KR101698706B1 - 개량형 니트릴 히드라타제 - Google Patents

Abstract

촉매 활성이 향상된 개량형 니트릴 히드라타제를 제공하고, 당해 개량형 니트릴 히드라타제를 코드하는 DNA, 당해 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체, 당해 형질 전환체의 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제 및 그 제조 방법을 제공한다. 또한, 당해 배양물 또는 당해 배양물의 처리물을 사용한 아미드 화합물의 제조 방법을 제공한다. β 서브유닛에 있어서, 배열 번호 50(GX₁X₂X₃X₄DX₅X₆R)에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제이며, X₄가, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 개량형 니트릴 히드라타제.

Description

개량형 니트릴 히드라타제{IMPROVED NITRILE HYDRATASE}

본 발명은 개량형(변이형) 니트릴 히드라타제, 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 나아가, 당해 효소를 코드하는 유전자 DNA, 당해 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터 및 당해 재조합 벡터를 갖는 형질 전환체, 및 아미드 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

최근 들어, 니트릴기를 수화하여 아미드기로 변환하는 니트릴 수화 활성을 갖는 효소인 니트릴 히드라타제가 발견되어, 당해 효소 또는 당해 효소를 함유하는 미생물 균체 등을 사용하여 니트릴 화합물로부터 대응하는 아미드 화합물을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 이 제조 방법은, 종래의 화학 합성법과 비교하여, 니트릴 화합물로부터 대응하는 아미드 화합물로의 전화율 및 선택율이 높은 것으로 알려져 있다.

니트릴 히드라타제를 생산하는 미생물로는, 예를 들어 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속 등에 속하는 미생물을 들 수 있다. 그 중에서도 로도코커스·로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1주는 아크릴아미드의 공업적 생산에 사용되고 있어, 유용성이 실증되어 있다. 또한, 그 균주가 산생하는 니트릴 히드라타제를 코드하는 유전자도 명확해져 있다(특허문헌 1 참조).

한편, 자연계에 존재하는 미생물로부터 단리한 니트릴 히드라타제나 그 유전자를 이용할 뿐만 아니라, 니트릴 히드라타제에 대하여 활성, 기질 특이성, Vmax, Km, 열 안정성, 기질에 대한 안정성, 생성물에 대한 안정성 등을 변화시킬 목적으로 니트릴 히드라타제에 변이를 도입하는 것이 시도되어 있으며, 슈도노카르디아·서모필라 JCM3095의 니트릴 히드라타제에서는, 입체 구조 정보로부터 기질 특이성이나 열 안정성에 관여하는 영역을 예측하고, 이들 중에서 기질 특이성이 변화한 변이 효소를 취득하고 있다(특허문헌 2 내지 4 참조). 또한, 본 발명자들에 의해 내열성 또는 아미드 화합물 내성을 함께 향상시킨 니트릴 히드라타제 유전자가 취득되어 있다(특허문헌 5 내지 9 참조).

효소법을 이용해서 공업적으로 아크릴아미드를 생산함에 있어서, 촉매 활성이 향상된 니트릴 히드라타제를 개발하는 것은, 촉매 비용 등의 생산 비용의 관점 등에서 매우 유용하고, 특히 활성이 향상된 효소의 취득은, 반응시의 효소량의 삭감 및 비용 삭감 등의 관점에서 개발이 요망되고 있다.

일본 특허 제3162091호 공보 국제 공개 제2004/056990호 팸플릿 일본 특허 공개 제2004-194588호 공보 일본 특허 공개 제2005-16403호 공보 국제 공개 제2005/116206호 팸플릿 일본 특허 공개 제2007-143409호 공보 일본 특허 공개 제2007-43910호 공보 일본 특허 공개 제2008-253182호 공보 일본 특허 공개 제2010-172295호 공보

따라서, 본 발명의 목적은, 니트릴 히드라타제의 개량에 의해, 촉매 활성이 향상된 개량형 니트릴 히드라타제를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은, 당해 개량형 니트릴 히드라타제를 코드하는 DNA, 당해 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체, 당해 형질 전환체의 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제 및 그 제조 방법을 제공하는 데에 있다. 또한, 본 발명의 목적은, 당해 배양물 또는 당해 배양물의 처리물을 사용한 아미드 화합물의 제조 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열 중, 특정한 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 단백질이 니트릴 히드라타제 활성을 가짐과 함께, 촉매 활성이 향상된 것인 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 하기 (a) 내지 (e)에서 선택되는 적어도 하나의 특징을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제.

