KR20190080948A - 변이형 나이트릴 히드라타아제, 그 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 핵산, 그 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체, 그 변이형 나이트릴 히드라타아제의 제조 방법, 및 아마이드 화합물의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

　 　 α 서브유닛과 β 서브유닛을 가지는 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서, α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째 및 43번째 및 β 서브유닛의 N 말단으로부터 205번째, 206번째 및 215번째로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치에 있어서의 아미노산 잔기의 특정의 아미노산 잔기로의 치환을 포함하는, 변이형 나이트릴 히드라타아제.

Description

변이형 나이트릴 히드라타아제, 그 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 핵산, 그 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체, 그 변이형 나이트릴 히드라타아제의 제조 방법, 및 아마이드 화합물의 제조 방법

본 개시(開示)는, 변이형 나이트릴 히드라타아제, 그 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 핵산, 그 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체, 그 변이형 나이트릴 히드라타아제의 제조 방법, 및 아마이드 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

나이트릴 히드라타아제는, 여러 가지의 화합물의 나이트릴기를 수화(水和)에 의해 아마이드기로 변환시키는 나이트릴 수화 활성을 가지는 효소이며, 효소 반응을 이용한 공업적인 아마이드 화합물의 제조 프로세스에서 이용되고 있다.

최근, 공업적인 아마이드 화합물의 제조 기술에 대한 요구 수준은 더욱더 높아지고 있는 경향이 있다. 이러한 사정을 감안하여, 아마이드 화합물의 제조 코스트를 차지하는 나이트릴 히드라타아제의 런닝 코스트(running cost)를 저감시킬 수 있도록, 여러 가지의 검토가 지금까지 이루어지고 있다. 특히, 나이트릴 히드라타아제에 관해서는, 그 효소의 단위 중량당의 활성값을 향상시키는 것이 가능한 변이체에 관련되는 기술에 관하여, 수 많은 보고가 이루어지고 있다(일본 특허공개 특개평9-275978호 공보, 일본 특허공개 특개2004-194588호 공보, 일본 특허공개 특개2005-160403호 공보, 국제 공개 제2004/056990호, 국제 공개 제2010/055666호, 일본 특허공개 특개2007-143409호 공보, 일본 특허공개 특개2008-253182호 공보 등).

여기서, 효소 반응을 이용한 공업적인 아마이드 화합물의 대표적인 제조 프로세스에 있어서는, 통상, pH가 7~9가 되도록 조정한 용액 중에 있어서, 나이트릴 히드라타아제의 촉매 작용을 이용하여 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 합성시키는 반응을 진행시키는 반응 공정과, 상기 용액의 pH를 3.5~6.5로 조정하고, 그 pH에 있어서 활성탄을 사용하여 상기 용액 중에 존재하는 나이트릴 히드라타아제에 흡착을 이용하여 제거함으로써 정제된 아마이드 화합물을 얻는 정제 공정을 이 순서로 실시하고 있었다(일본 특허공개 특개2001-270857호 공보).

본 발명자들은, 나이트릴 히드라타아제를 이용한 공업적인 아마이드 화합물의 제조 효율을 종래보다 더 한층 향상시킬 수 있도록 예의(銳意) 검토했다. 그 결과, 산성의 pH영역에서 실시되는 상기 정제 공정에 있어서도, 나이트릴 히드라타아제의 촉매 작용을 이용하여 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 합성시키는 반응을 계속 진행시키는 것이, 그 설계 지침으로서 유효한 것을 발견했다.

그러나, 일반적으로, 야생형 나이트릴 히드라타아제의 지적(至適) pH는 7~9이며, 야생형 나이트릴 히드라타아제는 pH3.5~6.5의 조건 하에 있어서는 활성이 크게 저하된다. 따라서, 야생형 나이트릴 히드라타아제를 사용해도, 정제 공정에 있어서 효소 반응은 만족할 수 있을 정도로는 발생되지 않는다. 또한, 상기와 같이 여러 가지의 나이트릴 히드라타아제 변이체가 보고되어 왔지만, 이들도 정제 공정에서 사용되는 산성 조건 하에 있어서는 활성이 크게 저하된다. 이와 같이, 산성 조건 하에서의 정제 공정에 있어서 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 합성하는 반응을 촉매하는 효소 활성이 양호한 pH 안정성을 나타내는 나이트릴 히드라타아제 변이체에 관한 기술은, 지금까지 보고되고 있지 않았다. 특히 pH5.0 이하라고 하는 비교적 강한 산성 조건 하에 있어서는, 단백질은 실활되는 경향이 보다 높고, 이와 같은 pH 조건 하에서도 효소 활성이 양호하게 유지되는 나이트릴 히드라타아제 변이체에 관한 기술은, 지금까지 보고되고 있지 않았다.

그래서, 본 개시는, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물의 합성 반응을 촉매하는 효소 활성의 pH에 대한 안정성이 향상된, 새로운 변이점을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제에 관한 기술을 제공한다. 보다 구체적으로는, pH3.5~6.5라고 하는 산성 영역에 있어서도 효소 활성을 양호하게 유지하는 변이형 나이트릴 히드라타아제에 관한 기술을 제공한다. 더 구체적으로는, pH가 3.5~5.0이라고 하는 비교적 강한 산성 영역에 있어서도 효소 활성을 양호하게 유지하는 변이형 나이트릴 히드라타아제에 관한 기술을 제공한다.

본 개시는, 이하의 태양(態樣)을 포함한다.

＜1＞ α 서브유닛(subunit)과 β 서브유닛을 가지는 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서, 하기의 아미노산 잔기 치환(a)~(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 변이형 나이트릴 히드라타아제,

(a) α 서브유닛의 N 말단(末端)으로부터 40번째의 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환,

(b) α 서브유닛의 N 말단으로부터 43번째의 아미노산 잔기의 Val로의 치환,

(c) β 서브유닛의 N 말단으로부터 205번째의 아미노산 잔기의 Val로의 치환,

(d) β 서브유닛의 N 말단으로부터 206번째의 아미노산 잔기의 Gln으로의 치환,

(e) β 서브유닛의 N 말단으로부터 215번째의 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환.

＜2＞　아미노산 잔기 치환(a)~(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, ＜1＞에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제.

＜3＞　아미노산 잔기 치환(b)와, 아미노산 잔기 치환(a), (c), (d) 및 (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 포함하는 ＜1＞ 또는 ＜2＞에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제.

＜4＞ α 서브유닛의 아미노산 서열에 있어서의, N 말단으로부터 36번째의 아미노산이 Trp인, ＜1＞~＜3＞ 중 어느 하나에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제.

＜5＞ α 서브유닛의 아미노산 서열에 있어서의, N 말단으로부터 36번째의 아미노산이 Met, Ser, Gly 또는 Ala인, ＜1＞~＜3＞ 중 어느 하나에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제.

＜6＞ α 서브유닛의 아미노산 서열이, 이하의 (1)~(13) 중 하나 이상을 만족하는, ＜1＞~＜5＞ 중 어느 하나에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제：

　(1) N 말단으로부터 6번째의 아미노산 잔기가 Thr 또는 Ala,

　(2) N 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 Leu,

　(3) N 말단으로부터 19번째의 아미노산 잔기가 Val,

　(4) N 말단으로부터 27번째의 아미노산 잔기가 Ile,

　(5) N 말단으로부터 48번째의 아미노산 잔기가 Gln,

　(6) N 말단으로부터 71번째의 아미노산 잔기가 His,

　(7) N 말단으로부터 92번째의 아미노산 잔기가 Glu,

　(8) N 말단으로부터 94번째의 아미노산 잔기가 Ile,

　(9) N 말단으로부터 126번째의 아미노산 잔기가 Tyr,

　(10) N 말단으로부터 148번째의 아미노산 잔기가 Asp,

　(11) N 말단으로부터 188번째의 아미노산 잔기가 Gly,

　(12) N 말단으로부터 197번째의 아미노산 잔기가 Cys,

　(13) N 말단으로부터 204번째의 아미노산 잔기가 Arg이다.

＜7＞ β 서브유닛의 아미노산 서열이, 이하의 (15)~(47) 중 적어도 하나를 만족하는, ＜1＞~＜6＞ 중 어느 하나에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제：

　(15) N 말단으로부터 4번째의 아미노산 잔기가 Met,

　(16) N 말단으로부터 8번째의 아미노산 잔기가 Ala,

　(17) N 말단으로부터 10번째의 아미노산 잔기가 Asp,

　(18) N 말단으로부터 24번째의 아미노산 잔기가 Ile,

　(19) N 말단으로부터 33번째의 아미노산 잔기가 Val 또는 Met,

　(20) N 말단으로부터 37번째의 아미노산 잔기가 Val 또는 Leu,

　(21) N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기가 Ile, Val 또는 Leu,

　(22) N 말단으로부터 41번째의 아미노산 잔기가 Ile,

　(23) N 말단으로부터 46번째의 아미노산 잔기가 Lys,

　(24) N 말단으로부터 48번째의 아미노산 잔기가 Val,

　(25) N 말단으로부터 51번째의 아미노산 잔기가 Val,

　(26) N 말단으로부터 61번째의 아미노산 잔기가 Val, Gly, Trp, Ser, Leu 또는 Thr,

　(27) N 말단으로부터 79번째의 아미노산 잔기가 Asn,

　(28) N 말단으로부터 96번째의 아미노산 잔기가 Arg,

　(29) N 말단으로부터 107번째의 아미노산 잔기가 Met,

　(30) N 말단으로부터 108번째의 아미노산 잔기가 Asp 또는 Arg,

　(31) N 말단으로부터 110번째의 아미노산 잔기가 Asn,

　(32) N 말단으로부터 112번째의 아미노산 잔기가 Val 또는 Ile,

　(33) N 말단으로부터 118번째의 아미노산 잔기가 Val,

　(34) N 말단으로부터 127번째의 아미노산 잔기가 Ser,

　(35) N 말단으로부터 146번째의 아미노산 잔기가 Gly,

　(36) N 말단으로부터 150번째의 아미노산 잔기가 Asn 또는 Ser,

　(37) N 말단으로부터 160번째의 아미노산 잔기가 Cys, Trp 또는 Met,

　(38) N 말단으로부터 168번째의 아미노산 잔기가 Glu,

　(39) N 말단으로부터 176번째의 아미노산 잔기가 Ala, Thr, Met 또는 Cys,

　(40) N 말단으로부터 186번째의 아미노산 잔기가 Arg,

　(41) N 말단으로부터 200번째의 아미노산 잔기가 Glu,

　(42) N 말단으로부터 212번째의 아미노산 잔기가 Tyr,

　(43) N 말단으로부터 217번째의 아미노산 잔기가 Val, His, Met, Gly, Ser, Leu 또는 Cys,

　(44) N 말단으로부터 218번째의 아미노산 잔기가 Met 또는 Ser,

　(45) N 말단으로부터 226번째의 아미노산 잔기가 Ile,

　(46) N 말단으로부터 230번째의 아미노산 잔기가 Glu,

　(47) N 말단으로부터 231번째의 아미노산 잔기가 Val이다.

＜8＞　하기 [1]~[49] 중 어느 하나의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서, 상기 (a)~(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, ＜1＞~＜7＞ 중 어느 하나에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제.

　[1] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[2] 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[3] 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[4] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[5] 서열번호 19의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[6] 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 35의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[7] 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[8] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 37의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[9] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 38의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[10] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 39의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[11] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 40의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[12] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 41의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[13] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 42의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[14] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 43의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[15] 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 44의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[16] 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 45의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[17] 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 46의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[18] 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 47의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[19] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 48의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[20] 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 49의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[21] 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 50의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[22] 서열번호 26의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 51의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[23] 서열번호 27의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 52의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[24] 서열번호 28의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 53의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[25] 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 54의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[26] 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[27] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 56의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[28] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 57의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[29] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 58의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[30] 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 59의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[31] 서열번호 31의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 60의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[32］서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[33] 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 62의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[34] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 63의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[35] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 64의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[36] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 65의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[37] 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 54의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[38] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 66의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[39] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[40] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 68의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[41] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 69의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[42] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 70의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[43] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 71의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[44] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 72의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[45] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 73의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

　[46] 상기 [1]~[45]의 나이트릴 히드라타아제 중 어느 하나에 있어서의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 36번째의 아미노산 잔기를 Trp잔기로 한, 나이트릴 히드라타아제

　[47] 상기 [1]~[46] 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제(A)의 α 서브유닛 또는 그 α 서브유닛과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 α 서브유닛 배리언트(variant)와, 상기 나이트릴 히드라타아제(A)의 β 서브유닛 또는 그 β 서브유닛과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 β 서브유닛 배리언트를 가지는 나이트릴 히드라타아제로서, α 서브유닛 및 β 서브유닛 중 적어도 한쪽은 α 서브유닛 배리언트 또는 β 서브유닛 배리언트인, 나이트릴 히드라타아제

　[48] 상기 [1]~[46] 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제(B)에 있어서의 α 서브유닛에 있어서 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 잔기(상기 (a) 및 (b)의 치환되는 아미노산 잔기를 제외한다)의 총수가 1~10이며, 또한, 상기 나이트릴 히드라타아제(B)에 있어서의 β 서브유닛에 있어서, 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 잔기(상기 (c)~(e)의 치환되는 아미노산 잔기를 제외한다)의 총수가 1~10인 나이트릴 히드라타아제

＜9＞　＜1＞~＜8＞ 중 어느 하나에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 핵산.

＜10＞　＜9＞에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.

＜11＞　발현 벡터인, ＜10＞에 기재된 벡터.

＜12＞　＜11＞에 기재된 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.

＜13＞　＜12＞에 기재된 형질전환체를 배지 중에서 배양하는 것, 및 배양된 형질전환체 및 배지 중 적어도 한쪽으로부터, ＜1＞~＜8＞ 중 어느 하나에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제를 회수하는 것을 포함하는 변이형 나이트릴 히드라타아제의 제조 방법.

＜14＞　＜13＞에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 변이형 나이트릴 히드라타아제.

＜15＞　＜1＞~＜8＞ 및 ＜14＞ 중 어느 하나에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제를 나이트릴 화합물에 접촉시키는 것을 포함하는, 아마이드 화합물의 제조 방법.

＜16＞　pH3.5~pH6.5이고, 아마이드 화합물을 포함하는 용액으로부터 불순물을 제거하는 것을 더 포함하는, ＜15＞에 기재된 아마이드 화합물의 제조 방법.

＜17＞　아마이드 화합물을 활성탄에 의해 정제하는 것을 더 포함하는, ＜15＞ 또는 ＜16＞에 기재된 아마이드 화합물의 제조 방법.

본 개시에 의하면, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물의 합성 반응을 촉매하는 효소 활성의 pH에 대한 안정성이 향상된, 새로운 변이점을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제에 관한 기술을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로는, pH3.5~6.5라고 하는 산성 영역에 있어서도 효소 활성을 양호하게 유지하는 변이형 나이트릴 히드라타아제에 관한 기술을 제공할 수 있다. 더 구체적으로는, pH가 3.5~5.0이라고 하는 비교적 강한 산성 영역에 있어서도 효소 활성을 양호하게 유지하는 변이형 나이트릴 히드라타아제에 관한 기술을 제공할 수 있다.

＜변이형 나이트릴 히드라타아제＞

본 개시는, α 서브유닛과 β 서브유닛을 가지는 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서, 하기의 아미노산 잔기 치환(a)~(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 변이형 나이트릴 히드라타아제(이하, 변이형 나이트릴 히드라타아제 A라고도 한다)를 제공한다：

(a) α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환,

(b) α 서브유닛의 N 말단으로부터 43번째의 아미노산 잔기의 Val로의 치환,

(c) β 서브유닛의 N 말단으로부터 205번째의 아미노산 잔기의 Val로의 치환,

(d) β 서브유닛의 N 말단으로부터 206번째의 아미노산 잔기의 Gln으로의 치환,

(e) β 서브유닛의 N 말단으로부터 215번째의 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환.

