JP5120852B2 - 新規タンパク質複合体、該タンパク質複合体を用いたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼを用いた方法 - Google Patents
新規タンパク質複合体、該タンパク質複合体を用いたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼを用いた方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、新規タンパク質複合体などに関する。より詳しくは、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼの成熟化に関与する新規タンパク質複合体、該タンパク質複合体を用いたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼを用いた方法などに関する。
ニトリルヒドラターゼは、ニトリル基を水和しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素である。例えば、アクリルニトリルからアクリルアミドへの変換に酵素として用いられている。現在では、この方法を使ってアクリルアミドが年数万トン生産されている。また、ニトリルヒドラターゼは、ビタミンの一種であるニコチンアミド（ＮＡＤ）等の生産にも酵素として用いられている。
ニトリルヒドラターゼは、酵素反応を起こす活性中心金属が鉄である鉄型と、活性中心金属がコバルトであるコバルト型に分けられる。一般に鉄型は安定性が低く、コバルト型は安定性が高い。このため、コバルト型のニトリルヒドラターゼの方が、工業的に多く利用されている。
コバルト型ニトリルヒドラターゼは、高分子量（以下「Ｈ型」とする。）と低分子量（以下「Ｌ型」とする。）のものに分けられる。一般に、Ｈ型は安定性が高く反応性も高いため、工業的には、コバルト型高分子量（Ｈ型）ニトリルヒドラターゼが多く用いられている。
一方、Ｌ型は、成熟化（活性化）した酵素の精製が比較的難しいことから、現時点では、工業的にあまり利用されていない。
なお、特許文献１では、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５（Pseudonosardia thermophilaJCM3095）由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関与する遺伝子が開示されている。この遺伝子は、前記ニトリルヒドラターゼ構造遺伝子（α、βサブユニット）とは異なる第３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であることが開示されている。
その他、関連文献として、特許文献２には、代謝阻害剤等を用いたニトリルヒドラターゼを活性化する技術が、特許文献３には、ニトリルヒドラターゼを含有する細胞等を、酸化剤と接触させることにより、ニトリルヒドラターゼのニトリル水和活性を向上させる技術が、非特許文献１には、鉄型ニトリルヒドラターゼを成熟化させる遺伝子が開示されている。
特開平１１−２５３１６８号公報。
特開２００５−２９５８１５号公報。
特開２００４−３５０５７３号公報。
FEBS Letters 553(2003)391-396。
上述のように、ニトリルヒドラターゼ成熟化に関与する遺伝子については、一部報告があるが、ニトリルヒドラターゼ成熟化のメカニズムについては、ほとんど解明されていない。
そこで、本発明では、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化のメカニズムを解明し、該手段を用いて成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼの工業的利用を可能とすることを主目的とする。
本願発明者らは、Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを用いて、ニトリルヒドラターゼ成熟化について研究した結果、以下のことを見出した。
（１）コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ構造遺伝子（同酵素のαサブユニット、及びβサブユニットをコードする遺伝子）の近傍に、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化に関与する遺伝子が存在すること。
（２）該遺伝子がコードするタンパク質は、単独では精製できず、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼのαサブユニットと複合体を形成した状態で精製すること。
（３）前記タンパク質と前記αサブユニットからなるタンパク質複合体が、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化に関与していること。
（２）該遺伝子がコードするタンパク質は、単独では精製できず、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼのαサブユニットと複合体を形成した状態で精製すること。
