリル、 イソプチロニトリル、 n -バレロニト リル、 n—へキサン二トリル等の脂肪族二トリル化合物、 2-クロ口プロピオニト リル等のハロゲン原子を含む二トリル化合物、 アクリロニトリル、 クロトノニト リル、 メタタリロニトリル等の不飽和結合を含む脂肪族二トリル化合物、 ラクト 二トリル、マンデロニトリル等のヒ ドロキシュトリル化合物、 2—フエニルダリシ ノニトリル等のアミノニトリル化合物、 ベンゾニトリル、 シァノピリジン等の芳 香族二トリル化合物、 マロノ二トリル、 スクシノニトリル、 アジポニトリル等の ジニトリル化合物等おょぴトリ二トリル化合物を挙げることができる。
本発明の二トリルヒドラターゼの基質特異性は、 上述の測定条件において、 基 質を各種変更してそれぞれの基質に対し二トリルヒドラターゼ活性を有するか否 かを測定することにより判断することができる。 基質特異性が広ければ、 製造で きる対応するアミド化合物の種類も増え、 好ましいが、 本酵素は少なくとも、 ァ タリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトニトリル、 ィソブチロニトリル、 n -バ レロニトリル、 n-ブチロニトリル、 ベンゾニトリル、 へキサン二トリルを基質と することができる。 .
本発明の二トリルヒドラターゼは、 還元型 S D S (ソディウムードデシルーサ ルフェイト） 一ポリアクリルアミド電気泳動法により、 分子量 2 5 0 0 0 ± 2 0 0 0と分子量 2 8 0 0 0 ± 2 0 0 0の二つのサブュニットがクマシ一プリリアン トブルーによる染色によって検出され、 前者を αサブユニット、 後者を サブュ ニットと呼ぶ。
本発明の二トリルヒドラターゼは、 活性測定に先立ち、 有機酸等の安定化剤を 含まない水溶液中の状態で, 7 0 °Cで 3 0分間加熱処理した後も、 加熱前の活性の 3 5 %の活性を保持することができる。
また、高濃度の二トリル基質は化学的に酵素を失活させることが報告されてい るが、 本発明の二ト リノレヒドラターゼは 6重量0 /0のァクリロニトリルを基質とし て用いても、そのような現象が観察されない。
さらに、 高濃度の反応産物であるアミド化合物が反応を阻害することが報告さ れ， 高濃度な反応産物を得る際に大きな問題となるが、 本発明の二トリルヒドラ ターゼは 3 5重量％のアクリルアミドを活性測定溶液に加えても、 基.質であるァ クリロニトリル濃度の減少が有意にみられ、 活性を保持する。 また、 本発明としては上記 （1 8 ) に記載のものが例示される。 すなわち、 本 発明の二トリルヒドラターゼとしては、 配列表の配列番号： 1に示される 2 0 5 個のアミノ酸の配列により示される αサブュュットおよぴ配列表の配列番号： 2 に示される 2 2 6個のアミノ酸の配列により示される /3サブュニットにより構成 されることが好ましい例として挙げられる。 この二つのサブニット以外にも、 金 属ゃ他のペプチド等を含有してもよい。 金属としては、 特に鉄やコバルトを含有 することが多い。 さらに、 このサブユニットのどちらか一方を含有する蛋白質で もよレ、。 また、 個々のサブユニットのアミノ酸配列としては、 他のサブュットと 複合体を形成して二トリルヒドラターゼ活性を有する限り、 アミノ酸配列におい て、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を有していてもよく、 宿主の種類により、翻訳後に修飾を受けることも当然予想される。特に、二トリル ヒドラターゼの サブュニットにおいてはシスティン残基が翻訳後、 システィン スルフィン酸またはシステインスルフェン酸に修飾されることが多い。 該ァミノ 酸配列のうちの 1〜 3 0個ァミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 または翻訳後修飾され ているアミノ酸配列も好ましい例として挙げられ、 より好ましくは 1〜1 0個、 更に好ましくは 1〜5個、 最も好ましくは 1〜3個である。 なお、 このような置 換、 欠失、 または挿入を有するアミノ酸配列を有する二トリルヒ ドラターゼ酵素 は、 公知の部位特異的変異導入法、 例えば Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法により、 塩基配列の対応す る部位に置換、 欠失、 または挿入を導入せしめた D NAを用い、 後述の通り、 宿 主微生物に導入し発現させることにより得ることができ、 熱安定性や有機溶媒耐 性の向上や基質.特異性の変化等の産業上望ましい性質を付加した変異酵素を作出 する試みも可能である。 かかる技術水準に鑑み、 それらが二トリルヒドラターゼ 活性を有している場合は本発明に包含されるものとする。
また、 本発明としては上記 （1 9 ) に記載のものが例示されるが、 これは本発 明の D N Aの説明において詳細に説明する。
上記のような理化学的性質を有する二トリノレヒドラターゼは、 例えば、 ジォバ チルス属に属する微生物を培養することにより取得することができる。 本発明に おいて使用される微生物は、 ジォバチルス属に属し、 二トリル化合物をアミ ド化 合物に変換させる水和活性を有する微生物であれば、 いかなるものでもよい。 ジ ォバチルス属に属する微生物としては、 ジォバチルス ·カルドキシロシリティカ ス (Geobacillus caldoxylosilyticus ) ジォバチルス · カウス 卜フィラス (Geobacillus kaustophilus ) s ジォバチルス · リ ツァニカス （Geobacillus lituanicus ) N ジォバチノレス ' ステア ロサーモフ ィ ラス （ Geobacillus stearothermophi lus )、 ジォバチルス · サブテラネウス ( Geobacillus subterraneus ) 、 ジオノ チルス * サ一モカ テヌ ラ タ ス ( Geobacillus thermocatenulatus N ジ才ノ チ /レス ·サーモ "二卜ジフイカンス (Geobacillus thermodenitrif icans) , ジォバチルス .サーモダルコシデシウス （Geobacillus thermoglucosidasius )、 シォパチルス · サ一モレオボランス (Geobacillus thermoleovorans) ^ ジ才ノ チノレス · トェヒ、、一 (Geobacillus toebii)、 ジ才 チノレ ス .ュゼネンシス （Geobacillus uzenensis) が挙げられる。 また、 ジォバチルス 属由来の微生物に特に限定されるものではなく、 他の微生物株由来の二トリルヒ ドラターゼ遺伝子も含まれる。 そのような微生物株としては、 ァグロパクテリゥ ム (Agrobacterium)属、 ァクロモノ ク夕ー (Achromobactei 属、 ァシ 卜 /· ^クタ一 (Acinetobacter)属、 エア口モナス (Aeromonas)属、 ェンテロパク ター (Errterobacter)属、エルウイニァ（Erwinia)属、キサン卜バタター（Xanthobacter) 属、 クレブシエラ（Klebsiella)属、 コリネパクテリゥム（Corynebacterium)属、 シ ノリゾビゥム （sinorhizobium) 属、 シユードモナス（Pseudomonas)属、 ストレプ トマイセス（Streptomyces)属、 ノカルディア (Nocardia)属、バチルス（Bacillus) 属、 ミクロコッカス (Micrococcus)属、 ロドコッカス (Rhodococcus)属、 ロ ドシュ ードモナス (Rhodopseudomonas) 属、 リゾビゥム（Rhizobium)属、 シユードノ力ノレ ディア（Pseudonocardia)属等が挙げられる。 具体的には、 本発明では下記の手法 でスクリーニングを行った。 まず、 様々な場所で採取した土壌を少量とつて、 水 または生理食塩水をいれた試験管内に入れて、 2日から 1 4日の間、 6 5 °Cの振 とう培養器の中で振とう培養する。 この培養液の一部を取り、 汎用的な微生物生 育用培地、 例えばグリセロール、 ポリペプトン、 酵母エキス等を主成分とした液 体培地に入れ、 6 5 °Cの培養温度にて、 1 Θから 7日間程度の間培養する。 これ により得られる培養液の一部を、 前述の微生物生育用培地成分を含む寒天平板培 地に広げて 6 5 °Cでさらに培養しコロニーを形成させることによって、 微生物を 単離することができる。 このようにして得られた微生物を、 前記培地成分にさら に n—バレロ二トリル等の二トリル化合物あるいはメタクリルアミド等のアミド 化合物を加えた液体培地を入れた試験管あるいはフラスコを用い適当な期間、 例 えば約 1 2時間から 7日程度の間、 6 5 °Cの培養温度で振とう培養することによ つて増殖させ、上記の二トリルヒドラターゼ活性測常法に基づいて、目的の微生物 を選択する。 そのような微生物の代表的菌株の同定を 1 6 S r R NA及び下記の 生化学的性質から行つた所、ジォバチルス'サーモダルコシデシウス（Geobacillus thermoglucosidasius) であることが判明し、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシ ウス Q _ 6 (Geobacillus thermoglucosidasius Q-6) の名称で、 独立行政法人産 業技術総合研究所 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に番号 F E RM P—1 9 3 5 1 (受理日平成 1 5年 5月 1 6日）として寄託され、 F E RM B P— 0 8 6 5 8としてブタぺスト条約に基づく寄託へ移管された （受領日平成 1 6年 3月 1 1日）。様々な特許 ·文献調査を行ったが、 ジォバチルス ·サーモグ ルコシデシウスに属する微生物に関して、 二 リノレヒドラターゼ活性を有する事 に関しては何の記載もなかった。 この事からジォバチルス ·サーモダルコシデシ ウス Q— 6株は新菌株と認められる。 また、 この新菌株の変異体、 即ち、 ジォパ チルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株より誘導された突然変異体、 細胞融合 株および遺伝子組み換え株を用いてもアミド化合物の製造が可能である。 なお、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の性質は下記のとおりである。
( a ) 形態的性質
培養条件： Nutrient Agar (Oxoid, England, UK) 培地 6 0 °C
1 . 細胞の形おょぴ大きさ 形 ：桿菌
大きさ ： 0.8X2.0〜3·0μπι
2. 細胞の多形性の有無 ：―
3. 運動性の有無 ： +
鞭毛の着生状態：周毛
4. 胞子の有無 ： ―
胞子の部位：端立
(b) 培養的性質
培養条件： Nutrient Agar (Oxoid, England, UK) 培地 60°C
1. 色：タリーム色
2. 光沢： +
3. 色素生産：一
培養条件： Nutrient broth (Oxoid, England, UK) 培地 60 °C 1. 表 発育の有無：一
2. 培地の混濁の有無： +
培養条件：ゼラチン穿刺培養 60 °C
1. 生育状態： +
2. ゼラチン液化： +
培養条件： リ トマス · ミルク 60°C
1. 凝固：—
2. 液化：―
(c) 生理学的性質
1. グラム染色 ： 不定
2. 硝酸塩の還元 ： 一
2. 脱窒反応 ： 一
3. MRテスト ： 一
4. VPテスト ： 一 . インドーノレの生成 ： -. 硫化水素の生成 ： 一
. デンプンの加水分解 ： 一 . クェン酸の利用
Koser：―
Christensen： ―
. 無機窒素源の利用
硝酸塩： 一
アンモニゥム塩 ： +
. 色素の生成：一
. ゥレアーゼ活性：―
. ォキシダーゼ： +
. カタラーゼ： +
. 生育の範囲
H ： 5. 5〜8. 0 温度 ： 4 5 °C〜7 2 °C
. 酸素に対する態度 ：通性嫌気性 . O— Fテスト ： 一ノー
( d ) 糖類からの酸産生 ガス産生 . L—ァラビノース —/— . D—キシロース +Z— . D—グルコース +Z— . D—マンノース +Z— . D—フノレク トース + /— . D—ガラクトース 一 /— . マルトース +Z—
. サークロース +/— 9. ラタトース 一/—
10. トレ /ヽロース +/_
1 1. D—ソノレビトーノレ -/-
12. D—マンニトール +/-
13. イノシトール 一 ー
14. グリセリン 一/一
(e) その他の性質
1. β—ガラクトシターゼ活性：一
2. アルギニンジヒドロラーゼ活性：一
3. リジンデカルポキシラーゼ活性：―
4. トリプトファンデァミナーゼ活性：一
