JP6757422B2 - 変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法 - Google Patents
変異型ニトリルヒドラターゼ、該変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター及び形質転換体、該変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法、並びにアミド化合物の製造方法 Download PDFInfo
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Description
足できる程度には生じない。また、上記のとおり種々のニトリルヒドラターゼ変異体が報告されてきたが、これらも精製工程で用いられるような酸性条件下においては活性が大きく低下する。このように、酸性条件下での精製工程においてニトリル化合物からアミド化合物を合成する反応を触媒する酵素活性の良好なpH安定性を示すニトリルヒドラターゼ変異体に関する技術は、これまでに報告されていなかった。特にpH5.0以下といった比較的強い酸性条件下においては、タンパク質は失活する傾向がより高く、このようなpH条件下でも酵素活性が良好に保持されるニトリルヒドラターゼ変異体に関する技術は、これまでに報告されていなかった。
<1> αサブユニットとβサブユニットとを有するシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいて、下記のアミノ酸残基置換(a)〜(e)からなる群から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基置換を含む、変異型ニトリルヒドラターゼ、
(a)αサブユニットのN末端から40番目のアミノ酸残基のAsnへの置換、
(b)αサブユニットのN末端から43番目のアミノ酸残基のValへの置換、
(c)βサブユニットのN末端から205番目のアミノ酸残基のValへの置換、
(d)βサブユニットのN末端から206番目のアミノ酸残基のGlnへの置換、
(e)βサブユニットのN末端から215番目のアミノ酸残基のAsnへの置換。
(1)N末端から6番目のアミノ酸残基がThr又はAlaである、
(2)N末端から13番目のアミノ酸残基がLeuである、
(3)N末端から19番目のアミノ酸残基がValである、
(4)N末端から27番目のアミノ酸残基がIleである、
(5)N末端から48番目のアミノ酸残基がGlnである、
(6)N末端から71番目のアミノ酸残基がHisである、
(7)N末端から92番目のアミノ酸残基がGluである、
(8)N末端から94番目のアミノ酸残基がIleである、
(9)N末端から126番目のアミノ酸残基がTyrである、
(10)N末端から148番目のアミノ酸残基がAspである、
(11)N末端から188番目のアミノ酸残基がGlyである、
(12)N末端から197番目のアミノ酸残基がCysである、
(13)N末端から204番目のアミノ酸残基がArgである。
(15)N末端から4番目のアミノ酸残基がMetである、
(16)N末端から8番目のアミノ酸残基がAlaである、
(17)N末端から10番目のアミノ酸残基がAspである、
(18)N末端から24番目のアミノ酸残基がIleである、
(19)N末端から33番目のアミノ酸残基がVal又はMetである、
(20)N末端から37番目のアミノ酸残基がVal又はLeuである、
(21)N末端から40番目のアミノ酸残基がIle、Val又はLeuである、
(22)N末端から41番目のアミノ酸残基がIleである、
(23)N末端から46番目のアミノ酸残基がLysである、
(24)N末端から48番目のアミノ酸残基がValである、
(25)N末端から51番目のアミノ酸残基がValである、
(26)N末端から61番目のアミノ酸残基がVal、Gly、Trp、Ser、Leu又はThrである、
(27)N末端から79番目のアミノ酸残基がAsnである、
(28)N末端から96番目のアミノ酸残基がArgである、
(29)N末端から107番目のアミノ酸残基がMetである、
(30)N末端から108番目のアミノ酸残基がAsp又はArgである、
(31)N末端から110番目のアミノ酸残基がAsnである、
(32)N末端から112番目のアミノ酸残基がVal又はIleである、
(33)N末端から118番目のアミノ酸残基がValである、
(34)N末端から127番目のアミノ酸残基がSerである、
(35)N末端から146番目のアミノ酸残基がGlyである、
(36)N末端から150番目のアミノ酸残基がAsn又はSerである、
(37)N末端から160番目のアミノ酸残基がCys、Trp又はMetである、
(38)N末端から168番目のアミノ酸残基がGluである、
(39)N末端から176番目のアミノ酸残基がAla、Thr、Met又はCysである、
(40)N末端から186番目のアミノ酸残基がArgである、
(41)N末端から200番目のアミノ酸残基がGluである、
(42)N末端から212番目のアミノ酸残基がTyrである、
(43)N末端から217番目のアミノ酸残基がVal、His、Met、Gly、Ser、Leu又はCysである、
(44)N末端から218番目のアミノ酸残基がMet又はSerである、
(45)N末端から226番目のアミノ酸残基がIleである、
(46)N末端から230番目のアミノ酸残基がGluである、
(47)N末端から231番目のアミノ酸残基がValである。
[1]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号2のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[2]配列番号16のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号33のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[3]配列番号17のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号33のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[4]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号34のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[5]配列番号19のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号34のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[6]配列番号20のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号35のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[7]配列番号20のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号36のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[8]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号37のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[9]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号38のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[10]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号39のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[11]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号40のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[12]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号41のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[13]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号42のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[14]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号43のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[15]配列番号22のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号44のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[16]配列番号23のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号45のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[17]配列番号24のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号46のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[18]配列番号25のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号47のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[19]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号48のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[20]配列番号23のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号49のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[21]配列番号16のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号50のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[22]配列番号26のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号51のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[23]配列番号27のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号52のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[24]配列番号28のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号53のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[25]配列番号17のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号54のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[26]配列番号29のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号55のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[27]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号56のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[28]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号57のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[29]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号58のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[30]配列番号29のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号59のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[31]配列番号31のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号60のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[32]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号61のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[33]配列番号32のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号62のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[34]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号63のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[35]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号64のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[36]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号65のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[37]配列番号25のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号54のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[38]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号66のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[39]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号67のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[40]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号68のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[41]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号69のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[42]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号70のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[43]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号71のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[44]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号72のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[45]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号73のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[46]上記[1]〜[45]のニトリルヒドラターゼのうちいずれか1つにおけるαサブユニットのN末端から36番目のアミノ酸残基をTrp残基とした、ニトリルヒドラターゼ