（３）前記タンパク質と前記αサブユニットからなるタンパク質複合体が、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化に関与していること。
そこで、本発明では、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、配列番号２に示すアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのタンパク質と、から形成された３量体のタンパク質複合体を提供する。
該タンパク質複合体を用いることにより、未成熟コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを成熟化させることができる。
また、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ作製過程で、前記タンパク質複合体を用いることにより、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを大量に作製することができる。
前記成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼは、様々なアミド化合物の生産に用いることができる。例えば、アクリルニトリルからアクリルアミドへの変換酵素として用いることができる。また、３−シアノピリジンからニコチンアミドへの変換酵素としても用いることができる。
以下、本発明で使用する技術用語等を説明する。
コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼは、αサブユニット、及びβサブユニットから形成される。前記αサブユニットは、本発明に係るタンパク質複合体を構成するタンパク質であって、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質である。
「未成熟コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ」とは、構造変換が不完全で、酵素活性の低いコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを意味する。
「成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ」とは、構造変換により、活性化した状態のコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを意味する。
本発明に係るタンパク質複合体を用いることにより、未成熟コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを成熟化させることができ、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼの酵素活性を上昇させることができる。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
＜タンパク質複合体について＞
本発明に係る新規タンパク質複合体について、図１を用いて、以下説明する。
本発明に係る新規タンパク質複合体について、図１を用いて、以下説明する。
図１は、本発明に係るタンパク質複合体を模式的に示した図である。
図１に示す通り、本発明に係るタンパク質複合体は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質（以下「ＮｈｌＡタンパク質」とする。図中符号「α」参照。）と、配列番号２に示すアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのタンパク質（以下、「ＮｈｌＥタンパク質」とする。図中符号「ｅ」参照。）とから形成された３量体である。
上述の通り、ニトリルヒドラターゼは、αサブユニット及びβサブユニットから形成される。ＮｈｌＡタンパク質は、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ（以下「Ｌ−ＮＨａｓｅ」とする。）のαサブユニットを構成するタンパク質である。また、ＮｈｌＡタンパク質は、上述の通り、ＮｈｌＥタンパク質と三量体を形成することにより、未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅを成熟化させる機能を有する。
なお、本発明に係るＮｈｌＡタンパク質は、上述の機能を保持しているものであれば、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものの実に狭く限定されない。即ち、配列番号１に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入等されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明に係るＮｈｌＡタンパク質に包含される。
ＮｈｌＥタンパク質は、上述の通り、ＮｈｌＡタンパク質と三量体を形成することにより、未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅを成熟化させる機能を有する。