5. ゼラチナ"ゼ活性： + 本発明方法において使用する微生物の培養方法は、 一般的な微生物培養方法に 準じて行われ、 固体培養または液体培養いずれも可能である。 バチルス ·サーモ ダルコシデシウス（Geobacillus thermoglucosidasius)は、通性嫌気性の微生物で ある為、 通常の通性嫌気性微生物と同様な培養条件で培養することができる。 培 養温度は、 微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、 例えば、 40°C〜75°C の鲔囲である。 培地の pHは、 例えば、 4〜 9をあげることができる。 特に、 バ チルス ·サーモグルコシデシウス Q— 6 (Geobacillus thermoglucosidasius Q-6) の場合、 45°C〜72 °C、好ましくは、 '55°C〜70 °Cの範囲の培養温度で、 5 〜8の培地： Hをあげることができる。 培養時間は、 種々の条件によって異なる が、 通常、 約 1日〜約 7日間程度が好ましい。 一方、 培地としては、 一般的な微 生物に用いる通常の炭素源、 窒素源、 有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地 を用いる。 炭素源として、 グリセロール、 グルコース、 シユークロース、 糖密、 有機酸、 動植物油等が使用できる。 窒素源として、 酵母エキス、 ペプトン、 麦芽 エキス、 肉エキス、 尿素、 硝酸ナトリウム等が挙げられる。 有機ないし無機塩と して、 塩化ナトリウム、 硫酸マグネシウム、 塩化カリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マ ンガン、 塩化コバルト、 硫酸亜鉛、 硫酸銅、 酢酸ナトリウム、 炭酸カルシウム、 リン酸 2水素 1カリウム、 リン酸水素 2カリウム等を用いられる。 本発明方法に おいては、 使用する微生物が持つ二トリルヒドラターゼ活性を高めるために、 n —バレロニトリル、ィソバレロニトリル、クロ トノニトリル等の二トリル化合物、 メタクリルアミド等のァ ド化合物を培地に添加するのが好ましい。 添加量とし て、 例えば、 培地 1 1 に対して、 0 . 0 1 g〜l 0 gの範囲の適量を添加すると 良い。 また、 好ましくは F eイオンあるいは C oイオンは 0 . l ^u g Zm l以上 存在させるとよい。
本発明の酵素のアミノ酸配列情報を取得するためには、 本件発明の酵素を精製 後、還元型 S D S—ポリアクリルアミド電気泳動により各サブュニットを分離後、 ゲルより各バンドを切り出し、 タンパク質シークェンサ一によりアミノ酸配列の 一部を決定することができる。
さらに本発明は、 二トリルヒドラターゼをコードする D NAに関するものであ る。 具体的には、 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 6 9 5— 1 3 1 2位を含む D N Aと配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1 _ 6 8 1位を含む D N Aが例示さ れ、 各々が αサブユニットと ]3サブユニットをコードするが、 これに限定される ものではなく、 この塩基配列を含む D N Aであればよい。 またこれらの配列と相 補的な塩基配列からなる D N Aに対して、 ストリンジェントな条件下にてハイブ リダィズすることができる D N Aであっても、 二トリルヒドラターゼ活性を有す る限り、 本発明に包含される。 すなわち、 これらの D NAを用いて本発明のニト リルヒドラターゼを発現することができる。ストリンジェントな条件下としては、 例 X.は ECL direct nucleic acid labeling and detection system 、アマンャム フアルマシアバイオテク社製） を用いて、 マニュアル記載の条件 （w a s h ： 4 2 °C、 0 . 5 x S S Cを含む primary wash buffer) が例示される。 ストリンジ ェントな条件下にてハイブリダィズすることができる D N Aとしては、 例えば、 前述のストリンジヱントな条件下、 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 6 9 5— 1 3 1 2位を含む D N Aとまたは配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1一 6 8 1 位を含む D N Aにおける相補的な塩基配列の任意の、 通常は少なくとも 2 0個、 好ましくは少なくとも 5 0個、 特に好ましくは少なくとも 1 0 0個の連続した塩 基配列を検出試料として、 これにハイプリダイズする D NAが例示される。
本発明の二トリルヒドラクーゼをコードする D N Aは、 以下の方法によって得 ることができる。 本明細書において、 特に記載がない限り当該分野で公知である 遺伝子組換え技術、 組み換えタンパク質の生産技術、 分析法が採用される。
本発明の二トリルヒドラターゼをコードする D N Aは、 本願明細書において開 示される塩基配列、 またはアミノ酸配列、 場合によれば前記した精製酵素から決 '定したアミノ酸配列等の配列情報にしたがって、 本発明の二トリルヒドラターゼ を含有する微生物、 例えばサーモダルコシデシウス Q— 6株から取得することが できる。 アミノ酸配列にしたがって合成されたオリゴヌクレオチドをプローブと して用い、 二トリルヒドラターゼを含有する微生物の染色体 D N Aを制限酵素に より消化した D NA断片をファージゃプラスミドに導入し、 宿主を形質転換して 得られるライブラリーから、 プラークハイブリダィゼーシヨンやコロニーハイプ リダイゼーシヨンなどにより本発明の二トリルヒドラターゼをコ一ドする D NA を得ることもできる。 また、 オリゴヌクレオチドをプローブとせず、 前記した精 製酵素から決定した両サブュニットの N末端のアミノ酸配列情報等にしたがって プライマーを作製し、 二トリルヒドラターゼ遺伝子の一部を Polymerase Chain Reaction (PCR)により増幅したものをプローブとして、同様の過程により取得する こともできる。得られた D N Aは、プラスミドベクター、 たとえば pUC118に挿入 しクローユングし、 ジデォキシ'ターミネータ一法（Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 74： 5463-5467, 1977)等の周知の方法により塩基配 列の決定を行うことができる。 このようにして調製された遺伝子は、 該遺伝子を 用いて形質転換した大腸菌宿主中の発現産物を上記にて記載の活性測常法を用い ることにより、 二トリルヒドラターゼをコ一ドする D NAであることを確認する ことができる。 さらに本発明は、 上記の D NAがベクターに連結されていることを特徴とする 組換えベクターを提供する。
本発明における組換えベクターとは、 宿主微生物に適したプロモータ一領域の 下流に、 上記方法で得られた D NAの 5 ' 末端側が機能し得るように連結して、 必要に応じてその下流に転写終結配列を挿入し、 適切な発現用べクターに組み込 み調製することができる。
適切な発現ベクターとしては、 宿主微生物内で複製増殖可能であれば特に制限 されない。また、染色体に遺伝子挿入が可能な宿主であれば、該宿主における自律 複製可能な領域を有する必要はない。 例えば、 宿主として大腸菌を用いるのであ れば、 強力なプロモーター、 たとえば、 lac、 trp、 tac、 trc、 T7， PLやピノレビン 酸ォキシダーゼ遺伝子のプロモーター （特許公報第 2 5 7 9 5 0 6号） などを含 む pUC系、 pGEX系、 pET系、 pT7系、 pBluescript系、 pKK系、 PBS系、 pBC系、 pCAL系などを含む、通常大腸菌で使用される任意のベクターから選択できる。 ま た、 αサブュニット遺伝子及ぴ サブュニット遺伝子が各々のプロモーターより 独立のシストロンとして発現されてもよいし、 共通のプロモーターによりポリシ ストロンとして発現されてもよレ、。 さらには、 独立のシストロンの場合、 各々の サブュニット遺伝子が別のベタター上にあっても良い。
さらに本発明においては上記の二トリルヒドラターゼの糸且換えベクターに、 本 発明の二トリルヒドラターゼ遺伝子の下流にある遺伝子を発現する D N Αを組み 込むことにより， 二トリルヒドラターゼの活性がより上昇することを見出し、 こ のようなベクターも提供する。 具体的には、 上記と同様に発現に必要なプロモー ターや転写終結因子等を含むプラスミドベクターを用い、 二トリルヒドラターゼ の活性化に関与するタンパク質をコードする遺伝子、 二トリルヒドラターゼの" サブュニット遺伝子及び j3サブュニット遺伝子が各々独立のシストロンとして発 現されていてもよいし、 共通の制御領域によりポリシストロンとして発現されて いてもよい。 同様に、 各々の遺伝子が別のベクター上にあってもよい。
それゆえ、 本発明は、 二トリルヒ ドラターゼの活性化に関与するタンパク質を コードする D NAを提供する。 具体的には、 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1 3 2 5— 1 6 6 3位が例示されるが、 これに限定されるものではなく、 この塩 基配列を含む D N Aであればよい。 またこれらの配列と相補的な塩基配列からな る D NAに対して、 ストリンジェントな条件下にてハイブリダィズすることがで きる D N Aであり、 二トリルヒドラターゼの^性化に関与する限り、 本発明に包 含される。 すなわち、 これらの D NAを用いて本発明の二トリルヒドラターゼを より活性化することができる。 ストリンジェントな条件下としては、 例えば ECL direct nucleic acid labeling and detection system 、アマシャムファノレマシァ バイオテク社製） を用いて、 マニュアル記載の条件 （w a s h ： 4 2 °C、 0 . 5 x S S Cを含む primary wash buffer) が例示される。 ストリンジェントな条件 下にてハイブリダィズすることができる D NAとしては、 例えば、 前述のストリ ンジヱントな条件下、 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1 3 2 5— 1 6 6 3位 を含む D N Aにおける相補的な塩基配列のうち、 任意の、 通常は少なくとも 2 0 個、 好ましくは少なくとも 5 0個、 特に好ましくは少なくとも 1 0 0個の連続し た塩基配列を検出試料として、 これにハイブリダィズする D N Aが例示される。 また、 本発明の二トリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質は、 配列表 の配列番号： 4に示される 1 1 2個のアミノ酸の配列により示される蛋白質であ るが、 二トリルヒドラターゼの活性化に関与する能力を有する限り、 アミノ酸配 列において、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、 欠失、 または挿入を有するァ ミノ酸配列を有していてもよく、 宿主の種類により、 翻訳後に修飾を受けること も当然予想される。 該アミノ酸配列のうちの 1〜2 5個アミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 または翻訳後修飾されているアミノ酸配列も好ましい例として挙げられ、 より好ましくは 1〜 1 0個、 更に好ましくは 1〜 5個、 最も好ましくは 1〜 3個 である。
また、 本発明は、 上記の D N Aが宿主細胞に導入され、 形質転換せしめられた ことを特徴とする形質転換体を提供する。
形質転換体は、 上記方法にて作成した発現ベクターを用い、 宿主細胞を形質転 換することにより、 取得することができる。 宿主細胞としては、 微生物、 哺乳類 細胞、 および植物細胞などが含まれるが、 微生物を利用することが好ましい。 微 生物の例としては後述の実施例のように大腸菌が挙げられるが、 特にそれに限定 されることなく、 バチルス属、 シユードモナス属、 コリネバクテリウム属、 プレ ビバクテリウム属、 ストレプトコッカス属、 ロドコッカス属、 放線菌ゃ酵母など が例示される。
宿主微生物への遺伝子の導入法としては、 たとえば、 形質転換、 形質導入、 接 合伝達、 またはエレクトロポレーシヨンなどの当技術分野で周知の任意の常法に よって、 好ましい宿主に導入することができる。
さらに本発明である二トリルヒドラターゼまたはそれを含有する菌体処理物の 製造方法としては、 前述の通り、 該ニトリルヒドラターゼを生産し得る微生物、 例えば、 ジォバチルス属の微生物、 特に好ましくは、 ジォバチルス 'サ一モグル コシデシウス Q— 6株の培養物から公知の精製方法を適宜組み合わせて該酵素を 取得することができるが、 さらに、 上述の通り、 二トリルヒドラターゼの遺伝子 を用レ、形質転換された形質転換体から取得することもできる。
該酵素を取得するにあたり、 ジォバチルス属の微生物の培養方法は前述のとお りであるが、 上記形質転換体は、 通常これらの微生物が資化可能な栄養源を含む 培地で培養することが好ましく、 例えば、 酵素や抗生物質などを生産する通常の 方法で培養することができる。 培養は、 通常、 液体培養でも固体培養でもよい。 例えば、 グルコース、 シユークロース等の炭水化物； ソルビトール、 グリセロー ル等のアルコール；クェン酸、 酢酸等の有機酸；大豆油等の炭素源またはこれら の混合物；酵母エキス、 肉エキス、硫安、アンモニア等の含窒素無機有機窒素源； リン酸塩、 マグネシウム、 鉄、 コバルト、 マンガン、 カリウム等の無機栄養源； およびビォチン、 チアミン等のビタミン類を適宜混合した培地が用いられる。 よ り好ましくはそのような培地成分に F eイオンあるいは C oイオンを 0 . 1 μ g Zm l以上存在させるとよい。 培養条件は、 通常、 好気条件下で行うことが好ま しい。 培養温度は、 宿主微生物が生育し得る温度であれば特に制限はないが、 通 常、 5 °C〜 8 0 °C、 好ましくは 2 0〜7 0 °C、 さらに好ましくは 2 5〜 4 2 で 行うことが例示される。 また、 培養途中の p Hは宿主微生物が生育し得る p Hで あれば特に制限はないが、 通常、 11 3〜9、 好ましくは 11 5〜8、 さらに好 ましくは p H 6〜 7で行うことが例示される。