상기 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환을 적어도 1개 이상 포함하는 변이체는, 지금까지 보고되고 있지 않았다. 즉, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제가 포함하는 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환은, 모두, 지금까지 보고가 이루어지지 않았던 변이라고 할 수 있다. 이들 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환을, 이하, 아미노산 잔기 치환군 A라고도 한다. 그리고, 상술한 변이를 포함하는 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물의 합성 반응에 대하여, 종래의 나이트릴 히드라타아제 변이체와 비교하여 폭넓은 pH영역에 있어서 안정성을 가지는 효소 활성을 나타내는 것이 가능한 효소이다. 이 점에 관해서는, 실시예에서 상세히 설명한다.

종래부터 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 변이체를 얻으려고 하는 시도는 이루어져 왔지만, 이들은 주로 효소의 지적 pH 조건 하에 있어서의 효소 활성의 향상을 목적으로 하는 것이며, 효소의 지적 pH 조건과는 반대의 산성 조건 하에 있어서의 효소 활성에 관한 검토는 이루어지지 않았다. 지적 조건으로부터 벗어나는 산성 조건 하에 있어서의 나이트릴 히드라타아제의 효소 활성은, 본 발명자들에 의해 처음으로 주목된 것이며, 상기의 새로운 아미노산 잔기 변이가 유효한 것을 발견한 것이다.

이하에, 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제에 관하여 보다 상세히 설명한다. 본 개시에 있어서의 뉴클레오티드 서열의 설명은, 해당 뉴클레오티드 서열을 유지하고 있는 핵산 사슬이 2개 사슬을 형성하고 있는 경우이라도 한쪽의 사슬 상의 서열에 주목하여 이루어지는 경우가 있지만, 2개 사슬 중 다른 쪽의 사슬에 있어서는, 그와 같은 서열의 설명은 그 상보적인 서열로 바꿔서 적용해야 한다.

본 개시에 있어서 「공정」이라는 용어는, 독립된 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우이라도 해당 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본 용어에 포함된다.

본 개시에 있어서 「~」를 이용해서 나타낸 수치 범위는, 「~」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.

본 개시에 있어서, 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 중의 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재하는 경우, 특별히 단정짓지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 해당 복수의 물질의 합계량을 의미한다.

본 개시에 있어서, 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제란, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제뿐만 아니라, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 대하여, 당업자가 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 개변 서열이라고 인식할 수 있을 정도로, 개변을 가한 개변 나이트릴 히드라타아제도 포함하는 개념이다. 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 개념에 포함되는 개변 나이트릴 히드라타아제에는, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 대하여, (i) 1개 이상의 아미노산 잔기에 있어서의 다른 아미노산 잔기로의 치환, (ii) 상기 (a)~(e) 이외의 1개 이상의 아미노산 잔기의 결실, (iii) 아미노산 잔기의 삽입, (iv) α 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단 및 C 말단 중 한쪽 혹은 양쪽에의 아미노산 잔기의 부가, (v) β 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단 및 C 말단 중 한쪽 혹은 양쪽에의 아미노산 잔기의 부가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 개변을 가한 개변 나이트릴 히드라타아제도 포함된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 치환된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~20이고, 혹은 1~15이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~8이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~6이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~3이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 치환된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 치환된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~20이고, 혹은 1~15이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~8이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~6이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~3이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 치환된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 결실된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~10이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 결실된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 결실된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~10이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 결실된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 삽입된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~10이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 삽입된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 삽입된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~10이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 삽입된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는, 예를 들면, 1~20이고, 혹은 1~14이고, 혹은 1~8이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 말단 부가가 있는 경우 등은, 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는, 0이어도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는, 예를 들면, 1~20이고, 혹은 1~14이고, 혹은 1~8이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 말단 부가가 있는 경우 등은, 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는, 0이어도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 말단 부가된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1 말단당 1~60이고, 혹은 1~40이고, 혹은 1~20이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~3이며, 혹은 1이다. 부가된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 말단 부가된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1 말단당 1~60이고, 혹은 1~40이고, 혹은 1~20이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~3이며, 혹은 1이다. 부가된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

말단 부가(付加) 아미노산 잔기는, 예를 들면 분비(分泌) 시그널 서열이어도 된다. 말단 부가 아미노산 잔기는 N 말단에만, C 말단에만, 혹은 N 말단 및 C 말단의 양쪽에 존재해도 된다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제와 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제와의 유사성은 서열 동일성에 의해서도 표현할 수 있다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 아미노산 서열은, 서열번호 1로 나타내는 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 아미노산 서열과의 사이에서, 예를 들면 70% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 80% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 85% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 90% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 96% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 97% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 98% 이상의 서열 동일성을 가지며, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가진다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 아미노산 서열은, 서열번호 2로 나타내는 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 아미노산 서열과의 사이에서, 예를 들면 70% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 80% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 85% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 90% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 95% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 96% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 97% 이상의 서열 동일성을 가지고, 혹은 98% 이상의 서열 동일성을 가지며, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가진다.

또한, 서열끼리의 얼라인먼트(alignment)는, ClustalW(1.83)에서 실시할 수 있고, 초기 파라미터(갭 오픈 패널티(gap open penalty)：10, 갭 익스텐션 페널티르티(gap extension penalty)：0.05를 포함한다)를 사용하여 실시할 수 있다.

개변 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열을 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열과 얼라인먼트한 경우, 개변 나이트릴 히드라타아제의 개변의 양식에 따라서는, 얼라인먼트 상에서 대응하는 아미노산 잔기끼리여도, 상기와 같이 규정된 서브유닛의 N 말단으로부터의 거리가 상이한 경우가 있다. 본 개시에 있어서는, 이와 같은 경우, 개변 나이트릴 히드라타아제에 관하여, 서브유닛의 N 말단으로부터 X번째의 아미노산 잔기란, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 해당 서브유닛의 N 말단으로부터 X번째의 아미노산 잔기와 얼라인먼트 상 대응하는 아미노산 잔기를 가리킨다. 예를 들면, 본 개시에 있어서의 「α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기」, 「α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 Asp 잔기」 혹은 「α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기인 Asp 잔기」란, 개변 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열 상에 있어서는, α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째 이외의 위치에 위치하는 경우가 있을 수 있다. 예를 들면, 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 41번째의 아미노산 잔기(반드시 Asp가 아니어도 된다)가, 아미노산 잔기의 삽입의 결과, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기인 Asp 잔기에 대응하는 경우가 있을 수 있다. 이와 같은 경우, 본 개시 중의 설명에 있어서의 「α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기」, 「α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 Asp 잔기」 또는 「α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기인 Asp 잔기」란, 개변 나이트릴 히드라타아제 중의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 41번째의 아미노산 잔기를 가리킨다.

야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서는, 서열번호 1의 선두에 위치하는 Met 잔기가 α 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 아미노산 잔기이고, α 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기는 Asp 잔기이며, α 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 43번째의 아미노산 잔기는 Ala 잔기이다. 또한, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서는, 서열번호 2의 선두에 위치하는 Met 잔기가 β 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 아미노산 잔기이고, β 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 205번째의 아미노산 잔기는 Gly잔기이고, β 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 206번째의 아미노산 잔기는 Pro잔기이며, β 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 215번째의 아미노산 잔기는 Tyr잔기이다.

아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입 대상으로서 사용할 수 있는 개변 나이트릴 히드라타아제의 서열은, National　Center　for　Biotechnology　Information(NCBI)이 제공하는 GenBank에 등록되어 있는 나이트릴 히드라타아제의 서열, 혹은 공지 문헌에 기재된 나이트릴 히드라타아제의 서열로부터 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 상술한 일본 특허공개 특개평9-275978호 공보, 일본 특허공개 특개2004-194588호 공보, 일본 특허공개 특개 2005-160403호 공보, 국제 공개 제2004/056990호, 국제 공개 제2010/055666호에 기재되어 있는 개변 나이트릴 히드라타아제의 서열로부터 선택하여 사용할 수 있다. 이 경우, 이들 특허 문헌에 기재된 개량에 더하여, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입에 의해 pH 안정성의 향상이라고 하는 새로운 효과도 얻을 수 있다.

또한, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입 대상으로서 사용할 수 있는 개변 나이트릴 히드라타아제는, N 말단으로부터 36번째의 아미노산 잔기(야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열에 있어서의 N 말단으로부터 36번째의 Thr 잔기에 얼라인먼트 상 대응하는 아미노산 잔기)가 Trp잔기인 것(이후에서는, 아미노산 잔기 치환(f)라고도 한다)이어도 된다. 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상에 추가하여 아미노산 잔기 치환(f)를 가지는 것은, 보다 향상된 pH 안정성을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 얻는 관점에서 바람직하다. 바꾸어 말하면, 아미노산 잔기 치환(f)가 존재하면, 아미노산 잔기 치환(a)로부터 (e)에 의한 효과가 보다 강해지는 경향이 있다.

또한, 예를 들면, 국제 공개 제2010/055666호에는, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열에 관하여, 이하와 같은 아미노산 잔기 치환(이하, 아미노산 잔기 치환군 B라고도 한다)을 도입하는 것이 기재되어 있다.

α 서브유닛의 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 잔기 치환(α 서브유닛의 N 말단을 기준으로 한 위치에서 나타낸다)

6번째의 아미노산 잔기인 Leu를 Thr 또는 Ala로 치환

13번째의 아미노산 잔기인 Ile를 Leu로 치환

19번째의 아미노산 잔기인 Ala를 Val로 치환

27번째의 아미노산 잔기인 Met를 Ile로 치환

36번째의 아미노산 잔기인 Thr을 Met, Ser, Gly 또는 Ala로 치환

48번째의 아미노산 잔기인 Asn을 Gln으로 치환

71번째의 아미노산 잔기인 Arg를 His로 치환

92번째의 아미노산 잔기인 Asp를 Glu로 치환

94번째의 아미노산 잔기인 Met를 Ile로 치환

126번째의 아미노산 잔기인 Phe를 Tyr로 치환

148번째의 아미노산 잔기인 Gly를 Asp로 치환

188번째의 아미노산 잔기인 Thr을 Gly로 치환

197번째의 아미노산 잔기인 Gly를 Cys로 치환

204번째의 아미노산 잔기인 Val을 Arg로 치환

β 서브유닛의 아미노산 서열에 있어서의 아미노산 잔기 치환(β 서브유닛의 N 말단을 기준으로 한 위치에서 나타낸다)

4번째의 아미노산 잔기인 Val을 Met로 치환

8번째의 아미노산 잔기인 Gly를 Ala로 치환

10번째의 아미노산 잔기인 Thr을 Asp로 치환

24번째의 아미노산 잔기인 Val을 Ile로 치환

33번째의 아미노산 잔기인 Ala를 Val 또는 Met로 치환

37번째의 아미노산 잔기인 Phe를 Val 또는 Leu로 치환

40번째의 아미노산 잔기인 Thr을 Ile, Val 또는 Leu로 치환

41번째의 아미노산 잔기인 Phe를 Ile로 치환

46번째의 아미노산 잔기인 Met를 Lys로 치환

48번째의 아미노산 잔기인 Leu를 Val로 치환

51번째의 아미노산 잔기인 Phe를 Val로 치환

61번째의 아미노산 잔기인 Ala를 Val, Gly, Trp, Ser, Leu 또는 Thr로 치환

79번째의 아미노산 잔기인 His를 Asn으로 치환

96번째의 아미노산 잔기인 Gln을 Arg로 치환

107번째의 아미노산 잔기인 Pro를 Met로 치환

108번째의 아미노산 잔기인 Glu를 Asp 또는 Arg로 치환

110번째의 아미노산 잔기인 Glu를 Asn으로 치환

112번째의 아미노산 잔기인 Lys를 Val 또는 Ile로 치환

118번째의 아미노산 잔기인 Phe를 Val로 치환

127번째의 아미노산 잔기인 Leu를 Ser로 치환

146번째의 아미노산 잔기인 Arg를 Gly로 치환

150번째의 아미노산 잔기인 Ala를 Asn 또는 Ser로 치환

160번째의 아미노산 잔기인 Arg를 Cys, Trp 또는 Met로 치환

168번째의 아미노산 잔기인 Thr을 Glu로 치환

176번째의 아미노산 잔기인 Tyr을 Ala, Thr, Met 또는 Cys로 치환

186번째의 아미노산 잔기인 Leu를 Arg로 치환

200번째의 아미노산 잔기인 Ala를 Glu로 치환

206번째의 아미노산 잔기인 Pro를 Leu로 치환

212번째의 아미노산 잔기인 Ser을 Tyr로 치환

217번째의 아미노산 잔기인 Asp를 Val, His, Met, Gly, Ser, Leu 또는 Cys로 치환

218번째의 아미노산 잔기인 Cys를 Met 또는 Ser로 치환

226번째의 아미노산 잔기인 Val을 Ile로 치환

230번째의 아미노산 잔기인 Ala를 Glu로 치환

231번째의 아미노산 잔기인 Ala를 Val로 치환

아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입 대상으로서 사용할 수 있는 개변 나이트릴 히드라타아제는, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에, 상기 아미노산 잔기 치환군 B로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 것이어도 되고, 이것에 아미노산 잔기 치환(f)를 더 가지고 있어도 된다. 상기 아미노산 잔기 치환은 2개 이상을 조합하여 포함되어 있어도 된다. 그러한 조합의 예도 국제 공개 제2010/055666호에는 다수 기재되어 있다. 또한, 개변 나이트릴 히드라타아제는, 물론, 나이트릴 히드라타아제 활성을 가져야 한다.

예를 들면, 3개를 조합하여 포함하고 있는 경우는,

α 서브유닛에 있어서의 Thr36Ser 및 Asp92Glu 및 β 서브유닛에 있어서의 Ala33Val의 조합,

α 서브유닛에 있어서의 Met94Ile 및 β 서브유닛에 있어서의 Ala61Gly 및 Ala150Asn의 조합,

β 서브유닛에 있어서의 Val4Met, Tyr176Ala 및 Asp217Val의 조합

β 서브유닛에 있어서의 Ala33Met, His79Asn 및 Tyr176Thr의 조합,

β 서브유닛에 있어서의 Thr40Val, Cys218Met 및 Val226Ile의 조합,

등을 예로서 들 수 있다.

또한, 예를 들면 8개를 조합하여 포함하고 있는 경우는,

α 서브유닛에 있어서의 Ile13Leu, Ala19Val, Arg71His 및 Phe126Tyr 및 β 서브유닛에 있어서의 Phe37Leu, Gln96Arg, Glu108Asp 및 Ala200Glu의 조합(국제 공개 제2010/055666호：형질전환체 번호 59),

α 서브유닛에 있어서의 Leu6Thr, Met27Ile, Thr36Met 및 Phe126Tyr 및 β 서브유닛에 있어서의 Thr10Asp, Pro107Met, Phe118Val 및 Ala200Glu의 조합(국제 공개 제2010/055666호：형질전환체 번호 68),

α 서브유닛에 있어서의 Leu6Thr, Thr36Met 및 Phe126Tyr 및 β 서브유닛에 있어서의 Thr10Asp, Phe118Val, Ala200Glu, Pro206Leu 및 Ala230Glu의 조합(국제 공개 제2010/055666호：형질전환체 번호 92),

α 서브유닛에 있어서의 Leu6Thr, Ala19Val 및 Phe126Tyr 및

β 서브유닛에 있어서의 Leu48Val, His79Asn, Glu108Arg, Ser212Tyr 및 Ala230Glu의 조합(국제 공개 제2010/055666호：형질전환체 번호 85),

α 서브유닛에 있어서의 Thr36Met, Gly148Asp 및 Val204Arg 및 β 서브유닛에 있어서의 Phe41Ile, Phe51Val, Glu108Asp, Pro206Leu 및 Ala230Glu의 조합(국제 공개 제2010/055666호：형질전환체 번호 93),

을 예로서 들 수 있다.

