JPH11253168A - ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子Info
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- JPH11253168A JPH11253168A JP10065520A JP6552098A JPH11253168A JP H11253168 A JPH11253168 A JP H11253168A JP 10065520 A JP10065520 A JP 10065520A JP 6552098 A JP6552098 A JP 6552098A JP H11253168 A JPH11253168 A JP H11253168A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ
３０９５（Pseudonocardia thermophila JCM3095）由来
のニトリルヒドラターゼの活性化に関与するニトリルヒ
ドラターゼ活性化タンパク質及び該タンパク質をコード
する遺伝子を提供する。 【解決手段】 ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質
をコードする遺伝子を有する組換えプラスミドを構築
し、該組換えプラスミドで大腸菌を形質転換し、該大腸
菌内でニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子と共に
発現させる。 【効果】 遺伝子工学的な手法で該酵素を大量に発現さ
せることが可能となる。
３０９５（Pseudonocardia thermophila JCM3095）由来
のニトリルヒドラターゼの活性化に関与するニトリルヒ
ドラターゼ活性化タンパク質及び該タンパク質をコード
する遺伝子を提供する。 【解決手段】 ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質
をコードする遺伝子を有する組換えプラスミドを構築
し、該組換えプラスミドで大腸菌を形質転換し、該大腸
菌内でニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子と共に
発現させる。 【効果】 遺伝子工学的な手法で該酵素を大量に発現さ
せることが可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シュードノカルデ
ィア・サーモフィラＪＣＭ３０９５（Pseudonocardia t
hermophila JCM3095、以下単にシュードノカルディア・
サーモフィラと呼ぶ）由来のニトリルヒドラターゼの活
性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子
に関する。さらに、本発明は、該遺伝子を含有する組換
えプラスミド、該遺伝子およびニトリルヒドラターゼ遺
伝子を含有する組換えプラスミド、該組換えプラスミド
により形質転換された形質転換株及び該形質転換株を培
養して得られた形質転換株、培養液、およびそれらの処
理物を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物
を製造する方法に関する。
ィア・サーモフィラＪＣＭ３０９５（Pseudonocardia t
hermophila JCM3095、以下単にシュードノカルディア・
サーモフィラと呼ぶ）由来のニトリルヒドラターゼの活
性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子
に関する。さらに、本発明は、該遺伝子を含有する組換
えプラスミド、該遺伝子およびニトリルヒドラターゼ遺
伝子を含有する組換えプラスミド、該組換えプラスミド
により形質転換された形質転換株及び該形質転換株を培
養して得られた形質転換株、培養液、およびそれらの処
理物を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物
を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、種々の化合物のニトリル基を水和
しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素で
あるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素を産生す
る微生物株が多数開示されている。ニトリルヒドラター
ゼを用いてニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に
製造するためには、アミド化合物の製造コストに占める
該酵素の製造コストを下げることが重要であり、より具
体的には単位微生物重量あたりの該酵素含有量を高くす
る必要がある。そこで、該酵素の遺伝子を用いて遺伝子
工学の手法により該酵素を大量に発現させることを目的
として、該酵素の遺伝子をクローニングする試みが検討
されている。
しアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素で
あるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素を産生す
る微生物株が多数開示されている。ニトリルヒドラター
ゼを用いてニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に
製造するためには、アミド化合物の製造コストに占める
該酵素の製造コストを下げることが重要であり、より具
体的には単位微生物重量あたりの該酵素含有量を高くす
る必要がある。そこで、該酵素の遺伝子を用いて遺伝子
工学の手法により該酵素を大量に発現させることを目的
として、該酵素の遺伝子をクローニングする試みが検討
されている。
【０００３】本発明者らは、ニトリルヒドラターゼ活性
を有する微生物としてシュードノカルディア・サーモフ
ィラを見出した（特開平８−５６６８４）。また、本発
明者らは、同株よりニトリルヒドラターゼを単離し、同
酵素がαサブユニットおよびβサブユニットより構成さ
れることを確認した。さらに、同株よりニトリルヒドラ
ターゼ遺伝子を単離し、そのアミノ酸配列および遺伝子
配列を明らかにするとともに、該遺伝子を大腸菌内で大
量に発現できる遺伝子組換えプラスミドおよび同プラス
ミドにより形質転換された形質転換大腸菌株を作出する
ことにも成功している（特開平９−２７５９７８）。
尚、シュードノカルディア・サーモフィラであるが、本
菌株は理化学研究所微生物系統保存施設（埼玉県和光市
広沢２−１）に番号ＪＣＭ３０９５として保管され、何
人にも請求により自由に分譲される。
を有する微生物としてシュードノカルディア・サーモフ
ィラを見出した（特開平８−５６６８４）。また、本発
明者らは、同株よりニトリルヒドラターゼを単離し、同
酵素がαサブユニットおよびβサブユニットより構成さ
れることを確認した。さらに、同株よりニトリルヒドラ
ターゼ遺伝子を単離し、そのアミノ酸配列および遺伝子
配列を明らかにするとともに、該遺伝子を大腸菌内で大
量に発現できる遺伝子組換えプラスミドおよび同プラス
ミドにより形質転換された形質転換大腸菌株を作出する
ことにも成功している（特開平９−２７５９７８）。
尚、シュードノカルディア・サーモフィラであるが、本
菌株は理化学研究所微生物系統保存施設（埼玉県和光市
広沢２−１）に番号ＪＣＭ３０９５として保管され、何
人にも請求により自由に分譲される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、特開
平９−２７５９７８記載のシュードノカルディア・サー
モフィラ由来のニトリルヒドラターゼを大腸菌内で大量
に発現させることが可能な遺伝子組換えプラスミド（ｐ
ＰＴ−ＤＢ１）の詳細な解析により判明した該酵素の活
性化に関与するタンパク質、それをコードする遺伝子、
該遺伝子を含有する組換えプラスミド、該遺伝子および
ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含有する組換えプラスミ
ド、該組換えプラスミドにより形質転換された形質転換
株及び該形質転換株を培養して得られた形質転換株、培
養液、およびそれらの処理物を用いてニトリル化合物か
ら対応するアミド化合物を製造する方法を提供すること
である。
平９−２７５９７８記載のシュードノカルディア・サー
モフィラ由来のニトリルヒドラターゼを大腸菌内で大量
に発現させることが可能な遺伝子組換えプラスミド（ｐ
ＰＴ−ＤＢ１）の詳細な解析により判明した該酵素の活
性化に関与するタンパク質、それをコードする遺伝子、
該遺伝子を含有する組換えプラスミド、該遺伝子および
ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含有する組換えプラスミ
ド、該組換えプラスミドにより形質転換された形質転換
株及び該形質転換株を培養して得られた形質転換株、培
養液、およびそれらの処理物を用いてニトリル化合物か
ら対応するアミド化合物を製造する方法を提供すること
である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、特開平９
−２７５９７８記載のＭＴ−１０８２２株に導入されて
いる遺伝子組換えプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１上のシュー
ドノカルディア・サーモフィラ由来のＤＮＡ断片の塩基
配列を詳細に解析した。その結果、以下の１〜５の知見
を得るに至った。第一に、ｐＰＴ−ＤＢ１上にニトリル
ヒドラターゼ構造遺伝子（αおよびβサブユニット構造
遺伝子）とは異なる第３のオープンリーディングフレー
ム（以下、ＯＲＦ３と呼称する）が該ＤＮＡ断片上に存
在し、ＯＲＦ３が分子量約１５９００のタンパク質をコ
ードしていることを見出した。第二に、ｐＰＴ−ＤＢ１
上のαサブユニットのオープンリーディングフレーム
（以下、ＯＲＦ２と呼称する）、βサブユニットのオー
プンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦ１と呼称す
る）およびＯＲＦ３のみがクローニングされたプラスミ
ドｐＰＴ−Ｄ１を作製し、同プラスミドで形質転換した
形質転換大腸菌がニトリルヒドラターゼ活性を有してい
ることを確認した。第三に、ｐＰＴ−ＤＢ１よりＯＲＦ
１およびＯＲＦ２のみを有する遺伝子組換えプラスミド
ｐＰＴ−Ｆ１を構築した。同プラスミドで形質転換した
形質転換大腸菌のニトリルヒドラターゼ活性を測定した
結果、同大腸菌からはニトリルヒドラターゼ活性が検出
されなかった。一方、菌体内には、αおよびβサブユニ
ットに相当するポリペプチド鎖の存在が確認された。第
四に、ｐＰＴ−ＤＢ１より、ＯＲＦ３領域のみがクロー
ニングされたプラスミドｐＰＴ−Ｇ１を作製し、同プラ
スミドで形質転換した形質転換大腸菌にはニトリルヒド
ラターゼ活性が見いだされないことを確認した。第五
に、ｐＰＴ−Ｆ１より、ｌａｃＺプロモーター、ＯＲＦ
１およびＯＲＦ２を含む領域をＰＣＲにより増幅し、得
られた増幅ＤＮＡ断片をｐＰＴ−Ｇ１のＯＲＦ３の３’
末端側下流に再クローニングしたプラスミドｐＰＴ−Ｈ
１を作製した。同プラスミドで形質転換した形質転換大
腸菌のニトリルヒドラターゼ活性を測定した結果、該大
腸菌にはニトリルヒドラターゼ活性が検出された。
−２７５９７８記載のＭＴ−１０８２２株に導入されて
いる遺伝子組換えプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１上のシュー
ドノカルディア・サーモフィラ由来のＤＮＡ断片の塩基
配列を詳細に解析した。その結果、以下の１〜５の知見
を得るに至った。第一に、ｐＰＴ−ＤＢ１上にニトリル
ヒドラターゼ構造遺伝子（αおよびβサブユニット構造
遺伝子）とは異なる第３のオープンリーディングフレー
ム（以下、ＯＲＦ３と呼称する）が該ＤＮＡ断片上に存
在し、ＯＲＦ３が分子量約１５９００のタンパク質をコ
ードしていることを見出した。第二に、ｐＰＴ−ＤＢ１
上のαサブユニットのオープンリーディングフレーム
（以下、ＯＲＦ２と呼称する）、βサブユニットのオー
プンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦ１と呼称す
る）およびＯＲＦ３のみがクローニングされたプラスミ
ドｐＰＴ−Ｄ１を作製し、同プラスミドで形質転換した
形質転換大腸菌がニトリルヒドラターゼ活性を有してい
ることを確認した。第三に、ｐＰＴ−ＤＢ１よりＯＲＦ
１およびＯＲＦ２のみを有する遺伝子組換えプラスミド
ｐＰＴ−Ｆ１を構築した。同プラスミドで形質転換した
形質転換大腸菌のニトリルヒドラターゼ活性を測定した
結果、同大腸菌からはニトリルヒドラターゼ活性が検出
されなかった。一方、菌体内には、αおよびβサブユニ
ットに相当するポリペプチド鎖の存在が確認された。第
四に、ｐＰＴ−ＤＢ１より、ＯＲＦ３領域のみがクロー
ニングされたプラスミドｐＰＴ−Ｇ１を作製し、同プラ
スミドで形質転換した形質転換大腸菌にはニトリルヒド
ラターゼ活性が見いだされないことを確認した。第五
に、ｐＰＴ−Ｆ１より、ｌａｃＺプロモーター、ＯＲＦ
１およびＯＲＦ２を含む領域をＰＣＲにより増幅し、得
られた増幅ＤＮＡ断片をｐＰＴ−Ｇ１のＯＲＦ３の３’
末端側下流に再クローニングしたプラスミドｐＰＴ−Ｈ
１を作製した。同プラスミドで形質転換した形質転換大
腸菌のニトリルヒドラターゼ活性を測定した結果、該大
腸菌にはニトリルヒドラターゼ活性が検出された。
【０００６】以上の知見より、本発明者らは、シュード
ノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラター
ゼが導入された大腸菌が同活性を示すためには、ＯＲＦ
３領域の存在が必須であり、さらに、上記の第二、第三
および第五の知見を併せ考えるとＯＲＦ３の翻訳産物の
存在が必須であると結論した。また、同酵素がαサブユ
ニットおよびβサブユニットにより構成されること（特
開平９−２７５９７８）、および、ＯＲＦ１〜３の３種
類のオープンリディングフレームを含む最小のＤＮＡ断
片を大腸菌に導入した場合でも遺伝子組換え大腸菌がニ
トリルヒドラターゼ活性を示すこと（上記の第二の知
見）より、ＯＲＦ３の翻訳産物は、該ニトリルヒドラタ
ーゼの活性化に関与していると結論した。すなわち、Ｏ
ＲＦ３は、シュードノカルディア・サーモフィラ由来の
ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質を
コードする遺伝子座であると結論し、本願発明を完成さ
せるに至った。
ノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラター
ゼが導入された大腸菌が同活性を示すためには、ＯＲＦ
３領域の存在が必須であり、さらに、上記の第二、第三
および第五の知見を併せ考えるとＯＲＦ３の翻訳産物の
存在が必須であると結論した。また、同酵素がαサブユ
ニットおよびβサブユニットにより構成されること（特
開平９−２７５９７８）、および、ＯＲＦ１〜３の３種
類のオープンリディングフレームを含む最小のＤＮＡ断
片を大腸菌に導入した場合でも遺伝子組換え大腸菌がニ
トリルヒドラターゼ活性を示すこと（上記の第二の知
見）より、ＯＲＦ３の翻訳産物は、該ニトリルヒドラタ
ーゼの活性化に関与していると結論した。すなわち、Ｏ
ＲＦ３は、シュードノカルディア・サーモフィラ由来の
ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質を
コードする遺伝子座であると結論し、本願発明を完成さ
せるに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、シュードノカルディ
ア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化
に関与するタンパク質およびそれをコードする遺伝子配
列を提供するものである。さらに、本発明は、該遺伝子
を含む組換えプラスミド、該遺伝子およびニトリルヒド
ラターゼ遺伝子を含有する組換えプラスミド、該組換え
プラスミドにより形質転換された形質転換株、及び、該
形質転換株を培養して得られた形質転換株、培養液、お
よびそれらの処理物を用いて、ニトリル化合物から対応
するアミド化合物を製造する方法を提供するものであ
る。
ア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化
に関与するタンパク質およびそれをコードする遺伝子配
列を提供するものである。さらに、本発明は、該遺伝子
を含む組換えプラスミド、該遺伝子およびニトリルヒド
ラターゼ遺伝子を含有する組換えプラスミド、該組換え
プラスミドにより形質転換された形質転換株、及び、該
形質転換株を培養して得られた形質転換株、培養液、お
よびそれらの処理物を用いて、ニトリル化合物から対応
するアミド化合物を製造する方法を提供するものであ
る。
【０００８】
【発明実施の形態】以下、本発明の詳細について説明す
る。
る。
【０００９】本発明におけるシュードノカルディア・サ
ーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関与
するタンパク質（以下、単にニトリルヒドラターゼ活性
化タンパク質と呼称する）とは、前述の課題を解決する
ための手段および後述の実施例のように、該タンパク質
の発現の有無がシュードノカルディア・サーモフィラ由
来のニトリルヒドラターゼの活性化を直接左右する性質
を有しているタンパク質のことである。
ーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関与
するタンパク質（以下、単にニトリルヒドラターゼ活性
化タンパク質と呼称する）とは、前述の課題を解決する
ための手段および後述の実施例のように、該タンパク質
の発現の有無がシュードノカルディア・サーモフィラ由
来のニトリルヒドラターゼの活性化を直接左右する性質
を有しているタンパク質のことである。
【００１０】本発明におけるニトリルヒドラターゼ活性
化タンパク質とは、シュードノカルディア・サーモフィ
ラ由来のものをその代表例として挙げることができる。
尚、近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、
シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒ
ドラターゼ活性化タンパク質の分子生物学的な性質やア
ミノ酸配列等を直接参考にすることにより、該タンパク
質と同等の機能を有するタンパク質をシュードノカルデ
ィア・サーモフィラとは全く別個の微生物株より取得す
ることが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。か
かる技術水準に鑑み、シュードノカルディア・サーモフ
ィラ以外の微生物株由来であっても、シュードノカルデ
ィア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性
化に関与するタンパク質は、本発明に包含されるものと
する。そのような微生物株としては、ノカルディア(Noc
ardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、
バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュード
モナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)
属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコ
ッッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetob
acter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレ
プトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobiu
m)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター
(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロ
モナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)
属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバク
テリウム(Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermo
phila)種ＪＣＭ３０９５株以外のシュードノカルディア
(Pseudonocardia)属に属する株を好適な例として挙げる
ことができる。
化タンパク質とは、シュードノカルディア・サーモフィ