(a) β 서브유닛에서, 배열 번호 50에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제이며,

GX₁X₂X₃X₄DX₅X₆R(배열 번호 50)

(G는 글리신, D는 아스파라긴산, R은 아르기닌을 나타내고, X₁, X₂, X₃, X₅, X₆은 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)

X₄가, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 개량형 니트릴 히드라타제.

(b) β 서브유닛에서, 배열 번호 81에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제이며,

WEX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈D(배열 번호 81)

(W는 트립토판, E는 글루탐산, D는 아스파라긴산, X₁ 내지 X₆ 및 X₈ 내지 X₁₈은 각각 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)

X₇이, 알라닌, 발린, 아스파라긴산, 트레오닌, 페닐알라닌, 이소류신 및 메티오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 개량형 니트릴 히드라타제.

(c) α 서브유닛에서, 배열 번호 119에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제이며,

AX₁X₂X₃X₄GX₅X₆GX₇X₈(배열 번호 119)

(A는 알라닌, G는 글리신, X₁ 내지 X₇은 각각 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)

X₈이, 알라닌, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 리신, 프롤린, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 개량형 니트릴 히드라타제.

(d) α 서브유닛에서, 배열 번호 132에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제이며, X₇이 야생형과는 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 개량형 니트릴 히드라타제.

AX₁X₂X₃X₄GX₅X₆GX₇Q(배열 번호 132)

(A는 알라닌, G는 글리신, Q는 글루타민, X₁ 내지 X₆은 각각 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)

(e) α 서브유닛에서, 배열 번호 136에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제이며, X₉가 야생형과는 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 개량형 니트릴 히드라타제.

AX₁X₂X₃X₄GX₅X₆GX₇QX₈X₉(배열 번호 136)

(A는 알라닌, G는 글리신, Q는 글루타민, X₁ 내지 X₈은 각각 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)

(2) 배열 번호 50의 X₂가 S(세린)인 것을 특징으로 하는, (1)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(3) 배열 번호 50의 X₁이 I(이소류신), X₂가 S(세린), X₃이 W(트립토판), X₅가 K(리신), X₆이 S(세린)인 것을 특징으로 하는, (1)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(4) 상기 배열 번호 50에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제가, 배열 번호 51에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(5) 배열 번호 81의 X₁₄가 G(글리신)인 것을 특징으로 하는, (1)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(6) 배열 번호 81의 X₁이 G(글리신), X₂가 R(아르기닌), X₃이 T(트레오닌), X₄가 L(류신), X₅가 S(세린), X₆이 I(이소류신), X₈이 T(트레오닌), X₉가 W(트립토판), X₁₀이 M(메티오닌), X₁₁이 H(히스티딘), X₁₂가 L(류신), X₁₃이 K(리신), X₁₄가 G(글리신)인 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(7) 상기 배열 번호 81에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제가, 배열 번호 82에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 (1), (5) 및 (6) 중 어느 한 항에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(8) 배열 번호 119의 X₁이 M(메티오닌), X₂가 A(알라닌), X₃이 S(세린), X₄가 L(류신), X₅가 Y(티로신), X₆이 A(알라닌), X₇이 E(글루탐산)인 것을 특징으로 하는, (1)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(9) 상기 배열 번호 119에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제가, 배열 번호 120에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 (1) 또는 (8)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(10) α 서브유닛에서, 배열 번호 132에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제이며, X₇이 시스테인, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는, (1)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(11) 배열 번호 132의 X₁이 M(메티오닌), X₂가 A(알라닌), X₃이 S(세린), X₄가 L(류신), X₅가 Y(티로신), X₆이 A(알라닌)인 것을 특징으로 하는, (1) 또는 (10)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(12) 상기 배열 번호 132에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제가, 배열 번호 131에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 (1), (10) 및 (11) 중 어느 한 항에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(13) α 서브유닛에서, 배열 번호 136에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제이며, X₉가 시스테인, 글루탐산, 페닐알라닌, 이소류신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(14) 배열 번호 136의 X₁이 M(메티오닌), X₂가 A(알라닌), X₃이 S(세린), X₄가 L(류신), X₅가 Y(티로신), X₆이 A(알라닌), X₇이 E(글루탐산), X₈이 A(알라닌)인 것을 특징으로 하는, (1) 또는 (13)에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(15) 상기 배열 번호 136에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제가, 배열 번호 135에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 (1), (13) 및 (14) 중 어느 한 항에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(16) 상기 니트릴 히드라타제가, 로도코커스속 세균 또는 노카르디아속 세균 유래인, (1) 내지 (15) 중 어느 한 항에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제.