[47]上記[1]〜[46]のうちいずれか1つのニトリルヒドラターゼ(A)のαサブユニット又は該αサブユニットと90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるαサブユニットバリアントと、前記ニトリルヒドラターゼ(A)のβサブユニット又は該βサブユニットと90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβサブユニットバリアントと、を有するニトリルヒドラターゼであって、αサブユニット及びβサブユニットのうち少なくとも一方はαサブユニットバリアント又はβサブユニットバリアントである、ニトリルヒドラターゼ
[48]上記[1]〜[46]のうちいずれか1つのニトリルヒドラターゼ(B)におけるαサブユニットにおいて付加、置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸残基(前記(a)及び(b)の置換されるアミノ酸残基を除く)の総数が1〜10であり、かつ、前記ニトリルヒドラターゼ(B)におけるβサブユニットにおいて、付加、置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸残基(前記(c)〜(e)の置換されるアミノ酸残基を除く)の総数が1〜10であるニトリルヒドラターゼ
本開示は、αサブユニットとβサブユニットとを有するシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいて、下記のアミノ酸残基置換(a)〜(e)からなる群から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基置換を含む、変異型ニトリルヒドラターゼ(以下、変異型ニトリルヒドラターゼAともいう)を提供する:
(a)αサブユニットのN末端から40番目のアミノ酸残基のAsnへの置換、
(b)αサブユニットのN末端から43番目のアミノ酸残基のValへの置換、
(c)βサブユニットのN末端から205番目のアミノ酸残基のValへの置換、
(d)βサブユニットのN末端から206番目のアミノ酸残基のGlnへの置換、
(e)βサブユニットのN末端から215番目のアミノ酸残基のAsnへの置換。
る酵素活性についての検討はされていなかった。至適条件から外れる酸性条件下におけるニトリルヒドラターゼの酵素活性は、本発明者等によって初めて着目されたものであり、上記の新たなアミノ酸残基変異が有効であることを見いだしたものである。
本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても当該工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本開示において、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、置換されたアミノ酸残基の数は、例えば、1〜20であり、あるいは1〜15であり、あるいは1〜10であり、あるいは1〜8であり、あるいは1〜7であり、あるいは1〜6であり、あるいは1〜5であり、あるいは1〜4であり、あるいは1〜3であり、あるいは1〜2であり、あるいは1である。置換されたアミノ酸残基の数は0であってもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、欠失されたアミノ酸残基の数は、例えば、1〜10であり、あるいは1〜7であり、あるいは1〜4であり、あるいは1〜2であり、あるいは1である。欠失されたアミノ酸残基の数は0であってもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、挿入されたアミノ酸残基の数は、例えば、1〜10であり、あるいは1〜7であり、あるいは1〜4であり、あるいは1〜2であり、あるいは1である。挿入されたアミノ酸残基の数は0であってもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、例えば、1〜20であり、あるいは1〜14であり、あるいは1〜8であり、あるいは1〜4であり、あるいは1〜2であり、あるいは1である。末端付加がある場合などは、置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、0であってもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、末端付加されたアミノ酸残基の数は、例えば、一末端あたり1〜60であり、あるいは1〜40であり、あるいは1〜20であり、あるいは1〜10であり、あるいは1〜5であり、あるいは1〜3であり、あるいは1である。付加されたアミノ酸残基の数は0であってもよい。
末端付加アミノ酸残基は、例えば分泌シグナル配列であってもよい。末端付加アミノ酸残基はN末端のみに、C末端のみに、あるいはN末端及びC末端の両方に存在してもよい。
前記改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列は、配列番号1で表される野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列との間で、例えば70%以上の配列同一性を有し、あるいは80%以上の配列同一性を有し、あるいは85%以上の配列同一性を有し、あるいは90%以上の配列同一性を有し、あるいは95%以上の配列同一性を有し、あるいは96%以上の配列同一性を有し、あるいは97%以上の配列同一性を有し、あるいは98%以上の配列同一性を有し、あるいは99%以上の配列同一性を有する。
ルティ:0.05を含む)を使用して行うことができる。
い換えると、アミノ酸残基置換(f)が存在すると、アミノ酸残基置換(a)から(e)による効果がより強くなる傾向にある。
6番目のアミノ酸残基であるLeuをThr又はAlaに置換
13番目のアミノ酸残基であるIleをLeuに置換
19番目のアミノ酸残基であるAlaをValに置換
27番目のアミノ酸残基であるMetをIleに置換
36番目のアミノ酸残基であるThrをMet、Ser、Gly又はAlaに置換
48番目のアミノ酸残基であるAsnをGlnに置換
71番目のアミノ酸残基であるArgをHisに置換
92番目のアミノ酸残基であるAspをGluに置換
94番目のアミノ酸残基であるMetをIleに置換
126番目のアミノ酸残基であるPheをTyrに置換
148番目のアミノ酸残基であるGlyをAspに置換
188番目のアミノ酸残基であるThrをGlyに置換
197番目のアミノ酸残基であるGlyをCysに置換
204番目のアミノ酸残基であるValをArgに置換
4番目のアミノ酸残基であるValをMetに置換
8番目のアミノ酸残基であるGlyをAlaに置換
10番目のアミノ酸残基であるThrをAspに置換
24番目のアミノ酸残基であるValをIleに置換
33番目のアミノ酸残基であるAlaをVal又はMetに置換
37番目のアミノ酸残基であるPheをVal又はLeuに置換
40番目のアミノ酸残基であるThrをIle、Val又はLeuに置換
41番目のアミノ酸残基であるPheをIleに置換
46番目のアミノ酸残基であるMetをLysに置換
48番目のアミノ酸残基であるLeuをValに置換
51番目のアミノ酸残基であるPheをValに置換
61番目のアミノ酸残基であるAlaをVal、Gly、Trp、Ser、Leu又はThrに置換
79番目のアミノ酸残基であるHisをAsnに置換
96番目のアミノ酸残基であるGlnをArgに置換
107番目のアミノ酸残基であるProをMetに置換
108番目のアミノ酸残基であるGluをAsp又はArgに置換
110番目のアミノ酸残基であるGluをAsnに置換
112番目のアミノ酸残基であるLysをVal又はIleに置換
118番目のアミノ酸残基であるPheをValに置換
127番目のアミノ酸残基であるLeuをSerに置換
146番目のアミノ酸残基であるArgをGlyに置換
150番目のアミノ酸残基であるAlaをAsn又はSerに置換
160番目のアミノ酸残基であるArgをCys、Trp又はMetに置換
168番目のアミノ酸残基であるThrをGluに置換
176番目のアミノ酸残基であるTyrをAla、Thr、Met又はCysに置換
186番目のアミノ酸残基であるLeuをArgに置換
200番目のアミノ酸残基であるAlaをGluに置換
206番目のアミノ酸残基であるProをLeuに置換
212番目のアミノ酸残基であるSerをTyrに置換
217番目のアミノ酸残基であるAspをVal、His、Met、Gly、Ser、Leu又はCysに置換
218番目のアミノ酸残基であるCysをMet又はSerに置換
226番目のアミノ酸残基であるValをIleに置換
230番目のアミノ酸残基であるAlaをGluに置換
231番目のアミノ酸残基であるAlaをValに置換
αサブユニットにおけるThr36Ser及びAsp92Glu並びにβサブユニットにおけるAla33Valの組み合わせ、
αサブユニットにおけるMet94Ile並びにβサブユニットにおけるAla61Gly及びAla150Asnの組み合わせ、
βサブユニットにおけるVal4Met、Tyr176Ala及びAsp217Valの組み合わせ
βサブユニットにおけるAla33Met、His79Asn及びTyr176Thrの組み合わせ、
βサブユニットにおけるThr40Val、Cys218Met及びVal226Ileの組み合わせ、
などが例として挙げられる。
αサブユニットにおけるIle13Leu、Ala19Val、Arg71His及びPhe126Tyr並びにβサブユニットにおけるPhe37Leu、Gln96Arg、Glu108Asp及びAla200Gluの組み合わせ(国際公開第2010/055666号:形質転換体番号59)、
αサブユニットにおけるLeu6Thr、Met27Ile、Thr36Met及びPhe126Tyr並びにβサブユニットにおけるThr10Asp、Pro107Met、Phe118Val及びAla200Gluの組み合わせ(国際公開第2010/055666号:形質転換体番号68)、
αサブユニットにおけるLeu6Thr、Thr36Met及びPhe126Tyr並びにβサブユニットにおけるThr10Asp、Phe118Val、Ala200Glu、Pro206Leu及びAla230Gluの組み合わせ(国際公開第2010/055666号:形質転換体番号92)、
αサブユニットにおけるLeu6Thr、Ala19Val及びPhe126Tyr並
びにβサブユニットにおけるLeu48Val、His79Asn、Glu108Arg、Ser212Tyr及びAla230Gluの組み合わせ(国際公開第2010/055666号:形質転換体番号85)、
αサブユニットにおけるThr36Met、Gly148Asp及びVal204Arg並びにβサブユニットにおけるPhe41Ile、Phe51Val、Glu108Asp、Pro206Leu及びAla230Gluの組み合わせ(国際公開第2010/055666号:形質転換体番号93)、
が例として挙げられる。
αサブユニットのN末端から40番目のアミノ酸残基のAsnへの置換、
αサブユニットのN末端から43番目のアミノ酸残基のValへの置換、
βサブユニットのN末端から205番目のアミノ酸残基のValへの置換、
βサブユニットのN末端から206番目のアミノ酸残基のGlnへの置換、
βサブユニットのN末端から215番目のアミノ酸残基のAsnへの置換。
のうち少なくとも1つを、以下のニトリルヒドラターゼ(1)〜(47)のいずれかに導入したもの(以下、変異型ニトリルヒドラターゼBともいう)であってもよい:
(2)配列番号16のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号33のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(3)配列番号17のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号33のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(4)配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号34のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(5)配列番号19のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号34のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(6)配列番号20のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号35のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(7)配列番号20のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号36のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(8)配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号37のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(9)配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号38のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(10)配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号39のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(11)配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号40のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(12)配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号41のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(13)配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号42のアミ
ノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(14)配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号43のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(15)配列番号22のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号44のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(16)配列番号23のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号45のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(17)配列番号24のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号46のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(18)配列番号25のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号47のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(19)配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号48のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(20)配列番号23のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号49のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(21)配列番号16のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号50のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(22)配列番号26のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号51のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(23)配列番号27のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号52のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(24)配列番号28のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号53のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(25)配列番号17のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号54のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(26)配列番号29のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号55のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(27)配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号56のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(28)配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号57のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(29)配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号58のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(30)配列番号29のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号59のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(31)配列番号31のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号60のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(32)配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号61のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(33)配列番号32のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号62のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(34)配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号63のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(35)配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号64のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(36)配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号65のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(37)配列番号25のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号54のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(38)配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号66のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(39)配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号67のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(40)配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号68のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(41)配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号69のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(42)配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号70のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(43)配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号71のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(44)配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号72のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(45)配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号73のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
(46)上記(1)〜(45)のニトリルヒドラターゼのうちいずれか1つにおけるαサブユニットのN末端から36番目のアミノ酸残基をTrp残基とした、ニトリルヒドラターゼ、
(47)上記(1)〜(46)のニトリルヒドラターゼのうちいずれか1つである特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるαサブユニットバリアントと、前記特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβサブユニットバリアントと、を有する改変ニトリルヒドラターゼであって、αサブユニットのアミノ酸配列及びβサブユニットのアミノ酸配列のうち少なくとも一方はαサブユニットバリアント又はβサブユニットバリアントのアミノ酸配列である、改変ニトリルヒドラターゼ。
前記(47)のニトリルヒドラターゼβサブユニットにおいて、上記(1)〜(46)のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に置換されたアミノ酸残基の数は、例えば、1〜20であり、あるいは1〜15であり、あるいは1〜10であり、あるいは1〜8であり、あるいは1〜7であり、あるいは1〜6であり、あるいは1〜5であり、あるいは1〜4であり、あるいは1〜3であり、あるいは1〜2であり、あるいは1である。置換されたアミノ酸残基の数は0であってもよい。
前記(47)のニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、上記(1)〜(46)のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に欠失されたアミノ酸残基の数は、例えば、1〜10であり、あるいは1〜7であり、あるいは1〜4であり、あるいは1〜2であり、あるいは1である。欠失されたアミノ酸残基の数は0であってもよい。
ってもよい。
前記(47)のニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、上記(1)〜(46)のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に挿入されたアミノ酸残基の数は、例えば、1〜10であり、あるいは1〜7であり、あるいは1〜4であり、あるいは1〜2であり、あるいは1である。挿入されたアミノ酸残基の数は0であってもよい。
前記(47)の改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、上記(1)〜(46)のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、例えば、1〜20であり、あるいは1〜14であり、あるいは1〜8であり、あるいは1〜4であり、あるいは1〜2であり、あるいは1である。末端付加がある場合などは、置換、欠失又は挿入されたアミノ酸残基の総数は、0であってもよい。
前記(47)のニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、上記(1)〜(46)のいずれかのニトリルヒドラターゼのβサブユニットを基準とした場合に末端付加されたアミノ酸残基の数は、例えば、一末端あたり1〜60であり、あるいは1〜40であり、あるいは1〜20であり、あるいは1〜10であり、あるいは1〜5であり、あるいは1〜3であり、あるいは1である。付加されたアミノ酸残基の数は0であってもよい。
上記ニトリルヒドラターゼ(1)〜(46)のいずれかのニトリルヒドラターゼである特定ニトリルヒドラターゼに対して、あるいは
特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットに対して70%以上の配列同一性を有する改変αサブユニット及び特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットに対して70%以上の配列同一性を有する改変βサブユニットを有するが特定ニトリルヒドラターゼ自体ではない改変ニトリルヒドラターゼに対して、
以下のアミノ酸残基置換のうち少なくとも1つを導入したもの(以下変異型ニトリルヒドラターゼCともいう)であってもよい:
前記特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのN末端から40番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のAsnへの置換、
前記特定ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのN末端から43番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のValへの置換、
前記特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのN末端から205番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のValへの置換、
前記特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのN末端から206番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のGlnへの置換、