なお、本発明に係るＮｈｌＥタンパク質は、上述の機能を保持しているものであれば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものの実に狭く限定されない。即ち、配列番号２に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入等されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明に係るＮｈｌＥタンパク質に包含される。
ＮｈｌＥタンパク質をコードする遺伝子（以下、「ｎｈｌＥ遺伝子」とする。）は、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子（即ち、この酵素のαサブユニット及びβサブユニットをコードする遺伝子。以下、それぞれ、「ｎｈｌＡ遺伝子」、及び「ｎｈｌＢ遺伝子」とする。）の近傍に位置する。
これらの遺伝子を有するものとして、例えば、Achromobacter属、Acinetobacter属、Aeromonas属、Agrobacterium属、Bacillus属、Citrobacter属、Corynebacterium属、Enterobacter属、Erwinia属、Klebsiella属、Micrococcus属、Nocardia属、Pseudomonas属、Pseudonocardia属、Rhodococcus属 Streptomyces属、Thermophila属、Rhizobium属、Xanthobacter属などの微生物を挙げることができる。代表例として、Rhodococcus rhodochrous J1菌における塩基配列を配列表（配列番号３）に示す。
＜本発明に係るプラスミドなどについて＞
続いて、本発明に係るプラスミドの例などについて、以下、図２などを用いて説明する。
続いて、本発明に係るプラスミドの例などについて、以下、図２などを用いて説明する。
図２は、本発明に係るプラスミドの構成例を示す模式図である。
図２に示す通り、このプラスミドは、ｎｈｌＡ遺伝子をコードする配列（配列番号３に示す塩基配列のうち第７４５番目から第１３６８番目の配列、図中「ｎｈｌＡ」参照。）とｎｈｌＥ遺伝子をコードする配列（配列番号３に示す塩基配列のうち第１３７０番目から第１８１６番目の配列、図中「ｎｈｌＥ」参照。）を少なくとも含む。
例えば、このプラスミドを、所定の培養細胞などにトランスフェクションし、細胞内で大量発現させた後、精製することにより、本発明に係るタンパク質複合体を簡易かつ大量に取得できる。なお、本発明に係るタンパク質複合体の調製手段としては、公知の方法が広く適用可能であり、同調製手段は、前記手段のみに狭く限定されない。
図２に示すプラスミドは、公知の方法により、作製できる。例えば、ｎｈｌＡ遺伝子及びｎｈｌＥ遺伝子と同じ配列を有するＤＮＡを調製し、それらのＤＮＡ（予め連結したものを含む）とプラスミドＤＮＡとを制限酵素（例えば、図中「Ｘｂａ Ｉ」及び「Ｓａｃ Ｉ」参照。）で処理した後、連結酵素で処理することにより、即ち、プラスミドＤＮＡにそれらのＤＮＡを組み込むことにより、本発明に係るプラスミドを作製できる。
＜Ｌ−ＮＨａｓｅの成熟化方法について＞
本発明に係るタンパク質複合体αｅ２を用いて、Ｌ−ＮＨａｓｅを成熟化する方法を、図３を用いて説明する。
本発明に係るタンパク質複合体αｅ２を用いて、Ｌ−ＮＨａｓｅを成熟化する方法を、図３を用いて説明する。
図３は、本発明に係るタンパク質複合体αｅ２を用いたＬ−ＮＨａｓｅ成熟化方法を模式的に示す図である。図３中（I）に示す４量体α２β２と２量体αβは、酵素活性の低い未成熟なまま精製されたＬ−ＮＨａｓｅを示している。これらの４量体α２β２、２量体αβは、本発明に係るタンパク質複合体αｅ２を用いることにより、酵素活性の高い４量体α２β２へと成熟化する（図２中（II）参照）。
このようにして、本発明に係るタンパク質複合体αｅ２は、未成熟なまま精製されたＬ−ＮＨａｓｅ（４量体α２β２、２量体αβ）を、精製後（翻訳後）に成熟化させることができる。
＜Ｌ−ＮＨａｓｅ成熟化のメカニズムについて＞
ここで、本願発明者らが新たに見出した、Ｌ−ＮＨａｓｅ成熟化のメカニズムを、図４を用いて説明する。
ここで、本願発明者らが新たに見出した、Ｌ−ＮＨａｓｅ成熟化のメカニズムを、図４を用いて説明する。
図４では、ｎｈｌＥ遺伝子１、ｎｈｌＡ遺伝子２、及びｎｈｌＢ遺伝子３の３つのＯＲＦを持つプラスミド１２３を宿主に導入した様子を模式的に示す。
ｎｈｌＡ遺伝子２、及びｎｈｌＢ遺伝子３からは、４量体４１（α２β２）と２量体４２（αβ）のＬ−ＮＨａｓｅが発現する。発明者らの研究の結果、これらの酵素活性は低く、未成熟であることが分かっている（実施例３参照）。一方、ｎｈｌＥ遺伝子１、及びｎｈｌＡ遺伝子２からは、本発明に係るタンパク質複合体５（αｅ２）が発現する。
次に、タンパク質複合体５（αｅ２）が、４量体４１（α２β２）及び２量体４２（αβ）のＬ−ＮＨａｓｅに作用する。その結果、酵素活性の高い４量体６（α２β２）のＬ−ＮＨａｓｅが出現する。
このようにして、本発明に係るタンパク質複合体５（αｅ２）が、未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅ（４量体４１（α２β２）、２量体４２（αβ））を、酵素活性の高いＬ−ＮＨａｓｅ（４量体６（α２β２））へと成熟化させる。
＜成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅ生産方法について＞