(17) (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제를 코드하는 DNA.

(18) (17)에 기재된 DNA와, 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.

(19) (17) 또는 (18)에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 벡터.

(20) (19)에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체.

(21) (20)에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제.

(22) (20)에 기재된 형질 전환체를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 니트릴 히드라타제를 채취하는 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타제의 제조 방법.

(23) (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 개량형 니트릴 히드라타제 또는 (20)에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물, 또는 당해 배양물의 처리물을 니트릴 화합물에 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 아미드 화합물의 제조 방법.

본 발명에 따르면, 촉매 활성이 향상된, 신규의 개량형(변이형) 니트릴 히드라타제를 제공할 수 있다. 촉매 활성이 향상된 개량형 니트릴 히드라타제는, 아미드 화합물의 제조상 매우 유용하다.

본 발명에 따르면, 또한, 상기 개량형 니트릴 히드라타제를 코드하는 유전자 DNA, 당해 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체, 당해 형질 전환체의 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제 및 그 제조, 및 상기 단백질(개량형 니트릴 히드라타제) 또는, 당해 배양물 또는 당해 배양물의 처리물을 사용한 아미드 화합물의 제조 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 플라스미드 pSJ034의 구성도이다.
도 2a는 기지의 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 얼라인먼트 결과를 도시하는 도면이다.
도 2b는 기지의 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 얼라인먼트 결과를 도시하는 도면이다.
도 3은 배열 번호 51로 나타내는, 본 발명의 β 서브유닛의 아미노산 배열이다.
도 4는 SDS-PAGE의 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 플라스미드 pER855A의 구성도이다.
도 6a는 각종 미생물 유래의 야생형 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 아미노산 배열(N 말단측의 일부)을 도시하는 도면이다.
도 6b는 도 6a와 마찬가지의 아미노산 배열을 도시하는 도면이며, 도 6a의 아미노산 배열에 계속되는 배열(C 말단측의 일부)을 나타내고 있다.
도 7은 배열 번호 82로 나타내는, 본 발명의 β 서브유닛의 아미노산 배열이다.
도 8a는 각종 미생물 유래의 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산 배열(N 말단측의 일부)을 도시하는 도면이다.
도 8b는 도 8a와 마찬가지의 아미노산 배열을 도시하는 도면이며, 도 8a의 아미노산 배열에 계속되는 배열을 나타내고 있다.
도 9는 배열 번호 121로 나타내는, 본 발명의 α 서브유닛의 아미노산 배열이다.
도 10a는 각종 미생물 유래의 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산 배열(N 말단측의 일부)을 도시하는 도면이다.
도 10b는 도 2a와 마찬가지의 아미노산 배열을 도시하는 도면이며, 도 10a의 아미노산 배열에 계속되는 배열을 나타내고 있다.
도 11은 배열 번호 131로 나타내는, 본 발명의 α 서브유닛의 아미노산 배열이다.
도 12a는 각종 미생물 유래의 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산 배열(N 말단측의 일부)을 도시하는 도면이다.
도 12b는 도 12a와 마찬가지의 아미노산 배열을 도시하는 도면이며, 도 12a의 아미노산 배열에 계속되는 배열을 나타내고 있다.
도 13은 배열 번호 135로 나타내는, 본 발명의 α 서브유닛의 아미노산 배열이다.

이하에, 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 니트릴 히드라타제

(a) 기지의 니트릴 히드라타제

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는, 기지의 니트릴 히드라타제의 개량형이며, 그 유래는 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 미국 생물공학 정보센터(NCBI; National Center for Biotechnology Information)에 의해 제공되는 GenBank 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein)에서 니트릴 히드라타제로서 등록되어 있는 것이나, 공지 문헌에서 니트릴 히드라타제에 대하여 기재되어 있는 것이 있으면 그것을 참고로 해도 된다. 예를 들어, 특허문헌 5 내지 9(참조함으로써, 본 명세서에 도입된다)에 기재된 니트릴 히드라타제를 나타낼 수 있다. 특허문헌 5 내지 9의 니트릴 히드라타제는, 내열성이나 아크릴아미드 내성을 갖고 있으며, 본 발명의 아미노산 치환의 부가에 의해, 촉매 활성의 향상이라는 성질을 부가할 수 있다. 구체적으로는, 배열 번호 53 내지 57의 아미노산 배열을 갖는 니트릴 히드라타제를 들 수 있다.