前記特定ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのN末端から215番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のAsnへの置換。
改変ニトリルヒドラターゼのαサブユニットにおいて、付加、置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列(前記(a)及び(b)の置換されるアミノ酸残基を除く)を含む場合は、置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸残基の総数は1〜10であることが好ましく、1〜5であることがより好ましい。同様に、改変ニトリルヒドラターゼのβサブユニットにおいて、付加、置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸配列(前記(c)〜(e)の置換されるアミノ酸残基を除く)を含む場合は、置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸残基の総数は1〜10であることが好ましく、1〜5であることがより好ましい。
した野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度の、酸処理を施していない野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度に対する比(酸処理後の反応初速度/酸処理前の反応初速度)の値に対して、1.1倍以上の値を示していることが好ましい。
なお、上述した変異型ニトリルヒドラターゼまたは野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのpH安定性は、例えば、以下の方法で評価することができる。
反応条件として、基質であるアクリロニトリルを2.5%(v/v)含む、50mMトリス塩酸水溶液(pH8.0)で、反応温度20℃で15分から60分反応させる。反応終了後、生成したアクリルアミドを定量する。アクリルアミド量はHPLCによって分析することができる。また、酸処理は、例えば、pH4.0近辺で30℃、30時間処理することで行うことができる。具体的には、実施例におけるpH安定性の評価の欄に記載したやり方で評価できる。
において良好な状態に保持されていると考えられる。このため、上記(a)から(e)のアミノ酸残基置換は一群のアミノ酸残基置換であると考えられる(アミノ酸残基置換群A)。
システイン残基がシステインスルフェン酸(Cys-SOH)にそれぞれ翻訳後修飾を受
け、この修飾アミノ酸残基を介してαサブユニットのポリペプチド鎖とコバルト原子が結合し、活性中心を形成するものである。
術総合研究所特許生物寄託センターに平成8年2月7日より寄託されている)を使用することができる。また、改変ニトリルヒドラターゼは、通常の遺伝子操作技術を用いて得ることができる。タンパク質の立体構造は、一般に、アミノ酸配列の相同性が高い場合、該タンパク質を含む菌株の種属によらず、類似の構造を有する蓋然性が高いとされているため、アミノ酸残基置換(a)〜(e)のうち1つ以上の導入により得られる効果は、改変ニトリルヒドラターゼを含め、上記で規定されたシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ一般に対して発揮される。そして、得られた変異型ニトリルヒドラターゼは、例えば、pH8.0における酵素活性に比したpH4.0における酵素活性により評価されるpH安定性が、アミノ酸残基置換(a)〜(e)のうち1つ以上の導入前に比して向上していてもよい。
4つの組み合わせの場合、例えば、(a)、(b)、(c)及び(d)の組み合わせ、(a)、(b)、(c)及び(e)の組み合わせ、(a)、(b)、(d)及び(e)の組み合わせ、(a)、(c)、(d)及び(e)の組み合わせ、及び(b)、(c)、(d)及び(e)の組み合わせが挙げられる。
もちろん、(a)〜(e)は5つ組み合わせて置換しても構わない。
のうち1つ以上のアミノ酸残基置換を含む。上記(b)のアミノ酸残基置換と共に含まれる上記(a)及び(c)〜(e)のアミノ酸残基置換からなる群のうち1つ以上のアミノ酸残基置換は、2つのアミノ酸残基置換であってもよく、3つのアミノ酸残基置換であってもよく、4つのアミノ酸残基置換(つまり、(a)及び(c)〜(e)の全て)であってもよい。また、この実施形態においては、前記変異型ニトリルヒドラターゼはさらに前記(f)のアミノ酸残基置換を有していてもよい。
例えば、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするDNAを含む発現ベクターを用意し、この発現ベクターにより任意の宿主細胞を形質転換して形質転換体または細胞株を取得し、ついで、前記形質転換体や細胞株を培養して変異型ニトリルヒドラターゼを産生することができる。
そして、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするDNAは、少なくとも、配列番号3で示されるヌクレオチド配列または配列番号4で示されるヌクレオチド配列における、上記(a)〜(e)のアミノ酸残基置換位置に対応するコドン(計5箇所)のうち1つ以上に下記のようなヌクレオチド置換を有しており、その他の位置においても改変ニトリルヒドラターゼに対応するヌクレオチド置換を有している。
流に位置する事が望ましく、転写終結配列は変異型ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子より3'末端側下流に位置する事が望ましい。また、その様な制御領域により変異型
ニトリルヒドラターゼのαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々独立のシストロンとして発現されてもよいし、共通の制御領域によりポリシストロンとして発現されてもよい。
okら;Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)等に記載されている分子生物学、生物工学、及び遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法や宿主細胞を採用することができる。
本開示に係る核酸は、前記変異型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する。
前記変異型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を合成する方法として、対応する野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列に変異点を導入する方法や、変異点を含む全ヌクレオチド配列を化学的に合成する方法などが挙げられる。野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列を鋳型として、遺伝子に変異を生じさせる方法としては、例えば、部位特異的変異法(Kramer,
W. and frita,H.J., Methods in Enzymology,v
ol.154,P.350(1987))、リコンビナントPCR法(PCR Tech
nology,Stockton Press(1989)、特定の部分のDNAを化学
合成する方法、遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法、遺伝子を保有する菌株を紫外線照射する方法、ニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法、市販の突然変異導入キットを使用する方法などが挙げられる。本開示に係る核酸はDNAであってもRNAであってもよい。
本開示に係るベクターは、前記変異型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で示される核酸を含むベクターであれば特に限定されず、公知のベクターに前記変異型ニトリルヒドラターゼを導入したものが例として挙げられる。また、前記ベクターはファージベクターであってもプラスミドベクターであってもかまわない。
本開示に係る発現ベクターは、前記変異型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列で示される核酸を含む発現ベクターであれば特に限定されるものではないが、形質転換効率や翻訳効率を向上させるなどの観点より、以下に示すような構成を示すプラスミドベクターやファージベクターであることがより好ましい。
発現ベクターは、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列を含み、前記宿主細胞を形質転換しうるものであれば特に限定されない。必要に応じて、該ヌクレオチド配列の他に、他の領域を構成するヌクレオチド配列(以下、単に「他の領域」とも言う。)を含んでいてもよい。 他の領域としては、例えば、前記形質転換体が、前記変異型ニトリルヒドラターゼを産生するために必要とする制御領域や、自律複製に必要な領域などが挙げられる。
また、前記形質転換体の選択を容易にするという観点より、選択マーカーとなりうる選択遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。
前記変異型ニトリルヒドラターゼを産生するために必要となる制御領域としては、プロモーター配列(転写を制御するオペレーター配列を含む。)、リボゾーム結合配列(SD配列)、転写終結配列等を挙げることができる。
酵母を宿主細胞とした場合、発現ベクターとしては、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列の他に、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、酵母を宿主細胞とする形質転換体中で前記変異型ニトリルヒドラターゼを発現できるものであればいずれを用いてもよい。
なお、上記プロモーター配列の由来は宿主細胞となる酵母に限定されない。
サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターなどのように、外来のプロモーターを用いてもよい。これらは用いる酵素の由来や種類によって適宜選択することができる。
体が前記変異型ニトリルヒドラターゼを産生した場合、細胞外に前記変異型ニトリルヒドラターゼを分泌することが可能となる。
分泌シグナルとしては、宿主細胞となる酵母から前記変異型ニトリルヒドラターゼを分泌できるものであれば、特に限定されない。分泌効率の観点より、αファクターシグナル配列、インベルターゼシグナル配列、酸ホスファターシグナル配列、グルコアミラーゼシグナル配列などを用いることが好ましい。
糸状菌を宿主細胞とした場合、発現ベクターとしては、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列の他に、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、糸状菌を宿主細胞とする形質転換体中で前記変異型ニトリルヒドラターゼを発現できるものであればいずれを用いてもよい。
J.J.et al.(1991)In:Bennett,J.W.and Lasure, L.L.(eds.)More gene Manipulations in
Fungi.Academic Press,pp.396−428に記載されている。
また、pUC18、pBR322,pUC100、pSL1180(ファルマシア・インク社製)、pFB6及びアスペルギルス(Aspergillus)pRAX、トリコデルマ(Trichoderma)pTEX等のような一般的に用いられる他の発現ベクターを用いることもできる。
大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核生物を宿主細胞とする場合、発現ベクターは、前記変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列の他に、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。また、プロモーター配列の他にリボゾーム結合配列や転写終結配列等を含んでいてもよい。
また、tacプロモーターのように独自に改変又は設計されたプロモーター配列も利用できる。
前記リボゾーム結合配列としては、例えば、16SリボゾームRNAの3’末端領域に相補的な配列のうち、4ヌクレオチド以上連続したコンセンサス配列をDNA合成により作成した配列などが挙げられる。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、trpオペロンターミネーター等が利用できる。
これら制御領域の発現ベクター上での配列順序は、特に制限されるものではないが、転写効率を考慮すると5’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、目的蛋
白質をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
また、2種類以上の宿主内での自律複製が可能な発現ベクターの例として、pHV14、TRp7、YEp7及びpBS7等を発現ベクターとして利用することができる。
本開示に係る形質転換体は、公知の方法により作製することができる。例えば、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼをコードするヌクレオチド配列と、必要に応じて前記他の領域とを含む前記発現ベクターを構築し、該発現ベクターを所望の宿主細胞に形質転換する方法等が挙げられる。具体的には、Sambrook,J.,et.al.,”Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory
Press,(2001)等に記載されている分子生物学、生物工学及び遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用することができる。
これにより、発現ベクターに組み込んだ前記変異型ニトリルヒドラターゼ由来のタンパク質の生産量を増加させることができる可能性がある。
本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法は、前記形質転換体を培地中で培養すること、及び培養された形質転換体及び培地のうち少なくとも一方から、前記変異型ニトリルヒドラターゼを回収することを含む。
〔形質転換体の培養方法〕
前記発現ベクターで形質転換して得られた形質転換体の培養の条件は、形質転換前の宿主細胞の培養条件と同様であり、公知の条件を用いることができる。
培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培地に使用する成分としては、公知のものを用いることができる。例えば、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、NZアミン及びジャガイモ等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン及び有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素及び塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム及び鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。