また、 本発明においては、 本発明の酵素を用いて、 二トリル化合物を製造する ことができる。 この発明において、 前述の酵素を用いるに際しては、 本発明の酵 素の作用を阻害しないかぎり、 特別に精製程度等は限定されず、 精製された本発 明の酵素の他、 その酵素含有物を用いてもよく、 さらには、 その酵素を生産する 微生物やその酵素の遺伝子を導入して形質転換された形質転換体等を使用しても よレ、。 微生物や形質転換体等を使用する場合には、 菌体を利用してもよく、 菌体 としては、 生菌体、 もしくはアセトンやトルエン等の溶媒処理または凍結乾燥等 の処理を施して、 化合物の透過性を増した菌体を使用することができる。 場合に よっては、 菌体破碎物ゃ菌体抽出物等の酵素含有物となっていてもよい。 該酵素 を含有する菌体処理物の作成方法を例示すれば、 まず培養物を固液分離し、 得ら れる湿菌体を必要に応じてリン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁 せしめ、 次いで超音波処理、 フレンチプレス処理やガラスビーズを用いる粉碎処 理、 あるいはリゾチームゃプ口テアーゼ等の細胞壁溶解酵素による処理などの菌 体破碎処理を適宜組み合わせて、 菌体内から該酵素を抽出し、 粗製の二トリルヒ ドラターゼ含有液を得ることができる。 この粗製の酵素含有液を、 必要により、 公知のタンパク質、 酵素などの単離、 精製手段を用いることにより、 さらに精製 することができる。 例えば、 粗製の酵素含有液に、 アセトン、 エタノールなどの 有機溶媒を加えて分別沈殿せしめる 、 硫安などを加えて塩析せしめるかして、 水溶液から二トリルヒドラターゼを含有する区分を沈殿せしめ回収する方法が例 示される。 またさらに、 陰イオン交換、 陽イオン交換、 ゲル濾過、 抗体ゃキレー トを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製する ことができる。 勿論、 酵素ゃ菌体、 酵素を含有する菌体処理物等は、 公知の方法 により、カラムにおいて充填されていてもよく、担体に固定化されていてもよく、 特に菌体の場合はポリアクリルアミドゲル等の高分子中に抱埋してもよい。 菌体 または菌体処理物を水またはリン酸緩衝液等の緩衝液等の水性水溶液に懸濁し、 これにュトリル化合物を加えることにより、 反応を進行させる。 使用する菌体も しくは菌体処理物の濃度は、 0. 0 1重量％〜2 0重量％、 好ましくは、 0. 1重 量％〜1 0重量％である。 反応温度の上限は、 好ましくは 9 0 °C、 さらに好まし くは 8 5 °C、 一層好ましくは 7 0 °Cを、 反応温度の下限は、 例えば 1 °C、 好まし くは 4 °C、さらに好ましくは 1 0 °Cを、反応 p Hは、例えば、 5〜 1 0、好ましく は、 6〜8 を、 反応時間は、 例えば、 1分間〜 7 2時間を挙げることができる。 また、 二トリルイ匕合物を徐々に滴下することによって、 アミド化合物を高濃度に 生成蓄積させることもできる。 反応液からのアミド化合物を回収するには、 菌体 ゃ菌体処理物等をろ過や遠心分離等で取り除いた後、 晶析などの手法で取り出す 方法等がある。 実施例
以下に、 実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、' これらの実施例は本発明 の範囲を限定するものではない。 実施例 1 ：菌体分離
埼玉県の温泉近傍で採取した土壌を少量 （約 l g ) とって、 生理食塩水を 5 m 1入れた試験管内に入れて、 3日間、 6 5 °Cの振とう培養器の中で振とう培養し た。 この培養液の一部 （0 . 5 m l ) を取り、 グルコース 1 . 0重量 0 /0、 ポリべ プトン 0. 5重量％、 イーストエキストラタト 0. 3重量％からなる培地 （p H7. 0 ) に加え、 2日間 6 5 °Cで往復振とう培養した。 これにより得られる培養液の 一部（0. 1 m 1 ) を、前述の培地成分を含む寒天平板培地に広げて 6 5 °Cでさら に 2日間培養しコロニーを形成させることによって、 微生物を単離した。 単離し た微生物を、上記と同組成の培地に 0. 1重量0 /0の n—バレロ二トリルを添加した 液体培地に接種した後、 6 5 °Cで 2 4時間培養することにより、 二トリル資化性 の高い微生物を有する培養液を得た。この培養液 1mlを 9mlの 1.1重量％の アクリロニトリル溶液 （0.05M—リン酸バッファー pH7. 7) に加えて、 反応 温度 27°Cにて反応を開始した。 10分後、 1mlの IN HC 1を加えること. により反応を停止した。 反応液の一部を液体クロマトグラフィー （HPLC) に て分析し、 アクリルアミド生成の有無を検定することによって、 二トリルヒドラ ターゼ活性を有する微生物をスクリ一ユングした。 このようにして二トリル化合 物をアミド化合物に変換させる水和活性を有する微生物としてジォバチルス ·サ ーモダルコシデシウス Q一 6株を得た。
(液体ク口マトグラフィ一分析条件）
本体： HITACHI D-7000 (日立社製）
カ ラ ム ； Inertsil 0DS- 3 (GLサイエンスネ土製）
長さ； 200 mm
カラム温度 ； 35°C
流堇； 1 m 1 _/ m i n
サンプル注入量 ； 10 μ 1
溶液： 0.1 w t %リン酸水溶液 実施例 2 ：菌体培養の生育上限温度
実施例 1により得られたジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株を、 実施例 1で使用した培地成分を含む寒天平板培地に塗布し、 複数の異なる温度で 培養を行い、 菌体の生育状況を調べた。 その結果を表 1に示す。 ジォバチルス ' サーモダルコシデシウス Q—6株は、 70°Cまでは通常の增殖を示し、 72°C でも生育が可能であった。 表 1
評価基準： -増殖しなかった、 + 増殖した、 ++ 良く増殖した
Figure imgf000028_0001
実施例 3 ：ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の菌体中の二トリル ヒ ドラターゼ活性の測定とその温度依存性
グリセロール 0. 2重量％、 クェン酸 3ナトリウム 2水和物 0. 2重量％、 リン 酸 2水素カリウム 0. 1重量％、 リン酸水素 2カリウム 0. 1重量％、 ポリぺプト ン 0. 1重量0 /0、 酵母エキス 0. 1重量0 /0、 塩化ナトリウム 0. 1重量0 /0、 n—バ レロニトリル 0. 1重量％、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 0 2重量％、硫酸鉄（Π) 7水和物 0. 0 0 3重量％、塩化コバルト 6水和物 0. 0 0 0 2。/。を含む滅菌済培 地（pH7. 0) 1 0 0m lを 5 0 0m l三角フラスコに入れたものにあらかじめ同 培地で培養したジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の培養液 1 m 1 を植菌した。 これを 6 5°Cで 1日間、 2 0 Ostroke/minで回転振とう培養し、 菌 体培養液を得た。 このジォバチルス ·サーモグルコシデシウス Q— 6株の菌体培 養液 30 Om 1から遠心分離（10000 X g， 15分） によって菌体を集め、 0. 05Mリン酸緩衝液 (pH 7.5 ) にて洗浄後、 同緩衝液 5 Omlに懸濁した。 こう して調製した菌体懸濁液について、 上述の方法で、 5分間反応し、 二トリル化合 物をアミド化合物に変換させる水和活性を測定した。酵素活性の単位（ュニット） を、 1分間に Ι μιηοΐ のアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を 1 ユニット （以下、 Uと記す） と定めると、 27°Cにおける湿菌体重量当たりの二 トリルヒドラターゼ活性（UZmg)は 9. 37U/mgであった。 さらに 10°C において、 5U/m 1になるように 0.5重量0 /0のァクリロニトリルを含む菌体懸 濁液を調製し、 この菌体懸濁液を用いて、 30°C、 40°C, 50°C、 60°C, 7 0°Cの条件で同様に二トリルヒドラターゼ活性を求め、表 2に示した。その結果、 菌体を反応に用いた時の至適温度は 60°C近傍にあり、'高温域において特に高い 活性を示した。 表 2
Figure imgf000029_0001
実施例 4 ：ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の菌体中の二トリル ヒドラターゼの熱安定性
ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の菌体中にある二トリルヒド ラターゼの活性の熱安定性を調べるために、 実施例 3の培養法で得た菌体を 10 U/mlとなるように蒸留水に懸濁し、 30分、 所定温度での保温処理を行い、 残存活性を測定した。 0. 5 m 1の 1重量％ァクリロ二トリル溶液（ 0. 05 Mリ ン酸カリゥム緩衝液、 H7. 5)に 0. 5mlの保温処理後の菌体液を加えて、 27°Cにて攪拌しながら反応を開始した。 5分後、 100 /xLの 1規定塩酸を加 えることにより反応を停止した。 保存処理前の活性に対する保存処理後の活性を 算出し、 保存処理前の活性を基準（100)とした換算値として表 3に示す。 この 結果より、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の菌体中の二トリル ヒ ドラターゼの酵素活性は、 高温下においても安定に保持されるといえ、 70°C という高温下においても 80%以上の活性を保持することができ、 80°Cの高温 下においても 30 %以上の活性を保持することが出来る。 表 3
Figure imgf000030_0001
実施例 5 ：各種二トリル化合物を基質とした反応
下記表 4に記載している各種二トリル化合物を対応するアミド化合物に変換さ せる二トリルヒドラターゼ活性について調べた。 9 m 1の 1. 1 %二トリル溶液 (0. 05Mリン酸カリウム緩衝液、 pH7. 5)に lm 1菌体懸濁液を加えて、 反応温度 30°Cにて反応を開始した。 10分後、 1mlの IN HC 1を加える ことにより反応を停止した。 HP LCによる分析条件は実施例 1と同様であるが、 溶液を 1.0 wt%ァセトニトリルを含む蒸留水とした。 その結果、 表 4に記載し たすベての二トリル化合物を基質として二トリルヒドラターゼ活性を有していた c 表 4 供試二トリル化合物
アジポニトリル n -プチロニトリル
ァセトニトリル へキサン二トリル
イソプチロニトリル ベンゾニトリル
n—バレロ二トリル
実施例 6以降に記載のジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株由来の -トリルヒ ラターゼ αサブユニット （ORF2)、 j3サブユニット （ORF 1) 及び二トリルヒドラターゼ活性化因子 （ORF3) のアミノ酸配列及び塩基配列 を解明するに至った本発明の流れを以下に要約した。
ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株を培養して得られた菌体を破 枠後、 硫酸アンモニゥムによる沈殿、 陰イオン交換カラム口マトグラフィー、 D EAEカラム、 ハイドロキシアパタイトカラムに供し、 ゲルろ過グロマトグラフ ィー、 透析を行い、 二トリルヒ ドラターゼ酵素を精製した。
精製した二トリルヒドラターゼの Q;サブュニット及ぴ j3サブュニットの N末約 30残基のアミノ酸配列を決定し、 該菌の属に基づくアミノ酸のコドン使用を考 慮して遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド縮重プライマーを作製し、 該菌体から抽 出した染色体 DN Aを鎳型として縮重 PC Rを行い、増幅 DN A断片を取得した。 増幅された DN A断片をクローユングし、 挿入断片の塩基配列を決定した。 該塩 基配列より推定されるアミノ酸配列と、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒ ドラターゼ αサブュニット及ぴ サブュニット の N末端アミノ酸配列を比較し、 クローニングされた配列が二トリルヒ ドラター ゼをコ一ドしていることを確認した。
その結果、 ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株において、 5， 末 端側上流より二トリルヒドラターゼ遺伝子は βサブュニット、 αサブュニットの 順に隣接して存在することが明らかになった。
公知の様々二トリルヒドラターゼ αサブュニットの下流遺伝子における相同性 の高い配列から、 遺伝子増幅用オリゴヌクレオチド縮重プライマーを作製し、 該 菌体から抽出した染色体 D N Αを铸型として縮重 P C Rを行い、 増幅 D NA断片 を取得した。 得られた該菌の αサブュニット部分の増幅 D NA断片をクローニン グし塩基配列を決定した。
以上より取得されたジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリ ルヒドラターゼ αサブュニット及び j3サブュニットを適当な発現ベクターに導入 した。 構築した発現プラスミドを用いて、 適当な宿主菌を形質転換した。 宿主の 例としては、 ロドコッカス属、 コリネ属、 大腸菌などが挙げられる。 好ましくは アミダーゼを有していない宿主が良い。 更に、 得られた形質転換体を培養して得 た菌体とアタリロニトリルを水性媒体中で接触させることによりアクリルアミド が生成することを確認し、 その生成効率及び二トリルヒドラターゼ活性を比較し 次に、 上記より得られた D N A断片をプローブとして、 コロニーハイブリダィ ゼーションを行い、 ジォバチルス .サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリル ヒドラターゼ αサブュニッ ト及び サブュニットの下流遺伝子を含む周辺遺伝子 をクローユングした。