또한, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입 대상으로서 사용할 수 있는 개변 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열과 비교하여, 상기에 예시된 개소(箇所)(아미노산 잔기 치환군 B 및 아미노산 잔기 치환(f)) 이외의 아미노산 잔기에 있어서의 아미노산 잔기 치환을 포함하고 있어도 된다. 이와 같은, 아미노산 잔기 치환군 B중 1개 이상의 아미노산 잔기 치환 및/또는 아미노산 잔기 치환(f)에 더하여, 혹은 아미노산 잔기 치환군 B의 아미노산 잔기의 치환도 아미노산 잔기 치환(f)도 없이, 아미노산 잔기 치환군 B 및 아미노산 잔기 치환(f) 이외의 아미노산 잔기에 있어서의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 개변 나이트릴 히드라타아제에 대하여도, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입은, 후술과 같이 입체 구조 상의 안정화를 통해서, 개변 나이트릴 히드라타아제가 가지는 pH 안정성을 향상시키는 효과를 나타낸다.

상기의 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제 또는 개변 나이트릴 히드라타아제에 대하여, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상을 도입하여, 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 얻을 수 있다.

상기 변이 나이트릴 히드라타아제는, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 및 (f) 중, 표 I에서 나타내는 2개의 아미노산 잔기 치환의 조합을 포함하고 있어도 된다.

상기 변이 나이트릴 히드라타아제는, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 및 (f) 중, 표 II에서 나타내는 3개의 아미노산 잔기 치환의 조합으로도를 포함하고 있어도 된다.

상기 변이 나이트릴 히드라타아제는, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 및 (f) 중, 표 III에서 나타내는 4개의 아미노산 잔기 치환의 조합을 포함하고 있어도 된다.

상기 변이 나이트릴 히드라타아제는, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 및 (f) 중, 표 IV로 나타내는 5개의 아미노산 잔기 치환의 조합을 포함하고 있어도 된다.

상기 변이 나이트릴 히드라타아제는, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 및 (f)의 모든(표 V로 나타내는 6개의 아미노산 잔기 치환) 조합을 포함하고 있어도 된다.

아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입 대상으로서 사용할 수 있는 개변 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열은, 국제 공개 제2010/055666호 등으로 제작된 개변 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열 또는 이것과 유사한 서열이어도 된다. 이 때문에, 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 예를 들면,

α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환,

α 서브유닛의 N 말단으로부터 43번째의 아미노산 잔기의 Val로의 치환,

β 서브유닛의 N 말단으로부터 205번째의 아미노산 잔기의 Val로의 치환,

β 서브유닛의 N 말단으로부터 206번째의 아미노산 잔기의 Gln으로의 치환,

β 서브유닛의 N 말단으로부터 215번째의 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환.

중 적어도 1개를, 이하의 나이트릴 히드라타아제(1)~(47) 중 어느 것에 도입한 것(이하, 변이형 나이트릴 히드라타아제 B라고도 한다)이어도 된다：

(1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(2) 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(3) 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(4) 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(5) 서열번호 19의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(6) 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 35의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(7) 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(8) 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 37의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(9) 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 38의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(10) 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 39의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(11) 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 40의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(12) 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 41의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(13) 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 42의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(14) 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 43의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(15) 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 44의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(16) 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 45의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(17) 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 46의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(18) 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 47의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(19) 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 48의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(20) 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 49의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(21) 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 50의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(22) 서열번호 26의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 51의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(23) 서열번호 27의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 52의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(24) 서열번호 28의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 53의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(25) 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 54의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(26) 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(27) 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 56의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(28) 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 57의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(29) 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 58의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(30) 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 59의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(31) 서열번호 31의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 60의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(32) 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(33) 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 62의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(34) 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 63의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(35) 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 64의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(36) 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 65의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(37) 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 54의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(38) 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 66의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(39) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(40) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 68의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(41) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 69의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(42) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 70의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(43) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 71의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(44) 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 72의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(45) 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 73의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,

(46) 상기 (1)~(45)의 나이트릴 히드라타아제 중 어느 하나에 있어서의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 36번째의 아미노산 잔기를 Trp잔기로 한, 나이트릴 히드라타아제,

(47) 상기 (1)~(46)의 나이트릴 히드라타아제 중 어느 하나인 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 α 서브유닛 배리언트와, 상기 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 β 서브유닛 배리언트를 가지는 개변 나이트릴 히드라타아제로서, α 서브유닛의 아미노산 서열 및 β 서브유닛의 아미노산 서열 중 적어도 한쪽은 α 서브유닛 배리언트 또는 β 서브유닛 배리언트의 아미노산 서열인, 개변 나이트릴 히드라타아제.

또한, 상기의 나이트릴 히드라타아제(2)~(45)는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제(1)와 비교하면 이하 표 6~표 13에 기재된 아미노산 잔기에 있어서 상위(相違)하고, 국제 공개 제2010/055666호에 형질전환체 번호와 함께 기재되어 있다. 이하의 표에 있어서, 변이 개소 란(欄)의 숫자는, 해당하는 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터의 위치를 나타내고 있다. 또한, 형질전환체 번호란, 국제 공개 제2010/055666호에 있어서 부여되어 있는 번호이다.

아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입 대상으로서 사용할 수 있는 개변 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열은, 상기 (2)~(45)의 44 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열인 것이 바람직하고, 상기 (3), (11), (18), (19), (25), (27), (28), (29), (32), (33), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41, (42), (43), (44), 및 (45) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열인 것이 보다 바람직하다.

상기 (47)에 있어서, α 서브유닛 배리언트의 아미노산 서열의 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 대한 서열 동일성은, 80% 이상이어도 되고, 혹은 85% 이상이어도 되고, 혹은 90% 이상이어도 되고, 혹은 95% 이상이어도 되고, 혹은 96% 이상이어도 되고, 혹은 97% 이상이어도 되고, 혹은 98% 이상이어도 되고, 혹은 99% 이상이어도 된다. 동일하게, 상기 (47)에 있어서, β 서브유닛 배리언트의 아미노산 서열의 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 대한 서열 동일성은, 80% 이상이어도 되고, 혹은 85% 이상이어도 되고, 혹은 90% 이상이어도 되고, 혹은 95% 이상이어도 되고, 혹은 96% 이상이어도 되고, 혹은 97% 이상이어도 되고, 혹은 98% 이상이어도 되고, 혹은 99% 이상이어도 된다. 또한, α 서브유닛 배리언트란, 상기에서 규정된 서열 동일성을 만족하지만, 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛과는 상이한 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛을 말한다. β 서브유닛 배리언트란, 상기에서 규정된 서열 동일성을 만족하지만, 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛과는 상이한 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 말한다.

상기 (2)~(45)의 나이트릴 히드라타아제는, 국제 공개 제2010/055666호에 있어서 그 활성이 실시예에 있어서 확인된(형질전환체 번호 5, 62, 68, 95 및 111) 나이트릴 히드라타아제이고, 또한, 상기 (1)의 나이트릴 히드라타아제는 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제이다. (2)~(46)의 나이트릴 히드라타아제도, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입 대상으로서 사용할 수 있다. 또한, 이 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열과 유사한 아미노산 서열을 가지는 다른 개변 나이트릴 히드라타아제도 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입 대상으로서 사용할 수 있다. 이 때문에, 개변 나이트릴 히드라타아제와 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제 사이의 아미노산 서열의 차이에 관하여 설명한 사항(서열 개변의 정도나 예에 관한 설명을 포함한다)은, 「야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제」를 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제라고 바꿔 읽어 그대로 적용할 수 있다. 또한, 개변 나이트릴 히드라타아제는, 물론, 나이트릴 히드라타아제 활성을 가져야 한다.

예를 들면, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제 B를 포함할 수 있는 아미노산 잔기 치환 및 그 조합, 및 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 36번째의 아미노산 잔기에 관해서는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제 B는 상기 표 I에 기재된 아미노산 잔기의 조합 a~o, 상기 표 II에 기재된 아미노산 잔기의 조합 p~ai, 상기 표 III에 기재된 아미노산 잔기의 조합 aj~ax, 상기 표 IV에 기재된 아미노산 잔기의 조합 ay~bd, 및 상기 표 V에 기재된 아미노산 잔기의 조합 be로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조합을 포함하고 있어도 된다. 즉, 상기 (1)~(46)의 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열에 대하여, 이와 같은 아미노산 잔기 치환의 조합을 도입할 수 있다.

또한, 예를 들면, 상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제는, 상기 (1)~(46)의 나이트릴 히드라타아제 중 어느 것에 대하여, (i) 1개 이상의 아미노산 잔기에 있어서의 다른 아미노산 잔기로의 치환, (ii) 상기 (a)~(e) 이외의 1개 이상의 아미노산 잔기의 결실, (iii) 아미노산 잔기의 삽입, (iv) α 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단 및 C 말단 중 한쪽 혹은 양쪽에의 아미노산 잔기의 부가, (v) β 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단 및 C 말단 중 한쪽 혹은 양쪽에의 아미노산 잔기의 부가로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 개변을 가한 개변 나이트릴 히드라타아제여도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛을 기준으로 한 경우에 치환된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~20이고, 혹은 1~15이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~8이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~6이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~3이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 치환된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제 β 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛을 기준으로 한 경우에 치환된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~20이고, 혹은 1~15이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~8이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~6이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~3이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 치환된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛을 기준으로 한 경우에 결실된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~10이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 결실된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛을 기준으로 한 경우에 결실된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~10이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 결실된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛을 기준으로 한 경우에 삽입된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~10이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 삽입된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛을 기준으로 한 경우에 삽입된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1~10이고, 혹은 1~7이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 삽입된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛을 기준으로 한 경우에 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는, 예를 들면, 1~20이고, 혹은 1~14이고, 혹은 1~8이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 말단 부가가 있는 경우 등은, 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는, 0이어도 된다.

상기 (47)의 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛을 기준으로 한 경우에 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는, 예를 들면, 1~20이고, 혹은 1~14이고, 혹은 1~8이고, 혹은 1~4이고, 혹은 1~2이며, 혹은 1이다. 말단 부가가 있는 경우 등은, 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는, 0이어도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛을 기준으로 한 경우에 말단 부가된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1 말단당 1~60이고, 혹은 1~40이고, 혹은 1~20이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~3이며, 혹은 1이다. 부가된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 상기 (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛을 기준으로 한 경우에 말단 부가된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1 말단당 1~60이고, 혹은 1~40이고, 혹은 1~20이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~3이며, 혹은 1이다. 부가된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

상기 (47)의 나이트릴 히드라타아제는, (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에, 상기 아미노산 잔기 치환군 B로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 것이어도 된다. 상기 아미노산 잔기 치환은 2개 이상을 조합하여 포함되어 있어도 된다.

상기에 있어서 (47)의 α／ β 서브유닛 배리언트는, 특정 나이트릴 히드라타아제의 α／ β 서브유닛의 아미노산 서열과 비교한 아미노산의 삽입이나 아미노산 잔기의 결실은 없고, 아미노산 잔기의 치환 또는 말단 부가만을 가지는 것이어도 된다. (47)의 α／ β 서브유닛 배리언트 중에 있어서의 아미노산 잔기의 위치에 관해서는, 전술한 바와 동일하게, 특정 나이트릴 히드라타아제의 α／ β 서브유닛 중의 지정된 아미노산 잔기와 얼라인먼트 상 대응하는 위치를 의미한다.

본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제는,

상기 나이트릴 히드라타아제(1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제인 특정 나이트릴 히드라타아제에 대하여, 혹은

특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 개변 α 서브유닛 및 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 개변 β 서브유닛을 가지지만 특정 나이트릴 히드라타아제 자체가 아닌 개변 나이트릴 히드라타아제에 대하여,

이하의 아미노산 잔기 치환 중 적어도 1개를 도입한 것(이하 변이형 나이트릴 히드라타아제 C라고도 한다)이어도 된다：

상기 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환,

상기 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 43번째의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기의 Val로의 치환,

상기 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 N 말단으로부터 205번째의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기의 Val로의 치환,

상기 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 N 말단으로부터 206번째의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기의 Gln으로의 치환,

상기 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 N 말단으로부터 215번째의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환.

상기 설명에 있어서, 상기 도입 전의 나이트릴 히드라타아제가 상기 개변 나이트릴 히드라타아제인 경우, 「특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 A번째의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기」란, 상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 아미노산 서열을 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 아미노산 서열에 대하여 얼라인먼트했을 때에, 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 A번째의 아미노산 잔기와 대응하는 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 아미노산 서열 상의 아미노산 잔기를 가리키며, 동일하게 「특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 N 말단으로부터 A번째의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기」란, 상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 아미노산 서열을 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 아미노산 서열에 대하여 얼라인먼트했을 때에, 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 아미노산 서열의 N 말단으로부터 A번째의 아미노산 잔기와 대응하는 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 아미노산 서열 상의 아미노산 잔기를 가리킨다. 또한, 상기 도입 전의 나이트릴 히드라타아제가 특정 나이트릴 히드라타아제인 경우, 「특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 A번째의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기」란, 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 A번째의 아미노산 잔기를 가리키며, 「특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 N 말단으로부터 A번째의 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기」란, 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 N 말단으로부터 A번째의 아미노산 잔기를 가리킨다.

상기 개변 나이트릴 히드라타아제에 있어서, 그 α 서브유닛의, 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 대한 서열 동일성은, 80% 이상이어도 되고, 혹은 85% 이상이어도 되고, 혹은 90% 이상이어도 되고, 혹은 95% 이상이어도 되고, 혹은 96% 이상이어도 되고, 혹은 97% 이상이어도 되고, 혹은 98% 이상이어도 되고, 혹은 99% 이상이어도 된다. 동일하게, 그 β 서브유닛의, 상기 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 대한 서열 동일성은, 80% 이상이어도 되고, 혹은 85% 이상이어도 되고, 혹은 90% 이상이어도 되고, 혹은 95% 이상이어도 되고, 혹은 96% 이상이어도 되고, 혹은 97% 이상이어도 되고, 혹은 98% 이상이어도 되고, 혹은 99% 이상이어도 된다. 특히, 상기 개변 나이트릴 히드라타아제에 있어서, 그 α 서브유닛의, 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 대한 서열 동일성은, 90% 이상인 것이 바람직하고, 95% 이상인 것이 보다 바람직하다. 동일하게, 상기 개변 나이트릴 히드라타아제에 있어서, 그 β 서브유닛의, 특정 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 대한 서열 동일성은, 90% 이상인 것이 바람직하고, 95% 이상인 것이 보다 바람직하다. 개변 나이트릴 히드라타아제와 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제 사이의 아미노산 서열의 차이에 관하여 설명한 사항(서열 개변의 정도나 예에 관한 설명을 포함한다)은, 「야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제」를 특정 나이트릴 히드라타아제라고 바꿔 읽어 그대로 적용할 수 있다. 상기에 있어서 개변 나이트릴 히드라타아제의 α／ β 서브유닛의 아미노산 서열은, 특정 나이트릴 히드라타아제의 α／ β 서브유닛의 아미노산 서열과 비교한 아미노산의 삽입이나 아미노산 잔기의 결실은 없고, 아미노산 잔기의 치환 또는 말단 부가만을 가지는 것이어도 된다. 또한, 개변 나이트릴 히드라타아제는, 물론, 나이트릴 히드라타아제 활성을 가져야 한다.