成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅ生産方法の一例を、図５を用いて説明する。図５中ＳＴＥＰ１は、in vivo（宿主内）、ＳＴＥＰ２は、in vitroでの様子を示す。
成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅ生産方法の一例を、図５を用いて説明する。図５中ＳＴＥＰ１は、in vivo（宿主内）、ＳＴＥＰ２は、in vitroでの様子を示す。
まず、ｎｈｌＥ遺伝子１とｎｈｌＡ遺伝子２の２つのＯＲＦを持つプラスミド１２を宿主に導入し、本発明に係るタンパク質複合体５（αｅ２）を精製する。また、ｎｈｌＡ遺伝子２とｎｈｌＢ遺伝子３の２つのＯＲＦを持つプラスミド２３を宿主に導入し、４量体４１（α２β２）、及び２量体４２（αβ）のＬ−ＮＨａｓｅを精製する。前記と同様、このときの４量体４１（α２β２）、及び２量体４２（αβ）のＬ−ＮＨａｓｅは、酵素活性が低く、未成熟である。
そして、精製したタンパク質複合体５（αｅ２）と、未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅ（４量体４１（α２β２）、２量体４２（αβ））とを、in vitroにおいて混合する。その結果、未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅ（４量体４１（α２β２）、２量体４２（αβ））が、酵素活性の高いＬ−ＮＨａｓｅ（４量体６（α２β２））へと成熟化する。
このように、本発明に係るタンパク質複合体５（αｅ２）を用いて、成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅを生産することができる。本発明に係る成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅ生産方法は、タンパク質複合体５（αｅ２）を用いていれば、その方法は限定されず、前記混合以外にも、添加、滴下など、タンパク質複合体５（αｅ２）を用いる方法全てを包含する。
従来、成熟化ニトリルヒドラターゼを生産するには、ニトリルヒドラターゼ構造遺伝子と共に、前記遺伝子を同一の宿主内に導入し、成熟化ニトリルヒドラターゼとして精製する必要があった。
しかし、本発明に係るタンパク質複合体５（αｅ２）を用いることで、一旦、未成熟なまま精製されたＬ−ＮＨａｓｅであっても、精製後に成熟化させることが可能となった。従って、未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅから、別に精製したタンパク質複合体５（αｅ２）を用いて、成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅを生産することができる。
本発明に係る成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅ生産方法は、図５で示した形態に限定されず、タンパク質複合体５（αｅ２）を用いて未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅを成熟化する工程を含む方法を全て包含する。
＜成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅの工業的利用について＞
前記産生方法で得られた成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅは、反応性が高いため、あらゆるアミド化合物の工業的生産に用いることができる。
前記産生方法で得られた成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅは、反応性が高いため、あらゆるアミド化合物の工業的生産に用いることができる。
例えば、本発明に係る成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅは、アクリルアミドの工業的生産において、アクリルニトリルからアクリルアミドへの変換酵素として、用いることができる。本発明に係るアクリルアミド生産方法は、成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅを前記変換酵素として用いる工程を含む方法を全て包含する。
また、本発明に係る成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅは、ニコチンアミドの工業的生産において、３−シアノピリジンからニコチンアミドへの変換酵素として、用いることができる。本発明に係るニコチンアミド生産方法は、成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅを前記変換酵素として用いる工程を含む方法を全て包含する。
実施例１では、以下実施例２から実施例８において使用するプラスミドを構築した。