ラ由来のものをその代表例として挙げることができる。
尚、近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、
シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒ
ドラターゼ活性化タンパク質の分子生物学的な性質やア
ミノ酸配列等を直接参考にすることにより、該タンパク
質と同等の機能を有するタンパク質をシュードノカルデ
ィア・サーモフィラとは全く別個の微生物株より取得す
ることが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。か
かる技術水準に鑑み、シュードノカルディア・サーモフ
ィラ以外の微生物株由来であっても、シュードノカルデ
ィア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性
化に関与するタンパク質は、本発明に包含されるものと
する。そのような微生物株としては、ノカルディア(Noc
ardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、
バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュード
モナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)
属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコ
ッッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetob
acter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレ
プトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobiu
m)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター
(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロ
モナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)
属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバク
テリウム(Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermo
phila)種ＪＣＭ３０９５株以外のシュードノカルディア
(Pseudonocardia)属に属する株を好適な例として挙げる
ことができる。
【００１１】本発明におけるニトリルヒドラターゼ活性
化タンパク質とは、配列表における配列番号：１に示す
アミノ酸配列により構成されるものをその代表例として
挙げることができる。また、同じ塩基配列の遺伝子を鋳
型として転写・翻訳された場合であっても、それを導入
する宿主の種類、培養に使用する栄養培地の成分や組
成、培養時の温度やｐＨ等によっては、宿主内酵素によ
る翻訳後の修飾などにより、所期の機能は保持している
ものの配列表におけるＮ末端付近のアミノ酸の１個また
は２個以上が欠失したり、Ｎ末端に１個または２個以上
のアミノ酸が新たに付加した部分変異タンパク質を産生
することがある。さらに、組換えＤＮＡ技術の進歩によ
りタンパク質の機能を実質的に変えることなく比較的容
易にその構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミ
ノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入できるようにもな
った。かかる技術水準に鑑み、この発明でいうニトリル
ヒドラターゼ活性化タンパク質とは、配列表における配
列番号：１に示すアミノ酸配列をそのまま具備するもの
は言うにおよばず、１個または２個以上のアミノ酸が他
のアミノ酸に置換、欠失、削除もしくは挿入されたアミ
ノ酸配列を有する部分変異タンパク質であっても、それ
がシュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリル
ヒドラターゼの活性化に関与する場合は本発明に包含さ
れるものとする。
化タンパク質とは、配列表における配列番号：１に示す
アミノ酸配列により構成されるものをその代表例として
挙げることができる。また、同じ塩基配列の遺伝子を鋳
型として転写・翻訳された場合であっても、それを導入
する宿主の種類、培養に使用する栄養培地の成分や組
成、培養時の温度やｐＨ等によっては、宿主内酵素によ
る翻訳後の修飾などにより、所期の機能は保持している
ものの配列表におけるＮ末端付近のアミノ酸の１個また
は２個以上が欠失したり、Ｎ末端に１個または２個以上
のアミノ酸が新たに付加した部分変異タンパク質を産生
することがある。さらに、組換えＤＮＡ技術の進歩によ
りタンパク質の機能を実質的に変えることなく比較的容
易にその構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミ
ノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入できるようにもな
った。かかる技術水準に鑑み、この発明でいうニトリル
ヒドラターゼ活性化タンパク質とは、配列表における配
列番号：１に示すアミノ酸配列をそのまま具備するもの
は言うにおよばず、１個または２個以上のアミノ酸が他
のアミノ酸に置換、欠失、削除もしくは挿入されたアミ
ノ酸配列を有する部分変異タンパク質であっても、それ
がシュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリル
ヒドラターゼの活性化に関与する場合は本発明に包含さ
れるものとする。
【００１２】すなわち、本発明は、配列表の配列番号：
１に示される１４４個のアミノ酸の配列により構成され
るニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質である。ま
た、本発明においては、配列表の配列番号：１に示され
るアミノ酸配列の一部が置換、欠失、削除または挿入し
て得られた部分変異タンパク質であり、かつ、シュード
ノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラター
ゼの活性化に関与する場合には、本発明のニトリルヒド
ラターゼ活性化タンパク質に含まれるものとする。
１に示される１４４個のアミノ酸の配列により構成され
るニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質である。ま
た、本発明においては、配列表の配列番号：１に示され
るアミノ酸配列の一部が置換、欠失、削除または挿入し
て得られた部分変異タンパク質であり、かつ、シュード
ノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラター
ゼの活性化に関与する場合には、本発明のニトリルヒド
ラターゼ活性化タンパク質に含まれるものとする。
【００１３】本発明におけるニトリルヒドラターゼ活性
化タンパク質とは、シュードノカルディア・サーモフィ
ラ由来であり、かつ、配列表における配列番号：１に示
すアミノ酸配列により構成されるものをその代表例とし
て挙げることができる。また、近年の遺伝子工学の進歩
により、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼ活性化タンパク質のアミノ酸配列を
直接参考にすることにより、該タンパク質と同等の機能
を有するタンパク質をシュードノカルディア・サーモフ
ィラとは全く別個の微生物株より取得することが可能と
なり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に
鑑み、シュードノカルディア・サーモフィラ以外の微生
物株由来であり、配列表における配列番号：１に示すア
ミノ酸配列をそのまま具備する場合または１個または２
個以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除も
しくは挿入されたアミノ酸配列を有する場合であって、
かつ、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニト
リルヒドラターゼの活性化に関与する場合には、該タン
パク質は、本発明に包含されるものとする。そのような
微生物株としては、ノカルディア(Nocardia)属、コリネ
バクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillu
s)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomon
as)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス
(rhodochrous)種に代表されるロドコッッカス(Rhodococ
cus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサン
トバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Str
eptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエ
ラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)
属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromona
s)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバク
ター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobact
erium)属またはサーモフィラ(thermophila)種ＪＣＭ３
０９５株以外のシュードノカルディア(Pseudonocardia)
属に属する株を好適な例として挙げることができる。
化タンパク質とは、シュードノカルディア・サーモフィ
ラ由来であり、かつ、配列表における配列番号：１に示
すアミノ酸配列により構成されるものをその代表例とし
て挙げることができる。また、近年の遺伝子工学の進歩
により、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼ活性化タンパク質のアミノ酸配列を
直接参考にすることにより、該タンパク質と同等の機能
を有するタンパク質をシュードノカルディア・サーモフ
ィラとは全く別個の微生物株より取得することが可能と
なり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に
鑑み、シュードノカルディア・サーモフィラ以外の微生
物株由来であり、配列表における配列番号：１に示すア
ミノ酸配列をそのまま具備する場合または１個または２
個以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、欠失、削除も
しくは挿入されたアミノ酸配列を有する場合であって、
かつ、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニト
リルヒドラターゼの活性化に関与する場合には、該タン
パク質は、本発明に包含されるものとする。そのような
微生物株としては、ノカルディア(Nocardia)属、コリネ
バクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillu
s)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomon
as)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス
(rhodochrous)種に代表されるロドコッッカス(Rhodococ
cus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサン
トバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Str
eptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエ
ラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)
属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromona
s)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバク
ター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム(Agrobact
erium)属またはサーモフィラ(thermophila)種ＪＣＭ３
０９５株以外のシュードノカルディア(Pseudonocardia)
属に属する株を好適な例として挙げることができる。
【００１４】本発明においては、ニトリルヒドラターゼ
活性化タンパク質をコードする遺伝子の配列が含まれ
る。本発明のニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質を
コードする遺伝子とは、本発明のニトリルヒドラターゼ
活性化タンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定
されるものではなく、本発明の範囲に含まれるものとす
る。
活性化タンパク質をコードする遺伝子の配列が含まれ
る。本発明のニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質を
コードする遺伝子とは、本発明のニトリルヒドラターゼ
活性化タンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定
されるものではなく、本発明の範囲に含まれるものとす
る。
【００１５】本発明においては、配列表の配列番号：１
に示される１４４個のアミノ酸の配列をコードする塩基
配列は、本発明のニトリルヒドラターゼ活性化タンパク
質をコードする遺伝子の範囲に含まれる。また、本発明
においては、配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸
配列の一部が置換、欠失、削除または挿入して得られる
部分変異タンパク質であり、かつ、シュードノカルディ
ア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化
に関与する場合には、該部分変異タンパク質のアミノ酸
配列をコードする塩基配列も本発明のニトリルヒドラタ
ーゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子の範囲に含ま
れるものとする。
に示される１４４個のアミノ酸の配列をコードする塩基
配列は、本発明のニトリルヒドラターゼ活性化タンパク
質をコードする遺伝子の範囲に含まれる。また、本発明
においては、配列表の配列番号：１に示されるアミノ酸
配列の一部が置換、欠失、削除または挿入して得られる
部分変異タンパク質であり、かつ、シュードノカルディ
ア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化
に関与する場合には、該部分変異タンパク質のアミノ酸
配列をコードする塩基配列も本発明のニトリルヒドラタ
ーゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子の範囲に含ま
れるものとする。
【００１６】本発明のニトリルヒドラターゼ活性化タン
パク質をコードする遺伝子とは、配列表の配列番号２に
記載の１３２８番目から１７６２番目までの塩基配列を
その代表例として挙げることができる。また、組換えＤ
ＮＡ技術の進歩によりタンパク質のアミノ酸配列を実質
的に変えることなく比較的容易に翻訳の際の鋳型となる
ＤＮＡの塩基配列を他の塩基配列で置換できるようにな
った。さらに、翻訳の際の鋳型となるＤＮＡの塩基配列
を置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、タン
パク質の機能を実質的に変えることなくその構成アミノ
酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、
削除または挿入させることもできるようになった。かか
る技術水準に鑑み、この発明でいうニトリルヒドラター
ゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子とは、配列表に
おける配列番号：２に記載の１３２８番目から１７６２
番目までの塩基配列をそのまま具備するものは言うにお
よばず、そのＤＮＡ塩基配列の１個または２個以上の塩
基が他の塩基に置換、欠失、削除もしくは挿入された部
分変異配列であっても、それがシュードノカルディア・
サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関
与するタンパク質の鋳型として機能する場合には、本発
明に包含されるものとする。
パク質をコードする遺伝子とは、配列表の配列番号２に
記載の１３２８番目から１７６２番目までの塩基配列を
その代表例として挙げることができる。また、組換えＤ
ＮＡ技術の進歩によりタンパク質のアミノ酸配列を実質
的に変えることなく比較的容易に翻訳の際の鋳型となる
ＤＮＡの塩基配列を他の塩基配列で置換できるようにな
った。さらに、翻訳の際の鋳型となるＤＮＡの塩基配列
を置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、タン
パク質の機能を実質的に変えることなくその構成アミノ
酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、
削除または挿入させることもできるようになった。かか
る技術水準に鑑み、この発明でいうニトリルヒドラター
ゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子とは、配列表に
おける配列番号：２に記載の１３２８番目から１７６２
番目までの塩基配列をそのまま具備するものは言うにお
よばず、そのＤＮＡ塩基配列の１個または２個以上の塩
基が他の塩基に置換、欠失、削除もしくは挿入された部
分変異配列であっても、それがシュードノカルディア・
サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関
与するタンパク質の鋳型として機能する場合には、本発
明に包含されるものとする。
【００１７】すなわち、本発明は、ニトリルヒドラター
ゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子であって、配列
表の配列番号：２に記載の１３２８番目から１７６２番
目までの塩基配列により構成されるものを含んでいる。
また、本発明においては、配列表の配列番号：２に記載
の１３２８番目から１７６２番目までの塩基配列の一部
を置換、欠失、削除または挿入して得られる塩基配列を
有する遺伝子であって、該遺伝子がコードするタンパク
質がシュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリ
ルヒドラターゼの活性化に関与する場合には、本発明の
ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺
伝子に含まれるものとする。
ゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子であって、配列
表の配列番号：２に記載の１３２８番目から１７６２番
目までの塩基配列により構成されるものを含んでいる。
また、本発明においては、配列表の配列番号：２に記載
の１３２８番目から１７６２番目までの塩基配列の一部
を置換、欠失、削除または挿入して得られる塩基配列を
有する遺伝子であって、該遺伝子がコードするタンパク
質がシュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリ
ルヒドラターゼの活性化に関与する場合には、本発明の
ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺
伝子に含まれるものとする。
【００１８】本発明においては、ニトリルヒドラターゼ
活性化タンパク質をコードする遺伝子が挿入された組換
えプラスミドを構築することが含まれる。より具体的に
は、ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードす
る遺伝子が該遺伝子の発現に必要な制御領域及び自律複
製に必要な領域を含むプラスミドベクターに挿入された
プラスミドのことである。
活性化タンパク質をコードする遺伝子が挿入された組換
えプラスミドを構築することが含まれる。より具体的に
は、ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードす
る遺伝子が該遺伝子の発現に必要な制御領域及び自律複
製に必要な領域を含むプラスミドベクターに挿入された
プラスミドのことである。
【００１９】発現に必要な制御領域とは、プロモーター
配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボ
ゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示して
いる。プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来
のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラク
トースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ
由来のＰLプロモーター及びＰRプロモーターや、枯草菌
由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・ア
ルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロ
テアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロ
モーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロ
モーターのように独自に改変・設計された配列も利用で
きる。リボゾーム結合配列としては、本発明のシュード
ノカルディア本来の配列や大腸菌由来または枯草菌由来
の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主
内で機能する配列であれば特に限定されるものではな
い。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域
に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列
をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転
写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性
のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐ
オペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領
域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上
流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ニトリ
ルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子、
転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボ
ゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示して
いる。プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来
のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラク
トースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ
由来のＰLプロモーター及びＰRプロモーターや、枯草菌
由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・ア
ルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロ
テアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロ
モーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロ
モーターのように独自に改変・設計された配列も利用で
きる。リボゾーム結合配列としては、本発明のシュード
ノカルディア本来の配列や大腸菌由来または枯草菌由来
の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主
内で機能する配列であれば特に限定されるものではな
い。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域
に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列
をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転
写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性
のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐ
オペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領
域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上
流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ニトリ
ルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子、
転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【００２０】プラスミドベクターの具体例としては、大
腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ
（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中
での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐ
ＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等を挙げ
ることができる。また、２種類以上の宿主内での自律複
製が可能なプラスミドベクターの例として、ｐＨＶ１
４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７を挙げることがで
きる。
腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２
２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ
（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中
での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐ
ＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等を挙げ
ることができる。また、２種類以上の宿主内での自律複
製が可能なプラスミドベクターの例として、ｐＨＶ１
４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７を挙げることがで
きる。
【００２１】本発明においては、ニトリルヒドラターゼ
活性化タンパク質をコードする遺伝子とニトリルヒドラ
ターゼ遺伝子が同時に挿入された組換えプラスミドを構
築することが含まれる。すなわち、両遺伝子が両遺伝子
の発現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域を含
むプラスミドベクターに挿入された組換えプラスミドの
ことであり、該組換えプラスミドが任意の宿主に導入さ
れることにより、該酵素の産生および活性化が可能とな
る組換えプラスミドのことである。具体的には、前述と
同じ発現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域を
含むプラスミドベクターを選択すればよい。また、その
様な制御領域によりニトリルヒドラターゼ活性化タンパ
ク質をコードする遺伝子、ニトリルヒドラターゼのαサ
ブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々独立
のシストロンとして発現されていてもよいし、共通の制
御領域によりポリシストロンとして発現されていてもよ
い。
活性化タンパク質をコードする遺伝子とニトリルヒドラ
ターゼ遺伝子が同時に挿入された組換えプラスミドを構
築することが含まれる。すなわち、両遺伝子が両遺伝子
の発現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域を含
むプラスミドベクターに挿入された組換えプラスミドの
ことであり、該組換えプラスミドが任意の宿主に導入さ
れることにより、該酵素の産生および活性化が可能とな
る組換えプラスミドのことである。具体的には、前述と
同じ発現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域を
含むプラスミドベクターを選択すればよい。また、その
様な制御領域によりニトリルヒドラターゼ活性化タンパ
ク質をコードする遺伝子、ニトリルヒドラターゼのαサ
ブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々独立
のシストロンとして発現されていてもよいし、共通の制
御領域によりポリシストロンとして発現されていてもよ
い。
【００２２】本発明のニトリルヒドラターゼ遺伝子と
は、シュードノカルディア・サーモフィラ由来の該遺伝
子をその代表例として挙げることができる。より具体的
には、配列表の配列番号：２に記載の７１４番目から１
３３１番目までの塩基配列で表されるαサブユニットを
コードする遺伝子および配列表の配列番号：２に記載の
１６番目から７１７番目までの塩基配列で表されるβサ
ブユニットをコードする遺伝子が挙げられる。すなわ
ち、基本的にはαサブユニットが６１８個の塩基配列に
より構成され、βサブユニットが７０２個の塩基配列に
より構成されているニトリルヒドラターゼであるが、組
換えＤＮＡ技術の進歩により、該酵素のアミノ酸配列を
実質的に変えることなく比較的容易に翻訳の際の鋳型と
なるＤＮＡの塩基配列を他の塩基配列で置換したり、翻
訳の際の鋳型となるＤＮＡの塩基配列を置換、欠失、削
除もしくは挿入することにより、酵素の作用を実質的に
変えることなくその構成アミノ酸の１個または２個以上
を他のアミノ酸で置換、欠失、削除または挿入させるこ
ともできるようになった。かかる技術水準に鑑み、この
発明でいうシュードノカルディア・サーモフィラ由来の
ニトリルヒドラターゼ遺伝子とは、配列表の配列番号：
２に記載の７１４番目から１３３１番目までの塩基配列
で示されるαサブユニットと配列表の配列番号：２に記
載の１６番目から７１７番目までの塩基配列で示される
βサブユニットをそのまま具備するものは言うにおよば
ず、そのＤＮＡ塩基配列の１個または２個以上の塩基が
他の塩基に置換、欠失、削除もしくは挿入された部分変
異配列であっても、それがニトリルヒドラターゼ活性を
有するタンパク質の鋳型として機能できる限りは本発明
のシュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリル
ヒドラターゼ遺伝子に包含されるものとする。
は、シュードノカルディア・サーモフィラ由来の該遺伝
子をその代表例として挙げることができる。より具体的
には、配列表の配列番号：２に記載の７１４番目から１
３３１番目までの塩基配列で表されるαサブユニットを
コードする遺伝子および配列表の配列番号：２に記載の
１６番目から７１７番目までの塩基配列で表されるβサ
ブユニットをコードする遺伝子が挙げられる。すなわ
ち、基本的にはαサブユニットが６１８個の塩基配列に
より構成され、βサブユニットが７０２個の塩基配列に
より構成されているニトリルヒドラターゼであるが、組
換えＤＮＡ技術の進歩により、該酵素のアミノ酸配列を
実質的に変えることなく比較的容易に翻訳の際の鋳型と
なるＤＮＡの塩基配列を他の塩基配列で置換したり、翻
訳の際の鋳型となるＤＮＡの塩基配列を置換、欠失、削
除もしくは挿入することにより、酵素の作用を実質的に
変えることなくその構成アミノ酸の１個または２個以上
を他のアミノ酸で置換、欠失、削除または挿入させるこ
ともできるようになった。かかる技術水準に鑑み、この
発明でいうシュードノカルディア・サーモフィラ由来の
ニトリルヒドラターゼ遺伝子とは、配列表の配列番号：
２に記載の７１４番目から１３３１番目までの塩基配列
で示されるαサブユニットと配列表の配列番号：２に記
載の１６番目から７１７番目までの塩基配列で示される
βサブユニットをそのまま具備するものは言うにおよば
ず、そのＤＮＡ塩基配列の１個または２個以上の塩基が
他の塩基に置換、欠失、削除もしくは挿入された部分変
異配列であっても、それがニトリルヒドラターゼ活性を
有するタンパク質の鋳型として機能できる限りは本発明
のシュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリル
ヒドラターゼ遺伝子に包含されるものとする。
【００２３】具体的には、特開平９−２７５９７８に示
されたように、配列表の配列番号：２に記載の塩基配列
の７２９番目から７３１番目、７６８番目から７７０番
目、８２５番目から８２７番目、９４２番目から９４４
番目、９８１番目から９８３番目、１０１７番目から１
０１９番目、１０２９番目から１０３１番目、１０８９
番目から１０９１番目、１１０１番目から１１０３番
目、１１３７番目から１１３９番目、１１４９番目から
１１５１番目、１２７２番目から１２７４番目、１２９
３番目から１２９５番目、１３２０番目から１３２２番
目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換し
て得られる塩基配列で表されるαサブユニット遺伝子を
構成要素として有しているニトリルヒドラターゼ遺伝子
を挙げることができる。
されたように、配列表の配列番号：２に記載の塩基配列
の７２９番目から７３１番目、７６８番目から７７０番
目、８２５番目から８２７番目、９４２番目から９４４
番目、９８１番目から９８３番目、１０１７番目から１
０１９番目、１０２９番目から１０３１番目、１０８９
番目から１０９１番目、１１０１番目から１１０３番
目、１１３７番目から１１３９番目、１１４９番目から
１１５１番目、１２７２番目から１２７４番目、１２９
３番目から１２９５番目、１３２０番目から１３２２番
目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換し
て得られる塩基配列で表されるαサブユニット遺伝子を
構成要素として有しているニトリルヒドラターゼ遺伝子
を挙げることができる。
【００２４】すなわち、本発明においては、αサブユニ
ットのアミノ酸配列の６番目、１９番目、３８番目、７
７番目、９０番目、１０２番目、１０６番目、１２６番
目、１３０番目、１４２番目、１４６番目、１８７番
目、１９４番目及び２０３番目のアミノ酸の何れか一つ
以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られるαサ
ブユニットを構成要素として有しているニトリヒドラタ
ーゼをコードする遺伝子が含まれる。
ットのアミノ酸配列の６番目、１９番目、３８番目、７
７番目、９０番目、１０２番目、１０６番目、１２６番
目、１３０番目、１４２番目、１４６番目、１８７番
目、１９４番目及び２０３番目のアミノ酸の何れか一つ
以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られるαサ
ブユニットを構成要素として有しているニトリヒドラタ
ーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【００２５】同様に、配列表の配列番号：２に記載の塩
基配列の７３番目から７５番目、７６番目から７８番
目、３３７番目から３３９番目、６１３番目から６１５
番目、６４９番目から６５１番目の何れか一つ以上の塩
基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列で表
されるβサブユニット遺伝子を構成要素として有してい
るニトリルヒドラターゼ遺伝子を挙げることができる。
基配列の７３番目から７５番目、７６番目から７８番
目、３３７番目から３３９番目、６１３番目から６１５
番目、６４９番目から６５１番目の何れか一つ以上の塩
基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列で表
されるβサブユニット遺伝子を構成要素として有してい
るニトリルヒドラターゼ遺伝子を挙げることができる。
【００２６】すなわち、本発明においては、βサブユニ
ットのアミノ酸配列の２０番目、２１番目、１０８番
目、２００番目、２１２番目のアミノ酸の何れか一つ以
上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られるβサブ
ユニットを構成要素として有しているニトリルヒドラタ
ーゼをコードする遺伝子が含まれる。
ットのアミノ酸配列の２０番目、２１番目、１０８番
目、２００番目、２１２番目のアミノ酸の何れか一つ以
上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換して得られるβサブ
ユニットを構成要素として有しているニトリルヒドラタ
ーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【００２７】また、本発明におけるニトリルヒドラター
ゼ遺伝子は、前述のシュードノカルディア・サーモフィ
ラ由来の該遺伝子に特に限定されるものではなく、本発
明のニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質により活性
化される場合には、他の微生物株由来のニトリルヒドラ
ターゼ遺伝子も含まれる。そのような微生物株として
は、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(C
orynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性の
バチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロ
コッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)
種に代表されるロドコッッカス(Rhodococcus)属、アシ
ネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xa
nthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)
属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiel
la)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィ
ニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロ
バクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromob
acter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属およ
びサーモフィラ(thermophila)種ＪＣＭ３０９５株以外
のシュードノカルディア(Pseudonocardia)属を好適な例
として挙げることができる。
ゼ遺伝子は、前述のシュードノカルディア・サーモフィ
ラ由来の該遺伝子に特に限定されるものではなく、本発
明のニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質により活性
化される場合には、他の微生物株由来のニトリルヒドラ
ターゼ遺伝子も含まれる。そのような微生物株として
は、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(C
orynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性の
バチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロ
コッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)
種に代表されるロドコッッカス(Rhodococcus)属、アシ
ネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xa
nthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)
属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiel
la)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィ
ニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロ
バクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromob
acter)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属およ
びサーモフィラ(thermophila)種ＪＣＭ３０９５株以外
のシュードノカルディア(Pseudonocardia)属を好適な例
として挙げることができる。
【００２８】本発明においては、前述の組換えプラスミ
ドを任意の微生物宿主に導入して形質転換体を得ること
が含まれる。この際には、ニトリルヒドラターゼ活性化
タンパク質をコードする遺伝子、ニトリルヒドラターゼ
のαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子を同
一のプラスミドベクター上に存在させた組換えプラスミ
ドを使用してもよいし、各遺伝子を独立のプラスミドベ
クター上に存在させた複数の組換えプラスミドを同時に
導入してもよい。また、ここでいう任意の宿主には、後
述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例
として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのもの
ではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属
菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その
様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１
９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微
生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づ
いて寄託されている。）が挙げられる。
ドを任意の微生物宿主に導入して形質転換体を得ること
が含まれる。この際には、ニトリルヒドラターゼ活性化
タンパク質をコードする遺伝子、ニトリルヒドラターゼ
のαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子を同
一のプラスミドベクター上に存在させた組換えプラスミ
ドを使用してもよいし、各遺伝子を独立のプラスミドベ
クター上に存在させた複数の組換えプラスミドを同時に
導入してもよい。また、ここでいう任意の宿主には、後
述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例
として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのもの
ではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属
菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その
様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１
９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微
生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づ
いて寄託されている。）が挙げられる。
【００２９】尚、外来遺伝子の発現に必要な領域を有す
るプラスミドベクターに本発明のニトリルヒドラターゼ
活性化タンパク質コードする遺伝子、および／または、
シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子を挿入して本発明の組換えプラスミド
を構築する方法、該組換えプラスミドを所望の宿主に形
質転換する際には、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されて
いる遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を参
考にすればよい。
るプラスミドベクターに本発明のニトリルヒドラターゼ
活性化タンパク質コードする遺伝子、および／または、
シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子を挿入して本発明の組換えプラスミド
を構築する方法、該組換えプラスミドを所望の宿主に形
質転換する際には、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）等に記載されて
いる遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を参
考にすればよい。
【００３０】本発明においては、ニトリルヒドラターゼ
活性化タンパク質をコードする遺伝子とニトリルヒドラ
ターゼ遺伝子を同時に任意の宿主に導入し、得られた形
質転換体を一般的な栄養培地で培養して該酵素を産生さ
せ、該酵素を産生している該形質転換株、該形質転換株
の培養液、該形質転換株の培養液より得られる形質転換
菌体、該形質転換菌体の菌体処理物を調製し、水性媒体
中にてそれらとニトリル化合物を接触させて対応するア
ミド化合物を製造することが含まれている。該形質転換
株の調製に際しては、分子生物学・生物工学・遺伝子工
学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製す
ればよい。たとえば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体
培地（より好ましくはそのような培地成分にＦｅイオン
及びＣｏイオンを０．１μｇ／ｍｌ以上存在させるとよ
い）に該形質転換株を植菌した後、適当な培養温度（一
般的には、２０℃〜５０℃）で生育させればよい。ま
た、該培養液そのものや、該培養液より遠心分離によっ
て分離・回収して得られる形質転換菌体、該形質転換菌
体の菌体処理物を利用することもできる。ここでいう菌
体処理物とは、該形質転換菌体の抽出物や磨砕物、該抽
出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離・
精製して得られれる後分離物、該形質転換菌体や該形質
転換菌体の抽出物・磨砕物・後分離物を適当な担体を用
いて固定化した固定化物のことを示している。また、ニ
トリル化合物から対応するアミド化合物を製造する場合
のニトリル化合物としては、本発明のニトリルヒドラタ
ーゼが基質として作用できる化合物であれば特に限定さ
れないが、好ましくはアセトニトリル、プロピオニトリ
ル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチ
ロニトリル、イソブチロニトリル、クロトノニトリル、
α−ヒドロキシイソブチロニトリル、エチレンシアンヒ
ドリン、フマロニトリル、マロノニトリル、ベンゾニト
リル、マンデロニトリル、シアノピラジン、３−シアノ
ピリジン等のニトリル化合物がその代表例として挙げら
れる。該ニトリル化合物の水性媒体中での濃度は、特に
限定されるものではなく、また、反応温度も特に限定さ
れないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活し
ない温度範囲内であり、より好ましくは０℃〜５０℃で
ある。
活性化タンパク質をコードする遺伝子とニトリルヒドラ
ターゼ遺伝子を同時に任意の宿主に導入し、得られた形
質転換体を一般的な栄養培地で培養して該酵素を産生さ
せ、該酵素を産生している該形質転換株、該形質転換株
の培養液、該形質転換株の培養液より得られる形質転換
菌体、該形質転換菌体の菌体処理物を調製し、水性媒体
中にてそれらとニトリル化合物を接触させて対応するア
ミド化合物を製造することが含まれている。該形質転換
株の調製に際しては、分子生物学・生物工学・遺伝子工
学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製す
ればよい。たとえば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体
培地（より好ましくはそのような培地成分にＦｅイオン
及びＣｏイオンを０．１μｇ／ｍｌ以上存在させるとよ
い）に該形質転換株を植菌した後、適当な培養温度（一
般的には、２０℃〜５０℃）で生育させればよい。ま
た、該培養液そのものや、該培養液より遠心分離によっ
て分離・回収して得られる形質転換菌体、該形質転換菌
体の菌体処理物を利用することもできる。ここでいう菌
体処理物とは、該形質転換菌体の抽出物や磨砕物、該抽
出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離・
精製して得られれる後分離物、該形質転換菌体や該形質
転換菌体の抽出物・磨砕物・後分離物を適当な担体を用
いて固定化した固定化物のことを示している。また、ニ
トリル化合物から対応するアミド化合物を製造する場合
のニトリル化合物としては、本発明のニトリルヒドラタ
ーゼが基質として作用できる化合物であれば特に限定さ
れないが、好ましくはアセトニトリル、プロピオニトリ
ル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチ
ロニトリル、イソブチロニトリル、クロトノニトリル、
α−ヒドロキシイソブチロニトリル、エチレンシアンヒ
ドリン、フマロニトリル、マロノニトリル、ベンゾニト
リル、マンデロニトリル、シアノピラジン、３−シアノ
ピリジン等のニトリル化合物がその代表例として挙げら
れる。該ニトリル化合物の水性媒体中での濃度は、特に
限定されるものではなく、また、反応温度も特に限定さ
れないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活し
ない温度範囲内であり、より好ましくは０℃〜５０℃で
ある。
【００３１】
【実施例】以下の実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明は以下の実施例によって何等限定される
ものではない。尚、各実施例及び比較例におけるＨＰＬ
Ｃ分析は、カラムとして日本分光製のＦｉｎｅｐａｋ
ＳＩＬ Ｃ１８−５（２５０×４．６φｍｍ）を用い、
４体積％のアセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液
を展開液として使用した。また、アクリルアミド、アク
リロニトリル、アクリル酸は２１０ｎｍの吸光度により
検出した。
するが、本発明は以下の実施例によって何等限定される
ものではない。尚、各実施例及び比較例におけるＨＰＬ
Ｃ分析は、カラムとして日本分光製のＦｉｎｅｐａｋ
ＳＩＬ Ｃ１８−５（２５０×４．６φｍｍ）を用い、
４体積％のアセトニトリルを含む１０ｍＭリン酸水溶液
を展開液として使用した。また、アクリルアミド、アク
リロニトリル、アクリル酸は２１０ｎｍの吸光度により
検出した。
【００３２】［実施例１］ＭＴ−１０８２２株の挿入断
片の解析（１） ５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培
地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートク
レーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ
／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−
１０８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）を一白菌耳
植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて１６時間培養した。
遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを
培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該
菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を
得た。
片の解析（１） ５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培
地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートク
レーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ
／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−
１０８２２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５）を一白菌耳
植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて１６時間培養した。
遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを
培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該
菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を
得た。
【００３３】 培地組成 酵母エキストラクト ５．０ｇ／Ｌ ポリペプトン １０．０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ ５．０ｇ／Ｌ 塩化コバルト・六水和物 １０．０ｍｇ／Ｌ 硫酸第二鉄・七水和物 ４０．０ｍｇ／Ｌ ｐＨ７．５
【００３４】該湿菌体よりアルカリＳＤＳ抽出法により
ｐＰＴ−ＤＢ１［図−１（図１）］のプラスミドＤＮＡ
を調製し、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオー
トシークエンサー３７３Ａを用いてプライマーエクステ
ンション法により挿入断片の全塩基配列を決定した。そ
の結果、挿入断片中に７０５ｂｐ、６２１ｂｐおよび４
３５ｂｐの塩基配列からなるオープンリディングフレー
ム（各々ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３と呼ぶ）が５’
末端側よりこの順番で確認され、また、それぞれの転写
方向も完全に一致していた。翻訳停止コドンを含めたＯ
ＲＦ１の最も３’末端側の４塩基とＯＲＦ２の最も５’
末端側の４塩基は重複し、同様に翻訳停止コドンを含め
たＯＲＦ２の最も３’末端側の４塩基とＯＲＦ３の最も
５’末端側の４塩基は重複していた。尚、特開平９−２
７５９７８にて既に示されたように、ＯＲＦ１はニトリ
ルヒドラターゼのβサブユニット遺伝子であり、ＯＲＦ
２はαサブユニット遺伝子である。
ｐＰＴ−ＤＢ１［図−１（図１）］のプラスミドＤＮＡ
を調製し、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオー
トシークエンサー３７３Ａを用いてプライマーエクステ
ンション法により挿入断片の全塩基配列を決定した。そ
の結果、挿入断片中に７０５ｂｐ、６２１ｂｐおよび４
３５ｂｐの塩基配列からなるオープンリディングフレー
ム（各々ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３と呼ぶ）が５’
末端側よりこの順番で確認され、また、それぞれの転写
方向も完全に一致していた。翻訳停止コドンを含めたＯ
ＲＦ１の最も３’末端側の４塩基とＯＲＦ２の最も５’
末端側の４塩基は重複し、同様に翻訳停止コドンを含め
たＯＲＦ２の最も３’末端側の４塩基とＯＲＦ３の最も
５’末端側の４塩基は重複していた。尚、特開平９−２
７５９７８にて既に示されたように、ＯＲＦ１はニトリ
ルヒドラターゼのβサブユニット遺伝子であり、ＯＲＦ
２はαサブユニット遺伝子である。
【００３５】次に、ＯＲＦ１からＯＲＦ３までの全領域
を再クローニングするために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミ
ドＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施した。ｐＰＴ−ＤＢ
１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として、配列表の配
列番号３記載のプライマー及び配列表の配列番号４記載
プライマーを各々１００ｐｍｏｌとＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを５Ｕを含む全量１００μｌの系で、熱変性（９
８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反
応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこ
とにより行った。ＰＣＲ反応の反応終了液液１０μｌを
用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低
融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）に
よりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約１．８ｋ
ｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、ア
ガロースゲルから約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片のみを切
り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し
１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してア
ガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェ
ノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行った。
まず、ＴＥ（１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭ
のトリス塩酸水溶液；ｐＨ８．０）で飽和させたフェノ
ール液１ｍｌを加え緩やかにかくはんした。遠心分離
（３０００ｒｐｍ、１０分）により水相と有機相を分離
し、水相のみを分取した。この操作を３回繰り返した
後、得られた水相に上記のＴＥ飽和フェノール液０．４
ｍｌとクロロホルム０．４ｍｌを加えて再び緩やかにか
くはんした後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）に
より水相と有機相を再度分離し、水相のみを再分取し
た。この水相にクロロホルム０．８ｍｌを加えて再び緩
やかにかくはんした後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１
０分）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを分
取した。この水相に１．１ＭのＮａＣｌを含むＴＥ溶液
８０μｌとエタノール１．７ｍｌを加えて−８０℃で３
０分間放置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０
ｍｉｎ、４℃）によりＤＮＡ断片の沈殿を回収した。該
ＤＮＡ断片を風乾後、最終的に１０μｌのＴＥに溶解し
た。精製した約１．８ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩにより切断した後、この制限
酵素処理液に対して上記と同様のフェノール／クロロホ
ルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を再度