또한, 상기 아미노산 배열을 코드하는 유전자로부터 공지된 방법을 사용하여 변이를 도입하고, 원하는 성능을 갖는 변이 효소를 평가·선발함으로써 더욱 성능 향상된 개량 효소를 취득할 수 있다. 구체적으로는 배열 번호 58 내지 61의 아미노산 배열을 갖는 니트릴 히드라타제를 들 수 있다.

"니트릴 히드라타제"는, α 서브유닛 및 β 서브유닛의 도메인이 집합해서 이루어지는 고차 구조를 취하며, 보결 분자로서 비헴철 원자, 또는 비콜린 핵 코발트 원자를 갖고 있다. 이러한 니트릴 히드라타제는, 각각 철형 니트릴 히드라타제 및 코발트형 니트릴 히드라타제라는 호칭으로 구별되어 있다.

철형 니트릴 히드라타제로는, 로도코커스속 N-771주 유래의 것을 그 대표 예로서 들 수 있다. 이 철형 니트릴 히드라타제는, X선 결정 구조 해석이 이루어져, 그 입체 구조가 밝혀져 있다. 그 결과, 당해 효소는, 활성 중심을 형성하는 α 서브유닛의 시스테인 클러스터(Cys-Ser-Leu-Cys-Ser-Cys)(배열 번호 48) 중의 4개의 아미노산 잔기를 개재하여 비헴철과 결합하고 있다.

코발트형 니트릴 히드라타제로는, 로도코커스·로도크로우스 J1주(이하 "J1균"이라고도 함) 유래의 것, 또는 슈도노카르디아·서모필라(Pseudonocardia thermophila) 유래의 것을 대표 예로서 들 수 있다.

J1균 유래의 코발트형 니트릴 히드라타제는, 활성 중심을 형성하는 α 서브유닛의 시스테인 클러스터(Cys-Thr-Leu-Cys-Ser-Cys)(배열 번호 49)로 나타내는 영역을 개재하여 코발트 원자와 결합하고 있다. 또한, 슈도노카르디아·서모필라 유래의 코발트형 니트릴 히드라타제의 시스테인 클러스터는, 상기 J1균 유래의 시스테인 클러스터에서의 상류측(N 말단측)에서부터 제4번째의 시스테인(Cys)이 시스테인 술핀산(Csi)이며, 가장 하류측(C 말단측)의 제6번째의 시스테인(Cys)이 시스테인 술펜산(Cse)이다.

상술한 바와 같이, 보결 분자는, α 서브유닛 중의 시스테인 클러스터 "C(S/T)LCSC"(배열 번호 48, 49)로 표현되는 영역과 결합하고 있다. 이러한 보결 분자 결합 영역을 포함하는 니트릴 히드라타제로는, 예를 들어 로도코커스·로도크로우스 J1(FERM BP-1478), 로도코커스·로도크로우스 M8(SU1731814), 로도코커스·로도크로우스 M33(VKM Ac-1515D), 로도코커스·로도크로우스 ATCC39484(일본 특허 공개 제2001-292772호), 바실러스 스미티이(Bacillus smithii)(일본 특허 공개 평 9-248188호), 슈도노카르디아·서모필라(일본 특허 공개 평 9-275978호) 또는 지오바실러스 서모글루코시데시어스(Geobacillus thermoglucosidasius) 유래의 아미노산 배열을 갖는 니트릴 히드라타제 및 유전자 배열로 코드되는 니트릴 히드라타제를 들 수 있다.

한편, β 서브유닛의 기능에 대해서는 구조의 안정성에 관여하고 있는 것으로 여겨지고 있다.

예를 들어, 로도코커스·로도크로우스 J1(FERM BP-1478) 유래의 α 서브유닛은, 아미노산 배열이 배열 번호 4로 나타나고, 염기 배열이 배열 번호 3으로 나타난다. 또한, β 서브유닛는 아미노산 배열이 배열 번호 2로 나타나고, 염기 배열이 배열 번호 1로 나타나고, 액세션 번호는 "P21220"이다. 또한, 로도코커스·로도크로우스 M8(SU1731814) 유래의 α 서브유닛의 액세션 번호는 "ATT79340"이며, β 서브유닛의 액세션 번호는 "AAT79339"이다. 로도코커스·피리디노보란스 MW3 유래의 니트릴 히드라타제 유전자의 액세션 번호는 AJ582605, 로도코커스·피리디노보란스 S85-2 유래의 니트릴 히드라타제 유전자의 액세션 번호는 AJ582605, 로도코커스·루버 RH(CGMCC No.2380)의 니트릴 히드라타제 유전자는 CN101463358에 기재되어 있다. 또한, 노카르디아·YS-2002 유래의 니트릴 히드라타제 유전자는 액세션 번호 "X86737"이며, 노카르디아 sp.JBRs 유래 니트릴 히드라타제 유전자는 액세션 번호 "AY141130"이다.