상기 변이형 나이트릴 히드라타아제 C를 포함할 수 있는 아미노산 잔기 치환 및 그 조합, 및 상기 특정 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 36번째에 대응하는 아미노산 잔기에 관해서는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제 C는 상기 표 I에 기재된 아미노산 잔기의 조합 a~o, 상기 표 II에 기재된 아미노산 잔기의 조합 p~ai, 상기 표 III에 기재된 아미노산 잔기의 조합 aj~ax, 상기 표 IV에 기재된 아미노산 잔기의 조합 ay~bd, 및 상기 표 V에 기재된 아미노산 잔기의 조합 be로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기의 조합을 포함하고 있어도 된다. 즉, 특정 나이트릴 히드라타아제 또는 개변 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열에 대하여, 이와 같은 아미노산 잔기 치환의 조합을 도입할 수 있다.

또한, 예를 들면, 상기 개변 나이트릴 히드라타아제는, (1)~(46) 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에, 상기 아미노산 잔기 치환군 B로부터 선택되는 1개 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 것이어도 된다. 상기 아미노산 잔기 치환은 2개 이상을 조합하여 포함되어 있어도 된다.

또한, 이상에서 설명한 개변 나이트릴 히드라타아제는, 상기에서 특정된 α 서브유닛 또는 그 N 말단 혹은 C 말단 혹은 그 양쪽에 부가 서열을 추가한 폴리펩타이드와, 상기에서 특정된 β 서브유닛 또는 그 N 말단 혹은 C 말단 혹은 그 양쪽에 부가 서열을 추가한 폴리펩타이드를 가지는 나이트릴 히드라타아제여도 된다. 상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 말단 부가된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1 말단당 1~60이고, 혹은 1~40이고, 혹은 1~20이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~3이며, 혹은 1이다. 부가된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다. 상기 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 말단 부가된 아미노산 잔기의 수는, 예를 들면, 1 말단당 1~60이고, 혹은 1~40이고, 혹은 1~20이고, 혹은 1~10이고, 혹은 1~5이고, 혹은 1~3이며, 혹은 1이다. 부가된 아미노산 잔기의 수는 0이어도 된다.

개변 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛에 있어서, 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 서열(상기 (a) 및 (b)의 치환되는 아미노산 잔기를 제외한다)을 포함하는 경우는, 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는 1~10인 것이 바람직하고, 1~5인 것이 보다 바람직하다. 동일하게, 개변 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛에 있어서, 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 서열(상기 (c)~(e)의 치환되는 아미노산 잔기를 제외한다)을 포함하는 경우는, 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 잔기의 총수는 1~10인 것이 바람직하고, 1~5인 것이 보다 바람직하다.

본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 일반적으로, 상기와 같이 규정된 α 서브유닛 2개와, 상기와 같이 규정된 β 서브유닛 2개가 회합되어, 기능하는 것이다.

본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 종래의 나이트릴 히드라타아제 변이체와 달리, pH3.5~6.5 등의 산성 조건 하에 있어서도, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물의 합성 반응에 대하여 양호한 효소 활성을 나타낸다. 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제가 가지는 상기 산성 조건 하에 있어서의 효소 활성의 안정성의 향상은, pH5.0 이하의 영역에서 특히 현저하다. 그 때문에, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제에 의하면, 나이트릴 히드라타아제를 이용한 공업적인 아마이드 화합물의 제조 프로세스에 있어서, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 합성시키는 반응을 진행시키는 반응 공정뿐만 아니라, pH3.5~6.5 등의 산성 조건 하에서 활성탄을 사용하고, 그 용액 중에 존재하는 단백질 등의 불순물을 흡착 제거하여 정제된 아마이드 화합물을 얻는 정제 공정에 있어서도, 기질인 나이트릴 화합물을 아마이드 화합물로 전환하는 그 아마이드 화합물의 합성 반응을 충분히 진행시키는 것이 가능하게 된다. 그 때문에, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제에 의하면, 종래의 효소를 사용하는 경우와 비교하여, 공업적인 아마이드 화합물의 제조 프로세스에 있어서, 목적의 생성물인 아마이드 화합물의 제조 효율을 비약적으로 향상시키는 것이 가능하다. 상기 산성 조건은, 불필요한 단백질의 보다 효율적인 제거를 위해서 5.0 이하의 pH, 예를 들면 pH3.5~pH5.0에서 실시해도 된다.

또한, 산처리(예를 들면 pH4.0, 30℃, 30시간의 처리)를 실시한 변이형 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도(初速度)의, 산 처리를 실시하지 않은 변이형 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도에 대한 비(比)(산처리 후의 반응 초속도/산처리 전의 반응 초속도)의 값은, 산처리를 실시한 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도의, 산 처리를 실시하지 않은 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도에 대한 비(산처리 후의 반응 초속도/산처리 전의 반응 초속도)의 값에 대하여, 1.1배 이상의 값을 나타내고 있는 것이 바람직하다.

또한, 상술한 변이형 나이트릴 히드라타아제 또는 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성은, 예를 들면, 이하의 방법에서 평가할 수 있다.

반응 조건으로서, 기질인 아크릴로나이트릴을 2.5%(v／v) 포함하는, 50mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)에서, 반응 온도 20℃에서 15분 내지 60분 반응시킨다. 반응 종료 후, 생성된 아크릴 아마이드를 정량한다. 아크릴 아마이드량은 HPLC에 의해 분석할 수 있다. 또한, 산처리는, 예를 들면, pH4.0 부근에서 30℃, 30시간 처리함으로써 실시할 수 있다. 구체적으로는, 실시예에 있어서의 pH 안정성의 평가의 란에 기재한 방식으로 평가할 수 있다.

예를 들면, 나이트릴 히드라타아제를 생산하는 형질전환체의 배양 종료액 40μl을 740μL의 54mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)에 현탁하고, 이것에 20μL의 아크릴로나이트릴을 첨가하여 20℃에서 서서히 교반하면서 15분 내지 60분간 반응시키고, 반응 종료 후에 HPLC를 사용하여 반응액의 분석을 실시하고, 생성된 아마이드 화합물의 양(P)을 측정한다(혹은 소비된 나이트릴 화합물의 양으로부터 계산해도 된다). 또한, 상기 형질전환체의 배양 종료액 1000μl을 취하고, 원심분리하여 회수한 균체에 50mM 시트르산 완충액(pH4.0) 1000μl을 첨가하여, 교반하면서 30℃에서 30시간 처리한다(산처리). 처리 후, 780μl을 원심분리하여 균체를 회수하고, 780μL의 54mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)에 현탁하고, 이것에 20μL의 아크릴로나이트릴을 첨가하여 20℃에서 서서히 교반하면서 15분 내지 60분간 반응시키고, 반응 종료 후에 HPLC를 사용하여 반응액의 분석을 실시하고, 생성된 아마이드 화합물의 양(Q)을 측정한다(혹은 소비된 나이트릴 화합물의 양으로부터 계산해도 된다). 반응 및 분석은 각각의 조건에 관하여 3회 이상 실시한다. 산처리 후의 나이트릴 히드라타아제에 의해 얻어진 아마이드 화합물의 양(Q)을 산처리 전의 나이트릴 히드라타아제에 의해 얻어진 아마이드 화합물의 양(P)으로 나누어, 몫(R)을 구한다. 몫 R을 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 관하여, 및 시험 대상의 나이트릴 히드라타아제에 관하여 각각 구하고, 시험 대상의 나이트릴 히드라타아제에 있어서의 R의 값의, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서의 R에 대한 비(시험 대상/야생형)를 구한다. 이 비가 1.0을 초과하고 있으면, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제와 비교하여 pH 안정성이 향상되고 있는 것이 나타난다.

본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제보다도 상기에 의해 구한 R값이 높은 것이고, 변이형 나이트릴 히드라타아제의 R값은 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 R값의 1.1배 이상인 것이 바람직하고, 1.2배 이상인 것이 보다 바람직하고, 1.3배 이상인 것이 보다 바람직하며, 1.4배 이상인 것이 보다 바람직하다.

또한, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 상술한 바와 같이, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물의 합성 반응에 대하여, 종래의 변이형 나이트릴 히드라타아제와 비교하여 폭넓은 pH영역에 있어서 효소 활성을 나타낸다고 하는 점에서, pH 안정성이 뛰어난 효소이다. 그리고, 상술한 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환이 모두 나이트릴 히드라타아제의 효소 활성의 pH 안정성을 향상시키는 요인에 관하여, 본 발명자들이 고찰한 결과, 상술한 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환에 관련되는 아미노산은, 모두, 효소의 기질 포켓 근방에 존재하고 있는 것이 판명되었다. 상술한 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환 중 1개 이상을 포함함으로써, 단백질의 입체 구조(폴딩 상태)가 폭넓은 pH영역에 있어서 양호한 상태로 유지되고 있다고 생각된다. 이 때문에, 상기 (a)에서 (e)의 아미노산 잔기 치환은 한 무리의 아미노산 잔기 치환이라고 생각된다(아미노산 잔기 치환군 A).

또한, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는, α 서브유닛과 β 서브유닛이 회합된 2량체가 그 기본 구조 단위로 되어 있고, 그 2량체가 더 회합되어 4량체를 형성한다. α 서브유닛의 N 말단으로부터 111번째의 아미노산 잔기인 시스테인 잔기가 시스테인설핀산(Cys-SOOH)에, N 말단으로부터 113번째의 아미노산 잔기인 시스테인 잔기가 시스테인설펜산(Cys-SOH)으로 각각 번역 후 수식(修飾)을 받고, 이 수식 아미노산 잔기를 통하여 α 서브유닛의 폴리펩타이드 사슬과 코발트 원자가 결합되어, 활성 중심을 형성하는 것이다.

야생형의 슈도노카르디아·서모필라(Pseudonocardia　thermophila) 유래의 나이트릴 히드라타아제를 형질전환체내에서 대량으로 발현시킬 수 있는 플라스미드 및 그 플라스미드에 의해 형질전환된 세포주로서는, MT-10822(수탁 번호 FERM BP-5785로서 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1　독립행정법인 산업기술총합연구소 특허 생물 기탁 센터에 1996년 2월 7일부터 기탁되어 있다)를 사용할 수 있다. 또한, 개변 나이트릴 히드라타아제는, 통상의 유전자 조작 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 단백질의 입체 구조는, 일반적으로, 아미노산 서열의 상동성이 높은 경우, 그 단백질을 포함하는 균주의 종속(種屬)에 관계 없이, 유사한 구조를 가질 개연성이 높다고 여겨지고 있기 때문에, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입에 의해 얻을 수 있는 효과는, 개변 나이트릴 히드라타아제를 포함하고, 상기에서 규정된 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제 일반에 대하여 발휘된다. 그리고, 얻어진 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 예를 들면, pH8.0에 있어서의 효소 활성에 비교한 pH4.0에 있어서의 효소 활성에 의해 평가되는 pH 안정성이, 아미노산 잔기 치환(a)~(e) 중 1개 이상의 도입 전에 비교하여 향상되어 있어도 된다.

또한, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 상기 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환 중 적어도 1개를 포함하는 것이다. 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는, (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환을 1개만 포함하고 있어도 되고, 2개 이상 포함하고 있어도 된다. 예를 들면, 2개의 조합의 경우, (a)와 (b)의 조합, (a)와 (c)의 조합, (a)와 (d)의 조합, (a)와 (e)의 조합, (b)와 (c)의 조합, (b)와 (d)의 조합, (b)와 (e)의 조합, (c)와 (d)의 조합, (c)와 (e)의 조합, (d)와 (e)의 조합, 및 (d)와 (f)의 조합을 들 수 있다.

3개의 조합의 경우, 예를 들면, , (a), (b) 및 (c)의 조합, (a), (b) 및 (d)의 조합, (a), (b) 및 (e)의 조합, (a), (c) 및 (d)의 조합, (a), (c) 및 (e)의 조합, (a), (d) 및 (e)의 조합, (b), (c) 및 (d)의 조합, (b), (c) 및 (e)의 조합, (b), (d) 및 (e)의 조합, 및 (c), (d) 및 (e)의 조합을 들 수 있다.

4개의 조합의 경우, 예를 들면, (a), (b), (c) 및 (d)의 조합, (a), (b), (c) 및 (e)의 조합, (a), (b), (d) 및 (e)의 조합, (a), (c), (d) 및 (e)의 조합, 및 (b), (c), (d) 및 (e)의 조합을 들 수 있다.

물론, (a)~(e)는 5개 조합하여 치환해도 상관없다.

일 실시형태에 있어서는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 상기 (b)의 아미노산 잔기 치환, 및 이것에 더하여 상기 (a) 및 (c)~(e)의 아미노산 잔기 치환으로 이루어지는 군 중 1개 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 상기 (b)의 아미노산 잔기 치환과 함께 포함되는 상기 (a) 및 (c)~(e)의 아미노산 잔기 치환으로 이루어지는 군 중 1개 이상의 아미노산 잔기 치환은, 2개의 아미노산 잔기 치환이어도 되고, 3개의 아미노산 잔기 치환이어도 되고, 4개의 아미노산 잔기 치환(즉, (a) 및 (c)~(e)의 모두)이어도 된다. 또한, 이 실시형태에 있어서는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는 상기 (f)의 아미노산 잔기 치환을 더 가지고 있어도 된다.

그리고, 상술한 바와 같이, (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환 중 적어도 1개를 도입하는 대상이 되는 개변 나이트릴 히드라타아제는, 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제 또는 상술한 (1)~(5)의 특정 서열에 대하여 아미노산의 치환 등의 개변을 포함하는 것이어도 된다. 이 때문에, 변이형 나이트릴 히드라타아제도, 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제 또는 상술한 (1)~(5)의 특정 서열과 비교하여, 상기 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환에 더하여, 상기 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환 이외의 위치의 아미노산 잔기 치환을 포함하고 있어도 상관없다. 이와 같이 다른 아미노산 잔기 치환을 포함하는 변이형 나이트릴 히드라타아제여도, 입체 구조상 특정의 위치에 위치하는 아미노산 잔기 치환군 A에 의한 효과는 얻을 수 있다.

일 실시형태에 있어서는, 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제는, pH 안정성의 향상뿐만 아니라, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 생성하는 반응의 초속도에 있어서도 향상을 가지는 것이다. 즉, (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환 중 적어도 1개를 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제 또는 개변 나이트릴 히드라타아제에 도입함으로써, 도입 전의 반응 초속도보다도 향상된 반응 초속도를 나타내는 나이트릴 히드라타아제를 얻을 수 있다. 반응 초속도는, 예를 들면, 변이형 나이트릴 히드라타아제를 생산하는 형질전환체의 배양 종료액 40μl을 740μL의 54mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)에 현탁하고, 이것에 20μL의 아크릴로나이트릴을 첨가하여 20℃에서 서서히 교반하면서 15분 내지 60분간 반응시키고, 반응 종료 후에 HPLC를 사용하여 반응액의 분석을 실시함으로써 구할 수 있다. 또한, 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제보다도 높은 반응 초속도를 pH8.0으로 나타내는 것이 바람직하고, 1.1배 이상 높은 반응 초속도를 나타내는 것이 보다 바람직하고, 1.2배 이상 높은 반응 초속도를 나타내는 것이 보다 바람직하고, 1.3배 이상 높은 반응 초속도를 나타내는 것이 보다 바람직하며, 1.4배 이상 높은 반응 초속도를 나타내는 것이 보다 바람직하다.

상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 이하의 방법으로 제조할 수 있다.

예를 들면, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터를 준비하고, 이 발현 벡터에 의해 임의의 숙주 세포를 형질전환해 형질전환체 또는 세포주를 취득하고, 이어서, 상기 형질전환체나 세포주를 배양하여 변이형 나이트릴 히드라타아제를 산생(産生)할 수 있다.