なお、前記選択マーカーを含む発現ベクターにより形質転換した形質転換体の培養においては、例えば、前記選択マーカーが薬剤耐性である場合には、それに対応する薬剤を含む培地を使用し、前記選択マーカーが栄養要求性である場合には、それに対応する栄養素を含まない培地を使用する。培地のpHは、pH4〜pH8の範囲で選べばよい。
培養は前記培地を含有する液体培地中で、前記形質転換体を振とう培養、通気攪拌培養
、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なうことができる。
培養条件は、前記形質転換体、培地、培養方法の種類により適宜選択すればよく、形質転換体が生育し、本開示に係る変異型ニトリルヒドラターゼを産生できる条件であれば特に制限はない。
培養温度は20℃〜45℃、好ましくは24℃〜37℃で好気的に培養を行う。
培養期間は1日間〜7日間の範囲で目的の変異型ニトリルヒドラターゼ活性を有する蛋白質の含量が最大になるまで培養すればよい。
変異型ニトリルヒドラターゼ回収工程は、培養された形質転換体及び培養後の培地のうち少なくともいずれか一方から、前記変異型ニトリルヒドラターゼを回収する工程である。
本開示に係る前記変異型ニトリルヒドラターゼが形質転換した形質転換体外に分泌される場合は、該形質転換体の培養物を遠心分離、ろ過等を行うことで粗酵素液を容易に得ることができる。また、本開示に係る前記変異型ニトリルヒドラターゼが形質転換した形質転換体内に蓄積される場合は、培養した該形質転換体を遠心分離等の手段により回収し、回収した該形質転換体を緩衝液に懸濁し、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などの公知の方法に従い該形質転換体の細胞膜を破壊することにより、粗酵素液を回収すればよい。
回収されたニトリルヒドラターゼ活性を有する粗酵素液について、分離精製を必要とする場合は、例えば、硫酸アンモニウムなどによる塩析、アルコールなどによる有機溶媒沈殿法、透析及び限外ろ過などによる膜分離法、あるいはイオン交換体クロマトグラフィー、逆相高速クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知のクロマト分離法を適宜組み合わせて行うことができる。
上述した接触させる温度は、好ましくは、前記変異型ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲内であり、より好ましくは、0℃〜60℃、より好ましくは15℃〜35℃である。例えば、前記変異型ニトリルヒドラターゼを産生する形質転換体や細胞株を培養した培養液を、ニトリル化合物を含む水溶液中にそのまま添加してもよく、あるいは培養液を遠心処理して菌体を分離し、菌体をニトリル化合物を含む水溶液に添加してもよい。反
応時における水溶液のpHは7〜9であることが好ましく、7.5〜8.5であることがより好ましい。ニトリル化合物は水溶液中に、例えば0.25体積%〜20.0体積%、より好ましくは2.0体積%〜5.0体積%の濃度で存在してもよい。形質転換体の培養についての詳細は、変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法の項で述べたとおりである。
30mLの試験管に10mLのLB液体培地を調製し、121℃における20分間のオートクレーブにより該液体培地を滅菌した。この液体培地に対し、終濃度が100μg/mLとなるようにアンピシリンを添加した後、上記の細胞株MT−10822を一白金耳植菌し、37℃で300rpmにて約20時間培養した。その後、得られた培養液1mLを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離(15000rpm×5分)により該菌体を分離した。
続いてアルカリSDS抽出法により、分離して得られた菌体よりプラスミドpPT−DB1を調製した。調製したプラスミドを大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)に形質転換し、形質転換体(1)を得た。形質転換体(1)は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼであるニトリルヒドラターゼ(1)を産生する。
表14で示すような野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのN末端から92番目のアミノ酸残基であるAspをGluに置換した変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(2)を取得するために、宝酒造社製の「LA PCR in vitro mutagenesis Kit」(以後、変異導入キットと呼ぶ)を用いた部位特異的な変異導入を行った。野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ発現プラスミドpPT−DB1を鋳型としてPCR反応を行った。
PCR反応No.1は、配列番号5のプライマー及びM13プライマーM4(配列番号12に配列を記載)を各々50pmol含む全量50μLの系(組成は変異導入キットに記載の条件による)で、熱変性(98℃)15秒、アニーリング(55℃)30秒、伸長反応(72℃)120秒の条件を25サイクル繰り返す事により行った。
PCR反応No.2は、MUT4プライマー(配列番号14に配列を記載)及びM13プライマーRV(配列番号13に配列を記載)を各々50pmol含む全量50μLの系(組成は変異導入キットに記載の条件による)で、PCR反応No.1と同様の操作により行った。
Microcon100(宝酒造社製)を用いてそれぞれのPCR反応終了液より過剰なプライマー及びdNTPを除去した後、TEを加えて各々50μLの溶液を調製した。該TE溶液を各0.5μLずつ含む全量47.5μLのアニーリング溶液(組成は変異導入キットに記載の条件による)を調製し、熱変性処理(98℃)を10分間行った後、37℃まで60分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて37℃で15分間保持することによってアニーリング処理を行った。
アニーリング処理液にTaKaRa LA Taqを0.5μL加えて72℃で3分間加熱処理を行い、ヘテロ2本鎖を完成させた。
これにM13プライマーM4(配列番号12に配列を記載)及びM13プライマーRV(配列番号13に配列を記載)を各々50pmol加えて全量を50μLとした後、熱変性(98℃)15秒、アニーリング(55℃)30秒、伸長反応(72℃)120秒の条件を25サイクル繰り返すことによるPCR反応No.3を行った。
続いて、アガロースゲルから約2KbのDNA断片のみを切り出し、該アガロース片(約0.1g)を細かく粉砕し1mLのTE溶液に懸濁後、55℃で1時間保温してアガロースを完全に融解させた。
この融解液に対してフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該DNA断片を精製し、最終的に10μLのTEに溶解した。
精製した約2kbの増幅DNA断片を制限酵素EcoRI及びHindIIIにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該DNA断片を精製し、最終的に10μLのTEに溶解した。
同様に、EcoRI及びHindIIIによりニトリルヒドラターゼ発現プラスミドpPT−DB1を切断し、アガロースゲル電気泳動(シグマ社製タイプVII低融点アガロース使用;アガロース濃度0.7%)を行い、アガロースゲルから約2.7KbのDNA断片のみを切り出した。
切りだしたアガロース片(約0.1g)を細かく粉砕し1mLのTE溶液に懸濁後、55℃で1時間保温してアガロースを完全に融解させた。
この融解液に対してフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該DNA断片を精製し、最終的に10μLのTEに溶解した。
この様にして得られた約2kbと約2.7KbのDNA断片をDNAライゲーションキット(宝酒造社製)を用いて連結させた後、大腸菌HB101のコンピテントセル(東洋紡績社製)を形質転換し、形質転換体(2)を得た。また上記菌体からアルカリSDS抽出法によりプラスミドを調製し、DNAシーケンサーにてニトリルヒドラターゼ遺伝子部分のヌクレオチド配列を決定し、実施例1記載のプラスミドpPT−DB1に、αサブユニットのN末端から92番目のアミノ酸残基であるAspをGluとする変異を有していることを確認した。形質転換体(2)は、表14に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(2)を産生する。
こうして得られた形質転換体(2)、及び、そのベースとなったpPT−DB1を含む形質転換体(1)を用いたアミド化合物の製造におけるpH安定性を以下の方法により比較した。これによりニトリルヒドラターゼ(2)のニトリルヒドラターゼ(1)と比較した相対的なpH安定性が評価できる。
試験管に40μg/mLの硫酸第二鉄・七水和物及び10μg/mLの塩化コバルト・二水和物を含む5mLのLB液体培地を調製し、121℃における20分間のオートクレーブにより滅菌した。
この培地に終濃度が100μg/mLとなるようにアンピシリンを添加した後、各形質転換体を一白金耳植菌し、37℃において200rpmにて約20時間其々培養した。
該培養終了液40μlを取り、740μLの54mMトリス塩酸水溶液(pH8.0)に懸濁し、これに20μLのアクリロニトリルを添加して20℃で緩やかに攪拌しながら15分から60分間反応させた。反応終了後、HPLCを用いて反応液の分析を行い、ニトリル化合物からアミド化合物を生成する酵素活性を求めた。反応及び分析は各形質転換体に対し3回以上行い、分注操作等でのデータのばらつきを補正した。
同様に、前記培養終了液1000μlを取り、遠心分離し回収した菌体に50mMクエン酸緩衝液(pH4.0)1000μlを加え、撹拌しながら30℃、30hr処理した(酸処理)。処理後、780μlを遠心分離し菌体を回収し、780μLの54mMトリス塩酸水溶液(pH8.0)に懸濁し、これに20μLのアクリロニトリルを添加して20℃で緩やかに攪拌しながら15分から60分間反応させた。反応終了後、HPLCを用いて反応液の分析を行い、ニトリル化合物からアミド化合物を生成する酵素活性を求めた。反応及び分析は各形質転換体に対し3回以上行い、分注操作等でのデータのばらつきを補正した。
分析機器: 日本分光HPLC
カラム : YMC Pack ODS−A (150×6.00 mm)
分析温度: 40℃
移動相 : 3% アセトニトリル、10mM リン酸
50mMクエン酸緩衝液(pH4.0)で処理した菌体の活性と処理無しの菌体の酵素活性の比を取りpH安定性とした。形質転換体(2)のpH安定性は野生型(1)と比較し0.82倍であった。
表14で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(3)を取得するために、配列番号5のプライマーに代えて配列番号7のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体(3)を得た。形質転換体(3)は、表14に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(3)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(3)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表14に示す。
表14で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(4)を取得するために、配列番号5のプライマーに代えて配列番号8のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体(4)を得た。形質転換体(4)は、表14に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(4)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(4)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表14に示す。
表14で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(5)を取得するために、配列番号5のプライマーに代えて配列番号9のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体(5)を得た。形質転換体(5)は、表14に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(5)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(5)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表14に示す。
表14で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(6)を取得するために、配列番号5のプライマーに代えて配列番号10のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体(6)を得た。形質転換体(6)は、表14に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(6)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(6)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表14に示す。