(b-1) 개량형 니트릴 히드라타제(β48)

각종 미생물 유래의 기지의 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 아미노산(1문자 표기) 배열의 얼라인먼트를 도 2a 및 2b에 나타냈다. 또한, 도 2a, 2b 각각에서, 각 아미노산 배열은, 위에서부터 순차적으로, 배열 번호 2, 5 내지 12 및 42 내지 47을 나타낸다.

또한, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에는, 배열 번호 50으로 나타내는 아미노산 배열을 제외한 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, 1개 또는 수개(예를 들어 1개 내지 10개 정도, 바람직하게는 1개 내지 5개 정도)의 아미노산 잔기가 결실, 치환 및/또는 부가된 개량형 니트릴 히드라타제도 포함된다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 일례로는, 도 3에 도시한 바와 같이, β 서브유닛이 배열 번호 51에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것을 들 수 있다. 여기에서는, N 말단에서부터 세서 44번째 내지 52번째에, 배열 번호 50으로 나타내는 아미노산 배열이 존재한다.

하나의 실시 양태에서는, 배열 번호 51에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁, X₂, X₃, X₅, X₆은 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, X₄는, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

또한, 다른 실시 양태에서는, 배열 번호 51에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁, X₃, X₅, X₆은 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, X₂는 S(세린)이며, X₄는, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

또한, 다른 실시 양태에서는, 배열 번호 51에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁이 I(이소류신), X₂가 S(세린), X₃이 W(트립토판), X₅가 K(리신), X₆이 S(세린)이며, X₄는, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린 및 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 다른 일례로는, 배열 번호 2로 나타내는 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, β 서브유닛의 48번째의 아미노산 잔기(트립토판)가 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린 또는 트레오닌으로 치환된 것을 들 수 있다.

이러한 아미노산 치환의 양태의 표기 예로는, Wβ48C, Wβ48D, Wβ48E, Wβ48H, Wβ48I, Wβ48K, Wβ48M, Wβ48N, Wβ48P, Wβ48Q, Wβ48S, Wβ48T를 들 수 있다. 또한, 아미노산의 알파벳 표기는 통상의 1문자로 나타낼 수 있고, 치환 부위까지의 아미노산 잔기 수를 나타내는 숫자(예를 들어 "48")의 좌측에 표시한 알파벳은, 치환 전의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고, 우측에 표시한 알파벳은 치환 후의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고 있다.

구체적으로는, 배열 번호 2에 나타내는 β 서브유닛의 아미노산 배열에 대해서, "Wβ48C"라고 표기한 경우에는, β 서브유닛의 아미노산 배열(배열 번호 2) 중 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서(당해 N 말단의 아미노산 잔기를 포함해서 세서) 48번째의 트립토판인(W)이 시스테인(C)으로 치환된 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태를 의미한다.

본 발명의 보다 바람직한 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태는, 각각 이하의 1 내지 12의 표기로 나타낼 수 있다.

1. Wβ48C

2. Wβ48D

3. Wβ48E

4. Wβ48H

5. Wβ48I

6. Wβ48K

7. Wβ48M

8. Wβ48N

9. Wβ48P

10. Wβ48Q

11. Wβ48S

12. Wβ48T

상기 아미노산 치환을 발생시키기 위한 염기 치환으로는, 이하의 양태를 바람직하게 들 수 있다.

Wβ48C: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 TGC로 치환시키는 것(TGG→TGC)이 바람직하다.

Wβ48D: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 GAC로 치환시키는 것(TGG→GAC)이 바람직하다.

Wβ48E: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 GAG로 치환시키는 것(TGG→GAG)이 바람직하다.

Wβ48F: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 TTC로 치환시키는 것(TGG→TTC)이 바람직하다.

Wβ48H: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 CAC로 치환시키는 것(TGG→CAC)이 바람직하다.

Wβ48I: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 ATC로 치환시키는 것(TGG→ATC)이 바람직하다.