下流遺伝子を二トリルヒドラターゼ αサブュニット及び サブュニッ トと共発 現させ、 二トリルヒ ドラターゼ活性を比較した。 その結果、 下流遺伝子が二トリ ルヒドラターゼ活性を顕著に上昇させる活性化に関与する遺伝子であることを見 出した。 実施例 6 ：ジォバチルス .サーモダルコシデシウス Q— 6株由来二トリルヒドラ ターゼ酵素の精製 '
ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株を培養し、 種々のカラムに供 することで二トリルヒドラターゼ活性画分を精製した。 クロマトグラフィーにおける二トリルヒドラターゼ活性画分の測定方法は以下 のように行った。 HEPESバッファー （100mM、 H 7. 2) により希釈 した各画分の溶出液に 1重量％のァタリロニトリルを添加して 27 で 1分間反 応させた。 IN HC 1を 10液量％反応液に添加することにより反応を停止さ せ、 生成したアクリルアミド濃度を実施例 1に記載の HPLC分析法により測定 した。
ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株由来二トリルヒドラターゼ酵 素を精製するために、 まず 0. 1 重量％の n—パレロニトリルを含有する V/F 培地 （グリセロール 0. 2重量％、 クェン酸 3ナトリウム 2水和物 0.2重量0 /0、 リン酸 2水素カリウム 0. 1重量％、 リン酸水素 2カリウム 0. 1重量％、 ポリぺ プトン 0. 1重量0 /0、酵母エキス 0. 1重量0 /0、塩化ナトリウム 0. 1重量0 /0、 n - バレロ二トリル 0. 1重量0 /0、 硫酸マグネシウム 7水和物 0.02重量％、 硫酸鉄
(Π) 7水和物 0.003重量％、塩化コバルト 6水和物 0. 0002重量％) に ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株 を植菌し、 65 °Cで 24時間培 養した。 培養には、 96穴 2m 1の深底プレート （CO STAR社） を用いた。 培養終了後、 8000 g、 10分間の遠心分離により集菌し、 得られた湿菌体 3 gを 20mLの HEPESバッファー（100 mM、 pH 7. 2)に再懸濁した。 菌体を冷却下で超音波破碎機を用いて破碎し、菌体破碎液に硫酸ァンモニゥム（ 3 0%飽和濃度） を加えて 4 °Cで 30分間緩やかに攪拌し、 20000 g、 10分 '間の遠心分離を行い、 上清を得た。 遠心上清液に硫酸アンモニゥム （70%飽和 濃度） 加え 4°Cで 30分間緩やかに攪拌した後、 20000 g、 10分間の遠心 分離により得られた沈殿物を 9 mlの HE PESバッファー （ 100 mM、 pH
7. 2) に再溶解し、 1 Lの伺液中において 4 °Cで 24時間透析し、 陰イオン交 換クロマトグラフィー （アマシャムバイオサイェンセス社； H i T r a p DE AE FF (カラム体積 5mLX 5本）） に供した。展開液は H E P E Sバッファ 一 （100mM、 pH7. 2) を用い、 塩化カリウム濃度を 0. 0Mから 0. 5 Mまで直線的に増加させることにより分画を溶出し、 二トリルヒドラターゼ活性 を含む画分を得た。 その画分をアパタイトカラムクロマトグラフィー （B I O— RAD社製； CHT2— I (カラム体積 2mL)) に供した。 0. 01Mリン酸力 リウム水溶液（PH7. 2) を展開液とし、 リン酸カリウムを 0. 01Mから 0. 3Mまで直線的に増加させることにより分画を溶出し、 二トリルヒドラターゼ活 性を含む画分を得た。 その画分を 0. 15M Na C lを含む0. 05Mリン酸 ナトリゥム水溶液（PH7. 2)を展開液としたゲルろ過クロマトグラフィー（ァ マシャムパイォサイエンセス社； S u p e r d e X 200 HR 10/30) に供し、 二トリルヒドラターゼ活性画分を取得した。 こうして得られたゲルろ過 クロマトグラフィーの二トリルヒドラターゼ活性画分を用いて以下の実施例を行 つた。 実施例 7 ：ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリ ルヒドラターゼ活性画分における二トリルヒドラターゼの反応温度依存性
ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株由来の-トリルヒドラターゼ 活性画分溶液 （3. 2mgZmL、 0.05Mリン酸緩衝液 （pH7. 5)) につ いて、 表 5に示した反応温度で二トリルイヒ合物をアミド化合物に変換させるニト リルヒドラターゼ活性を測定した。 1 mL の 0. 5重量0 /0ァクリロ二トリル溶液 (0. 05M リン酸カリウム緩衝液、 pH7. 5)に二トリルヒドラターゼ活性画分 溶液を加えて、各温度にて攪拌しながら反応を開始した。 2分後、 100 /xLの 1 N 塩酸を加えることにより反応を停止した。 酵素活性の単位 （ユニット） は、 1分間に l ^umol のアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活性を 1ュニ ット （以下、 Uと記す） と定めて、 酵素重量当たりの水和活性 （UZmg) を表 5に示した。 この結果より、 ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株よ り精製した二トリルヒドラターゼ活性画分における二トリルヒドラターゼの活性 は 60度という高温まで、 反応温度の上昇に伴い上昇している。 最適温度は菌体 を反応に用いた時と同様に 60°C近傍にあると考えられ、 70度という高温下に おいても大変高い二トリルヒドラターゼ活性を示している。 表 5
Figure imgf000035_0001
実施例 8 ：ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリ ルヒドラターゼの熱安定性
ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラ ターゼの活性の熱安定性を調べるために、二トリルヒドラターゼ活性画分溶液（3. 2mg/m 1 , 0.05Mリン酸緩衝液 （pH7. 5)) を 30分、 所定温度での 保温処理を行い、 残存活性を測定した。 1 mL の 0. 5重量％ァクリロ二トリル 溶液（0. 05 Mリン酸カリウム緩衝液、 pH7. 5)に保温処理後の二トリルヒ ドラターゼ溶液を 5 μ 1加えて、 27°Cにて攪拌しながら反応を開始した。 2分 後、 100 1の IN HC 1を加えることにより反応を停止した。 保存処理前 の活性に対する保存処理後の活性 （残存活性） を算出し、 保存処理前の活性を基 準（100)とした換算値として表 6に示す。 この結果より、 ジォバチルス *サ一 モグルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラターゼ活性画分におけ る水溶液中の二トリルヒドラターゼの酵素活性は、 高温下においても安定に保持 されるといえ、 60°Cという高温下においても 60%以上の活性を保持すること ができ、 70°Cの高温下においても 35%以上の活性を保持することができる。 表 6
Figure imgf000036_0001
実施例 9 ：ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリ ルヒドラターゼのアタリロニトリル濃度依存性と濃度耐性
ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラ ターゼに関して、 基質であるァクリロニトリル濃度への依存性と耐性を調べるた めに、 4 ilの二トリルヒドラターゼ活性画分溶液 （3. 2mgZmL、 0.05 Mリン酸緩衝液 (pH7. 5)) を各種重量％のァクリロニトリルを含む 5m 1溶 液（0. 05Mリン酸カリウム緩衝液、 pH7. 5)に加えて、 27°Cにて攪拌し ながら反応を開始した。 5分、 10分、 20分、 40分後に lmlずつを取り出 し、 l O O^ L の IN HC 1を加えることにより反応を停止し、 生成したァク リルアミドの濃度を HP LCにより定量し、 表 7に示した。 この結果より、 ジォ バチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラターゼ 活性画分における水溶液中の二トリルヒドラターゼの酵素活性は、 .高いァクリ口 二トリル濃度においても安定に保持されるといえる。 6%という高濃度のァクリ ロニトリル溶液中において 40分反応させても、 より低いァクリロニトリル濃度 の場合に比べての活性の低下は観察されず、 逆に基質濃度の上昇に伴って活性は 上昇した。 表 7
Figure imgf000037_0001
実施例 10 ：ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製したニト リルヒドラターゼのアクリルアミ ド濃度耐性
ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株より精製した二トリルヒ ドラ ターゼに関して、 生成物であるアクリルアミ ドによる阻害を調べるために、 10 μ 1の二トリルヒドラターゼ活性画分溶液（3. 2mg/mL, 0.05Mリン酸 緩衝液 （ρΗ7· 5)) を 0. 5重量0 /0アクリロニトリルと 35重量0 /0アクリルァ ミ ドを含む溶液（0. 05Μリン酸カリウム緩衝液、 ρΗ7. 5)の lmlに対し て加え、 27 °Cにて攪拌しながら 10分間反応を行い、 反応後の液中のァクリ口 二トリル濃度を HP LCで定量したところ、 すべてのァクリロニトリルがァクリ ルアミ ドに変換されていた。 この結果より、 ジォバチルス 'サーモダルコシデシ ウス Q— 6株より精製した二トリルヒドラターゼ活性画分における水溶液中の二 トリルヒドラターゼの酵素活性は、 35%という高いアクリルアミ ド濃度におい ても活性が保持されるといえる。 実施例 11 ：ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株由来の二トリルヒ ドラターゼ サブュニット及ぴ ο;サブュニット部分の遺伝子のクローユング (1) ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株由来の二トリルヒ ドラタ ーゼ酵素の確認及ぴ N末ァミノ酸配列決定
実施例 6により得られたゲルろ過クロマトグラフィーでの二トリルヒ ドラター ゼ活性画分溶出液を還元条件下において還元型 S D S -ポリアクリルアミ ド電気 泳動に供した。 泳動後、 クマシ一ブリリアントブルー （CB B) による蛋白質染 色を行い、 脱色した結果、 約 2 5 Kダルトン及ぴ約 2 8 Kダルトンの分子量を有 する 2本の主要なパンドが確認された。 この 2本の主要な精製蛋白質を、 ブロッ ティング装置 （B I O— RAD社） を用いて PVDF膜 （M I L L I PORE社 製） に転写し、 CB B染色し、 目的の 2本のバンドが吸着している部分を PVD F膜から切り出した。 次に、 全自動タンパク質一次構造分析装置 P P S Q— 2 3 A (島津製作所） を用いて 2種類の蛋白質の N末端アミノ酸配列を解読した。 そ の結果、 分子量 2 5 Kダルトンの蛋白質の N末ァミノ酸配列は、 配列表の配列番 号： 2 3に記載の配列であり、 分子量 2 8 Kダルトンの蛋白質の N末ァミノ酸配 列は、 配列表の配列番号： 24に記載の配列であった。
既知の二トリルヒドラターゼ酵素のァミノ酸配列と比較した結果、 2 5 Kダル トンのポリぺプチド鎖が二トリルヒ ドラターゼ αサブュニット、 2 8 Κダルトン のポリべプチド鎖が二トリルヒドラターゼ] 3サブュニットと低いながらもホモ口 ジーを示し、 該蛋白質をコードすることが示唆された。
(2) Ν末端アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマ の合成 上記で解読した 2種類の蛋白質の Ν末端のアミノ酸配列から、 該菌属のコドン 使用に基づいて縮重 P CR用オリゴヌクレオチドプライマーを以下の 1 2種類合 成した。 配列表の配列番号： 5に記載のプライマー 1 (a F l)、 配列表の配列番 号： 6に記載のプライマー 2 (a F 2)、 配列表の配列番号： 7に記載のプライマ 一 3 (a F 3) 配列表の配列番号： 8に記載のプライマー 4 (o; R l)、 配列表 の配列番号： 9に記載のプライマー 5 ( a R 2 )、配列表の配列番号： 1 0に記載 のプライマー 6 (aR 3)、配列表の配列番号： 1 1に記載のプライマー 7 (β Ρ 1 )、 配列表の配列番号： 1 2に記載のプライマー 8 ( /3 F 2 )、 配列表の配列番 号： 1 3に記載のプライマー 9 F 3), 配列表の配列番号： 1 4に記載のブラ イマ一 1 0 (j3 R 1)、配列表の配列番号： 1 5に記載のプライマー 1 1 (/3 R 2)、 配列表の配列番号： 1 6に記載のプライマー 1 2 (/3 R 3) である。 尚、 yは c または tを表し、 rは aまたは gを表し、 mは aまたは cを表し、 kは gまたは tを表し、 sは cまたは gを表し、 wは aまたは tを表し、 dは a、 gまたは t を表し、 nは、 a、 c、 gまたは tを表している。 また、 αサブユニット及び ]3 サブュニットをコードする遺伝子の染色体上での位置を考慮し、 プライマーを作 成した。