精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。同様に、
ｐｕｃ１８ベクター上の唯一の制限酵素サイトであるＥ
ｃｏＲＩおよびＳｐｈＩにより同ベクターを切断し、ア
ガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点
アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、ア
ガロースゲルから約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切
り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細
かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間
保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に
対して上述と同様のフェノール／クロロホルム抽出とエ
タノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に
１０μｌのＴＥに溶解した。この様にして得られた増幅
ＤＮＡ産物とｐｕｃ１８断片をＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドｐＰ
Ｔ−Ｄ１［図−２（図２）］を構築した。また、構築さ
れたｐＰＴ−Ｄ１のＥｃｏＲＩ部位からＳｐｈＩ部位間
の挿入断片の全塩基配列を配列表の配列番号２に記載し
た。
を再クローニングするために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミ
ドＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施した。ｐＰＴ−ＤＢ
１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として、配列表の配
列番号３記載のプライマー及び配列表の配列番号４記載
プライマーを各々１００ｐｍｏｌとＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを５Ｕを含む全量１００μｌの系で、熱変性（９
８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反
応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこ
とにより行った。ＰＣＲ反応の反応終了液液１０μｌを
用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低
融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）に
よりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約１．８ｋ
ｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、ア
ガロースゲルから約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片のみを切
り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し
１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してア
ガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェ
ノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行った。
まず、ＴＥ（１ｍＭのＥＤＴＡ・２Ｎａを含む１０ｍＭ
のトリス塩酸水溶液；ｐＨ８．０）で飽和させたフェノ
ール液１ｍｌを加え緩やかにかくはんした。遠心分離
（３０００ｒｐｍ、１０分）により水相と有機相を分離
し、水相のみを分取した。この操作を３回繰り返した
後、得られた水相に上記のＴＥ飽和フェノール液０．４
ｍｌとクロロホルム０．４ｍｌを加えて再び緩やかにか
くはんした後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）に
より水相と有機相を再度分離し、水相のみを再分取し
た。この水相にクロロホルム０．８ｍｌを加えて再び緩
やかにかくはんした後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１
０分）により水相と有機相を再度分離し、水相のみを分
取した。この水相に１．１ＭのＮａＣｌを含むＴＥ溶液
８０μｌとエタノール１．７ｍｌを加えて−８０℃で３
０分間放置した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２０
ｍｉｎ、４℃）によりＤＮＡ断片の沈殿を回収した。該
ＤＮＡ断片を風乾後、最終的に１０μｌのＴＥに溶解し
た。精製した約１．８ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵
素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩにより切断した後、この制限
酵素処理液に対して上記と同様のフェノール／クロロホ
ルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を再度
精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。同様に、
ｐｕｃ１８ベクター上の唯一の制限酵素サイトであるＥ
ｃｏＲＩおよびＳｐｈＩにより同ベクターを切断し、ア
ガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点
アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、ア
ガロースゲルから約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切
り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細
かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間
保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に
対して上述と同様のフェノール／クロロホルム抽出とエ
タノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に
１０μｌのＴＥに溶解した。この様にして得られた増幅
ＤＮＡ産物とｐｕｃ１８断片をＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドｐＰ
Ｔ−Ｄ１［図−２（図２）］を構築した。また、構築さ
れたｐＰＴ−Ｄ１のＥｃｏＲＩ部位からＳｐｈＩ部位間
の挿入断片の全塩基配列を配列表の配列番号２に記載し
た。
【００３６】東洋紡績社製の大腸菌ＨＢ１０１のコンピ
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｄ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．１を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに上述と同じ組成のＬＢ液体培地を
調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅
菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるよ
うにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換菌株
Ｎｏ．１を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて
約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）
により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌ
の生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離
を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２００ｍ
ｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）に
懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍｌ添加
し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間反応を
行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析に
より反応液の分析を行ったところ、反応液中にはアクリ
ルアミドのみが存在しており、アクリロニトリル及びア
クリル酸は認められなかった。すなわち、転化率及び選
択率は１００％であった。
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｄ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．１を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに上述と同じ組成のＬＢ液体培地を
調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅
菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるよ
うにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換菌株
Ｎｏ．１を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて
約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）
により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌ
の生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離
を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２００ｍ
ｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）に
懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍｌ添加
し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間反応を
行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析に
より反応液の分析を行ったところ、反応液中にはアクリ
ルアミドのみが存在しており、アクリロニトリル及びア
クリル酸は認められなかった。すなわち、転化率及び選
択率は１００％であった。
【００３７】［比較例１］ＭＴ−１０８２２株の挿入断
片の解析（２） ＯＲＦ１からＯＲＦ３の途中までの領域を再クローニン
グするために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲを実施した。実施例１で調整したｐＰＴ−
ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として、配列表
の配列番号３記載のプライマー及び配列表の配列番号５
記載プライマーを各々１００ｐｍｏｌとＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼを５Ｕを含む全量１００μｌの系で、熱変性
（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸
長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返
すことにより行った。ＰＣＲ反応の反応終了液液１０μ
ｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩ
Ｉ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．９重量
％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約
１．６ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続
いて、アガロースゲルから約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片
のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細か
く粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保
温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対
して実施例１と同様のフェノール／クロロホルム抽出と
エタノール沈澱を行い、増幅ＤＮＡ断片を精製した。精
製した約１．６ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＳｐｈＩにより切断した後、この制限酵素処
理液に対して実施例１と同様のフェノール／クロロホル
ム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を再度精
製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。この様にし
て得られた増幅ＤＮＡ産物と実施例１で調整した約２．
７ｋｂｐのｐｕｃ１８のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片をＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結
させてプラスミドｐＰＴ−Ｅ１［図−３（図３）］を構
築した。
片の解析（２） ＯＲＦ１からＯＲＦ３の途中までの領域を再クローニン
グするために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲを実施した。実施例１で調整したｐＰＴ−
ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として、配列表
の配列番号３記載のプライマー及び配列表の配列番号５
記載プライマーを各々１００ｐｍｏｌとＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼを５Ｕを含む全量１００μｌの系で、熱変性
（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸
長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返
すことにより行った。ＰＣＲ反応の反応終了液液１０μ
ｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩ
Ｉ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．９重量
％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約
１．６ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続
いて、アガロースゲルから約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片
のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細か
く粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保
温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対
して実施例１と同様のフェノール／クロロホルム抽出と
エタノール沈澱を行い、増幅ＤＮＡ断片を精製した。精
製した約１．６ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＳｐｈＩにより切断した後、この制限酵素処
理液に対して実施例１と同様のフェノール／クロロホル
ム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を再度精
製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。この様にし
て得られた増幅ＤＮＡ産物と実施例１で調整した約２．
７ｋｂｐのｐｕｃ１８のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片をＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結
させてプラスミドｐＰＴ−Ｅ１［図−３（図３）］を構
築した。
【００３８】東洋紡績社製の大腸菌ＨＢ１０１のコンピ
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｅ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．２を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに実施例１と同じ組成のＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換
菌株Ｎｏ．２を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍ
にて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５
分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０
ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心
分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２０
０ｍｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍ
ｌ添加し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間
反応を行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ
分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中には
アクリルアミドは認められず、未反応アクリロニトリル
のみが認められた。また、アクリル酸も認められなかっ
た。すなわち、転化率及び選択率は０％であった。一
方、培養液より分離された菌体内には、シュードノカル
ディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのα
およびβサブユニットに相当するポリペプチド鎖の存在
が確認された。
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｅ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．２を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに実施例１と同じ組成のＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換
菌株Ｎｏ．２を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍ
にて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５
分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０
ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心
分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２０
０ｍｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍ
ｌ添加し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間
反応を行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ
分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中には
アクリルアミドは認められず、未反応アクリロニトリル
のみが認められた。また、アクリル酸も認められなかっ
た。すなわち、転化率及び選択率は０％であった。一
方、培養液より分離された菌体内には、シュードノカル
ディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのα
およびβサブユニットに相当するポリペプチド鎖の存在
が確認された。
【００３９】［比較例２］ＭＴ−１０８２２株の挿入断
片の解析（３） ＯＲＦ１からＯＲＦ２までの全領域を再クローニングす
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
てＰＣＲを実施した。実施例１で調整したｐＰＴ−ＤＢ
１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として、配列表の配
列番号３記載のプライマー及び配列表の配列番号６記載
プライマーを各々１００ｐｍｏｌとＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを５Ｕを含む全量１００μｌの系で、熱変性（９
８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反
応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこ
とにより行った。ＰＣＲ反応の反応終了液液１０μｌを
用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低
融点アガロース使用；アガロース濃度０．９重量％）に
よりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約１．３ｋ
ｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、ア
ガロースゲルから約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片のみを切
り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し
１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してア
ガロースを完全に融解させた。この融解液に対して実施
例１と同様のフェノール／クロロホルム抽出とエタノー
ル沈澱を行い、増幅ＤＮＡ断片を精製した。精製した約
１．３ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＳｐｈＩにより切断した後、この制限酵素処理液に対
して実施例１と同様のフェノール／クロロホルム抽出と
エタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を再度精製し、最
終的に１０μｌのＴＥに溶解した。この様にして得られ
た増幅ＤＮＡ産物と実施例１で調整した約２．７ｋｂｐ
のｐｕｃ１８のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片をＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプ
ラスミドｐＰＴ−Ｆ１［図−４（図４）］を構築した。
片の解析（３） ＯＲＦ１からＯＲＦ２までの全領域を再クローニングす
るために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型とし
てＰＣＲを実施した。実施例１で調整したｐＰＴ−ＤＢ
１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として、配列表の配
列番号３記載のプライマー及び配列表の配列番号６記載
プライマーを各々１００ｐｍｏｌとＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを５Ｕを含む全量１００μｌの系で、熱変性（９
８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反
応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すこ
とにより行った。ＰＣＲ反応の反応終了液液１０μｌを
用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低
融点アガロース使用；アガロース濃度０．９重量％）に
よりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約１．３ｋ
ｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、ア
ガロースゲルから約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片のみを切
り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し
１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してア
ガロースを完全に融解させた。この融解液に対して実施
例１と同様のフェノール／クロロホルム抽出とエタノー
ル沈澱を行い、増幅ＤＮＡ断片を精製した。精製した約
１．３ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＳｐｈＩにより切断した後、この制限酵素処理液に対
して実施例１と同様のフェノール／クロロホルム抽出と
エタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を再度精製し、最
終的に１０μｌのＴＥに溶解した。この様にして得られ
た増幅ＤＮＡ産物と実施例１で調整した約２．７ｋｂｐ
のｐｕｃ１８のＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片をＤＮＡライ
ゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプ
ラスミドｐＰＴ−Ｆ１［図−４（図４）］を構築した。
【００４０】東洋紡績社製の大腸菌ＨＢ１０１のコンピ
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｆ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．３を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに実施例１と同じ組成のＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換
菌株Ｎｏ．３を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍ
にて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５
分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０
ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心
分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２０
０ｍｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍ
ｌ添加し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間
反応を行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ
分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中には
アクリルアミドは認められず、未反応アクリロニトリル
のみが認められた。また、アクリル酸も認められなかっ
た。すなわち、転化率及び選択率は０％であった。一
方、培養液より分離された菌体内には、シュードノカル
ディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのα
およびβサブユニットに相当するポリペプチド鎖の存在
が確認された。
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｆ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．３を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに実施例１と同じ組成のＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換
菌株Ｎｏ．３を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍ
にて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５
分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０
ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心
分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２０
０ｍｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍ
ｌ添加し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間
反応を行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ
分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中には
アクリルアミドは認められず、未反応アクリロニトリル
のみが認められた。また、アクリル酸も認められなかっ
た。すなわち、転化率及び選択率は０％であった。一
方、培養液より分離された菌体内には、シュードノカル
ディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのα
およびβサブユニットに相当するポリペプチド鎖の存在
が確認された。
【００４１】［比較例３］ＭＴ−１０８２２株の挿入断
片の解析（４） ＯＲＦ３の全領域を再クローニングするために、ｐＰＴ
−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し
た。実施例１で調整したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤ
ＮＡ１μｇを鋳型として、配列表の配列番号７記載のプ
ライマー及び配列表の配列番号４記載プライマーを各々
１００ｐｍｏｌとＴａｑＤＮＡポリメラーゼを５Ｕを含
む全量１００μｌの系で、熱変性（９８℃）１５秒、ア
ニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２
０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。
ＰＣＲ反応の反応終了液液１０μｌを用いたアガロース
電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使
用；アガロース濃度１．２重量％）によりＤＮＡ増幅産
物の分析を行ったところ、約４５０ｂｐの増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。続いて、アガロースゲルから約
４５０ｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース
片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸
濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解
させた。この融解液に対して実施例１と同様のフェノー
ル／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行い、増幅Ｄ
ＮＡ断片を精製した。精製した約４５０ｂｐの増幅ＤＮ
Ａ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩにより切断し
た後、この制限酵素処理液に対して実施例１と同様のフ
ェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って
該ＤＮＡ断片を再度精製し、最終的に１０μｌのＴＥに
溶解した。この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物と実施
例１で調整した約２．７ｋｂｐのｐｕｃ１８のＥｃｏＲ
Ｉ−ＳｐｈＩ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて連結させてプラスミドｐＰＴ−Ｇ１
［図−５（図５）］を構築した。
片の解析（４） ＯＲＦ３の全領域を再クローニングするために、ｐＰＴ
−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し
た。実施例１で調整したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤ
ＮＡ１μｇを鋳型として、配列表の配列番号７記載のプ
ライマー及び配列表の配列番号４記載プライマーを各々
１００ｐｍｏｌとＴａｑＤＮＡポリメラーゼを５Ｕを含
む全量１００μｌの系で、熱変性（９８℃）１５秒、ア
ニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２
０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。
ＰＣＲ反応の反応終了液液１０μｌを用いたアガロース
電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使
用；アガロース濃度１．２重量％）によりＤＮＡ増幅産
物の分析を行ったところ、約４５０ｂｐの増幅ＤＮＡ産
物の存在が確認できた。続いて、アガロースゲルから約
４５０ｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース
片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸
濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解
させた。この融解液に対して実施例１と同様のフェノー
ル／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行い、増幅Ｄ
ＮＡ断片を精製した。精製した約４５０ｂｐの増幅ＤＮ
Ａ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩにより切断し
た後、この制限酵素処理液に対して実施例１と同様のフ
ェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って
該ＤＮＡ断片を再度精製し、最終的に１０μｌのＴＥに
溶解した。この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物と実施
例１で調整した約２．７ｋｂｐのｐｕｃ１８のＥｃｏＲ
Ｉ−ＳｐｈＩ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒
造社製）を用いて連結させてプラスミドｐＰＴ−Ｇ１
［図−５（図５）］を構築した。
【００４２】東洋紡績社製の大腸菌ＨＢ１０１のコンピ
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｇ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．４を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに実施例１と同じ組成のＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換
菌株Ｎｏ．４を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍ
にて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５
分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０
ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心
分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２０
０ｍｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍ
ｌ添加し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間
反応を行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ
分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中には
アクリルアミドは認められず、未反応アクリロニトリル
のみが認められた。また、アクリル酸も認められなかっ
た。すなわち、転化率及び選択率は０％であった。
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｇ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．４を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに実施例１と同じ組成のＬＢ液体培
地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブによ
り滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとな
るようにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換
菌株Ｎｏ．４を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍ
にて約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５
分）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０
ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心
分離を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２０
０ｍｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．
０）に懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍ
ｌ添加し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間
反応を行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ
分析により反応液の分析を行ったところ、反応液中には
アクリルアミドは認められず、未反応アクリロニトリル
のみが認められた。また、アクリル酸も認められなかっ
た。すなわち、転化率及び選択率は０％であった。
【００４３】［実施例２］ＭＴ−１０８２２株の挿入断
片の解析（５） ｐＰＴ−Ｇ１プラスミドのＯＲＦ３領域の３’末端側
に、比較例１で作製したｐＰＴ−Ｆ１のｌａｃＺプロモ
ーター、βサブユニットのＯＲＦ２、αサブユニットの
ＯＲＦ１を含む領域をクローニングした。比較例１で調
整したｐＰＴ−Ｆ１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型と