Rhodococcus rhodochrous J1菌（特開平０５−２１９９７２号参照）由来のコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ（以下「Ｌ−ＮＨａｓｅ」とする。）遺伝子を含むプラスミドpLJK60（J.Biol.Chem.,271,15796-15802 1996）を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を本願発明者が先に発明したプラスミドpREIT19（特願2004-380940）に連結した。図６（ｍ）にプラスミドpLJK60に存在する遺伝子部位を模式的に示す。
そして、以下（I）から（V）のプラスミドを構築した。これらのプラスミドの遺伝子部位を、図６（I）から（V）に、模式的に示す。
（I）ｎｈｌＡ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第７４５番目から第１３６８番目、図６中「ｎｈｌＡ」参照、以下同じ）、ｎｈｌＢ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１番目から第６８１番目、図６中「ｎｈｌＢ」参照、以下同じ）、及びｎｈｌＥ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１３７０番目から第１８１６番目、図６中「ｎｈｌＥ」参照、以下同じ）の３つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBAE。
（II）ｎｈｌＡ遺伝子，及びｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBA。
（III）ｎｈｌＡ遺伝子，及びｎｈｌＥ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlAE。
（IV）ｎｈｌＥ遺伝子のみのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlE。
（V）Ｌ−ＮＨａｓｅのαサブユニットのＮ末端２４アミノ酸を欠損させ２５番目のMetから始まるＯＲＦと、ｎｈｌＥ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlΔAE。
（I）ｎｈｌＡ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第７４５番目から第１３６８番目、図６中「ｎｈｌＡ」参照、以下同じ）、ｎｈｌＢ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１番目から第６８１番目、図６中「ｎｈｌＢ」参照、以下同じ）、及びｎｈｌＥ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１３７０番目から第１８１６番目、図６中「ｎｈｌＥ」参照、以下同じ）の３つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBAE。
（II）ｎｈｌＡ遺伝子，及びｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBA。
（III）ｎｈｌＡ遺伝子，及びｎｈｌＥ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlAE。
（IV）ｎｈｌＥ遺伝子のみのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlE。
（V）Ｌ−ＮＨａｓｅのαサブユニットのＮ末端２４アミノ酸を欠損させ２５番目のMetから始まるＯＲＦと、ｎｈｌＥ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlΔAE。
実施例２では、本発明に係るタンパク質複合体αｅ２（図１参照）を構成するＮｈｌＥタンパク質の、Ｌ−ＮＨａｓｅ成熟化への関与について調べた。具体的には、実施例１で構築したプラスミドpREIT-nhlBA（II）を宿主に導入したときに発現するＬ−ＮＨａｓｅの比活性と、プラスミドpREIT-nhlBAE（I）を宿主に導入したときに発現するＬ−ＮＨａｓｅの比活性を比較した。なお、Ｌ−ＮＨａｓｅの活性測定は、以下のように行った（以下同様）。
水で希釈した無細胞抽出液、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）、20mM 3-シアノピリジンを含む0.5mL中で、20℃にて20分間反応後、アセトニトリルを0.5mL加えることにより反応を停止させた。酵素反応により生成したニコチンアミドをHPLCにより分析した。HPLCの解析条件は表１の通りである。１分間に１μmolの安息香酸を生成する酵素量を１unitとした。
まず、Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として、プラスミドpREIT-nhlBA（II）を導入し、Ｌ−ＮＨａｓｅを発現させた。すると、α、β両サブユニットの大量発現がSDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis）で確認できた。SDS-PAGEの結果を図７lane１に示す。しかし、α、β両サブユニットの発現量に対して無細胞抽出液のＬ−ＮＨａｓｅの酵素活性は０．１ U/mgと非常に低かった。酵素活性を表２に示す。