Wβ48K: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 AAG로 치환시키는 것(TGG→AAG)이 바람직하다.

Wβ48M: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 ATG로 치환시키는 것(TGG→ATG)이 바람직하다.

Wβ48N: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 AAC로 치환시키는 것(TGG→AAC)이 바람직하다.

Wβ48P: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 CCG로 치환시키는 것(TGG→CCG)이 바람직하다.

Wβ48Q: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 CAG로 치환시키는 것(TGG→CAG)이 바람직하다.

Wβ48S: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 TCC로 치환시키는 것(TGG→TCC)이 바람직하다.

Wβ48T: 염기 배열 TGG(배열 번호 1에서의 142 내지 144번째에 위치함)를 ACC로 치환시키는 것(TGG→ACC)이 바람직하다.

(b-2) 개량형 니트릴 히드라타제(β37)

각종 미생물 유래의 기지의 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 아미노산(1문자 표기) 배열의 얼라인먼트를 도 6a 및 6b에 나타냈다. 또한, 도 6a, 6b 각각에서, 각 아미노산 배열은, 위에서부터 순차적으로, 배열 번호 2, 5 내지 12, 42 내지 49를 나타낸다.

또한, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에는, 배열 번호 81로 나타내는 아미노산 배열을 제외한 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, 1개 또는 수개(예를 들어 1개 내지 10개 정도, 바람직하게는 1개 내지 5개 정도)의 아미노산 잔기가 결실, 치환 및/또는 부가된 개량형 니트릴 히드라타제도 포함된다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 일례로는, 도 7에 도시한 바와 같이, β 서브유닛이 배열 번호 82에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것을 들 수 있다. 여기에서는, N 말단에서부터 세서 29번째 내지 49번째에, 배열 번호 81로 나타내는 아미노산 배열이 존재한다.

하나의 실시 양태에서는, 배열 번호 82에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁ 내지 X₆ 및 X₈ 내지 X₁₈은 각각 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, X₇은, 알라닌, 발린, 아스파라긴산, 트레오닌, 페닐알라닌, 이소류신 및 메티오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

또한, 다른 실시 양태에서는, 배열 번호 82에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁ 내지 X₆, X₈ 내지 X₁₃ 및 X₁₅ 내지 X₁₈은 각각 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, X₁₄는 G(글리신)이며, X₇은, 알라닌, 발린, 아스파라긴산, 트레오닌, 페닐알라닌, 이소류신 및 메티오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

또한, 다른 실시 양태에서는, 배열 번호 82에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁₅ 내지 X₁₈은 각각 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, X₁이 G(글리신), X₂가 R(아르기닌), X₃이 T(트레오닌), X₄가 L(류신), X₅가 S(세린), X₆이 I(이소류신), X₈이 T(트레오닌), X₉가 W(트립토판), X₁₀이 M(메티오닌), X₁₁이 H(히스티딘), X₁₂가 L(류신), X₁₃이 K(리신), X₁₄가 G(글리신)이며, X₇은, 알라닌, 발린, 아스파라긴산, 트레오닌, 페닐알라닌, 이소류신 및 메티오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 다른 일례로는, 배열 번호 2로 나타내는 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, β 서브유닛의 37번째의 아미노산 잔기(류신)가 알라닌, 발린, 아스파라긴산, 트레오닌, 페닐알라닌, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환된 것을 들 수 있다.

이러한 아미노산 치환의 양태의 표기 예로는, Lβ37A, Lβ37D, Lβ37F, Lβ37I, Lβ37M, Lβ37T, Lβ37V를 들 수 있다. 또한, 아미노산의 알파벳 표기는 통상의 1문자로 나타낼 수 있고, 치환 부위까지의 아미노산 잔기 수를 나타내는 숫자(예를 들어 "37")의 좌측에 표시한 알파벳은, 치환 전의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고, 우측에 표시한 알파벳은 치환 후의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고 있다.

구체적으로는, 배열 번호 2에 나타내는 β 서브유닛의 아미노산 배열에 대해서, "Lβ37A"라고 표기한 경우에는, β 서브유닛의 아미노산 배열(배열 번호 2) 중 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서(당해 N 말단의 아미노산 잔기를 포함해서 세서) 37번째의 류신(L)이 알라닌(A)으로 치환된 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태를 의미한다.

본 발명의 보다 바람직한 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태는, 각각 이하의 1 내지 7의 표기로 나타낼 수 있다.