して、配列表の配列番号８記載のプライマー及び配列表
の配列番号９記載プライマーを各々１００ｐｍｏｌとＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼを５Ｕを含む全量１００μｌの
系で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５
℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５
サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応の反応
終了液液１０μｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ
社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃
度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行った
ところ、約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認
できた。続いて、アガロースゲルから約２．０ｋｂｐの
ＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１
ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃
で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この
融解液に対して実施例１と同様のフェノール／クロロホ
ルム抽出とエタノール沈澱を行い、増幅ＤＮＡ断片を精
製した。精製した約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制
限酵素ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断した後、
この制限酵素処理液に対して実施例１と同様のフェノー
ル／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮ
Ａ断片を再度精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解し
た。同様に、ｐＰＴ−Ｇ１プラスミド上の唯一の制限酵
素サイトであるＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより同プ
ラスミドを切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社
製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度
０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．１ｋｂｐ
のＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース
片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸
濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解
させた。この融解液に対して実施例１と同様のフェノー
ル／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮ
Ａ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物とｐＰＴ−Ｇ１の
ＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドｐ
ＰＴ−Ｈ１［図−６（図６）］を構築した。
片の解析（５） ｐＰＴ−Ｇ１プラスミドのＯＲＦ３領域の３’末端側
に、比較例１で作製したｐＰＴ−Ｆ１のｌａｃＺプロモ
ーター、βサブユニットのＯＲＦ２、αサブユニットの
ＯＲＦ１を含む領域をクローニングした。比較例１で調
整したｐＰＴ−Ｆ１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型と
して、配列表の配列番号８記載のプライマー及び配列表
の配列番号９記載プライマーを各々１００ｐｍｏｌとＴ
ａｑＤＮＡポリメラーゼを５Ｕを含む全量１００μｌの
系で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５
℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５
サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応の反応
終了液液１０μｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ
社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃
度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行った
ところ、約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認
できた。続いて、アガロースゲルから約２．０ｋｂｐの
ＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１
ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃
で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この
融解液に対して実施例１と同様のフェノール／クロロホ
ルム抽出とエタノール沈澱を行い、増幅ＤＮＡ断片を精
製した。精製した約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制
限酵素ＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断した後、
この制限酵素処理液に対して実施例１と同様のフェノー
ル／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮ
Ａ断片を再度精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解し
た。同様に、ｐＰＴ−Ｇ１プラスミド上の唯一の制限酵
素サイトであるＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより同プ
ラスミドを切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社
製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度
０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．１ｋｂｐ
のＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース
片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸
濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解
させた。この融解液に対して実施例１と同様のフェノー
ル／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮ
Ａ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物とｐＰＴ−Ｇ１の
ＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドｐ
ＰＴ−Ｈ１［図−６（図６）］を構築した。
【００４４】東洋紡績社製の大腸菌ＨＢ１０１のコンピ
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｈ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．５を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに上述と同じ組成のＬＢ液体培地を
調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅
菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるよ
うにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換菌株
Ｎｏ．５を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて
約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）
により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌ
の生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離
を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２００ｍ
ｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）に
懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍｌ添加
し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間反応を
行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析に
より反応液の分析を行ったところ、反応液中にはアクリ
ルアミドのみが存在しており、アクリロニトリル及びア
クリル酸は認められなかった。すなわち、転化率及び選
択率は１００％であった。
テントセルを用いてｐＰＴ−Ｈ１をＨＢ１０１株に導入
し、形質転換菌株Ｎｏ．５を得た。５００ｍｌのバッフ
ル付き三角フラスコに上述と同じ組成のＬＢ液体培地を
調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅
菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるよ
うにアンピシリンを添加した後、得られた形質転換菌株
Ｎｏ．５を一白菌耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて
約２０時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分）
により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌ
の生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離
を行って湿菌体を得た。該湿菌体１００ｍｇを２００ｍ
ｌの５０ｍＭのリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）に
懸濁し、この懸濁液にアクリロニトリルを１０ｍｌ添加
し、１０℃にて緩やかにかくはんしながら１時間反応を
行った。反応終了後、実施例１と同様のＨＰＬＣ分析に
より反応液の分析を行ったところ、反応液中にはアクリ
ルアミドのみが存在しており、アクリロニトリル及びア
クリル酸は認められなかった。すなわち、転化率及び選
択率は１００％であった。
【００４５】
【発明の効果】本発明により、シュードノカルディア・
サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関
与するニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質およびそ
れをコードする遺伝子配列が提供される。さらに、本発
明により、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該遺伝子
およびニトリルヒドラターゼ遺伝子を含有する組換えプ
ラスミド、該組換えプラスミドにより形質転換された形
質転換株、及び、該形質転換株を培養して得られる培養
液・菌体・菌体処理物を用いて、ニトリル化合物から対
応するアミド化合物を製造する方法が提供される。ま
た、本発明によれば、シュードノカルディア・サーモフ
ィラ由来のニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化合
物よりアミド化合物を工業的に製造する際に、遺伝子工
学的な手法で該酵素を大量に発現させることが可能とな
り、これよりアミド化合物の製造コストに占める該酵素
の製造コストの削減が達成される。
サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関
与するニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質およびそ
れをコードする遺伝子配列が提供される。さらに、本発
明により、該遺伝子を含む組換えプラスミド、該遺伝子
およびニトリルヒドラターゼ遺伝子を含有する組換えプ
ラスミド、該組換えプラスミドにより形質転換された形
質転換株、及び、該形質転換株を培養して得られる培養
液・菌体・菌体処理物を用いて、ニトリル化合物から対
応するアミド化合物を製造する方法が提供される。ま
た、本発明によれば、シュードノカルディア・サーモフ
ィラ由来のニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化合
物よりアミド化合物を工業的に製造する際に、遺伝子工
学的な手法で該酵素を大量に発現させることが可能とな
り、これよりアミド化合物の製造コストに占める該酵素
の製造コストの削減が達成される。
【００４６】
【配列表】
【００４７】配列番号：１ 配列の長さ：１４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌａ 株名：ＪＣＭ３０９５ 直接の起源 クローン名：ｐＰＴ−ＤＢ１ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：シュードノカルディア・サーモフィラ由来の
ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質の
アミノ酸配列を示す。 配列Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu 5 10 15 Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp 20 25 30 Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe 35 40 45 Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln 50 55 60 Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His 65 70 75 80 Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Val Ala Ala 85 90 95 Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu Pro Glu Ala Leu 100 105 110 Asp Glu Arg Thr Ala Glu Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His 115 120 125 His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser 130 135 140 144
ｐｈｉｌａ 株名：ＪＣＭ３０９５ 直接の起源 クローン名：ｐＰＴ−ＤＢ１ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：シュードノカルディア・サーモフィラ由来の
ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質の
アミノ酸配列を示す。 配列Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu 5 10 15 Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp 20 25 30 Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe 35 40 45 Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln 50 55 60 Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His 65 70 75 80 Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Val Ala Ala 85 90 95 Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu Pro Glu Ala Leu 100 105 110 Asp Glu Arg Thr Ala Glu Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His 115 120 125 His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser 130 135 140 144
【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：１７６２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌａ 株名：ＪＣＭ３０９５ 直接の起源 クローン名：ｐＰＴ−ＤＢ１ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：１６番目から７１７番目はβサブユニット遺
伝子の領域 ７１４番目から１３３１番目はαサブユニット遺伝子の
領域 １３２８番目から１７６２番目はシュードノカルディア
・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に