여기서, 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 유전자는, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진다. 또한. 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열은, 서열번호 1로 이루어지는 아미노산 서열에 대응하며, 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열은, 서열번호 2로 이루어지는 아미노산 서열에 대응한다.

그리고, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 DNA는, 적어도, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열에 있어서의, 상기 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환 위치에 대응하는 코돈(합계 5개소) 중 1개 이상에 하기의 뉴클레오티드 치환을 가지고 있고, 그 밖의 위치에 있어서도 개변 나이트릴 히드라타아제에 대응하는 뉴클레오티드 치환을 가지고 있다.

구체적으로는, 예를 들면, 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기인 Asp 잔기를 Asn으로 치환한 변이체를 제작하는 경우, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5＇말단으로부터 118~120번째의 뉴클레오티드인 GAC를 AAC 또는 AAT로 치환한 DNA를 사용하면 된다.

야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 43번째의 아미노산 잔기인 Ala 잔기를 Val로 치환한 변이체를 제작하는 경우, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5＇말단으로부터 127~129번째의 뉴클레오티드인 GCC를 GTT, GTC, GTA 또는 GTG로 치환한 DNA를 사용하면 된다.

야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 N 말단으로부터 205번째의 아미노산 잔기인 Gly잔기를 Val로 치환한 변이체를 제작하는 경우, 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5＇말단으로부터 613~615번째의 뉴클레오티드인 GGG를 GTT, GTC, GTA 또는 GTG로 치환한 DNA를 사용하면 된다.

야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛의 N 말단으로부터 206번째의 아미노산 잔기인 Pro잔기를 Gln으로 치환되어 있는 변이체를 제작하는 경우, 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5＇말단으로부터 616~618번째의 뉴클레오티드인 CCG를 CAA 또는 CAG로 치환한 DNA를 사용하면 된다.

야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 215번째의 아미노산 잔기인 Tyr잔기를 Asn으로 치환한 변이체를 제작하는 경우, 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5＇말단으로부터 643~645번째의 뉴클레오티드인 TAC를 AAC 또는 AAT로 치환한 DNA를 사용하면 된다.

또한, 아미노산 잔기 치환(f)에 관해서는, 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 36번째의 아미노산 잔기인 Thr잔기를 Trp로 치환한 변이체를 제작하는 경우, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5＇말단으로부터 106~108번째의 뉴클레오티드인 ACG를 TGG로 치환한 DNA를 사용하면 된다.

상기 발현 벡터는, 변이형 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛을 코드하는 유전자 및 변이형 나이트릴 히드라타아제의 β 서브유닛을 코드하는 유전자를 포함하고, 또한, 각 유전자의 발현에 필요한 제어 영역 및 자율 복제에 필요한 영역 등의, 형질전환체나 세포주에 의한 변이형 나이트릴 히드라타아제의 산생을 가능하게 하는 요소를 필요에 따라 포함한다. 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포는 임의의 세포여도 되지만, 예를 들면 대장균을 들 수 있다.

발현에 필요한 제어 영역으로서는, 프로모터 서열(전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함한다.), 리보좀 결합 서열(SD서열), 전사 종결 서열 등을 들 수 있다. 구체적인 프로모터 서열의 예로서는, 대장균 유래의 트립토판오페론의 trp 프로모터, 락토스오페론의 lac 프로모터, 람다 파지(lambda phage) 유래의 PL 프로모터 및 PR 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, tac 프로모터나 trc 프로모터와 같이 인위적으로 설계·개변된 서열도 사용할 수 있다.

리보좀 결합 서열로서는, 서열번호 74에 포함되는, TAAGGAGGT를 가지는 서열이 바람직하고, 이것들 제어 영역의 발현 벡터 상에서의 서열 순서는, 프로모터 서열과 리보좀 결합 서열은 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 유전자보다 5'말단측 상류에 위치하는 것이 바람직하고, 전사 종결 서열은 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 유전자보다 3'말단측 하류에 위치하는 것이 바람직하다. 또한, 그 같은 제어 영역에 의해 변이형 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛 유전자 및 β 서브유닛 유전자가 각각 독립된 시스트론으로서 발현되어도 되고, 공통의 제어 영역에 의해 폴리시스트론으로서 발현되어도 된다.

이상의 요건을 만족하고 있는 벡터의 예로서는, 대장균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 포함하고 있는 pBR322, pUC18, pBluescript, pKK223-3, pSC101를 들 수가 있다.

이와 같은 벡터에 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 유전자를 그 변이형 나이트릴 히드라타아제의 활성의 발현에 필요한 영역과 함께 삽입함으로써, 본 개시에 관련되는 발현 벡터를 구축하는 방법이나, 그 발현 벡터를 원하는 숙주 세포로 형질전환하는 방법, 또한 그 형질전환체내에서 나이트릴 히드라타아제를 산생시키는 방법 등에 관해서는, 예를 들면 「Molecular Cloning 3rd Edition」(J.Sambrook 등；Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 등에 기재되어 있는 분자생물학, 생물 공학, 및 유전자 공학의 분야에 있어서 공지의 일반적인 방법이나 숙주 세포를 채용할 수 있다.

상술한 발현 벡터를 원하는 숙주 세포로 형질전환하여 얻어진 형질전환체는, 배지에서 배양함으로써, 상기 발현 벡터가 포함하는 나이트릴 히드라타아제 유전자에 근거하는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 생산할 수 있다. 숙주 세포가 대장균인 경우, 상기 형질전환체를 배양하는 배지로서 LB 배지나 M9 배지 등이 일반적으로 사용되지만, 보다 바람직하게는 그와 같은 배지에 성분으로서 Fe 이온 및 Co 이온을 0.1μg/mL 이상 포함시킨 배지이다. 상기 형질전환체를 배지에 식균한 후, 적당한 배양 온도(일반적으로는, 20℃~50℃)에서 생육시키면 된다.

상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 유전자를 발현시켜 원하는 효소 활성을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 생산하는 경우, 나이트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자도 모두 발현시켜도 된다.

이 나이트릴 히드라타아제의 활성화에 관여하는 단백질이란, 그 단백질의 발현의 유무가, 나이트릴 히드라타아제의 활성화를 직접 좌우하는 성질을 가지고 있는 단백질의 것이며, 일본 특허공개 특개평11-253168호 공보에 기재되는 슈도노카르디아·서모필라 유래의 나이트릴 히드라타아제 활성화에 관여하는 단백질(나이트릴 히드라타아제 활성화 단백질)을 그 대표예로서 들 수가 있다. 상기 나이트릴 히드라타아제 활성화 단백질의 서열은 서열번호 75로 표시된다.

＜핵산＞

본 개시에 관련되는 핵산은, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 가진다.

상기 변이형 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 합성하는 방법으로서, 대응하는 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 뉴클레오티드 서열에 변이점을 도입하는 방법이나, 변이점을 포함하는 전(全) 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하는 방법 등을 들 수 있다. 야생형의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 주형(鑄型)으로 하여, 유전자에 변이를 발생시키게 하는 방법으로서는, 예를 들면, 부위 특이적 변이법(Kramer, W. and frita, H.J., Methods in Enzymology, vol.154, P.350(1987)), 리콘비난트 PCR법(PCR Technology, Stockton Press(1989), 특정의 부분의 DNA를 화학 합성하는 방법, 유전자를 하이드록시아민 처리하는 방법, 유전자를 보유하는 균주를 자외선 조사하는 방법, 나이트로소구아니딘이나 아질산 등의 화학 약제로 처리하는 방법, 시판되는 돌연변이 도입 키트(kit)를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 본 개시에 관련되는 핵산은 DNA여도 RNA여도 된다.

＜벡터＞

본 개시에 관련되는 벡터는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열로 나타나는 핵산을 포함하는 벡터이면 특별히 한정되지 않으며, 공지의 벡터에 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 도입한 것을 예로서 들 수 있다. 또한, 상기 벡터는 파지 벡터여도 플라스미드 벡터여도 상관없다.

＜발현 벡터＞

본 개시에 관련되는 발현 벡터는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열로 나타나는 핵산을 포함하는 발현 벡터이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 형질전환 효율이나 번역 효율을 향상시키는 등의 관점으로부터, 이하에 나타내는 구성을 나타내는 플라스미드 벡터나 파지 벡터인 것이 보다 바람직하다.

〔발현 벡터의 기본 구성〕

발현 벡터는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 숙주 세포를 형질전환할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 필요에 따라, 그 뉴클레오티드 서열 외에, 다른 영역을 구성하는 뉴클레오티드 서열(이하, 간단히 「다른 영역」이라고도 한다.)을 포함하고 있어도 된다.

다른 영역으로서는, 예를 들면, 상기 형질전환체가, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 산생하기 위해서 필요로 하는 제어 영역이나, 자율 복제에 필요한 영역 등을 들 수 있다.

또한, 상기 형질전환체의 선택을 용이하게 한다고 하는 관점으로부터, 선택 마커가 될 수 있는 선택 유전자를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하고 있어도 된다.

상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 산생하기 위해서 필요한 제어 영역으로서는, 프로모터 서열(전사를 제어하는 오퍼레이터 서열을 포함한다.), 리보좀 결합 서열(SD서열), 전사 종결 서열 등을 들 수 있다.

〔효모를 숙주 세포로 한 경우의 발현 벡터〕

효모를 숙주 세포로 한 경우, 발현 벡터로서는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 뉴클레오티드 서열 외에, 프로모터 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 프로모터 서열로서는, 효모를 숙주 세포로 하는 형질전환체내에서 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현할 수 있는 것이면 어느 것을 사용해도 된다.

예를 들면 알코올데하이드로게나아제(ADH1) 프로모터, 포스포글리세레이트키나아제(PGK1) 프로모터, 펩타이드 사슬 신장 인자(TEF) 프로모터, 글라이세롤 3-인산데하이드로게나아제(GPD) 프로모터, 갈락토키나아제(GAL1) 프로모터, 메탈로티오네인(CUP1) 프로모터, 억제성 산성 포스파타아제(PHO5) 프로모터, 글리세르알데하이드-3-인산데하이드로게나아제(GAPDH) 프로모터 등의 프로모터 서열이 사용된다.

또한, 상기 프로모터 서열의 유래는 숙주 세포가 되는 효모에 한정되지 않는다.

사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터 등과 같이, 외래의 프로모터를 사용해도 된다. 이들은 사용하는 효소의 유래나 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다.

또한, 상기 발현 벡터는, 분비 시그널을 포함하고 있어도 된다. 이에 의해, 형질전환체가 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 산생한 경우, 세포 외에 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 분비하는 것이 가능하게 된다.

분비 시그널로서는, 숙주 세포가 되는 효모로부터 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 분비할 수 있는 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 분비 효율의 관점으로부터, α팩터 시그널 서열, 인베르타아제 시그널 서열, 산(酸)포스파이터 시그널 서열, 글루코아밀라아제 시그널 서열 등을 사용하는 것이 바람직하다.

이상과 같은 프로모터 서열이나 분비 시그널을 포함하는 발현 벡터로서는, 구체적으로는 pRS423, pRS424, YEplac195 등을 들 수 있다.

〔사상균을 숙주 세포로 한 경우의 발현 벡터〕

사상균을 숙주 세포로 한 경우, 발현 벡터로서는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 뉴클레오티드 서열 외에, 프로모터 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 프로모터 서열로서는, 사상균을 숙주 세포로 하는 형질전환체내에서 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현할 수 있는 것이면 어느 것을 사용해도 된다.

사상균에 대하여 적절한 발현 벡터는,van　den　Hondel, C.A.M.J.J.et　al.(1991) In：Bennett, J.W.and　Lasure,　L.L.(eds.) More　gene　Manipulations　in Fungi.Academic　Press, pp.396-428에 기재되어 있다. 　

또한, pUC18, pBR322, pUC100, pSL1180(파마시아·잉크사제), pFB6 및 아스페르길루스(Aspergillus) pRAX, 트리코데르마(Trichoderma) pTEX 등과 같은 일반적으로 사용되는 다른 발현 벡터를 사용할 수도 있다.

〔원핵생물을 숙주 세포로 한 경우의 발현 벡터〕

대장균, 고초균, 방선균 등의 원핵생물을 숙주 세포로 하는 경우, 발현 벡터는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 뉴클레오티드 서열 외에, 프로모터 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 프로모터 서열 외에 리보좀 결합 서열이나 전사 종결 서열 등을 포함하고 있어도 된다.

프로모터 서열의 예로서는, 대장균 유래의 트립토판오페론의 trp 프로모터, 락토스오페론의 lac 프로모터, 람다 파지 유래의 PL 프로모터 및 PR 프로모터나, 고초균 유래의 글루콘산 합성 효소 프로모터(gnt), 알칼리프로테아제 프로모터(apr), 중성 프로테아제 프로모터(npr), α-아밀라아제 프로모터(amy) 등을 들 수 있다.

또한, tac 프로모터와 같이 독자적으로 개변 또는 설계된 프로모터 서열도 사용할 수 있다.

리보좀 결합 서열로서는, 대장균 유래 또는 고초균 유래의 서열을 들 수 있지만, 대장균이나 고초균 등의 원하는 숙주 세포내에서 기능하는 서열이면 특별히 한정되는 것은 아니다.

상기 리보좀 결합 서열로서는, 예를 들면, 16S 리보좀 RNA의 3＇말단 영역에 상보적인 서열 중, 4 뉴클레오티드 이상 연속한 콘센서스 서열을 DNA 합성에 의해 작성된 서열 등을 들 수 있다.

전사 종결 서열은 반드시 필요하지는 않지만, ρ인자 비(非)의존성의 것, 예를 들면 리포프로테인터미네이터, trp 오페론터미네이터 등을 이용할 수 있다.

이들 제어 영역의 발현 벡터 상에서의 서열 순서는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 전사 효율을 고려하면 5＇말단측 상류로부터 프로모터 서열, 리보좀 결합 서열, 목적 단백질을 코드하는 유전자, 전사 종결 서열의 순서로 나열되는 것이 바람직하다.

여기서 말하는 발현 벡터의 구체적인 예로서는, 대장균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 포함하고 있는 pBR322, pUC18, Bluescript　II　SK(＋), pKK223-3, pSC101이나, 고초균 중에서의 자율 복제 가능한 영역을 포함하고 있는 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, φ1, φ105 등을 발현 벡터로서 이용할 수 있다.

또한, 2 종류 이상의 숙주 내에서의 자율 복제가 가능한 발현 벡터의 예로서, pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7 등을 발현 벡터로서 이용할 수 있다.

〔형질전환체의 제작 방법〕

본 개시에 관련되는 형질전환체는, 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 뉴클레오티드 서열과, 필요에 따라 상기 다른 영역을 포함하는 상기 발현 벡터를 구축하고, 그 발현 벡터를 원하는 숙주 세포로 형질전환하는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, Sambrook, J., et.al., "Molecular　Cloning　A　Laboratory　Manual,　3rd　Edition", Cold　Spring　Harbor　Laboratory Press, (2001) 등에 기재되어 있는 분자 생물학, 생물 공학 및 유전자 공학의 분야에 있어 공지의 일반적인 방법을 이용할 수 있다.

본 개시에 관련되는 형질전환체는, 상기 숙주 세포에 상기 발현 벡터를 조립할뿐만 아니라, 필요에 따라 상기 숙주 세포에서의 사용 빈도가 낮은 코돈을, 사용 빈도가 높은 코돈으로 하도록, 사일런트 변이를 도입하는 것 등을 아울러 실시하여 제작할 수도 있다.

이에 의해, 발현 벡터에 조립한 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제 유래의 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있는 가능성이 있다.