(3) ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株より染色体 DNAの抽出 及び縮重 PCR
ジォバチルス♦サーモダルコシデシウス Q— 6株を実施例 6と同様の方法によ り培養、 回収し、 Q I八0£ 社の。 e n om i c— t i p S y s t em (5 00/G)キットを用いて菌体から染色体 DNAを抽出した。 TE溶液に溶解させ たジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の染色体 DNA0. 1 μ gを 铸型として縮重 PCRを行った。 縮重 PC Rは、 配列表の配列番号： 5から 1 0 に記載のプライマー 1から 6と、 配列表の配列番号： 1 1から 1 6に記載のブラ イマ一 7から 1 2の組み合わせ 36通りを行った。 1 00 pmo 1のプライマー 2種類を各々、 5Uの T a k a r a社の E X T a q DNAポリメラーゼ及ぴ バッファーを含む全量 1 00 μ 1の反応液を用い、 縮重 PC Rを行い DN Α断片 の増幅を試みた。反応条件は以下の通りである。 9 6°C、 3分の熱変性後、 9 6°C、 30秒熱変性、 42 °C、 30秒ァニーリング、 7 2 °C、 1分 30秒伸長反応を 3 5サイクル行った後、 72°C、 5分間伸長反応をさせ、 4°Cにて保冷した。 各々 の PC R産物を 1重量％ァガロース電気泳動に供し、 DN Aの増幅の確認を行つ たところ、 配列表の配列番号： 9に記載のプライマー 5 (aR 2) と配列表の配 列番号： 1 1に記載のプライマー 7 F 1) の組み合わせ及び配列表の配列番 号： 9に記載のプライマー 5 (aR 2) と配列表の配列番号： 1 2に記載のブラ イマ一 8 ( F 2) の組み合わせで行った P CRの場合のみ、 約 700 b pの D N A断片の増幅が確認された。 (4) 縮重 P C R産物のクローニング及ぴ増幅 D N A断片の塩基配列解読 増幅された DNA断片をゲルから切り出し、 Q I Aq u i c k Ge l Ex t r a c t i o n K i t (Q I AG E N社）を用いて抽出し、 p G EM— T V e c t o r (P r ome g a社） に T4 DNA L i g a s e (Ta k a r a 社） を用いてライゲーシヨンした。 Ex T a qによる PC Rの結果、 3，末端に Aが 1塩基付加される性質を利用している。 ライゲーシヨン反応後、 大腸菌 JM 109株を形質転換し、 LB寒天培地 （50 μ g/m 1アンピシリン、 0. 5重 量％バク ト酵母エキストラクト、 1重量％バタトトリプトン、 0. 5重量％Na C l、 2. 0重量0 /oB a c t o Ag a r (pH7. 5 )) にて 37 °Cでー晚培養 し、 アンピシリンにて形質転換体を選択した。 アンピシリンを含む LB培地にて 培養した形質転換体から常法によりプラスミ ド DN Aを抽出し、 約 700 b pの インサート配列を、 ベクター上にある S P 6及ぴ T 7プロモーターの配列をプラ イマ一として用いて塩基配列を解読した。
その結果、増幅 DNA断片内に 681 b pのオープンリーディングフレーム（以 後 ORF 1と呼称） が確認された。 ORF 1の翻訳停止コドンと次のオープンリ ーデイングフレーム （以後 ORF 2と呼称） の翻訳開始コドン ATGの間は 13 b pであった。 ORF 1の塩基配列より推定される N末端側 25個のアミノ酸配 列と上記にて精製した 28 Kダルトンのポリぺプチド鎖の N末端側の 25個のァ ミノ酸配列は全く一致しており、 配列表の配列番号： 2記載のァミノ酸配列の 1 番目から 25番目までの配列に相当している。 OR F 1のアミノ酸配列は、 既知 の二トリルヒドラターゼの ]3サブュニットのアミノ酸配列と低いながらもホモ口 ジーを示し、 該蛋白質をコードすることが示唆された。
ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ サ ブュニットは 226アミノ酸をコードしており、 既存のデーターベース中で相同 性を有する蛋白質とのアミノ酸配列の一致度は、 高い方から順に、 クレブシエラ 属 MC 12609株の二トリルヒドラターゼ サブュニットと 43 %、 ァグロバ クテリゥム属の二トリルヒドラターゼ /3サブュニットと 42%、 口ドシユードモ ナス属 CGAO 09株二トリルヒドラターゼ サブュニットと 40%と非常に低 レ、。 また、 ジォバチルス属と近縁の属であるバチルス属由来の蛋白質とのァミノ 酸の一致度も、 好熱菌 Bacillus B R 44 9株の二トリルヒ ドラターゼ /3サブュ ニットと 35 · 0 %、 好熱菌 Bacillus smithii S C- J 05 - 1株の二トリル ヒ ドラターゼ j3サブユニットと 3 4. 5 %と極めて低かった。 一方、 好熱菌 Bacillus B R 4 4 9株の二ト リルヒ ドラターゼ βサブュニッ トと好熱菌 Bacillus smithii S C_ J 0 5— 1株の二トリノレヒ ドラターゼ/ 3サブュニット は 8 5. 6%という高い一致度を有している。 また、 OR F 2の塩基配列より推 定される N末端のァミノ酸配列と上記にて精製した 2 5 Kダルトンのポリぺプチ ド鎖の N末端のァミノ酸配列は全く一致した。
以上より、 ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株では、 5， 末端側 上流より 28Kダルトンの二トリルヒドラターゼ] 3サブュニットをコ一ドする遺 伝子、 25 Kダルトンの二トリルヒ ドラターゼ αサブュニットをコ一ドする遺伝 子がこの順番で隣接して存在していることが判明した。
( 5 ) ジォバチルス ·サーモグルコシデシウス Q— 6株二トリルヒドラターゼ a サブュニット部分の遺伝子のクローユング 上記にて得られたジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリル ヒドラターゼ サブュニット部分の遺伝子の周辺遺伝子及び αサブュニット部分 の遺伝子をクローニングするために、 縮重 PCRを行った。 既知の二トリルヒ ド ラターゼひサブュニットの下流に位置する遺伝子を参考にして、 以下の縮重 PC R用オリゴヌクレオチドプライマ一以下 2種類を作成した。 配列表の配列番号： 1 7に記載のプライマー 1 3 (p R l)、配列表の配列番号： 1 8に記載のプライ マー 14 (p R 2) である。
また、 先に塩基配列を解読したジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6 株の二トリノレヒドラターゼ j3サブュニット内に PC R増幅用のオリゴヌクレオチ ドプライマ一以下 2種類を作成した。 配列表の配列番号： 1 9に記載のプライマ 一 1 5 (Q 6Ap o s F)、 配列表の配列番号： 20に記載のプライマー 1 6 (Q 6 a b F 1) である。 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の染色体 DNA0. 1 gを铸型として縮重 P CRを行った。 縮重 PCRは、 ァニーリン グ温度 50度にて、 配列表の配列番号： 1 7、 18に記載のプライマー 13、 1 4と、 配列表の配列番号： 18、 19に記載のプライマー 15、 16の組み合わ せ 4通りを行った。 その結果、 配列表の配列番号： 17に記載のプライマー 13 (p R 1) と配列表の配列番号： 18に記載のプライマー 15 (Q 6 Ap o s F) の組み合わせで行った PCRで約 0. 8 k bの増幅 DN A産物の存在が確認でき た。 更に、 配列表の配列番号 : 16に記載のプライマー 1 3 (pR l) と配列表 の配列番号： 19に記載のプライマー 16 (Q6 a b F 1) の組み合わせで行つ た PCRで 1. 5 kの増幅 DN A産物の存在が確認できた。 なお、 その他の組み 合わせで行つた P C Rの場合は、 増幅 D N A産物の存在が確認できなかつた。 配列表の配列番号： 16に記載のプライマー 13 (pR l) と配列表の配列番 号： 19に記載のプライマー 15 (Q 6 Ap o s F) の組み合わせで行った縮重 PCRにより増幅された 0.8 k bの DNA断片をァガロースゲルより切り出し、 常法により DNAを抽出し、 pGEM— T Ve c t o r (P r ome g a社） へ組み込み、 大腸菌 JM109株を形質転換し、 50 μ g/m 1のアンピシリン により組換え体を選択した。 アンピシリンを含む LB培地にて形質転換体を培養 し、 常法によりプラスミ ド DNAを抽出し、 約 0. 8 k bのインサート部分の塩 基配列を解読した。 その結果、 618 b pのオープンリーディングフレーム （以 後 0 R F 2と呼称） が確認された。 O R F 2の塩基配列より推定される N末端側 29個のアミノ酸配列と上記にて精製した 25 Kダルトンのポリぺプチド鎖の N 末端側の 29個のアミノ酸配列は完全に一致しており、 配列表の配列番号： 1記 載のアミノ酸配列の 1番目から 29番目までの配列に相当する。 OR F 2のアミ ノ酸配列は、 既知の二トリルヒ ドラターゼ αサブュニットのアミノ酸配列と低い ながらもホモロジ一を示し、 該蛋白質をコードすることが示唆された。
ジォバチルス .サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒ ドラターゼ αサ ブュニットは 205アミノ酸をコードしており、 既存のデーターベース中で相同 性を有する蛋白質とのアミノ酸配列の一致度は、 高い方より順に、 好熱菌
Bacillus B R 4 4 9株の二トリルヒ ドラターゼ j3サブユニットと 6 6 . 3 %、好 熱菌 Bacillus smithii S C - J Ό 5— 1株の二トリルヒ ドラターゼ] 3サブュニ ットと 6 3 . 9 %と低い。 一方、 好熱菌 Bacillus B R 4 4 9株の二トリルヒド ラターゼ J3サブュニットと好熱菌 Bacillus smithii S C— J 0 5 _ 1株の二ト リルヒドラターゼ サブュニットは 8 8 . 8 %がー致し、 高い相同性を有してい る。 実施例 1 2 ：ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラ ターゼ αサブュニット及ぴ /3サブュニット部分の発現べクタ一^ ·の組み込みと、 大腸菌での発現
( 1 ) ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ αサブュニット及ぴ j3サブュニット部分の発現べクタ一^■の組み込み
上記にて解読した塩基配列をもとに、 二トリルヒ ドラターゼひサブュニット及 び サブュニット部分を P C Rにて増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ 一以下 2種類を作成した。 配列表の配列番号： 2 1に記載のプライマー 1 7 (Q 6 a b - F 1一 T)、配列表の配列番号： 2 2に記載のプライマー 1 8 (Q 6 Α Β a 1 1一 R 1— B g 1 I I— T) である。 配列表の配列番号： 2 1に記載のプラ イマ一 1 7は、 制限酵素部位 N d e Iの中に、 ジォバチルス ·サーモダルコシデ シウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ ;3サブュニットの翻訳開始コドンを設計 した。 配列表の配列番号： 2 2に記載のプライマー 1 8には、 ジォバチルス ·サ ーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ αサブュニットの翻訳終 止コドンの直下に制限酵素 B g 1 I Iサイトを導入した。 ジォバチルス .サーモ ダルコシデシウス Q— 6株の染色体 D N Aを錶型とし、配列表の配列番号： 2 1、 2 2に記載のプライマー 1 7， 1 8を各々 1 0 0 p m o 1用いて P C Rを行った。 E x T a q D N Aポリメラーゼを用レヽ、 全量 1 0 0 μ 1にて 9 6 °C、 3分の 熱変性の後、 9 6 °C 3 0秒熱変性、 6 0 °C 3 0秒ァニーリング、 7 2 °C 1分 3 0 秒伸長反応の条件で P CRを 3 0サイクル行った後、 7 2 °Cにて 5分間伸長反応 させた後、 4°Cに冷却した。 P CR後の溶液を 1. 5重量％ァガロース電気泳動 に供したところ、 で約 1. 3 k bの DNA断片増幅が確認された。 この増幅 DN A産物をァガロースゲルより常法にて抽出し、 P r o me g a社の p GEM— T e a s y V e c t o rへライゲーシヨンし、 大腸菌 J M 1 0 9株を形質転換し た。 形質転換体より、 プラスミド DNAを抽出し、 インサート部分の塩基配列を 解読し、 PCRによる増幅にエラーのないことを確認した。