1. Lβ37A

2. Lβ37D

3. Lβ37F

4. Lβ37I

5. Lβ37M

6. Lβ37T

7. Lβ37V

상기 아미노산 치환을 발생시키기 위한 염기 치환으로는, 이하의 표 1에 나타내는 양태를 바람직하게 들 수 있다.

<표 1>

(b-3) 개량형 니트릴 히드라타제(α83)

각종 미생물 유래의 기지의 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산(1문자 표기) 배열의 얼라인먼트를 도 8a 및 8b에 나타냈다. 또한, 도 8a, 8b 각각에서, 각 아미노산 배열은, 위에서부터 순차적으로 배열 번호 4, 105 내지 108, 121, 109, 110, 112, 111, 122 내지 124, 113, 114, 125를 각각 나타낸다.

또한, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에는, 배열 번호 119로 나타내는 아미노산 배열을 제외한 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, 1개 또는 수개(예를 들어 1개 내지 10개 정도, 바람직하게는 1개 내지 5개 정도)의 아미노산 잔기가 결실, 치환 및/또는 부가된 개량형 니트릴 히드라타제도 포함된다. 일례로는, 특허문헌 5 내지 9(참조에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 함)에 기재된 니트릴 히드라타제를 나타낼 수 있다. 특허문헌 5 내지 9의 니트릴 히드라타제는 내열성이나 아크릴아미드 내성을 갖고 있으며, 본 발명의 아미노산 치환의 부가에 의해, 촉매 활성의 향상이라는 성질을 부가할 수 있다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 일례로는, 도 9에 도시한 바와 같이, α 서브유닛이 배열 번호 120에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것을 들 수 있다. 여기에서는, N 말단부터 세서 73번째 내지 83번째에, 배열 번호 119로 나타내는 아미노산 배열이 존재한다.

하나의 실시 양태에서는, 배열 번호 120에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁ 내지 X₇은 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, X₈은 알라닌, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 리신, 프롤린, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

또한, 다른 실시 양태에서는, 배열 번호 120에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁이 M(메티오닌), X₂가 A(알라닌), X₃이 S(세린), X₄가 L(류신), X₅가 Y(티로신), X₆이 A(알라닌), X₇이 E(글루탐산)이며, X₈은 알라닌, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 리신, 프롤린, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 다른 일례로는, 배열 번호 4로 나타내는 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, α 서브유닛의 83번째의 아미노산 잔기(글루타민)가 알라닌, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 리신, 프롤린, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 티로신 또는 트립토판으로 치환된 것을 들 수 있다.

이러한 아미노산 치환의 양태의 표기 예로는, Qα83A, Qα83C, Qα83D, Qα83E, Qα83F, Qα83G, Qα83H, Qα83K, Qα83L, Qα83M, Qα83N, Qα83P, Qα83R, Qα83S, Qα83T, Qα83AY, Qα83W를 들 수 있다. 또한, 아미노산의 알파벳 표기는 통상의 1문자로 나타낼 수 있고, 치환 부위까지의 아미노산 잔기 수를 나타내는 숫자(예를 들어 "83")의 좌측에 표시한 알파벳은, 치환 전의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고, 우측에 표시한 알파벳은 치환 후의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고 있다.

구체적으로는, 배열 번호 4에 나타내는 α 서브유닛의 아미노산 배열에 대해서, "Qα83A"라고 표기한 경우에는, α 서브유닛의 아미노산 배열(배열 번호 4) 중 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서(당해 N 말단의 아미노산 잔기를 포함해서 세서) 83번째의 글루타민(Q)이 알라닌(A)으로 치환된 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태를 의미한다.

본 발명의 보다 바람직한 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태는, 각각 이하의 1 내지 17의 표기로 나타낼 수 있다.

1. Qα83A

2. Qα83C

3. Qα83D

4. Qα83E

5. Qα83F

6. Qα83G

7. Qα83H

8. Qα83K

9. Qα83L

10. Qα83M

11. Qα83N

12. Qα83P

13. Qα83R

14. Qα83S

15. Qα83T

16. Qα83Y

17. Qα83W

상기 아미노산 치환을 발생시키기 위한 염기 치환으로는, 이하의 양태를 바람직하게 들 수 있다.

<표 2>

(b-4) 개량형 니트릴 히드라타제(α82)

각종 미생물 유래의 기지의 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산(1문자 표기) 배열의 얼라인먼트를 도 10a 및 10b에 나타냈다. 또한, 도 10a, 10b 각각에서, 각 아미노산 배열은, 위에서부터 순차적으로 배열 번호 4, 105 내지 108, 121, 109, 110, 112, 111, 122 내지 124, 113, 114, 125를 각각 나타낸다.