사일런트 변이의 도입에 관하여, 숙주 세포에서의 코돈 사용 빈도에 맞추어 발현 벡터 상에 있는 그 나이트릴 히드라타아제 유전자 및 그 나이트릴 히드라타아제 유전자를 세포 바깥으로 분비시키기 위한 시그널 서열의 코돈을 조정하는 방법이면, 사일런트 변이 도입의 방법, 변이점, 변경하는 뉴클레오티드의 종류 등은 특별히 제한되지 않는다.

＜변이형 나이트릴 히드라타아제의 제조 방법＞

본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제의 제조 방법은, 상기 형질전환체를 배지 중에서 배양하는 것, 및 배양된 형질전환체 및 배지 중 적어도 한쪽으로부터, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 회수하는 것을 포함한다.

〔형질전환체의 배양 방법〕

상기 발현 벡터로 형질전환하여 얻어진 형질전환체의 배양의 조건은, 형질전환 전의 숙주 세포의 배양 조건과 동일하고, 공지의 조건을 이용할 수 있다.

배지로서는 탄소원, 질소원, 무기물 및 그 밖의 영양소를 적당량 함유하는 배지라면 합성 배지 또는 천연 배지 중 어느 것이어도 사용 가능하다. 배지에 사용되는 성분으로서는, 공지의 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 맥아 엑기스, 펩톤, NZ아민 및 감자 등의 유기 영양원, 글루코오스, 말토오스, 자당, 전분 및 유기산 등의 탄소원, 황산암모늄, 요소(尿素) 및 염화암모늄 등의 질소원, 인산염, 마그네슘, 칼륨 및 철 등의 무기 영양원, 비타민류를 적절히 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 선택 마커를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체의 배양에 있어서는, 예를 들면, 상기 선택 마커가 약제 내성인 경우에는, 그에 대응하는 약제를 포함하는 배지를 사용하고, 상기 선택 마커가 영양 요구성인 경우에는, 그에 대응하는 영양소를 포함하지 않는 배지를 사용한다. 배지의 pH는, pH4~pH8의 범위에서 선택하면 된다.

배양은 상기 배지를 함유하는 액체 배지 중에서, 상기 형질전환체를 진탕 배양, 환기 교반 배양, 연속 배양, 유가(流加) 배양 등의 통상의 배양 방법을 이용하여 실시할 수 있다.

배양 조건은, 상기 형질전환체, 배지, 배양 방법의 종류에 따라 적절히 선택하면 되고, 형질전환체가 생육되어, 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 산생할 수 있는 조건이면 특별히 제한은 없다.

배양 온도는 20℃~45℃, 바람직하게는 24℃~37℃에서 호기적으로 배양을 실시한다.

배양 기간은 1일간~7일간의 범위에서 목적의 변이형 나이트릴 히드라타아제 활성을 가지는 단백질의 함량이 최대가 될 때까지 배양하면 된다.

변이형 나이트릴 히드라타아제 회수 공정

변이형 나이트릴 히드라타아제 회수 공정은, 배양된 형질전환체 및 배양 후의 배지 중 적어도 어느 한쪽으로부터, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 회수하는 공정이다.

형질전환된 형질전환체를 배양한 후, 본 개시에 관련되는 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 회수하는 방법은, 이 분야에서 관용되고 있는 방법을 사용할 수 있다.

본 개시에 관련되는 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제가 형질전환된 형질전환체 바깥으로 분비되는 경우는, 그 형질전환체의 배양물을 원심분리, 여과 등을 실시함으로써 조효소액(粗酵素液)을 용이하게 얻을 수 있다. 또한, 본 개시에 관련되는 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제가 형질전환된 형질전환체 내에 축적되는 경우는, 배양한 그 형질전환체를 원심분리 등의 수단에 의해 회수하고, 회수한 그 형질전환체를 완충액에 현탁하고, 라이소자임 처리, 동결 융해, 초음파 파쇄 등의 공지의 방법에 따라 그 형질전환체의 세포막을 파괴함으로써, 조효소액을 회수하면 된다.

상기 조효소액을, 한외여과법 등에 의해 농축하고, 방부제 등을 첨가하여 농축 효소로서 이용하는 것이 가능하다. 또한, 농축한 후, 스프레이 드라이법 등에 의해 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제의 분말 효소를 얻을 수도 있다.

회수된 나이트릴 히드라타아제 활성을 가지는 조효소액에 관하여, 분리 정제를 필요로 하는 경우는, 예를 들면, 황산암모늄 등에 의한 염석(鹽析), 알코올 등에 의한 유기용매 침전법, 투석 및 한외여과 등에 의한 막분리법, 혹은 이온 교환체 크로마토그래피, 역상 고속 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 공지의 크로마토 분리법을 적절히 조합하여 실시할 수 있다.

본 개시에 관련되는 아마이드 화합물의 제조 방법은, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 나이트릴 화합물에 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 합성하는 반응을 촉매한다. 아마이드 화합물의 제조 방법을, 이하에 보다 구체적으로 설명한다.

우선, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 산생하는 형질전환체나 세포주를 배양하고, 얻어지는 배양액, 세포 또는 세포 처리물을 매체 중에서 나이트릴 화합물과 접촉시킨다. 이에 의해 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는 나이트릴 화합물과 접촉하고, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 나이트릴 화합물을 대응하는 아마이드 화합물로 변환시킨다. 여기서 말하는 세포 처리물이란, 그 형질전환체로부터의 추출물이나 마쇄물, 이들 추출물이나 마쇄물의 나이트릴 히드라타아제 활성획분을 분리하여 얻어지는 조효소 조제물이나 더 정제하여 얻어지는 효소 정제물 등의 후(後)분리물, 그 형질전환체나 그 형질전환체의 추출물, 마쇄물 또는 후분리물을 적당한 수단을 사용하여 고정화한 고정화물의 것을 나타내고 있다.

상술한 접촉시키는 온도는, 바람직하게는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제가 실활되지 않는 온도 범위 내이며, 보다 바람직하게는, 0℃~60℃, 보다 바람직하게는 15℃~35℃이다. 예를 들면, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 산생하는 형질전환체나 세포주를 배양한 배양액을, 나이트릴 화합물을 포함하는 수용액 중에 그대로 첨가해도 되고, 혹은 배양액을 원심처리하고 균체를 분리하여, 균체를 나이트릴 화합물을 포함하는 수용액에 첨가해도 된다. 반응 시에 있어서의 수용액의 pH는 7~9인 것이 바람직하고, 7.5~8.5인 것이 보다 바람직하다. 나이트릴 화합물은 수용액 중에, 예를 들면 0.25체적%~20.0체적%, 보다 바람직하게는 2.0체적%~5.0체적%의 농도로 존재해도 된다. 형질전환체의 배양에 대한 상세(詳細)는, 변이형 나이트릴 히드라타아제의 제조 방법의 항(項)에서 설명한 바와 같다.

상술한 나이트릴 화합물의 구체적인 예로서는, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제가 기질로서 작용할 수 있는 화합물이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 아세토나이트릴, 프로피오나이트릴, 아크릴로나이트릴, 메타크릴로나이트릴, n-뷰티로나이트릴, 아이소뷰티로나이트릴, 크로토노나이트릴, α-하이드록시아이소뷰티로나이트릴 등이라고 하는 탄소수 2~4의 나이트릴 화합물을 그 대표예로서 들 수 있다. 나이트릴 화합물 중의 나이트릴기가 수화에 의해 아마이드기로 변환되기 때문에, 예를 들면, 아크릴로나이트릴은 아크릴아마이드로 변환될 수 있다.

다음으로, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 실활시키는 일 없이, 매체중에 활성탄을 첨가함으로써, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제를 촉매로서 사용한 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물의 합성 반응을 종료시키지 않고, 생성된 아마이드 화합물을 정제한다.

또한, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제와의 접촉에 의해 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 제조하는 반응은, 나이트릴 히드라타아제의 지적 pH에 맞춰, 예를 들면 pH7~9라고 하는 중성~염기성의 조건에서 실시한다. pH는 예를 들면 암모니아나 수산화나트륨이라고 하는 염기성 물질을 완충액 중에서 필요에 따라 사용함으로써 조절할 수 있다. 한편, 아마이드 화합물의 정제는, 예를 들면 pH3.5~6.5라고 하는 산성 조건 하에서 실시하는 것이 바람직하다. 이는 아마이드 화합물 함유액 중에 포함되는 불순물, 특히 단백질을, 효율적으로 제거하기 위해서이다. 산성 pH로의 변경은, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 발레르산, 염산, 아크릴산, 메타크릴산 등의 산을 사용함으로써 실시할 수 있다. 이와 같이, 상기 아마이드 화합물의 제조 방법은, pH3.5~6.5의 조건에서, 생성된 아마이드 화합물을 포함하는 용액으로부터 불순물을 제거하는 정제 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 이 공정에서는 불순물의 제거를 위해서 활성탄을 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 일 실시형태에 있어서는, 본 개시에 관련되는 아마이드 화합물의 제조 방법은, 또한, 아마이드 화합물을 활성탄에 의해 정제하는 것을 포함한다. 이 때문에, 상기 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 바람직하게는 pH3.5~6.5의 조건에 있어서, 상기 (a)~(e)의 아미노산 잔기 치환 중 적어도 1개를 도입하는 전보다도 향상된 효소 활성을 가지는 것이 바람직하다. 상기 pH 조건은, 불필요한 단백질의 보다 효율적인 제거를 위해서 5.0 이하의 pH에서 실시해도 된다.

상기와 같이, 본 개시에 관련되는 변이형 나이트릴 히드라타아제는, 그 향상된 pH 안정성에 의해, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 제조하는 프로세스 전체를 통한 높은 변환 효율을 달성하는 것이 가능하다. 이상, 실시형태에 관하여 설명했지만, 이들은 예시이며, 상기 이외의 여러 가지의 구성을 채용할 수도 있다.

실시예

이하의 실시예에 의해 실시형태를 더 상세히 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 아무것도 한정되는 것은 아니다. 또한, 이하의 실시예에 있어서 「변이 개소」란, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제와의 아미노산 서열 상의 차이의 위치를 가리킨다.

[비교예 1］

야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 취득(1)

30mL의 시험관에 10mL의 LB액체 배지를 조제하고, 121℃에 있어서의 20분간의 오토클레이브(autoclave)에 의해 그 액체 배지를 멸균했다. 이 액체 배지에 대하여, 종농도(終濃度)가 100μg/mL가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 상기의 세포주 MT-10822를 1백금이(白金耳) 식균하고, 37℃에서 300rpm으로 약 20시간 배양했다. 그 후, 얻어진 배양액 1ml을 적당한 원심 튜브에 분취(分取)한 후, 원심분리(15000rpm×5분)에 의해 그 균체를 분리했다.

계속하여 알칼리 SDS 추출법에 의해, 분리하여 얻어진 균체보다 플라스미드 pPT-DB1를 조제했다. 조제한 플라스미드를 대장균 HB101의 콘피텐트셀(토요방적사제)로 형질전환하여, 형질전환체(1)을 얻었다. 형질전환체(1)은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제인 나이트릴 히드라타아제(1)을 산생한다.

[비교예 2］변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(2)

표 14로 나타내는 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 92번째의 아미노산 잔기인 Asp를 Glu로 치환한 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(2)를 취득하기 위해서, 타카라주조사제의 「LA　PCR　in　vitro　mutagenesis　Kit」(이후, 변이 도입 키트라고 부른다)를 사용한 부위 특이적인 변이 도입을 실시했다. 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제 발현 플라스미드 pPT-DB1를 주형(鑄型)으로서 PCR 반응을 실시했다.

PCR 반응 No.1은, 서열번호 5의 프라이머 및 M13 프라이머 M4(서열번호 12에 서열을 기재)를 각각 50pmol 포함하는 전량 50μL의 계(조성은 변이 도입 키트에 기재된 조건에 따른다)에서, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장(伸長) 반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복함으로써 실시했다.

PCR 반응 No.2는, MUT4 프라이머(서열번호 14에 서열을 기재) 및 M13 프라이머 RV(서열번호 13에 서열을 기재)를 각각 50pmol 포함하는 전량 50μL의 계(조성은 변이 도입 키트에 기재된 조건에 따른다)에서, PCR 반응 No.1과 동일한 조작에 의해 실시했다.

PCR 반응 No.1 및 No.2의 반응 종료액 각 5μl을 사용한 아가로스 전기 영동(아가로스 농도 1.0중량%)에 의해 DNA 증폭 산물의 분석을 실시했던바, 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 있었다.

Microcon100(타카라주조사제)를 사용하여 각각의 PCR 반응 종료액보다 과잉의 프라이머 및 dNTP를 제거한 후, TE를 첨가하여 각각 50μL의 용액을 조제했다.그 TE용액을 각 0.5μL씩 포함하는 전량 47.5μL의 어닐링 용액(조성은 변이 도입 키트에 기재된 조건에 따른다)을 조제하고, 열변성 처리(98℃)를 10분간 실시한 후, 37℃까지 60분간 걸쳐 일정한 속도로 냉각을 실시하고, 계속하여 37℃에서 15분간 유지함으로써 어닐링 처리를 실시했다.

어닐링 처리액에 TaKaRa　LA　Taq를 0.5μL 첨가하고 72℃에서 3분간 가열 처리를 실시하여, 헤테로 2개 사슬을 완성시켰다.

이것에 M13 프라이머 M4(서열번호 12에 서열을 기재) 및 M13 프라이머 RV(서열번호 13에 서열을 기재)를 각각 50pmol 첨가하여 전량을 50μL로 한 후, 열변성(98℃) 15초, 어닐링(55℃) 30초, 신장 반응(72℃) 120초의 조건을 25사이클 반복하는 것에 의한 PCR 반응 No.3을 실시했다.

PCR 반응 No.3의 반응 종료액 5μl을 사용한 아가로스 전기 영동(시그마사제 타입 VII저융점 아가로스 사용；아가로스 농도 0.8중량%)에 의해 DNA 증폭 산물의 분석을 실시했던바, 약 2kb의 증폭 DNA 산물의 존재를 확인할 수 있었다.

계속하여, 아가로스 겔로부터 약 2kb의 DNA 단편만을 잘라내고, 그 아가로스편(약 0.1g)을 가늘게 분쇄하여 1mL의 TE용액에 현탁 후, 55℃에서 1시간 보온하여 아가로스를 완전하게 융해시켰다.

이 융해액에 대하여 페놀/클로로폼 추출과 에탄올 침전을 실시하여 그 DNA 단편(斷片)을 정제하고, 최종적으로 10μL의 TE에 용해했다.

정제한 약 2kb의 증폭 DNA 단편을 제한 효소 EcoRI 및 HindIII에 의해 절단 한 후, 이 제한 효소 처리액에 대하여 페놀/클로로폼 추출과 에탄올 침전을 실시하여 그 DNA 단편을 정제하고, 최종적으로 10μL의 TE에 용해했다.

동일하게, EcoRI 및 HindIII에 의해 나이트릴 히드라타아제 발현 플라스미드 pPT-DB1를 절단하고, 아가로스 겔 전기 영동(시그마사제 타입 VII 저융점 아가로스 사용；아가로스 농도 0.7%)을 실시하여, 아가로스 겔로부터 약 2.7kb의 DNA 단편만을 잘라냈다.

잘라낸 아가로스편(약 0.1g)를 잘게 분쇄하여 1mL의 TE용액에 현탁 후, 55℃에서 1시간 보온하여 아가로스를 완전하게 융해시켰다.

이 융해액에 대하여 페놀/클로로폼 추출과 에탄올 침전을 실시하여 그 DNA 단편을 정제하고, 최종적으로 10μL의 TE에 용해했다.