次に、 このプラスミドを N d e l , E c o R I制限酵素で消化し、 1. 5重量0 /0 ァガロース電気泳動に供し、 約 1. 3 Kbのインサート DNAをァガロースゲル 力 ら切り出し、 常法により抽出した。 発現ベクターには N o V a g e n e社の p ET- 2 6 b ( + ) V e c t o r及ぴ p ET— 2 8 a ( + ) V e c t o rを 用いた。この 2種類のベクター DNA N d e I , E c o R I制限酵素で消化し、 1重量％ァガロース電気泳動に供し、 約 5. 3Kbの DNA断片を常法により抽 出した。これらのインサートとベクターを常法に従いライゲーシヨン反応を行い、 大腸菌 JM1 0 9株を形質転換し、 カナマイシン耐性で選択した形質転換体より プラスミド DNAを抽出し、 インサートが導入されたプラスミドを選出した。 以 上より、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラター ゼ αサブュニット及ぴ サブュニット部分がインサートとして導入された発現プ ラスミドを取得した。 これらの完成したプラスミドを、 p ET— 2 6 b ( + )' _ 及ぴ £丁_ 2 8 & ( + ) — jS と以下呼称する。
(2) 大腸菌にて発現させたジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の 二トリノレヒドラターゼ活性
発現プラスミド p ET— 2 6 b ( + ) _ j3 CK及ぴ p ET— 2 8 a (+) — β a を用いて N o v a g e n e社の大腸菌 B L 2 1 (DE 3) L y s E株を形質転換 し、 ジォバチルス 'サーモグルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ ]3 サブュニット及び αサブュニットの蛋白質を Τ 7プロモーターにより、 ポリシス トロンとして共発現させた。 各々の発現プラスミドを用いて、 No V a g e n e社製の大腸菌 BL 21 (D E 3) L y s E株のコンビテントセルへの形質転換を行い、 S O^u g/mlの力 ナマイシンを含有する LB寒天培地 （0. 5重量％パクト酵母エキストラクト、 1重量0 /0パクトトリプトン、 0. 5重量0 /0 N a C 1、 2. 0重量0 /0 Ag a r ; pH7. 5) 上に形質転換処理後の菌液を撒き、 30°Cで一晩培養し、 カナマイ シンによる選択を行った。 この形質転換体を 30 μ g/m 1のカナマイシンを含 有する LB培地 2 m 1に植菌し、 30°Cでー晚 200 r pmにて振とう培養を行 つた。前培養液を 20 μ g/m 1の塩化コバルト六水和物（C o C 1 2 · 6 H 2 O) 及び 30 μ g/m 1のカナマイシンを含有する LB培地 1 Omlに 2重量％植菌 し、 30°Cで約 3時間、 200 r pmにて OD600 = 0. 5になるまで振とう 培養を行い、 0. ImMの I PTGを添カ卩し、. T 7プロモーターからの発現を誘 導後、 4時間 200 r pmにて振とう培養を行い、 菌体を回収した。
この菌体を用いて、 27 °Cにおいて二トリル化合物をアミド化合物に変換させ る二トリルヒドラターゼ水和活性を測定した。
ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株由来の二トリルヒドラターゼ を発現させた大腸菌の菌体を、 20mMのTr i s— HC 1及び 15 mMの N a C 1を含む TBS緩衝液 (pH7. 5) に再溶解し、 OD=0. 2になるよう希 釈し、 終濃度 0. 2重量％アクリロニトリル溶液の反応液を作成した。 27°Cに て辑拌しながら反応を行い、 30分後に 100 しの 1規定塩酸を加えることに より反応を停止した。 酵素活性の単位 （ユニット） は、 1分間に Ι μπιοΐ のァク リロ二トリルをアクリルアミドに変換する活性を 1ユニット （以下、 Uと記す） と定めて、 湿菌体重量当たりの水和活性 （UZmg) を表 8に示した。 表 8
Figure imgf000046_0001
この結果より、 ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒ ドラターゼ aサブュニット及ぴ j3サブュニットを大腸菌にて発現させた場合に、 ァクリロニトリルをアクリルアミドに転換する二トリルヒ ドラターゼ活性を有す ることが判明した。 実施例 1 3 ： コロニーハイブリダィゼーシヨンによるジォバチルス ·サーモグル コシデシウス Q— 6株由来の二トリルヒドラターゼ周辺遺伝子の取得
( 1 ) 蛍光標識 D I Gプローブの作成
配列表の配列番号： 2 5に記載のジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ αサブュニッ ト部分の D N Αを铸型に用いて、 ロシ ュ社製の D I G— D N Aラベリングキットにより蛍光標識プローブを作成した。 作成方法はロシュ社の D I Gマニュアルに従う。
( 2 ) クロモソームサザンハイブリダィゼーシヨン
実施例 1 1にて調製したジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の染 色体 D N Aを様々な制限酵素を用いて消化し、 1重量％ァガロースゲル電気泳動 に供した。 ァガロースゲノレ内の D N Aを、 ナイロンメンブレン H y b o n d— N + (アマシャム社)に転写した後、先に調製した蛍光標識 D I Gプローブを用い、 クロモソームサザンハイブリダィゼーシヨンを行った。 D N Aが転写、 固定され たメンブレンを 1枚に当たり 1 O m lのハイブリダィゼーションバッファー （1 重量％スキムミルク、 0. 1重量。 /oN—ラウロイルザルコシン、 0. 0 2重量0 /0 SD S、 5 0重量0 /0ホルムアミドを含有する 5 X S S C) に浸し、 4 2°Cで 2時 間プレハイブリダイゼーションを行つた。 上記と同様に作成した蛍光標識プロ一 プ 1 0 0 n gを 9 5 °Cで 1 0分間の煮沸及ぴ急冷処理により熱変性をさせ、 プレ ハイブリゼーションパッファ一に添加し、 4 2 °Cでー晚、 ハイブリダイゼーショ ンを行った。ハイブリダィゼーシヨン後のメンブレンを 1 5 0m 1の 0. 1重量0 /0 SD Sを含む 2 X S S Cにて室温で 2回洗浄した。 次に 6 5°Cに加熱した 1 5 0 m 1の 0. 1重量％ SD Sを含む 1 X S S C中で 5分間の洗浄を 2回行つた。 続 いて 1 0 Om 1のマレイン酸バッファー （0. 1Mマレイン酸、 0. 1 5M N a C l、 N a OHを用ぃてp H 7. 5に調製済み） で 5分間洗浄後、 5 Om lの ブロッキング溶液 （0. 3重量％Tw e e n 20、 0. 1 5^1 &。 1及ぴ1重 量0 /0スキミムルクを含む 0. 1Mマレイン酸バッファー； ： Η 7. 5) 中にて室 温で 3 0分間ブロッキング処理を行った。 抗ジゴキシゲニン一 ΑΡを 7 5mU/ m 1となるよう 20 m 1のブロッキング溶液にて希釈し、 室温で 3 0分間の抗体 反応を行った後、 1 0 Om 1の洗浄バッファー （0. 3重量％Tw e e n 2 0、 0. 1 5MN a C lを含む0. 1 Mマレイン酸バッファー； p H 7. 5) 中でメ ンプレンを 5回洗浄し、 結合していない抗体を洗い流した。 2 Om lの検出バッ ファー （0. 1M T r i s _HC l、 0. 1M N a C l、 p H 9. 5) 中で 5分間平衡化処理を行った後、 1 0m lの検出バッファーに 1 0 Omg/m 1の N BT (ニトロソブルーテトラゾリゥムクロライド） 溶液を 3 4 1、 5 Om g/ m 1の B C I P溶液を 3 5 μ 1を希釈した発色基質溶液 Ν Β Τ/Β C I Ρ (5— ブロモ一4—クロ口一 3—インドリルフォスフェイト） を作成し、 メンブレンが 完全に浸るように覆いかけ、遮光してインキュベートを 1分から 1 6時間行った。 ィンキュベート中はディスクを動かしたり揺らしたりせず、発色の確認を行った。 その結果、 制限酵素 H i n d I I Iにより消化される約 2. 3 k b遺伝子断片の 中に、 二トリルヒドラターゼ αサブュニット部分の下流遺伝子が含まれることが 明らかになった。 (3) コロニーハイブリダィゼーシヨンによる目的クローンの取得 ①コロニーハイブリダィゼーシヨン用のプラスミ ドライブラリーの作成
次に、 同蛍光標識 D I Gプローブを用い、 コロニーハイブリダィゼーシヨンを 行った。 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の染色体 DNA 10 μ gを 1重量％ァガロースゲル電気泳動に供し、 ァガロースゲルから約 2. 0 k b から 2. 6 k bの DNA断片を含む部分を切り出し、 前記と同様の方法で DNA 断片を抽出及び精製した。得られた DNA断片を DNAライゲーシヨンキット（T a k a r a社製） を用いて pUC 1 18プラスミ ドベクター（T a k a r a社製） のマルチクローユングサイト内にある H i n d I I I制限酵素部位に導入した。 ライゲーシヨンに用いた pUC 1 18プラスミ ドベクター DNAは、 制限酵素 H i n d I I Iで消化した後にフエノール Zクロ口ホルム処理及びエタノール沈澱 による精製を行い、 続いてアルカリフォスファターゼ （Ta k a r a社製） を用 いた 5， 末端の脱リン酸ィヒ処理後に再度フエノールノクロ口ホルム処理及ぴエタ ノール沈澱を行い、 ァガロース電気泳動に供し、 ァガロースゲルから抽出による 再精製を行つたものを使用した。
約 2. 0 k bから 2. 6 k bに断片化されたジォバチルス ·サーモダルコシデ シウス Q— 6株の染色体 DNAを: UC 1 18プラスミ ドベクターと H i n d I I I制限酵素部位にてライゲーシヨンした溶液を用いて、 大腸菌 JM109株を 形質転換し、 50 μ gZm 1のアンピシリン、 lmMのI PTG (イソプロピル — j3— D_チォガラタトビラノサイド） 及び 2重量0 /0X_Ga 1 (5- ブロモ - 4- クロ口- 3-インドリル - 3-D-ガラタトピラノシド） を含有する LB寒天培地 （0. 5重量％バクト酵母エキストラタ ト、 1重量％パクトトリプトン、 0. 5重量％ Na C l、 2. 0重量0 /0Ag a r ； pH7. 5) 上に撒き、 37 °Cで一晚培養し た。 その結果、 1枚当たり 50個から 500個の白コロニーが出現しているシャ ーレを多数枚取得することが出来た。
これらの染色体 DNAのプラスミ ドライブラリーに対して、 先に調製した蛍光 標識 D I Gプローブを用いてコロニーハイブリダィゼーションを行い、 目的の二 トリルヒドラターゼ Οίサブュニットの下流遺伝子を含むクローンをスクリーニン グした。
②コロニーハイブリダィゼーシヨンによる目的クローンの取得
まず、 出現した白コロニー約 1000クローンを、 滅菌済み爪楊枝を用いて新 しい LB寒天培地にストリークしなおした。 この時、 メンブレンをハイブリダィ ズさせる LB寒天培地と、 保存用の LB寒天培地に同様にストリークし、 30°C で一晩培養した。
次に、 コロニーの生えたシャーレ上にアマシャム社製のナイ口ンメンブレン H y b o n d—N +を静かに置き、 1分後端からピンセットを用いてゆつくりと取 り除いた。剥がしたメンプレンを、菌体の付着している面を上にして変性溶液（ 1. 5Mの Na C lを含む 0. 5Mの NaOH水溶液） に 7分間浸した後、 中和溶液 (1. 5Mの Na C 1と 1 mMの EDTA · 2N aを含む 0. 5Mトリス塩酸水 溶液； pH7. 2) に 3分間浸し、 新しい中和溶液に更に 3分間浸した。 次に、 2 X S S C溶液 （1 X S SC 1リツトル中に Na C 1 8. 76 g、 タエン酸ナト リウム 4. 41 gを含む） にて 1回洗浄を行った後、 乾いた濾紙上でメンブレン を風乾した。 さらに 12 Om J/cm2 の UV照射を行うことによりメンプレン 上に DN Aの固定を行った。
③ D I G抗体による検出及ぴ目的クローンの単離