同様にRhodococcus fascians DSM43985を宿主として、構築したプラスミドpREIT-nhlBAE（I）を導入し、Ｌ−ＮＨａｓｅを発現させた。すると、α、β両サブユニットの他にｎｈｌＥ遺伝子にコードされるＮｈｌＥタンパク質の大量発現が確認された。SDS-PAGEの結果を図７lane３に示す。また、無細胞抽出液のα、β両サブユニットの発現量は、前記のプラスミドpREIT-nhlBA（II）の場合とほぼ同じであるにもかかわらず、Ｌ−ＮＨａｓｅの酵素活性は８．６U/mgと著しく上昇した。酵素活性を表２に示す。
以上の結果から、酵素活性が高い成熟化Ｌ−ＮＨａｓｅを発現させるには、α、β両サブユニットの発現のみならず、ＮｈｌＥタンパク質の存在が重要であることが分かった。
実施例３では、Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として、プラスミドpREIT-nhlBAE（I）を導入した場合に発現するＬ−ＮＨａｓｅと、プラスミドpREIT-nhlBA（II）を導入した場合に発現するＬ−ＮＨａｓｅとのサブユニット構造、及び酵素活性の違いを調べた。
プラスミドpREIT-nhlBAE（I）を導入したRhodococcus fascians DSM43985からは、４量体（α２β２）のＬ−ＮＨａｓｅが精製できた。精製された４量体（α２β２）のＬ−ＮＨａｓｅのゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図８（１）に、SDS-PAGEの結果を図９lane１に示す。このＬ−ＮＨａｓｅの比活性は３２０U/mgであった。比活性を表３に示す。
一方、プラスミドpREIT-nhlBA（II）を導入したRhodococcus fascians DSM43985からは、４量体（α２β２）のＬ−ＮＨａｓｅと、２量体（αβ）のＬ−ＮＨａｓｅの２種のＬ−ＮＨａｓｅが精製できた。精製された４量体（α２β２）のＬ−ＮＨａｓｅのゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図８（２）に、SDS-PAGEの結果を図９lane２に示す。また、２量体（αβ）のＬ−ＮＨａｓｅのゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図８（３）に、SDS-PAGEの結果を図９lane３に示す。
これらの比活性について調べると、４量体（α２β２）のＬ−ＮＨａｓｅの比活性は８３U/mgと低く、２量体（αβ）のＬ−ＮＨａｓｅの比活性は４U/mgと非常に低かった。比活性を表３に示す。
以上の結果、及び実施例２の結果も踏まえると、成熟化した完全なＬ−ＮＨａｓｅにはＮｈｌＥタンパク質が必須であることが分かった。
実施例４では、ＮｈｌＥタンパク質の精製を試みた。
プラスミドpREIT-nhlBAE（I）を導入したRhodococcus fascians DSM43985から、SDS-PAGE上のバンドを指標にＮｈｌＥタンパク質の精製を試みた。その結果、ＮｈｌＥタンパク質は、単独での精製は確認されず、他のタンパク質と複合体を形成した状態で精製できた。精製した複合体の液体クロマトグラフィーにおける保持容量を図８（４）に示す。
実施例５では、実施例４で精製した複合体のサブユニット構造を調べた。
実施例４において、ＮｈｌＥタンパク質と複合体を形成した他のタンパク質は、αサブユニットとSDS-PAGE上で移動度が一致した。SDS-PAGEの結果を図９lane４に示す。
そこで、ＮｈｌＥタンパク質と、複合体を形成したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定したところ、αサブユニットと完全に一致した。また、この複合体の分子量は、ゲル濾過により55.3kDaであることが分かった。ここで、αサブユニットとＮｈｌＥタンパク質の分子量はそれぞれ22.8kDa，16.9kDaである。
以上の結果から、この複合体のサブユニット構造はαｅ２と考えられる。なお、この複合体には、Ｌ−ＮＨａｓｅ活性はなかった。
実施例６では、ＮｈｌＥタンパク質単独での発現を試みた。
Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として、実施例１で構築したｎｈｌＥ遺伝子のみのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlE（IV）を導入し、ＮｈｌＥタンパク質の発現を試みたが、発現は確認できなかった。
一方、Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として、実施例１で構築したｎｈｌＡ遺伝子，及びｎｈｌＥ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlAE（III）を導入したところ、タンパク質複合体αｅ２の発現が確認できた。
さらに、Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として、実施例１で構築したＬ−ＮＨａｓｅのαサブユニットのＮ末端２４アミノ酸を欠損させ２５番目のMetから始まるＯＲＦと、ｎｈｌＥ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlΔAE（V）を導入したが、ＮｈｌＥタンパク質単独での発現は確認できなかった。
以上の結果より、ＮｈｌＥタンパク質の発現にはαサブユニットが必要、あるいは発現したＮｈｌＥタンパク質の安定化にはαサブユニットが必要であることが分かった。