表14で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(7)を取得するために、配列番号5のプライマーに代えて配列番号11のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体(7)を得た。形質転換体(7)は、表14に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(7)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(7)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表14に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(8)を取得するために、実施例1のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号6のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(8)を得た。形質転換体(8)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(8)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(8)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(9)を取得するために、実施例2のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号6のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(9)を得た。形質転換体(9)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(9)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(9)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(10)を取得するために、実施例3のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号6のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(10)を得た。形質転換体(10)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(10)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(10)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する
形質転換体(11)を取得するために、実施例4のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号6のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(11)を得た。形質転換体(11)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(11)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(11)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(12)を取得するために、実施例5のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号6のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(12)を得た。形質転換体(12)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(12)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(12)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(13)を取得するために、実施例1のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号8のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(13)を得た。形質転換体(13)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(13)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(13)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(14)を取得するために、実施例1のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号9のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(14)を得た。形質転換体(14)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(14)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(14)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(15)を取得するために、実施例2のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号9のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(15)を得た。形質転換体(15)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(15)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(15)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(16)を取得するために、実施例2のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号10のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(16)を得た。形質転換体(16)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(16)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(16)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方
法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(17)を取得するために、実施例2のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号11のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(17)を得た。形質転換体(17)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(17)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(17)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(18)を取得するために、比較例1のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号15のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(18)を得た。形質転換体(18)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(18)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(18)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(19)を取得するために、実施例3のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号11のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(19)を得た。形質転換体(19)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(19)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(19)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表15で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(20)を取得するために、実施例4のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号11のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(20)を得た。形質転換体(20)は、表15に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(20)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(20)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表15に示す。
表16で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(21)を取得するために、実施例7のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号9のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(21)を得た。形質転換体(21)は、表16に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(21)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(21)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表16に示す。
表16で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(22)を取得するために、実施例11のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号9のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして、形質転換体(22)を得た。形質転換体(22)は、表16に記載の変異を有す
るニトリルヒドラターゼ(22)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(22)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表16に示す。
表16で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(23)を取得するために、実施例7のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号11のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして、形質転換体(23)を得た。形質転換体(23)は、表16に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(23)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(23)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表16に示す。
表17で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(24)を取得するために、実施例7のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号15のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にして形質転換体(24)を得た。形質転換体(24)は、表17に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(24)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(24)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表17に示す。
つ以上組み合わせても、ニトリルヒドラターゼのpH安定性の向上をもたらすことが分かる。また、その向上の程度は一段と高い傾向がある。
野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼ及び表18で示すアミノ酸残基置換を有するニトリルヒドラターゼの反応初速度を、「pH安定性の比較」に記載の酸処理前のアミド化合物生成の測定における反応初速度を測定することで調べた結果を表18に示す。反応初速度の値は、野生型シュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおける反応初速度の値に対する相対値で示す。
表19で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を含むプラスミド(日本国特許第5551081号形質転換体番号92参照)を用いて、比較例2に記載の形質転換と同様の方法によって形質転換体(25)を得た。形質転換体(25)は、表19に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(25)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(25)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表19に示す。
表19で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(26)を取得するために、比較例3のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号8のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体(26)を得た。形質転換体(26)は、表19に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(26)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(26)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表19に示す。
表20で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体の反応初速度を、「pH安定性の比較」に記載の酸処理前のアミド化合物生成の測定における反応初速度を測定することで調べた結果を表20に示す。反応初速度の値は、ニトリルヒドラターゼ(25)における反応初速度の値に対する相対値で示す。
表21で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を含むプラスミド(日本国特許第5551081号形質転換体番号114参照)を用いて、比較例2に記載の形質転換と同様の方法によって形質転換体(27)を得た。形質転換体(27)は、表21に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(27)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(27)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表21に示す。