上記にて処理した、 DNAの固定されたメンプレンを 1枚に当たり 10m 1の ハイブリダィゼーシヨンバッファー （1重量0 /。スキムミルク、 0. 1重量0/ oN_ ラウロイルザルコシン、 0. 02重量0 /0SDS、 50重量0 /0ホルムアミドを含有 する 5 X S S C)に浸し、 42 °Cで 2時間プレハイブリダィゼーシヨンを行った。 上記と同様に作成した蛍光標識プローブ 100 n gを 95°Cで 10分間の煮沸及 ぴ急冷処理により熱変性をさせ、 プレハイブリゼーシヨンバッファーに添加し、 42 °Cで一晩、 ハイブリダイゼーションを行った。 ハイブリダイゼーシヨン後の メンブレンを 15 Om 1の 0. 1重量0 /oSD Sを含む 2 X S S Cにて室温で 2回 洗浄した。 次に 65 °Cに加熱した 150 m 1の 0. 1重量％ SD Sを含む 1 X S S C中で 5分間の洗浄を 2回行った。 続いて 1 0 Om 1のマレイン酸バッファー (0. 1Mマレイン酸、 0. 1 5M N a C l、 N a OHを用いて pH 7. 5に 調整済み） で 5分間洗浄後、 5 Om lのブロッキング溶液 (0. 3重量。/。 Tw e e n 2 0、 0. 1 5M N a C 1及ぴ 1重量0 /oスキミムルクを含む 0. 1 Mマレ イン酸バッファー； p H 7. 5) 中にて室温で 3 0分間ブロッキング処理を行つ た。 抗ジゴキシゲニン一APを 7 5mU/m 1 となるよう 2 0m lのブロッキン グ溶液にて希釈し、 室温で 3 0分間の抗体反応を行った後、 1 00m lの洗浄バ ッファー （0. 3重量0 /0Tw e e n 2 0、 0. 1 5M N a C 1を含む 0. 1M マレイン酸バッファー； p H 7. 5) 中でメンブレンを 5回洗浄し、 結合してい ない抗体を洗い流した。 2 Om 1の検出バッファー （0. 1M T r i s—HC 1、 0. 1M N a C l、 p H 9. 5) 中で 5分間平衡ィ匕処理を行った後、 1 0 m 1の検出バッファーに 1 0 Omg/m 1の NBT溶液を 34 μ 1、 5 Om g/m 1の B C I P溶液を 3 5 μ 1を希釈した発色基質溶液 NBT " B C I Pを作成し、 メンブレンが完全に浸るように覆いかけ、 遮光してインキュベートを 1分から 1 6時間行った。 インキュベート中はディスクを動かしたり揺らしたりせず、 発色 の確認を行った。 その結果、 該メンブレン上の 1 0 0 0クローンのうち、 ポジテ ィブなシグナルを 4箇所見いだし、 その位置と重なるポジティブクローンを元の シャーレ上で確認した。
(4) ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ αサブュニット部分の下流遺伝子を含むポジティブクローンの解析
確認されたポジティブクローンをシャーレからアンピシリンを含有する LB液 体培地に植菌し、 3 7°C · 2 5 0 r pmでー晚振とう培養を行い、 菌体を遠心に より回収し、 常法によりプラスミ ド DNAを抽出した。 プラスミ ド DNAを制限 酵素 H i n d I I Iで消化した後に、 1. 5重量％ァガロース電気泳動に供し、 挿入断片の大きさの確認を行ったところ、約 2. 3 k bの大きさであった。また、 挿入断片がジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラタ ーゼ αサブユニット部分を含むことを、 数パターンの P CR及び、 制限酵素によ る消化パターンにより確認した。
以上より取得された本プラスミドを pUC 1 18—Q 6H i n 2.3と命名し、 挿入断片の全塩基配列を決定した。 ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ及び下流遺伝子群の制限酵素地図及び遺伝子構成を 図 1に記載した。
その結果、 挿入断片中に 339 b pの塩基配列からなるオープンリディンダフ レーム（以下、 ORF 3と呼称する）が二トリゾレヒドラターゼ αサブュニット （Ο RF 2) の 5' 末端側下流に同じ向きに存在することが確認された。 ORF 2の 翻訳終止コドンと OR F 3の翻訳開始コドンの間は 12 b pであり、 ORF 3の 翻訳終止コドンと更に下流に位置する OR Fの翻訳開始コドンの間は 145 b p であった。 ORF 3は 1 12アミノ酸をコードしており、既存のデータ-ベース中 の以下のタンパク質と大変低いながらも相同性を有していた。 既存のデーターべ ース中で相同性の高い配列とのアミノ酸の一致する割合は、 バチルス属 BR 44 9株の P 1 2 Kと 3 1%、 ロドコッカス · ロドクロウス 】 1株の1^1111 &と 3 1 %、 口ドコッカス 'ロドクロウス J 1株の Nh 1 Eと 21 %、 シユードノカル ディア ·サーモフイラ J CM3095株の P 16と 23%であった。 実施例 14 ：ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラ ターゼ αサブュニット及ぴ ]3サブュニット及ぴ下流遺伝子 OR F 3の発現プラス ミドの構築
p ET- 26 b ( + ) 一 α及ぴ p ET_ 28 a ( + ) — ]3 αプラスミドを制 P艮酵素 H i n d I I Iにて消化し、 脱リン酸化反応を行い、 フエノールクロロホ ルムで抽出することにより、 脱リン酸化処理を行った。 この消化産物を 1重量％ ァガロース電気泳動に供し、 約 6. 1 Kbの DNA断片を常法により抽出した。 この DNA断片には、 p ETベクター及びジォバチルス ·サーモダルコシデシゥ ス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ サブュニット及ぴ αサブュニットの 60番 目のアミノ酸に位置する H i n d I I I制限酵素部位までが含まれている。 次に、 pUC 1 18— Q6H i n 2. 3プラスミドを制限酵素 H i n d I I I により消化し、 1重量％ァガロース電気泳動に供し、 約 2. 3 k bのインサート DN Aを抽出した。 このインサートを、 先に抽出した断片とライゲーシヨンを行 い、 大腸菌 J Ml 09株を形質転換し、 カナマイシン耐性で選択した形質転換体 より、 インサート DNAを含むプラスミドを選出した。 インサートの向きを PC Rにより確認することにより、 pET— 26 b ( + ) 及び pET— 28 a ( + ) ベクターにジォバチルス .サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラタ ーゼ αサブュニット及び サブュニット及び下流遺伝子 OR F 3と更に下流域が 含まれたプラスミドを取得した。 こうして完成したプラスミドを、 pET— 26 b ( + ) — ]3 α 12及ぴ p ET— 28 a ( + ) 一 /3 α 12と以下呼称する。
次に、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラター ゼ aサブュニッ ト、 βサブュニット及び下流遺伝子 OR F 3の翻訳終止コ ドンま でを導入し、 3種類の蛋白質が共発現するような発現プラスミドを構築した。 先 に構築したプラスミド pET—26 b ( + ) — j3 α; 1 2を制限酵素 Nd e I及ぴ B g I I Iで消化し、 1. 5重量％ァガロースゲル電気泳動に供し、 αサブュニ ット、 βサブュニット及び下流遺伝子 ORF 3の翻訳終止コドンまでを含む 1. 7 k b遺伝子断片を常法により抽出した。 同時に、 発現ベクター p ET— 26 b (+ )及ぴ p ET— 28 a ( + ) を、 Nd e I及ぴ B a mH Iで消化し、 1重量0 /0 ァガロースゲル電気泳動に供し、 5. 3 k bのベクター部分の遺伝子断片を常法 により抽出した。 これらのベクターを先に抽出した aサブユニット、 βサブュニ ット及び下流遺伝子 O R F 3の翻訳終止コドンまでを含む 1. 7 k b遺伝子断片 をインサートとして、 常法に従いライゲーシヨン反応を行った。 この反応の際、 B g 1 I I制限酵素で消化した末端と B a mH I制限酵素で消化した末端が接着 される。ライゲーシヨン反応後の溶液を用いて大腸菌 JM109株を形質転換し、 カナマイシン耐性で選択した形質転換体よりプラスミド DNAを抽出し、 インサ ートが導入されたプラスミドを選出した。 以上より、 ジォバチルス 'サーモダル コシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ サブュニット、 j3サブュニット 部分及ぴ下流遺伝子 ORF 3がインサートとして導入され、 3種類の蛋白質が共 発現するような発現プラスミドを取得した。 これらの目的のプラスミドを、 p E T- 2 6 b ( + ) — j3 α 1及び p ET— 2 8 a ( + ) — /3 a 1と以下呼称する。 実施例 1 5 ：大腸菌にて下流遺伝子を共発現させたジォバチルス ·サーモダルコ シデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ活性
発現プラスミド p ET— 2 6 b ( + ) 一 a及ぴ p ET— 2 8 a ( + ) — β a を用いて N o v a g e n e社の大腸菌 B L 2 1 (DE 3) L y s E株を形質転換 し、 ジォバチルス .サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ サブュニット及ぴ αサブュニットの蛋白質を Τ 7プロモーターにより共発現させ た。 同様に、 p ET— 2 6 b ( + ) — j3 α 1及び p ET— 2 8 a ( + ) - j3 a 1 を用いて N o v a g e n e社の大腸菌 B L 2 1 (DE 3) L y s E株を形質転換 し、 ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼ] 3 サブュニット、 サブュュッ ト及び下流遺伝子 OR F 3の蛋白質を T 7プロモー ターにより共発現させた。コントロールとして、発現ベクター p ET— 2 6 b ( + ) 及ぴ p ET_ 2 8 a ( + ) を用いて No v a g e n e社の大腸菌 B L 2 1 (DE 3) L y s E株を形質転換した形質転換体を用いた。
各々の発現プラスミドを用いて、 N o V a g e n e社製の大腸菌 B L 2 1 (D E 3) L y s E株のコンビテントセルへの形質転換を行い、 S O ^u g/m lの力 ナマイシンを含有する LB寒天培地 （0. 5重量0 /0パクト酵母エキストラクト、 1重量0 /0パクトトリプトン、 0. 5重量0 /0 N a C 1、 2. 0重量0 /0 A g a r ; p H 7. 5) 上に形質転換処理後の菌液を撒き、 3 0°Cで一晩培養し、 カナマイ シン耐性による選択を行った。 この形質転換体を 3 0 μ g/m 1のカナマイシン を含有する LB培地 2 m 1に植菌し、 3 0°Cでー晚 2 0 0 r pmにて振とう培養 を行った。前培養液を 20 μ g/m 1の塩化コバルト六水和物（C o C 1 2 · 6 H 2 O) 及ぴ 3 0 μ g/m 1のカナマイシンを含有する L B培地 1 0m 1に 2重 量％植菌し、 3 0°Cで約 3時間、 20 0 r pmにて OD 6 0 0 = 0. 5になるま で振とう培養を行い、 0. 1 mMの I PTGを添加し、 T 7プロモーターからの 発現を誘導させ、 更に約 4時間 200 r pmにて振とう培養を行い、 菌体を回収 した。
このようにして得られたジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株由来 の二トリルヒドラターゼを発現させた大腸菌の菌体を、 20∞^ の丁て i s -H C 1及び 1 5mMの N a C 1を含む TB S緩衝液 (pH7. 5) に再懸濁し、 O D=0. 2になるよう希釈し、 終濃度。. 2重量％アタリロュトリル溶液の反応 液を作成した。 2 7°Cにて攪拌しながら反応を行い、 1 0分後、 30分後に 1 0 O ^uLの 1規定塩酸を加えることにより反応を停止した。 酵素活性の単位 （ュニ ット） は、 1分間に 1 μιηοΐ のアクリロニトリルをアクリルアミドに変換する活 性を 1ユニット （以下、 Uと記す） と定めて、 湿菌体重量当たりの水和活性 （U Zmg) を表 9に示した。 表 9
Figure imgf000054_0001
この結果より、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒ ドラターゼ サブュニット及ぴ サブュニットのみを発現させた場合と、 下流遺 伝子 OR F 3を共発現させた場合を比較すると、 下流遺伝子 OR F 3の存在によ り二トリルヒドラターゼ活性が著しく増加したことが分かる。 ORF 3がジォバ チルス .サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼの酵素活性を 著しく上昇させる機能を有することが明らかになった。 実施例 1 6 ：大腸菌にて発現させたジォバチルス ·サーモグルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼの熱安定性
活性の熱安定性を調べるために、 発現ベクター; p ET26 b ( + ) — ]3 αを持 ち、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒ ドラターゼを 発現させた大腸菌液 （2 OmMの T r i s _HC 1及ぴ 15πlMのNa C 1を含 む TBS緩衝液 （pH7. 5)) を 30分間 30, 65, 70度での保温処理を行 つた。 保温処理後、 氷上にて冷却し、 27度に保温し温度を一定にした後、 反応 温度 27度にて二トリルヒドラターゼ活 14を測定した。 ジォバチルス ·サーモグ ルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒドラターゼを発現させた大腸菌の菌を OD =0. 2の濁度に懸濁し、 終濃度 0. 5重量％アクリロニトリル溶液の反応液を 作成し、 27 °Cにて攪拌しながら反応を開始し、 30分後に 10液量％の 1規定 塩酸を加えることにより反応を停止した。 30度での保温処理を行った場合の活 性を基準（ 100 %)とした換算値として表 10に示す。 表 10
Figure imgf000055_0001
この結果より、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス Q— 6株の二トリルヒ ドラターゼを発現させた大腸菌における二トリルヒドラターゼの酵素活性は、 7 0度という高温下においても約 8割の活性を保持することができ、 大腸菌で発現 させた場合においても高い耐熱性を有しており、 工業的にも大変有用な酵素であ るといえる。 産業上の利用可能性