実施例７では、in vitroにおけるタンパク質複合体αｅ２の作用効果について調べた。
プラスミドpREIT-nhlBA（II）を導入したRhodococcus fascians DSM43985から比活性の低い４量体（α２β２）酵素（比活性83U/mg）、及び比活性の非常に低い２量体（αβ）酵素（比活性4U/mg）を精製した。得られたこれらの酵素に、それぞれ、タンパク質複合体αｅ２を混合し、ゲル濾過カラムを用いて混合溶液を分画した。
まず、比活性の低い４量体（α２β２）酵素とタンパク質複合体αｅ２との混合溶液を分画した。その結果、４量体（α２β２）酵素の大きさはそのままであったが、この酵素の比活性は、328.4U/mgまで上昇した。混合時（０時間）の４量体（α２β２）酵素とタンパク質複合体αｅ２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０Ａに、混合後１２時間後の４量体（α２β２）酵素とタンパク質複合体αｅ２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０Ｂに示す。また、それぞれの比活性を表４に示す。これは、プラスミドpREIT-BAE（I）を導入したRhodococcus fascians DSM43985から精製した４量体（α２β２）酵素の比活性と同じレベルである。
一方、比活性の非常に低い２量体（αβ）酵素とタンパク質複合体αｅ２との混合溶液を分画した。その結果、新たに４量体（α２β２）酵素が生成した。混合時（０時間）の２量体（αβ）酵素とタンパク質複合体αｅ２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０Ｃに、混合後１２時間後の４量体（α２β２）酵素とタンパク質複合体αｅ２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０Ｄに示す。新たに生成した４量体（α２β２）酵素の比活性は、326.2U/mgであった。比活性を表４に示す。これも、プラスミドpREIT-BAE（I）を導入したRhodococcus fascians DSM43985から精製した４量体（α２β２）酵素の比活性と同じレベルである。
以上の結果より、本発明に係るタンパク質複合体αｅ２は、in vitroにおいて、酵素活性の低い未成熟な状態で発現したＬ−ＮＨａｓｅを、翻訳後に酵素活性の高い成熟化したＬ−ＮＨａｓｅと変化させることが分かった。
実施例８では、Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として精製した、以下の酵素について、コバルトイオン含有量の測定を行った。
（ａ）pREIT-nhlBAE（I）を導入して精製した４量体（α２β２）酵素。
（ｂ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製した４量体（α２β２）酵素。
（ｃ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製した２量体（αβ）酵素。
（ｄ）（ｂ）の４量体酵素をin vitroにおいて、タンパク質複合体αｅ２で処理した後の４量体（α２β２）酵素。
（ｅ）（ｃ）の２量体酵素をin vitroにおいて、タンパク質複合体αｅ２で処理した後に生成した４量体（α２β２）酵素。
（ａ）pREIT-nhlBAE（I）を導入して精製した４量体（α２β２）酵素。
（ｂ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製した４量体（α２β２）酵素。
（ｃ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製した２量体（αβ）酵素。
（ｄ）（ｂ）の４量体酵素をin vitroにおいて、タンパク質複合体αｅ２で処理した後の４量体（α２β２）酵素。
（ｅ）（ｃ）の２量体酵素をin vitroにおいて、タンパク質複合体αｅ２で処理した後に生成した４量体（α２β２）酵素。
（ａ）から（ｅ）のそれぞれの酵素と、タンパク質複合体αｅ２のコバルトイオン含有量を測定した。その結果を表５に示す。
（ａ）pREIT-BAE（I）を導入して精製した４量体（α２β２）酵素はαβサブユニットあたり1.06モル（2.12モル/α２β２）のコバルトイオンを含有しているのに対し、（ｂ）pREIT-BA（II）を導入して精製した４量体（α２β２）酵素、及び（ｃ）pREIT-BA（II）を導入して精製した２量体（αβ）酵素は、それぞれαβサブユニットあたり0.036モル（0.072モル/α２β２）、0.030モルのコバルトイオンしか含有していなかった。なお、（ｂ）の酵素と処理するタンパク質複合体αｅ２、及び（ｃ）の酵素と処理するタンパク質複合体αｅ２のコバルトイオン含有量は、どちらもαｅ２サブユニットあたり0.92モルであった。
しかし、（ｂ）、及び（ｃ）の酵素をそれぞれタンパク質複合体αｅ２と処理した後の４量体（α２β２）酵素（ｄ），及び（ｅ）のコバルトイオン含有量は、それぞれ、αβサブユニットあたり1.16モル（2.32モル/α２β２）、1.18モル（2.36モル/α２β２）と増加した。