表21で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(28)を取得するために、比較例4のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号8のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体(28)を得た。形質転換体(28)は、表21に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(28)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(28)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表21に示す。
表21で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体の反応初速度を、「pH安定性の比較」に記載の酸処理前のアミド化合物生成の測定における反応初速度を測定することで調べた結果を表22に示す。反応初速度の値は、ニトリルヒドラターゼ(27)における反応初速度の値に対する相対値で示す。
表23で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体を含むプラスミド(特許第5551081号形質転換体番号33参照)を用いて、比較例2に記載の形質転換と同様の方法によって形質転換体(29)を得た。形質転換体(29)は、表23に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(29)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(29)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表23に示す。
表23で示すようなアミノ酸残基置換を有する変異型ニトリルヒドラターゼを発現する形質転換体(30)を取得するために、比較例5のプラスミドを鋳型として用い、配列番号5のプライマーに代えて配列番号8のプライマーを用いること以外は比較例2と同様にしてプラスミドを得て、形質転換体(30)を得た。形質転換体(30)は、表23に記載の変異を有するニトリルヒドラターゼ(30)を産生する。
ニトリルヒドラターゼ(30)のpH安定性を上記「pH安定性の比較」に記載した方法で評価した。得られた結果を表23に示す。
表23で示すようなアミノ酸置換位置で変異させたニトリルヒドラターゼ変異体の反応初速度を、「pH安定性の比較」に記載の酸処理前のアミド化合物生成の測定における反応初速度を測定することで調べた結果を表24に示す。反応初速度の値は、ニトリルヒドラターゼ(29)における反応初速度の値に対する相対値で示す。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
Claims (17)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するαサブユニットと、配列番号2で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するβサブユニットとを有するシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいて、下記のアミノ酸残基置換(a)〜(e)からなる群から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基置換を含み、酸処理(pH4.0、30℃ 、3 0時間の処理)を施した変異型ニトリルヒドラターゼの反応初速度の、酸処理を施していない変異型ニトリルヒドラターゼの反応初速度に対する比( 酸処理後の反応初速度/ 酸処理前の反応初速度) の値が、酸処理を施した野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度の、酸処理を施していない野生型のシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼの反応初速度に対する比( 酸処理後の反応初速度/ 酸処理前の反応初速度)の値に対して、1.1倍以上である、変異型ニトリルヒドラターゼ、
(a)αサブユニットにおいて、配列番号1のN末端から40番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のAsnへの置換、
(b)αサブユニットにおいて、配列番号1のN末端から43番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のValへの置換、
(c)βサブユニットにおいて、配列番号2のN末端から205番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のValへの置換、
(d)βサブユニットにおいて、配列番号2のN末端から206番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のGlnへの置換、
(e)βサブユニットにおいて、配列番号2のN末端から215番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のAsnへの置換。 - アミノ酸残基置換(a)〜(e)からなる群から選ばれる2つ以上のアミノ酸残基置換を含む、請求項1に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
- アミノ酸残基置換(b)と、アミノ酸残基置換(a)、(c)、(d)及び(e)からなる群から選択される少なくとも1つと、を含む、請求項1又は請求項2に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
- αサブユニットのアミノ酸配列における、配列番号1のN末端から36番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がTrpである、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
- αサブユニットのアミノ酸配列における、配列番号1のN末端から36番目のアミノ酸に対応するアミノ酸がMet、Ser、Gly又はAlaである、請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
- αサブユニットのアミノ酸配列が、以下の(1)〜(13)のうち1つ以上を満たす、請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ:
(1)配列番号1のN末端から6番目のアミノ酸残基がThr又はAlaである、
(2)配列番号1のN末端から13番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がLeuである、
(3)配列番号1のN末端から19番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValである、
(4)配列番号1のN末端から27番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がIleである、
(5)配列番号1のN末端から48番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がGlnである、
(6)配列番号1のN末端から71番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がHisである、
(7)配列番号1のN末端から92番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がGluである、
(8)配列番号1のN末端から94番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がIleである、
(9)配列番号1のN末端から126番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がTyrである、
(10)配列番号1のN末端から148番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がAspである、
(11)配列番号1のN末端から188番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がGlyである、
(12)配列番号1のN末端から197番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がCysである、
(13)配列番号1のN末端から204番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がArgである。 - βサブユニットのアミノ酸配列が、以下の(15)〜(47)のうち少なくとも1つを満たす、請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ:
(15)配列番号2のN末端から4番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がMetである、
(16)配列番号2のN末端から8番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がAlaである、
(17)配列番号2のN末端から10番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がAspである、
(18)配列番号2のN末端から24番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がIleである、
(19)配列番号2のN末端から33番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal又はMetである、
(20)配列番号2のN末端から37番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal又はLeuである、
(21)配列番号2のN末端から40番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がIle、Val又はLeuである、
(22)配列番号2のN末端から41番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がIleである、
(23)配列番号2のN末端から46番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がLysである、
(24)配列番号2のN末端から48番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValである、
(25)配列番号2のN末端から51番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValである、
(26)配列番号2のN末端から61番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、Gly、Trp、Ser、Leu又はThrである、
(27)配列番号2のN末端から79番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がAsnである、
(28)配列番号2のN末端から96番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がArgである、
(29)配列番号2のN末端から107番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がMetである、
(30)配列番号2のN末端から108番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がAsp又はArgである、
(31)配列番号2のN末端から110番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がAsnである、
(32)配列番号2のN末端から112番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal又はIleである、
(33)配列番号2のN末端から118番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValである、
(34)配列番号2のN末端から127番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がSerである、
(35)配列番号2のN末端から146番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がGlyである、
(36)配列番号2のN末端から150番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がAsn又はSerである、
(37)配列番号2のN末端から160番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がCys、Trp又はMetである、
(38)配列番号2のN末端から168番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がGluである、
(39)配列番号2のN末端から176番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がAla、Thr、Met又はCysである、
(40)配列番号2のN末端から186番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がArgである、
(41)配列番号2のN末端から200番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がGluである、
(42)配列番号2のN末端から212番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がTyrである、
(43)配列番号2のN末端から217番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がVal、His、Met、Gly、Ser、Leu又はCysである、
(44)配列番号2のN末端から218番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がMet又はSerである、
(45)配列番号2のN末端から226番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がIleである、