本発明の組成物は、 熱や高濃度の二トリル、 アミド化合物に対して高い安定性 を示し、 二トリル化合物を対応するアミド化合物に効率良く変換する効果を有す る。 本発明の組成物は、 高温、 および高二トリル化合物濃度や高アミド化合物濃 度下の反応においても、 二トリル化合物を対応するアミド化合物に変換する分野 で好適に利用できる。

Claims

請求の範囲
1. 下記の理化学的性質を有することを特徴とする蛋白質をコードする DN A。
(a) 二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b) 基質特異性：アクリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトニトリル、 ィ ソブチロニトリノレ、 n-バレロ二トリノレ、 n-ブチロニトリノレ、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである。
サブユニット α 分子量 25000±2000 サブュニット 分子量 28000±2000
(d) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアタリ口エトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f) 35重量％のアクリルアミ ド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とし た活性を有する。
2. 下記の （A) または （B) のいずれかの DNA。
(A) 配列表の配列番号： 1記載のァミノ酸配列をコードするひサブュニット 遺伝子を含有する塩基配列と、 配列表の配列番号： 2記載のアミノ酸配 列をコードする ]3サブュニット遺伝子を含有する塩基配列との組み合わ せからなることを特徴とする DNA。
(B)配列表の配列番号： 1記載のアミノ酸配列を含有する αサブュニットと、 配列表の配列番号： 2記載のァミノ酸配列を含有する サブュュットの いずれか一方、 または両方のそれぞれにおいて、 1若しくは複数個のァ ミノ酸に置換、 欠損、 付加、 翻訳後修飾がなされており、 その改変、 ま たは改変されていない 0；サブユニットと、 改変、 または改変されていな い) 3サブユニットとを含有し、 且つ二トリルヒドラターゼ活性を有する タンパク質をコードする DNA'。
3. 下記の （C) または （D) のいずれかの DNA。
(C) 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 695— 1312位の配列を含む D NAと、 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1— 68 1位の配列を含む DNAとの組合わせからなることを特徴とする DNA。
(D) 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 695— 1312位の配列を含む D NA、 またはその DNAに対してストリンジェントな条件下にてハイブ リダイズする DNAのうちのいずれか一方の DNAがコードする αサブ ユニットと、 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1一 68 1位の配列を 含む DNA、 またはその DNAに対してストリンジェントな条件下にて ハイブリダィズする DN Aのうちのいずれか一方の DN Aがコードする サブュュットとを含有し、 且つ二トリルヒドラターゼ活性を有する蛋 白質をコードする DNA。 但し、 上記 （C) となる場合を除く。
4. 配列表の配列番号： 4記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列を含む DNA,またはそのァミノ酸配列中の 1若しくは複数個のアミノ酸に置換、欠損、 付加、 翻訳後修飾がなされており且つ二トリルヒドラターゼの活性化に関与する ことを特徴とする蛋白質をコードする DNAのいずれかの DNAが、 さらに組合 されていることを特徴とする請求項 1〜 3の何れかに記載の DNA。
5. 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1325— 166.3位の配列を含む DNA、 またはその DNAに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダィ ズし且つ二トリルヒドラターゼ活性化に関与することを特徴とする蛋白質をコー ドする DN Aのいずれかの DN Aが、 さらに組合されていることを特徴とする請 求項 1〜 3の何れかに記載の D N A。
6. 配列表の配列番号： 1記載のァミノ酸配列をコードする二トリルヒドラ ターゼの CKサブュニット遺伝子を含有する DNA。
7. 配列表の配列番号： 2記載のアミノ酸配列をコードする二トリルヒドラ ターゼの j3サブュニット遺伝子を含有する DNA。
8. 配列表の配列番号： 4記載のァミノ酸配列をコードする二トリルヒドラ タ一ゼの活性化に関与することを特徴とする遺伝子を含有する DNA。
9. 該 DNAが、 ジォバチルス （Geobacillus) 属由来である請求項 1〜 8の 何れかに記載の DNA。
10. 該 DNAが、 ジォバチルス 'サーモダルコシデシウス （Geobacillus thermoglucosidasius) 種由来である請求項 1〜 8の何れかに記載の DNA。
1 1. 該 DNAが、 ジォバチルス ·サーモダルコシデシウス （Geobacillus thermoglucosidasius) Q— 6株（F ERM BP— 08658)由来である請求 項 1〜 8の何れかに記載の D N A。
12. 請求項 1〜 1 1の何れかに記載の D N Aを組み込んだ組み換えべクタ
13. 請求項 1〜1 1の何れかに記載の DN Aにより形質転換された微生物、 ま たはジォバチルス · サー モ ダルコ シデシ ウ ス （ Geobacillus thermoglucosidasius) Q- 6株（FERM BP— 08658)およびその変異体の いずれかの微生物。
14. 請求項 1〜1 1の何れかに記載の DN Aにより形質転換された微生物 を、 培地において培養することを特徴とする、 該蛋白質、 または該蛋白質を含有 する菌体処理物の製造方法。
15. ジォバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を生産し得 る微生物を、 培地において培養することを特徴とする、 該蛋白質、 または該蛋白 質を含有する菌体処理物の製造方法。
(a) 二トリルヒ ドラターゼ活性を有する。
( b ) 基質特異性： アクリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトニトリル、 ィ ソブチロニ ト リノレ、 n—ノ レロニ ト リノレ、 n -ブチロニ ト リノレ、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである。
サブュニット α 分子量 25000± 2000
サブュニット 分子量 28000± 2000
(d) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f ) 35重量％のアクリルアミド水溶液中でもアクリロニトリルを基質とし た活性を有する。
1 6. 請求項 14または請求項 1 5に記載のいずれかの製造方法により培養 された微生物から取得された、該蛋白質、または該蛋白質を含有する菌体処理物。
1 7. 下記の理化学的性質を有することを特徴とする蛋白質。
(a) 二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b) 基質特異性：アクリロニトリル、 アジポ-トリル、 ァセトニトリル、 ィ ソブチロニトリル、 n-バレロ二トリル、 n-ブチロニトリル、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS-ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである。
サブュニット α 分子量 25000± 2000
サブュニット 分子量 2 8 000± 2000
(d) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f ) 35重量％のアクリルアミド水溶液中でもァクリロニトリルを基質とし た活性を有する。 '
18. 下記の （A) または （B) のいずれかの蛋白質。
(A)配列表の配列番号： 1記载のァミノ酸配列を含有するひサブュニットと、 配列表の配列番号： 2記載のァミノ酸配列を含有する サブユニットと を含有することを特徴とする蛋白質。
(B)配列表の配列番号： 1記載のァミノ酸配列を含有する αサブュニットと、 配列表の配列番号： 2記載のァミノ酸配列を含有する j3サブュニットのいずれか —方、 または両方のそれぞれにおいて、 1若しくは複数個のアミノ酸の置換、 欠 損、 付加、 翻訳後修飾がなされており、 その改変、 または改変されていない aサ ブユニットと、 改変、 または改変されていない ]3サブユニットとを含有し、 且つ 二トリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質。
19. 下記の （C) または （D) のいずれかの蛋白質。
(C) 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 695— 1312位の配列を含む D Ν Αがコードする αサブユニットと、 配列表の配列番号： 3の塩基配列 の 1一 681位の配列を含む DNAがコードする /3サブュニットとを含 有することを特徴とする蛋白質。
(D) 配列表の配列番号： 3の塩基配列の 695- 1312位の配列を含む DN Α、またはその DNAに対してストリンジェントな条件下にてハイブリダ ィズする DN Αのうちのいずれか一方の DN Aがコードする αサブュニ ットと、配列表の配列番号： 3の塩基配列の 1一 681位の配列を含む D ΝΑ、またはその DNAに対してストリンジェントな条件下にてハイブリ ダイズする DNAのうちのいずれか一方の DNAがコードする /3サブュ ニットとを含有し、且つ二トリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質。但し、 上記 （C) となる場合を除く。
20. 少なくとも、 配列表の配列番号： 1記載のァミノ酸配列である αサブ ュニットを含有するポリペプチドまたは翻訳後修飾されたものと、 配列表の配列 番号： 2記載のアミノ酸配列である ]3サブュニットを含有するポリぺプチドまた は翻訳後修飾されたもののいずれか一方、 または両方を含有することを特徴とす る蛋白質。
21. 下記の理化学的性質を有する蛋白質、 または該蛋白質を含有する菌体 処理物に、 二トリルィヒ合物に作用させ該ニトリル化合物から誘導されるアミド化 合物を取得することを特徴とするアミド化合物の製造方法。
(a) 二トリルヒドラターゼ活性を有する。
(b) 基質特異性：アクリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトニトリル、 ィ ソブチロニトリル、 n -バレロ二トリ/レ、 n -ブチロニトリル、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS -ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである
サブュニット α 分子量 25000±2000
サブュニット 分子量 28000±2000
(d) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f ) 35重量0 /0のアクリルアミド水溶液中でもァクリロニトリルを基質とし た活 1"生を有する。
22. 請求項 1から請求項 1 1のいずれかに記載の DNAにより形質転換さ れた微生物、 またはジォバチルス属に属し下記の理化学的性質を有する蛋白質を 生産し得る微生物のいずれかを、 培地において培養して得た蛋白質、 または該蛋 白質を含有する菌体処理物であることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
(a) 二トリルヒ ドラターゼ活性を有する。 (b) 基質特異性：アクリロニトリル、 アジポニトリル、 ァセトニトリル、 ィ ソブチロニトリル、 n-パレロニトリル、 n-プチロニトリル、 ベンゾニト リル、 へキサン二トリルを基質として、 活性を示す。
(c) 分子量：少なくとも下記の 2種類のサブュニットから構成されるタンパ ク質であって、各サブュニットの還元型 SDS -ポリアクリルアミド電気泳 動による分子量が以下の通りである
サブュニット a 分子量 25000 ±2000
サブュニット 分子量 28000± 2000
(d) 熱安定性：水液中の酵素を 70°Cの温度で 30分加熱後に、 加熱前の 35% 以上の活性を残存する。
(e) 6重量％のアクリロニトリルを基質としても、 それ以下の基質濃度の時 に比べ、 活性が減少しない。
(f ) 3 5重量％のアクリルアミド水溶液中でもァクリロニトリルを基質とし た活性を有する。 -
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