関与するタンパク質をコードする遺伝子の領域 配列 TGAGAGGAGC TCCGCATGAA CGGCGTGTAC GACGTCGGCG GCACCGATGG GCTGGGCCCG 60 ATCAACCGGC CCGCGGACGA ACCGGTCTTC CGCGCCGAGT GGGAGAAGGT CGCGTTCGCG 120 ATGTTCCCGG CGACGTTCCG GGCCGGCTTC ATGGGCCTGG ACGAGTTCCG GTTCGGCATC 180 GAGCAGATGA ACCCGGCCGA GTACCTCGAG TCGCCGTACT ACTGGCACTG GATCCGCACC 240 TACATCCACC ACGGCGTCCG CACCGGCAAG ATCGATCTCG AGGAGCTGGA GCGCCGCACG 300 CAGTACTACC GGGAGAACCC CGACGCCCCG CTGCCCGAGC ACGAGCAGAA GCCGGAGTTG 360 ATCGAGTTCG TCAACCAGGC CGTCTACGGC GGGCTGCCCG CAAGCCGGGA GGTCGACCGA 420 CCGCCCAAGT TCAAGGAGGG CGACGTGGTG CGGTTCTCCA CCGCGAGCCC GAAGGGCCAC 480 GCCCGGCGCG CGCGGTACGT GCGCGGCAAG ACCGGGACGG TGGTCAAGCA CCACGGCGCG 540 TACATCTACC CGGACACCGC CGGCAACGGC CTGGGCGAGT GCCCCGAGCA CCTCTACACC 600 GTCCGCTTCA CGGCCCAGGA GCTGTGGGGG CCGGAAGGGG ACCCGAACTC CAGCGTCTAC 660 TACGACTGCT GGGAGCCCTA CATCGAGCTC GTCGACACGA AGGCGGCCGC GGCATGACCG 720 AGAACATCCT GCGCAAGTCG GACGAGGAGA TCCAGAAGGA GATCACGGCG CGGGTCAAGG 780 CCCTGGAGTC GATGCTCATC GAACAGGGCA TCCTCACCAC GTCGATGATC GACCGGATGG 840 CCGAGATCTA CGAGAACGAG GTCGGCCCGC ACCTCGGCGC GAAGGTCGTC GTGAAGGCCT 900 GGACCGACCC GGAGTTCAAG AAGCGTCTGC TCGCCGACGG CACCGAGGCC TGCAAGGAGC 960 TCGGCATCGG CGGCCTGCAG GGCGAGGACA TGATGTGGGT GGAGAACACC GACGAGGTCC 1020 ACCACGTCGT CGTGTGCACG CTCTGCTCCT GCTACCCGTG GCCGGTGCTG GGGCTGCCGC 1080 CGAACTGGTT CAAGGAGCCG CAGTACCGCT CCCGCGTGGT GCGTGAGCCC CGGCAGCTGC 1140 TCAAGGAGGA GTTCGGCTTC GAGGTCCCGC CGAGCAAGGA GATCAAGGTC TGGGACTCCA 1200 GCTCCGAGAT GCGCTTCGTC GTCCTCCCGC AGCGCCCCGC GGGCACCGAC GGGTGGAGCG 1260 AGGAGGAGCT CGCCACCCTC GTCACCCGCG AGTCGATGAT CGGCGTCGAA CCGGCGAAGG 1320 CGGTCGCGTG AGCGCCGAGG CGAAGGTCCG CCTGAAGCAC TGCCCCACGG CCGAGGACCG 1380 GGCGGCGGCC GACGCGCTGC TCGCGCAGCT GCCCGGCGGC GACCGCGCGC TCGACCGCGG 1440 CTTCGACGAG CCGTGGCAGC TGCGGGCGTT CGCGCTGGCG GTCGCGGCGT GCAGGGCGGG 1500 CCGGTTCGAG TGGAAGCAGC TGCAGCAGGC GCTGATCTCC TCGATCGGGG AGTGGGAGCG 1560 CACCCACGAT CTCGACGATC CGAGCTGGTC CTACTACGAG CACTTCGTCG CCGCGCTGGA 1620 ATCCGTGCTC GGCGAGGAAG GGATCGTCGA GCCGGAGGCG CTGGACGAGC GCACCGCGGA 1680 GGTCTTGGCC AACCCGCCGA ACAAGGATCA CCATGGACCG CATCTGGAGC CCGTCGCGGT 1740 CCACCCGGCC GTGCGGTCCT GA 1762
ｐｈｉｌａ 株名：ＪＣＭ３０９５ 直接の起源 クローン名：ｐＰＴ−ＤＢ１ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：１６番目から７１７番目はβサブユニット遺
伝子の領域 ７１４番目から１３３１番目はαサブユニット遺伝子の
領域 １３２８番目から１７６２番目はシュードノカルディア
・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に
関与するタンパク質をコードする遺伝子の領域 配列 TGAGAGGAGC TCCGCATGAA CGGCGTGTAC GACGTCGGCG GCACCGATGG GCTGGGCCCG 60 ATCAACCGGC CCGCGGACGA ACCGGTCTTC CGCGCCGAGT GGGAGAAGGT CGCGTTCGCG 120 ATGTTCCCGG CGACGTTCCG GGCCGGCTTC ATGGGCCTGG ACGAGTTCCG GTTCGGCATC 180 GAGCAGATGA ACCCGGCCGA GTACCTCGAG TCGCCGTACT ACTGGCACTG GATCCGCACC 240 TACATCCACC ACGGCGTCCG CACCGGCAAG ATCGATCTCG AGGAGCTGGA GCGCCGCACG 300 CAGTACTACC GGGAGAACCC CGACGCCCCG CTGCCCGAGC ACGAGCAGAA GCCGGAGTTG 360 ATCGAGTTCG TCAACCAGGC CGTCTACGGC GGGCTGCCCG CAAGCCGGGA GGTCGACCGA 420 CCGCCCAAGT TCAAGGAGGG CGACGTGGTG CGGTTCTCCA CCGCGAGCCC GAAGGGCCAC 480 GCCCGGCGCG CGCGGTACGT GCGCGGCAAG ACCGGGACGG TGGTCAAGCA CCACGGCGCG 540 TACATCTACC CGGACACCGC CGGCAACGGC CTGGGCGAGT GCCCCGAGCA CCTCTACACC 600 GTCCGCTTCA CGGCCCAGGA GCTGTGGGGG CCGGAAGGGG ACCCGAACTC CAGCGTCTAC 660 TACGACTGCT GGGAGCCCTA CATCGAGCTC GTCGACACGA AGGCGGCCGC GGCATGACCG 720 AGAACATCCT GCGCAAGTCG GACGAGGAGA TCCAGAAGGA GATCACGGCG CGGGTCAAGG 780 CCCTGGAGTC GATGCTCATC GAACAGGGCA TCCTCACCAC GTCGATGATC GACCGGATGG 840 CCGAGATCTA CGAGAACGAG GTCGGCCCGC ACCTCGGCGC GAAGGTCGTC GTGAAGGCCT 900 GGACCGACCC GGAGTTCAAG AAGCGTCTGC TCGCCGACGG CACCGAGGCC TGCAAGGAGC 960 TCGGCATCGG CGGCCTGCAG GGCGAGGACA TGATGTGGGT GGAGAACACC GACGAGGTCC 1020 ACCACGTCGT CGTGTGCACG CTCTGCTCCT GCTACCCGTG GCCGGTGCTG GGGCTGCCGC 1080 CGAACTGGTT CAAGGAGCCG CAGTACCGCT CCCGCGTGGT GCGTGAGCCC CGGCAGCTGC 1140 TCAAGGAGGA GTTCGGCTTC GAGGTCCCGC CGAGCAAGGA GATCAAGGTC TGGGACTCCA 1200 GCTCCGAGAT GCGCTTCGTC GTCCTCCCGC AGCGCCCCGC GGGCACCGAC GGGTGGAGCG 1260 AGGAGGAGCT CGCCACCCTC GTCACCCGCG AGTCGATGAT CGGCGTCGAA CCGGCGAAGG 1320 CGGTCGCGTG AGCGCCGAGG CGAAGGTCCG CCTGAAGCAC TGCCCCACGG CCGAGGACCG 1380 GGCGGCGGCC GACGCGCTGC TCGCGCAGCT GCCCGGCGGC GACCGCGCGC TCGACCGCGG 1440 CTTCGACGAG CCGTGGCAGC TGCGGGCGTT CGCGCTGGCG GTCGCGGCGT GCAGGGCGGG 1500 CCGGTTCGAG TGGAAGCAGC TGCAGCAGGC GCTGATCTCC TCGATCGGGG AGTGGGAGCG 1560 CACCCACGAT CTCGACGATC CGAGCTGGTC CTACTACGAG CACTTCGTCG CCGCGCTGGA 1620 ATCCGTGCTC GGCGAGGAAG GGATCGTCGA GCCGGAGGCG CTGGACGAGC GCACCGCGGA 1680 GGTCTTGGCC AACCCGCCGA ACAAGGATCA CCATGGACCG CATCTGGAGC CCGTCGCGGT 1740 CCACCCGGCC GTGCGGTCCT GA 1762
【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGAATTCTGA GAGGAGCTCC GCATGAACG 29
【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCATGCTCA GGACCGCACG GCCGGGTG 28
【００５１】配列番号：５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCATGCTCA GATCGAGGAG ATCAGCGC 28
【００５２】配列番号：６ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCATGCTCA CGCGACCGCC TTCGCCGG 28
【００５３】配列番号：７ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGAATTCTGA GAGGAGCTCC GCGTGAGCGC CGAGGCGAAG GTCCG 45
【００５４】配列番号：８ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCATGCCAT TAATGCAGCT GGCACGA 27
【００５５】配列番号：９ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TAAGCTTTCA GATCGAGGAG ATCAGCGC 28
【図１】プラスミドｐＰＴ−ＤＢ１の制限酵素切断点地
図を示す。
図を示す。
【図２】プラスミドｐＰＴ−Ｄ１の制限酵素切断点地図
を示す。
を示す。
【図３】プラスミドｐＰＴ−Ｅ１の制限酵素切断点地図
を示す。
を示す。
【図４】プラスミドｐＰＴ−Ｆ１の制限酵素切断点地図
を示す。
を示す。
【図５】プラスミドｐＰＴ−Ｇ１の制限酵素切断点地図
を示す。
を示す。
【図６】プラスミドｐＰＴ−Ｈ１の制限酵素切断点地図
を示す。
を示す。
ｂｌａ：β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を示す。 ＣｏｌＥ１-Ｏｒｉ：ＣｏｌＥ１系の複製開始部位を示
す。 ｌａｃＺ：ｐＵＣ１８由来のラクトースオペロンのプロ
モーターおよびオペレーター領域を示す。 ＮＨα：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝
子を示す。 ＮＨβ：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝
子を示す。 Ｐ１６：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコ
ードする遺伝子を示す。 Ｐ１６(一部)：シュードノカルディア・サーモフィラ由
来のニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク
質をコードする遺伝子の部分領域であることを示す。
す。 ｌａｃＺ：ｐＵＣ１８由来のラクトースオペロンのプロ
モーターおよびオペレーター領域を示す。 ＮＨα：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝
子を示す。 ＮＨβ：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝
子を示す。 Ｐ１６：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニ
トリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコ
ードする遺伝子を示す。 Ｐ１６(一部)：シュードノカルディア・サーモフィラ由
来のニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク
質をコードする遺伝子の部分領域であることを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 肉丸 誠也 千葉県茂原市東郷1144番地 三井化学株式 会社内 (72)発明者 中村 武史 千葉県茂原市東郷1144番地 三井化学株式 会社内
Claims (12)
- 【請求項１】 シュードノカルディア・サーモフィラＪ
ＣＭ３０９５（Pseudonocardia thermophila JCM3095）
由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関与することを
特徴とするタンパク質。 - 【請求項２】 配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配
列により構成されることを特徴とする請求項１に記載の
タンパク質。 - 【請求項３】 シュードノカルディア・サーモフィラＪ
ＣＭ３０９５（Pseudonocardia thermophila JCM3095）
由来であることを特徴とする請求項１または請求項２に
記載のタンパク質。 - 【請求項４】 請求項１から請求項３に記載のタンパク
質をコードする遺伝子。 - 【請求項５】 配列表の配列番号：２に記載の１３２８
番目から１７６２番目までの塩基配列で表される請求項
４に記載の遺伝子。 - 【請求項６】 請求項４または請求項５に記載の遺伝子
を含んでいることを特徴とする組換えプラスミド。 - 【請求項７】 ニトリルヒドラターゼ遺伝子を構成要素
として含んでいることを特徴とする請求項６に記載の組
換えプラスミド。 - 【請求項８】 ニトリルヒドラターゼ遺伝子がシュード
ノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５（Pseudono
cardia thermophila JCM3095）由来であることを特徴と
する請求項７に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項９】 ニトリルヒドラターゼ遺伝子が配列表の
配列番号：２に記載の７１４番目から１３３１番目まで
の塩基配列で表されるαサブユニットをコードする遺伝
子を構成要素として含んでいることを特徴とする請求項
７に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項１０】 ニトリルヒドラターゼ遺伝子が配列表
の配列番号：２に記載の１６番目から７１７番目までの
塩基配列で表されるβサブユニットをコードする遺伝子
を構成要素として含んでいることを特徴とする請求項７
に記載の組換えプラスミド。 - 【請求項１１】 請求項６から請求項１０に記載のいず
れかの組換えプラスミドを保持する形質転換株。 - 【請求項１２】 請求項７から請求項１０に記載のいず
れかの組換えプラスミドを保持する形質転換株を培養
し、培養によって得られた形質転換株、培養液、および
それらの処理物とニトリル化合物とを水性媒体中で接触
させて該ニトリル化合物に対応するアミド化合物を製造
する方法。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06552098A JP3408737B2 (ja) | 1998-03-16 | 1998-03-16 | ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 |
| US09/265,383 US6730508B1 (en) | 1998-03-16 | 1999-03-10 | Protein participating in the activation of nitrile hydratase and gene encoding the same |
| AU20397/99A AU727092B2 (en) | 1998-03-16 | 1999-03-15 | Protein participating in activation of nitrile hydratase and gene encoding same |
| AT99301990T ATE360698T1 (de) | 1998-03-16 | 1999-03-16 | Protein das an einer aktivierung von nitril hydratase teilnimmt,gen,plasmid und verfahren zur herstellung eines amid |
| IDP990223D ID22189A (id) | 1998-03-16 | 1999-03-16 | Protein yang berperan dalam pengaktifan nitril hidratase dan gen yang menyandikannya |
| EP99301990A EP0943686B1 (en) | 1998-03-16 | 1999-03-16 | Protein participating in activation of nitrile hydratase,gene,plasmid and a process for producing an amide |
| KR19990008896A KR100323899B1 (ko) | 1998-03-16 | 1999-03-16 | 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질 및 이것을 코딩하는 유전자 |
| CNB991062914A CN1250568C (zh) | 1998-03-16 | 1999-03-16 | 参与活化腈水合酶的蛋白以及编码它的基因 |
| DE69935880T DE69935880T2 (de) | 1998-03-16 | 1999-03-16 | Protein das an einer Aktivierung von Nitril Hydratase teilnimmt,Gen,Plasmid und Verfahren zur Herstellung eines Amid |
| HK00100890A HK1021983A1 (en) | 1998-03-16 | 2000-02-14 | Protein participating in activation of nitrile hy dratase and gene encoding the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06552098A JP3408737B2 (ja) | 1998-03-16 | 1998-03-16 | ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11253168A true JPH11253168A (ja) | 1999-09-21 |
| JP3408737B2 JP3408737B2 (ja) | 2003-05-19 |
Family
ID=13289395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06552098A Expired - Lifetime JP3408737B2 (ja) | 1998-03-16 | 1998-03-16 | ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6730508B1 (ja) |
| EP (1) | EP0943686B1 (ja) |
| JP (1) | JP3408737B2 (ja) |
| KR (1) | KR100323899B1 (ja) |
| CN (1) | CN1250568C (ja) |
| AT (1) | ATE360698T1 (ja) |
| AU (1) | AU727092B2 (ja) |
| DE (1) | DE69935880T2 (ja) |
| HK (1) | HK1021983A1 (ja) |
| ID (1) | ID22189A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1842907A1 (en) | 2006-04-07 | 2007-10-10 | B.R.A.I.N. Ag | A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity |
| US7595184B2 (en) | 2002-12-19 | 2009-09-29 | Mitsui Chemicals, Inc. | Nitrile hydratase variant |
| WO2010055666A1 (ja) | 2008-11-14 | 2010-05-20 | 三井化学株式会社 | ニトリルヒドラターゼ変異体 |
| JP5120852B2 (ja) * | 2006-07-06 | 2013-01-16 | 国立大学法人 筑波大学 | 新規タンパク質複合体、該タンパク質複合体を用いたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼを用いた方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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