(46)配列番号2のN末端から230番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がGluである、
(47)配列番号2のN末端から231番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がValである。 - 下記[1]〜[48]のいずれかのシュードノカルディア・サーモフィラ由来ニトリルヒドラターゼにおいて、前記(a)〜(e)からなる群から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基置換を含む、請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼ。
[1]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号2のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[2]配列番号16のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号33のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[3]配列番号17のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号33のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[4]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号34のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[5]配列番号19のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号34のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[6]配列番号20のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号35のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[7]配列番号20のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号36のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[8]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号37のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[9]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号38のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[10]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号39のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[11]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号40のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[12]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号41のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[13]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号42のアミ
ノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[14]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号43のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[15]配列番号22のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号44のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[16]配列番号23のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号45のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[17]配列番号24のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号46のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[18]配列番号25のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号47のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[19]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号48のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[20]配列番号23のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号49のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[21]配列番号16のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号50のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[22]配列番号26のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号51のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[23]配列番号27のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号52のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[24]配列番号28のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号53のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[25]配列番号17のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号54のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[26]配列番号29のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号55のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[27]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号56のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[28]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号57のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[29]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号58のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[30]配列番号29のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号59のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[31]配列番号31のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号60のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[32]配列番号18のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号61のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[33]配列番号32のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号62のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[34]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号63のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[35]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号64のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[36]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号65のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[37]配列番号25のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号54のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[38]配列番号30のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号66のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[39]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号67のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[40]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号68のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[41]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号69のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[42]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号70のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[43]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号71のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[44]配列番号21のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号72のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[45]配列番号1のアミノ酸配列を有するαサブユニットと、配列番号73のアミノ酸配列を有するβサブユニットと、を有するニトリルヒドラターゼ、
[46]上記[1]〜[45]のニトリルヒドラターゼのうちいずれか1つにおけるαサブユニットのN末端から36番目のアミノ酸残基をTrp残基とした、ニトリルヒドラターゼ
[47]上記[1]〜[46]のうちいずれか1つのニトリルヒドラターゼ(A)のαサブユニット又は該αサブユニットと90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるαサブユニットバリアントと、前記ニトリルヒドラターゼ(A)のβサブユニット又は該βサブユニットと90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるβサブユニットバリアントと、を有するニトリルヒドラターゼであって、αサブユニット及びβサブユニットのうち少なくとも一方はαサブユニットバリアント又はβサブユニットバリアントである、ニトリルヒドラターゼ
[48]上記[1]〜[46]のうちいずれか1つのニトリルヒドラターゼ(B)におけるαサブユニットにおいて付加、置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸残基(前記(a)及び(b)の置換されるアミノ酸残基を除く)の総数が1〜10であり、かつ、前記ニトリルヒドラターゼ(B)におけるβサブユニットにおいて、付加、置換、欠失、及び/又は挿入されたアミノ酸残基(前記(c)〜(e)の置換されるアミノ酸残基を除く)の総数が1〜10であるニトリルヒドラターゼ - 請求項1〜請求項8のいずれか1項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼをコードする核酸。
- 請求項9に記載の核酸を含むベクター。
- 発現ベクターである、請求項10に記載のベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
- 請求項12に記載の形質転換体を培地中で培養すること、並びに培養された形質転換体及び培地のうち少なくとも一方から、請求項1〜請求項8のいずれか1項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼを回収することを含む変異型ニトリルヒドラターゼの製造方法。
- 請求項13に記載の製造方法によって得られた変異型ニトリルヒドラターゼ。
- 請求項1〜請求項8及び請求項14のうちいずれか1項に記載の変異型ニトリルヒドラターゼをニトリル化合物に接触させることを含む、アミド化合物の製造方法。
- さらに、pH3.5〜pH6.5で、アミド化合物を含む溶液から不純物を除去することを含む、請求項15に記載のアミド化合物の製造方法。
- さらに、アミド化合物を活性炭により精製することを含む、請求項15または請求項16に記載のアミド化合物の製造方法。
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