이와 같이 하여 얻어진 약 2kb와 약 2.7kb의 DNA 단편을 DNA 라이게이션 키트(타카라주조사제)를 사용하여 연결시킨 후, 대장균 HB101의 콘피텐트셀(토요방적사제)을 형질전환하여, 형질전환체(2)를 얻었다. 또한 상기 균체로부터 알칼리 SDS 추출법에 의해 플라스미드를 조제하고, DNA 시퀸서로 나이트릴 히드라타아제 유전자 부분의 뉴클레오티드 서열을 결정하여, 실시예 1 기재의 플라스미드 pPT-DB1에, α 서브유닛의 N 말단으로부터 92번째의 아미노산 잔기인 Asp를 Glu로 하는 변이를 가지고 있는 것을 확인했다. 형질전환체(2)는, 표 14에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(2)를 산생한다.

〈pH 안정성의 비교〉

이렇게 하여 얻어진 형질전환체(2), 및, 그 베이스가 된 pPT-DB1를 포함하는 형질전환체(1)을 사용한 아마이드 화합물의 제조에 있어서의 pH 안정성을 이하의 방법에 의해 비교했다. 이에 의해 나이트릴 히드라타아제(2)의 나이트릴 히드라타아제(1)와 비교한 상대적인 pH 안정성을 평가할 수 있다.

시험관에 40μg/mL의 황산 제2철·칠수화물 및 10μg/mL의 염화코발트·이수화물을 포함하는 5mL의 LB액체 배지를 조제하고, 121℃에 있어서의 20분간의 오토클레이브에 의해 멸균했다.

이 배지에 종농도가 100μg/mL가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 각 형질전환체를 1백금이식균하여, 37℃에 있어서 200rpm으로 약 20시간 각기 배양했다.

그 배양 종료액 40μl을 취하고, 740μL의 54mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)에 현탁하고, 이것에 20μL의 아크릴로나이트릴을 첨가하여 20℃에서 서서히 교반하면서 15분 내지 60분간 반응시켰다. 반응 종료 후, HPLC를 사용하고 반응액의 분석을 실시하여, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 생성하는 효소 활성을 구했다. 반응 및 분석은 각 형질전환체에 대하여 3회 이상 실시하고, 분주조작 등으로의 데이터의 편차를 보정했다.

동일하게, 상기 배양 종료액 1000μl을 취하고, 원심분리하여 회수한 균체에 50mM 시트르산 완충액(pH4.0) 1000μl을 첨가하고, 교반 하면서 30℃, 30hr 처리했다(산처리). 처리 후, 780μl을 원심분리하여 균체를 회수하고, 780μL의 54mM 트리스 염산 수용액(pH8.0)에 현탁하고, 이것에 20μL의 아크릴로나이트릴을 첨가하여 20℃에서 서서히 교반하면서 15분 내지 60분간 반응시켰다. 반응 종료 후, HPLC를 사용하고 반응액의 분석을 실시하여, 나이트릴 화합물로부터 아마이드 화합물을 생성하는 효소 활성을 구했다. 반응 및 분석은 각 형질전환체에 대하여 3회 이상 실시하여, 분주조작 등으로의 데이터의 편차를 보정했다.

〈분석 조건〉

분석 기기：　니혼분광 HPLC

컬럼　：　YMC　Pack　ODS-A　(150Х6.00mm)

분석 온도：　40℃

이동상(移動相)　：　3%　아세토나이트릴, 10mM 　인산

50mM 시트르산 완충액(pH4.0)으로 처리한 균체의 활성과 처리 없는 균체의 효소 활성의 비(比)를 취해 pH 안정성으로 했다. 형질전환체(2)의 pH 안정성은 야생형(1)과 비교하여 0.82배였다.

상기의 결과는, 나이트릴 히드라타아제의 지적조건 하에서 반응 초속도를 상승시킨다고 생각되고 있는 변이여도(국제 공개 제2010/055666호 참조), pH 안정성의 향상은 반드시 초래되는 것은 아닌 것을 나타내고 있다.

[실시예 1] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(3)

표 14로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(3)를 취득하기 위해서, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 7의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 플라스미드를 얻고, 형질전환체(3)를 얻었다. 형질전환체(3)는, 표 14에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(3)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(3)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 14에 나타낸다.

[실시예 2] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(4)

표 14로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(4)를 취득하기 위해서, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 8의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 플라스미드를 얻고, 형질전환체(4)를 얻었다. 형질전환체(4)는, 표 14에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(4)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(4)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 14에 나타낸다.

[실시예 3] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(5)

표 14로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(5)를 취득하기 위해서, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 9의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 플라스미드를 얻고, 형질전환체(5)를 얻었다. 형질전환체(5)는, 표 14에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(5)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(5)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 14에 나타낸다.

[실시예 4] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(6)

표 14로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(6)를 취득하기 위해서, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 10의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 플라스미드를 얻고, 형질전환체(6)를 얻었다. 형질전환체(6)는, 표 14에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(6)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(6)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 14에 나타낸다.

[실시예 5] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(7)

표 14로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(7)를 취득하기 위해서, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 11의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 플라스미드를 얻고, 형질전환체(7)를 얻었다. 형질전환체(7)는, 표 14에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(7)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(7)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 14에 나타낸다.

표 14에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 각 아미노산 잔기 치환은, 단독으로, 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성의 향상을 초래하는 것을 알 수 있다. 한편, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하지 않는, α 서브유닛에 있어서의 N 말단으로부터 92번째의 Asp 잔기의 Glu로의 치환은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제와 비교하여 pH 안정성의 향상을 가져오지 않았다.

[실시예 6] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(8)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(8)를 취득하기 위해서, 실시예 1의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 6의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(8)를 얻었다. 형질전환체(8)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(8)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(8)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 7] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(9)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(9)를 취득하기 위해서, 실시예 2의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 6의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(9)를 얻었다. 형질전환체(9)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(9)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(9)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 8] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(10)

표 15로 나타내는 바와 같은 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(10)를 취득하기 위해서, 실시예 3의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 6의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(10)를 얻었다. 형질전환체(10)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(10)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(10)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 9] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(11)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(11)를 취득하기 위해서, 실시예 4의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 6의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(11)를 얻었다. 형질전환체(11)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(11)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(11)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 10] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(12)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(12)를 취득하기 위해서, 실시예 5의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 6의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(12)를 얻었다. 형질전환체(12)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(12)를 산생한다.

　나이트릴 히드라타아제(12)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 11] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(13)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(13)를 취득하기 위해서, 실시예 1의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 8의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(13)를 얻었다. 형질전환체(13)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(13)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(13)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 12] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(14)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(14)를 취득하기 위해서, 실시예 1의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 9의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(14)를 얻었다. 형질전환체(14)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(14)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(14)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 13] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(15)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(15)를 취득하기 위해서, 실시예 2의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 9의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(15)를 얻었다. 형질전환체(15)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(15)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(15)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 14] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(16)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(16)를 취득하기 위해서, 실시예 2의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 10의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(16)를 얻었다. 형질전환체(16)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(16)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(16)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 15] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(17)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(17)를 취득하기 위해서, 실시예 2의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 11의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(17)를 얻었다. 형질전환체(17)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(17)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(17)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 16] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(18)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(18)를 취득하기 위해서, 비교예 1의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 15의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(18)를 얻었다. 형질전환체(18)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(18)를 산생한다.

　나이트릴 히드라타아제(18)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 17] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(19)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(19)를 취득하기 위해서, 실시예 3의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 11의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(19)를 얻었다. 형질전환체(19)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(19)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(19)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

[실시예 18] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(20)

표 15로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(20)를 취득하기 위해서, 실시예 4의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 11의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(20)를 얻었다. 형질전환체(20)는, 표 15에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(20)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(20)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 15에 나타낸다.

표 15에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 각 아미노산 잔기 치환은, 서로 조합해도, 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성의 향상을 초래하는 것을 알 수 있다. 또한, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 아미노산 잔기 치환을 서로 조합한 경우, 혹은 아미노산 잔기 치환(f)과 조합한 경우에는, 그 pH 안정성이 보다 향상되는 경향이 있는 것을 알 수 있다.

[실시예 19] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(21)

표 16으로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(21)를 취득하기 위해서, 실시예 7의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 9의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(21)를 얻었다. 형질전환체(21)는, 표 16에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(21)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(21)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 16에 나타낸다.

[실시예 20] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(22)

표 16으로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(22)를 취득하기 위해서, 실시예 11의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 9의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여, 형질전환체(22)를 얻었다. 형질전환체(22)는, 표 16에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(22)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(22)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 16에 나타낸다.

[실시예 21] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(23)

표 16으로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(23)를 취득하기 위해서, 실시예 7의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 11의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여, 형질전환체(23)를 얻었다. 형질전환체(23)는, 표 16에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(23)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(23)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 16에 나타낸다.

표 16에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 각 아미노산 잔기 치환은, 2개 이상 조합해도, 또 한층 더 아미노산 잔기 치환(f)과 조합해도, 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성의 향상을 초래하는 것을 알 수 있다. 또한, 안정화의 정도는 조합에 의해 향상되는 경향이 있는 것을 알 수 있다.

[실시예 22] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 취득(24)

표 17로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(24)를 취득하기 위해서, 실시예 7의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 15의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 형질전환체(24)를 얻었다. 형질전환체(24)는, 표 17에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(24)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(24)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 17에 나타낸다.

표 17에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 각 아미노산 잔기 치환은, 3개 이상 조합해도, 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성의 향상을 초래하는 것을 알 수 있다. 또한, 그 향상의 정도는 한층 높은 경향이 있다.

[실시예 23] 변이형 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도

야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제 및 표 18로 나타내는 아미노산 잔기 치환을 가지는 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도를, 「pH 안정성의 비교」에 기재된 산처리 전의 아마이드 화합물 생성의 측정에 있어서의 반응 초속도를 측정함으로써 조사한 결과를 표 18에 나타낸다. 반응 초속도의 값은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서의 반응 초속도의 값에 대한 상대값으로 나타낸다.

표 18에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 아미노산 잔기 치환은, 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도의 향상도 초래하는 것을 알 수 있다.

[비교예 3] 나이트릴 히드라타아제 변이체의 취득(25)

표 19로 나타내는 바와 같은 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 나이트릴 히드라타아제 변이체를 포함하는 플라스미드(일본 특허 제5551081호 형질전환체 번호 92 참조)를 사용하고, 비교예 2에 기재된 형질전환과 동일한 방법에 의해 형질전환체(25)를 얻었다. 형질전환체(25)는, 표 19에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(25)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(25)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 19에 나타낸다.

[실시예 24] 나이트릴 히드라타아제 변이체의 취득(26)

표 19로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(26)를 취득하기 위해서, 비교예 3의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 8의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 플라스미드를 얻고, 형질전환체(26)를 얻었다. 형질전환체(26)는, 표 19에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(26)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(26)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 19에 나타낸다.

표 19에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 아미노산 잔기 치환은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성을 향상시키는 것뿐만 아니라, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제로부터의 개변 아미노산 서열을 가지는 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성의 향상도 초래하는 것을 알 수 있다.

[실시예 25] 나이트릴 히드라타아제 변이체의 반응 초속도

표 20으로 나타내는 바와 같은 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 나이트릴 히드라타아제 변이체의 반응 초속도를, 「pH 안정성의 비교」에 기재된 산처리 전의 아마이드 화합물 생성의 측정에 있어서의 반응 초속도를 측정함으로써 조사한 결과를 표 20에 나타낸다. 반응 초속도의 값은, 나이트릴 히드라타아제(25)에 있어서의 반응 초속도의 값에 대한 상대값으로 나타낸다.

표 20에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 아미노산 잔기 치환은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도를 향상시키는 것뿐만 아니라, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제로부터의 개변 아미노산 서열을 가지는 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도의 향상도 초래하는 것을 알 수 있다.

[비교예 4] 나이트릴 히드라타아제 변이체의 취득(27)

표 21로 나타내는 바와 같은 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 나이트릴 히드라타아제 변이체를 포함하는 플라스미드(일본 특허 제5551081호 형질전환체 번호 114 참조)를 사용하고, 비교예 2에 기재된 형질전환과 동일한 방법에 의해 형질전환체(27)를 얻었다. 형질전환체(27)는, 표 21에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(27)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(27)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 21에 나타낸다.

[실시예 26] 나이트릴 히드라타아제 변이체의 취득(28)

표 21로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(28)를 취득하기 위해서, 비교예 4의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 8의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 플라스미드를 얻고, 형질전환체(28)를 얻었다. 형질전환체(28)는, 표 21에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(28)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(28)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 21에 나타낸다.

표 21에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 아미노산 잔기 치환은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성을 향상시키는 것뿐만 아니라, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제로부터의 개변 아미노산 서열을 가지는 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성의 향상도 초래하는 것을 알 수 있다.

[실시예 27] 나이트릴 히드라타아제 변이체의 반응 초속도

표 21로 나타내는 바와 같은 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 나이트릴 히드라타아제 변이체의 반응 초속도를, 「pH 안정성의 비교」에 기재된 산처리 전의 아마이드 화합물 생성의 측정에 있어서의 반응 초속도를 측정함으로써 조사한 결과를 표 22에 나타낸다. 반응 초속도의 값은, 나이트릴 히드라타아제(27)에 있어서의 반응 초속도의 값에 대한 상대값으로 나타낸다.

표 22에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 아미노산 잔기 치환은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도를 향상시키는 것뿐만 아니라, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제로부터의 개변 아미노산 서열을 가지는 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도의 향상도 초래하는 것을 알 수 있다.

[비교예 5] 나이트릴 히드라타아제 변이체의 취득(29)

표 23으로 나타내는 바와 같은 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 나이트릴 히드라타아제 변이체를 포함하는 플라스미드(일본 특허 제5551081호 형질전환체 번호 33 참조)를 사용하고, 비교예 2에 기재된 형질전환과 동일한 방법에 의해 형질전환체(29)를 얻었다. 형질전환체(29)는, 표 23에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(29)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(29)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 23에 나타낸다.

[실시예 28] 나이트릴 히드라타아제 변이체의 취득(30)

표 23으로 나타내는 바와 같은 아미노산 잔기 치환을 가지는 변이형 나이트릴 히드라타아제를 발현하는 형질전환체(30)를 취득하기 위해서, 비교예 5의 플라스미드를 주형으로서 사용하고, 서열번호 5의 프라이머 대신에 서열번호 8의 프라이머를 사용하는 것 이외는 비교예 2와 동일하게 하여 플라스미드를 얻고, 형질전환체(30)를 얻었다. 형질전환체(30)는, 표 23에 기재된 변이를 가지는 나이트릴 히드라타아제(30)를 산생한다.

나이트릴 히드라타아제(30)의 pH 안정성을 상기 「pH 안정성의 비교」에 기재된 방법으로 평가했다. 얻어진 결과를 표 23에 나타낸다.

표 23에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 아미노산 잔기 치환은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성을 향상시키는 것뿐만 아니라, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제로부터의 개변 아미노산 서열을 가지는 나이트릴 히드라타아제의 pH 안정성의 향상도 초래하는 것을 알 수 있다.

[실시예 29] 나이트릴 히드라타아제 변이체의 반응 초속도

표 23으로 나타내는 바와 같은 아미노산 치환 위치에서 변이시킨 나이트릴 히드라타아제 변이체의 반응 초속도를, 「pH 안정성의 비교」에 기재된 산처리 전의 아마이드 화합물 생성의 측정에 있어서의 반응 초속도를 측정함으로써 조사한 결과를 표 24에 나타낸다. 반응 초속도의 값은, 나이트릴 히드라타아제(29)에 있어서의 반응 초속도의 값에 대한 상대값으로 나타낸다.

표 24에 나타낸 결과로부터, 아미노산 잔기 치환군 A에 속하는 아미노산 잔기 치환은, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도를 향상시키는 것뿐만 아니라, 야생형 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제로부터의 개변 아미노산 서열을 가지는 나이트릴 히드라타아제의 반응 초속도의 향상도 초래하는 것을 알 수 있다.