一方で、（ｂ）、及び（ｃ）の酵素を処理した後のタンパク質複合体αｅ２のコバルトイオン含有量は、それぞれ、αβ２サブユニットあたり0.40モル、0.42モルと減少していた。
以上の結果より、タンパク質複合体αｅ２は、コバルトイオン含量が少なく比活性の低い酵素Ｌ−ＮＨａｓｅに対し、自身のコバルトイオンを受け渡すことにより、酵素活性を上昇させることが分かった。
これまで工業的な使用が難しかった未成熟コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを、酵素活性の高い状態へ成熟化させることにより、種々のアミド化合物の工業的生産に利用することが可能となる。また、本発明に係るタンパク質複合体を使ったコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼの成熟化方法は、in vivo、及びin vitroにかかわらず、行うことができるため、様々な状況に応じて、コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼの工業的生産過程、更には、あらゆるアミノ化合物の工業的生産過程の一過程として用いることができる。
ｅ ＮｈｌＥタンパク質
α αサブユニット
１ ｎｈｌＥ遺伝子
２ ｎｈｌＡ遺伝子
３ ｎｈｌＢ遺伝子
１２ ｎｈｌＥ遺伝子、及びｎｈｌＡ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミド
１２３ ｎｈｌＥ遺伝子、ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子の３つのＯＲＦを持つプラスミド
４１ ４量体の未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅ
４２ ２量体の未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅ
５ タンパク質複合体αｅ２
６ 成熟Ｌ−ＮＨａｓｅ
２３ ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミド
α αサブユニット
１ ｎｈｌＥ遺伝子
２ ｎｈｌＡ遺伝子
３ ｎｈｌＢ遺伝子
１２ ｎｈｌＥ遺伝子、及びｎｈｌＡ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミド
１２３ ｎｈｌＥ遺伝子、ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子の３つのＯＲＦを持つプラスミド
４１ ４量体の未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅ
４２ ２量体の未成熟Ｌ−ＮＨａｓｅ
５ タンパク質複合体αｅ２
６ 成熟Ｌ−ＮＨａｓｅ
２３ ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミド
Claims (6)
- 配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、
配列番号２に示すアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのタンパク質と、
から形成された３量体のタンパク質複合体。 - 請求の範囲第１項記載のタンパク質複合体を用いて、未成熟コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを成熟化させる手順を少なくとも含むコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法。
- 請求の範囲第１項記載のタンパク質複合体を用いて、未成熟コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを成熟化させる工程を少なくとも含む成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ作製方法。
- 請求の範囲第１項記載のタンパク質複合体を用いて、未成熟コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを成熟化させる工程と、
該成熟化させる工程において成熟化されたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを、アクリルニトリルからアクリルアミドへの変換酵素として用いる工程を少なくとも含むアクリルアミド生産方法。 - 請求の範囲第１項記載のタンパク質複合体を用いて、未成熟コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを成熟化させる工程と、
該成熟化させる工程において成熟化されたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼを、３−シアノピリジンからニコチンアミドへの変換酵素として用いる工程を少なくとも含むニコチンアミド生産方法。 - 配列番号３に示す塩基配列のうち第１３７０番目から第１８１６番目の配列と、
配列番号３に示す塩基配列のうち第７４５番目から第１３６８番目の配列と、
を少なくとも含むプラスミド。
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