2016년 12월 28일에 출원된 일본 특허 출원 2016-256050호의 개시는, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격은, 개별적인 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격이 참조에 의해 원용되는 것이 구체적 또한 개별적으로 기록된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의해 원용된다.

SEQUENCE LISTING <110> MITSUI CHEMICALS, INC. <120> Mutant Nitrile Hydratase, Nucleic Acid Encoding the Mutant Nitrile Hydratase, Expression Vector and Transformant Containing the Nucleic Acid, Production Method for Muntant Nitrile Hydratase, and Production Method for Amide Compound <130> 2017P00694 <150> JP2016-256050 <151> 2016-12-28 <160> 75 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 205 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila <400> 1 Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu 1 5 10 15 Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly 20 25 30 Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn 35 40 45 Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr 50 55 60 Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys 65 70 75 80 Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val 85 90 95 Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser 100 105 110 Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu 115 120 125 Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys 130 135 140 Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala 195 200 205 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila <400> 2 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 3 <211> 618 <212> DNA <213> Pseudonocardia thermophila <400> 3 atgaccgaga acatcctgcg caagtcggac gaggagatcc agaaggagat cacggcgcgg 60 gtcaaggccc tggagtcgat gctcatcgaa cagggcatcc tcaccacgtc gatgatcgac 120 cggatggccg agatctacga gaacgaggtc ggcccgcacc tcggcgcgaa ggtcgtcgtg 180 aaggcctgga ccgacccgga gttcaagaag cgtctgctcg ccgacggcac cgaggcctgc 240 aaggagctcg gcatcggcgg cctgcagggc gaggacatga tgtgggtgga gaacaccgac 300 gaggtccacc acgtcgtcgt gtgcacgctc tgctcctgct acccgtggcc ggtgctgggg 360 ctgccgccga actggttcaa ggagccgcag taccgctccc gcgtggtgcg tgagccccgg 420 cagctgctca aggaggagtt cggcttcgag gtcccgccga gcaaggagat caaggtctgg 480 gactccagct ccgagatgcg cttcgtcgtc ctcccgcagc gccccgcggg caccgacggg 540 tggagcgagg aggagctcgc caccctcgtc acccgcgagt cgatgatcgg cgtcgaaccg 600 gcgaaggcgg tcgcgtga 618 <210> 4 <211> 702 <212> DNA <213> Pseudonocardia thermophila <400> 4 atgaacggcg tgtacgacgt cggcggcacc gatgggctgg gcccgatcaa ccggcccgcg 60 gacgaaccgg tcttccgcgc cgagtgggag aaggtcgcgt tcgcgatgtt cccggcgacg 120 ttccgggccg gcttcatggg cctggacgag ttccggttcg gcatcgagca gatgaacccg 180 gccgagtacc tcgagtcgcc gtactactgg cactggatcc gcacctacat ccaccacggc 240 gtccgcaccg gcaagatcga tctcgaggag ctggagcgcc gcacgcagta ctaccgggag 300 aaccccgacg ccccgctgcc cgagcacgag cagaagccgg agttgatcga gttcgtcaac 360 caggccgtct acggcgggct gcccgcaagc cgggaggtcg accgaccgcc caagttcaag 420 gagggcgacg tggtgcggtt ctccaccgcg agcccgaagg gccacgcccg gcgcgcgcgg 480 tacgtgcgcg gcaagaccgg gacggtggtc aagcaccacg gcgcgtacat ctacccggac 540 accgccggca acggcctggg cgagtgcccc gagcacctct acaccgtccg cttcacggcc 600 caggagctgt gggggccgga aggggacccg aactccagcg tctactacga ctgctgggag 660 ccctacatcg agctcgtcga cacgaaggcg gccgcggcat ga 702 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 cagggcgagg agatgatgtg ggtg 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 atcctcacct ggtcgatgat c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 gtcgatgatc aaccggatgg c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 accggatggt cgagatctac 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 9 gagctgtggg tgccggaagg g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 10 ctgtgggggc aggaagggga c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 11 ctccagcgtc aactacgact g 21 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial 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<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 64 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Ile Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Val Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Asp His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Ile Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 65 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 65 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Leu Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Ile 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Ile Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 66 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 66 Met Asn Gly Met Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Val Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Asp His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Leu Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 67 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 67 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Met Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His Asn Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Thr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 68 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 68 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Gly Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His Asn Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Asn Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 69 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 69 Met Asn Gly Met Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Val 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His Asn Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Arg His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Tyr Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 70 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 70 Met Asn Gly Met Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Thr Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His Asn Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Ser Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 71 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 71 Met Asn Gly Met Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His Asn Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Gly Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Ser Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala Ala Ala Ala 225 230 <210> 72 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 72 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His Asn Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Glu Ala Ala Ala 225 230 <210> 73 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Modified nitrile hydratase beta-subunit <400> 73 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Asp Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His Asn Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Val Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Glu Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Glu Ala Ala Ala 225 230 <210> 74 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide to act as a PCR primer <400> 74 tacgaattct aaggaggtct cagcatgaac ggc 33 <210> 75 <211> 144 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila <400> 75 Met Ser Ala Glu Ala Lys Val Arg Leu Lys His Cys Pro Thr Ala Glu 1 5 10 15 Asp Arg Ala Ala Ala Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Pro Gly Gly Asp 20 25 30 Arg Ala Leu Asp Arg Gly Phe Asp Glu Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe 35 40 45 Ala Leu Ala Val Ala Ala Cys Arg Ala Gly Arg Phe Glu Trp Lys Gln 50 55 60 Leu Gln Gln Ala Leu Ile Ser Ser Ile Gly Glu Trp Glu Arg Thr His 65 70 75 80 Asp Leu Asp Asp Pro Ser Trp Ser Tyr Tyr Glu His Phe Val Ala Ala 85 90 95 Leu Glu Ser Val Leu Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu Pro Glu Ala Leu 100 105 110 Asp Glu Arg Thr Ala Glu Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Lys Asp His 115 120 125 His Gly Pro His Leu Glu Pro Val Ala Val His Pro Ala Val Arg Ser 130 135 140

Claims (17)

1. α 서브유닛과 β 서브유닛을 가지는 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서, 하기의 아미노산 잔기 치환(a)~(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 변이형 나이트릴 히드라타아제,
   (a) α 서브유닛의 N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환,
   (b) α 서브유닛의 N 말단으로부터 43번째의 아미노산 잔기의 Val로의 치환,
   (c) β 서브유닛의 N 말단으로부터 205번째의 아미노산 잔기의 Val로의 치환,
   (d) β 서브유닛의 N 말단으로부터 206번째의 아미노산 잔기의 Gln으로의 치환,
   (e) β 서브유닛의 N 말단으로부터 215번째의 아미노산 잔기의 Asn으로의 치환.
2. 청구항 1에 있어서,
   아미노산 잔기 치환(a)~(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 변이형 나이트릴 히드라타아제.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
   아미노산 잔기 치환(b)와 아미노산 잔기 치환(a), (c), (d) 및 (e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개를 포함하는, 변이형 나이트릴 히드라타아제.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
   α 서브유닛의 아미노산 서열에 있어서의, N 말단으로부터 36번째의 아미노산이 Trp인, 변이형 나이트릴 히드라타아제.
5. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
   α 서브유닛의 아미노산 서열에 있어서의, N 말단으로부터 36번째의 아미노산이 Met, Ser, Gly 또는 Ala인, 변이형 나이트릴 히드라타아제.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서,
   α 서브유닛의 아미노산 서열이, 이하의 (1)~(13) 중 하나 이상을 만족하는, 변이형 나이트릴 히드라타아제：
   (1) N 말단으로부터 6번째의 아미노산 잔기가 Thr 또는 Ala,
   (2) N 말단으로부터 13번째의 아미노산 잔기가 Leu,
   (3) N 말단으로부터 19번째의 아미노산 잔기가 Val,
   (4) N 말단으로부터 27번째의 아미노산 잔기가 Ile,
   (5) N 말단으로부터 48번째의 아미노산 잔기가 Gln,
   (6) N 말단으로부터 71번째의 아미노산 잔기가 His,
   (7) N 말단으로부터 92번째의 아미노산 잔기가 Glu,
   (8) N 말단으로부터 94번째의 아미노산 잔기가 Ile,
   (9) N 말단으로부터 126번째의 아미노산 잔기가 Tyr,
   (10) N 말단으로부터 148번째의 아미노산 잔기가 Asp,
   (11) N 말단으로부터 188번째의 아미노산 잔기가 Gly,
   (12) N 말단으로부터 197번째의 아미노산 잔기가 Cys,
   (13) N 말단으로부터 204번째의 아미노산 잔기가 Arg이다.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서,
   β 서브유닛의 아미노산 서열이, 이하의 (15)~(47) 중 적어도 하나를 만족하는, 변이형 나이트릴 히드라타아제：
   (15) N 말단으로부터 4번째의 아미노산 잔기가 Met,
   (16) N 말단으로부터 8번째의 아미노산 잔기가 Ala,
   (17) N 말단으로부터 10번째의 아미노산 잔기가 Asp,
   (18) N 말단으로부터 24번째의 아미노산 잔기가 Ile,
   (19) N 말단으로부터 33번째의 아미노산 잔기가 Val 또는 Met,
   (20) N 말단으로부터 37번째의 아미노산 잔기가 Val 또는 Leu,
   (21) N 말단으로부터 40번째의 아미노산 잔기가 Ile, Val 또는 Leu,
   (22) N 말단으로부터 41번째의 아미노산 잔기가 Ile,
   (23) N 말단으로부터 46번째의 아미노산 잔기가 Lys,
   (24) N 말단으로부터 48번째의 아미노산 잔기가 Val,
   (25) N 말단으로부터 51번째의 아미노산 잔기가 Val,
   (26) N 말단으로부터 61번째의 아미노산 잔기가 Val, Gly, Trp, Ser, Leu 또는 Thr,
   (27) N 말단으로부터 79번째의 아미노산 잔기가 Asn,
   (28) N 말단으로부터 96번째의 아미노산 잔기가 Arg,
   (29) N 말단으로부터 107번째의 아미노산 잔기가 Met,
   (30) N 말단으로부터 108번째의 아미노산 잔기가 Asp 또는 Arg,
   (31) N 말단으로부터 110번째의 아미노산 잔기가 Asn,
   (32) N 말단으로부터 112번째의 아미노산 잔기가 Val 또는 Ile,
   (33) N 말단으로부터 118번째의 아미노산 잔기가 Val,
   (34) N 말단으로부터 127번째의 아미노산 잔기가 Ser,
   (35) N 말단으로부터 146번째의 아미노산 잔기가 Gly,
   (36) N 말단으로부터 150번째의 아미노산 잔기가 Asn 또는 Ser,
   (37) N 말단으로부터 160번째의 아미노산 잔기가 Cys, Trp 또는 Met,
   (38) N 말단으로부터 168번째의 아미노산 잔기가 Glu,
   (39) N 말단으로부터 176번째의 아미노산 잔기가 Ala, Thr, Met 또는 Cys,
   (40) N 말단으로부터 186번째의 아미노산 잔기가 Arg,
   (41) N 말단으로부터 200번째의 아미노산 잔기가 Glu,
   (42) N 말단으로부터 212번째의 아미노산 잔기가 Tyr,
   (43) N 말단으로부터 217번째의 아미노산 잔기가 Val, His, Met, Gly, Ser, Leu 또는 Cys,
   (44) N 말단으로부터 218번째의 아미노산 잔기가 Met 또는 Ser,
   (45) N 말단으로부터 226번째의 아미노산 잔기가 Ile,
   (46) N 말단으로부터 230번째의 아미노산 잔기가 Glu,
   (47) N 말단으로부터 231번째의 아미노산 잔기가 Val이다.
8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
   하기 [1]~[49] 중 어느 하나의 슈도노카르디아·서모필라 유래 나이트릴 히드라타아제에 있어서, 상기 (a)~(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는, 변이형 나이트릴 히드라타아제.
   [1] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [2] 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [3] 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 33의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [4] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [5] 서열번호 19의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 34의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [6] 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 35의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [7] 서열번호 20의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [8] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 37의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [9] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 38의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [10] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과 서열번호 39의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [11] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 40의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [12] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 41의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [13] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 42의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [14] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 43의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [15] 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 44의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [16] 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 45의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [17] 서열번호 24의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 46의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [18] 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 47의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [19] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 48의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [20] 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 49의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [21] 서열번호 16의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 50의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [22] 서열번호 26의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 51의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [23] 서열번호 27의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 52의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [24] 서열번호 28의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 53의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [25] 서열번호 17의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 54의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [26] 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 55의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [27] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 56의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [28] 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 57의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [29] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 58의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [30] 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 59의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [31] 서열번호 31의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 60의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [32］서열번호 18의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 61의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [33] 서열번호 32의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 62의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [34] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 63의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [35] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 64의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [36] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 65의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [37] 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 54의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [38] 서열번호 30의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 66의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [39] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [40] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 68의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [41] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 69의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [42] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 70의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [43] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 71의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [44] 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 72의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [45] 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 α 서브유닛과, 서열번호 73의 아미노산 서열을 가지는 β 서브유닛을 가지는 나이트릴 히드라타아제,
   [46] 상기 [1]~[45]의 나이트릴 히드라타아제 중 어느 하나에 있어서의 α 서브유닛의 N 말단으로부터 36번째의 아미노산 잔기를 Trp잔기로 한, 나이트릴 히드라타아제
   　[47] 상기 [1]~[46] 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제(A)의 α 서브유닛 또는 그 α 서브유닛과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 α 서브유닛 배리언트와, 상기 나이트릴 히드라타아제(A)의 β 서브유닛 또는 그 β 서브유닛과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 β 서브유닛 배리언트를 가지는 나이트릴 히드라타아제로서, α 서브유닛 및 β 서브유닛 중 적어도 한쪽은 α 서브유닛 배리언트 또는 β 서브유닛 배리언트인, 나이트릴 히드라타아제
   [48] 상기 [1]~[46] 중 어느 하나의 나이트릴 히드라타아제(B)에 있어서의 α 서브유닛에 있어서 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 잔기(상기 (a) 및 (b)의 치환되는 아미노산 잔기를 제외한다)의 총수가 1~10이며, 또한, 상기 나이트릴 히드라타아제(B)에 있어서의 β 서브유닛에 있어서, 부가, 치환, 결실, 및/또는 삽입된 아미노산 잔기(상기 (c)~(e)의 치환되는 아미노산 잔기를 제외한다)의 총수가 1~10인 나이트릴 히드라타아제
9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제를 코드하는 핵산.
10. 청구항 9에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
11. 청구항 10에 있어서,
    발현 벡터인, 벡터.
12. 청구항 11에 기재된 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
13. 청구항 12에 기재된 형질전환체를 배지 중에서 배양하는 것, 및 배양된 형질전환체 및 배지 중 적어도 한쪽으로부터, 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제를 회수하는 것을 포함하는 변이형 나이트릴 히드라타아제의 제조 방법.
14. 청구항 13에 기재된 제조 방법에 의해 얻어진 변이형 나이트릴 히드라타아제.
15. 청구항 1 내지 청구항 8 및 청구항 14 중 어느 한 항에 기재된 변이형 나이트릴 히드라타아제를 나이트릴 화합물에 접촉시키는 것을 포함하는, 아마이드 화합물의 제조 방법.
16. 청구항 15에 있어서,
    pH3.5~pH6.5이고, 아마이드 화합물을 포함하는 용액으로부터 불순물을 제거하는 것을 더 포함하는, 아마이드 화합물의 제조 방법.
17. 청구항 15 또는 16에 있어서,
    아마이드 화합물을 활성탄에 의해 정제하는 것을 더 포함하는, 아마이드 화합물의 제조 방법.