또한, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에는, 배열 번호 31로 나타내는 아미노산 배열을 제외한 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, 1개 또는 수개(예를 들어 1개 내지 10개 정도, 바람직하게는 1개 내지 5개 정도)의 아미노산 잔기가 결실, 치환 및/또는 부가된 개량형 니트릴 히드라타제도 포함된다. 일례로는, 특허문헌 5 내지 9(참조에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 함)에 기재된 니트릴 히드라타제를 나타낼 수 있다. 특허문헌 5 내지 9의 니트릴 히드라타제는 내열성이나 아크릴아미드 내성을 갖고 있으며, 본 발명의 아미노산 치환의 부가에 의해, 촉매 활성의 향상이라는 성질을 부가할 수 있다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 일례로는, 도 11에 도시한 바와 같이, α 서브유닛이 배열 번호 131에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것을 들 수 있다. 여기에서는, N 말단부터 세서 73번째 내지 82번째에, 배열 번호 132로 나타내는 아미노산 배열이 존재한다.

본 발명에서의 하나의 실시 양태에서는, 배열 번호 131에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁ 내지 X₆은 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, X₇은 시스테인, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

다른 실시 양태에서는, 배열 번호 131에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁이 M(메티오닌), X₂가 A(알라닌), X₃이 S(세린), X₄가 L(류신), X₅가 Y(티로신), X₆이 A(알라닌)이며, X₇은 시스테인, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 다른 일례로는, 배열 번호 4로 나타내는 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, α 서브유닛의 82번째의 아미노산 잔기(글루탐산)가 시스테인, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌 또는 티로신으로 치환된 것을 들 수 있다.

이러한 아미노산 치환의 양태의 표기 예로는, Eα82C, Eα82F, Eα82H, Eα82I, Eα82K, Eα82M, Eα82Q, Eα82R, Eα82T, Eα82Y를 들 수 있다. 또한, 아미노산의 알파벳 표기는 통상의 1문자로 나타낼 수 있고, 치환 부위까지의 아미노산 잔기 수를 나타내는 숫자(예를 들어 "82")의 좌측에 표시한 알파벳은, 치환 전의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고, 우측에 표시한 알파벳은 치환 후의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고 있다.

구체적으로는, 배열 번호 4에 나타내는 α 서브유닛의 아미노산 배열에 대해서, "Eα82C"라고 표기한 경우에는, α 서브유닛의 아미노산 배열(배열 번호 4) 중 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서(당해 N 말단의 아미노산 잔기를 포함해서 세서) 82번째의 글루탐산(E)이 시스테인(C)으로 치환된 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태를 의미한다.

본 발명의 보다 바람직한 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태는, 각각 이하의 1 내지 10의 표기로 나타낼 수 있다.

1. Eα82C

2. Eα82F

3. Eα82H

4. Eα82I

5. Eα82K

6. Eα82M

7. Eα82Q

8. Eα82R

9. Eα82T

10. Eα82Y

상기 아미노산 치환을 발생시키기 위한 염기 치환으로는, 이하의 양태를 바람직하게 들 수 있다.

<표 3>

(b-5) 개량형 니트릴 히드라타제(α85)

각종 미생물 유래의 기지의 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산(1문자 표기) 배열의 얼라인먼트를 도 12a 및 12b에 나타냈다. 또한, 도 12a, 12b 각각에서, 각 아미노산 배열은, 위에서부터 순차적으로 배열 번호 4, 105 내지 108, 121, 109, 110, 112, 111, 122 내지 124, 113, 114, 125를 각각 나타낸다.

또한, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에는, 배열 번호 135로 나타내는 아미노산 배열을 제외한 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, 1개 또는 수개(예를 들어 1개 내지 10개 정도, 바람직하게는 1개 내지 5개 정도)의 아미노산 잔기가 결실, 치환 및/또는 부가된 개량형 니트릴 히드라타제도 포함된다. 일례로는, 특허문헌 5 내지 9(참조에 의해 본 명세서에 도입되는 것으로 함)에 기재된 니트릴 히드라타제를 나타낼 수 있다. 특허문헌 5 내지 9의 니트릴 히드라타제는 내열성이나 아크릴아미드 내성을 갖고 있으며, 본 발명의 아미노산 치환의 부가에 의해, 촉매 활성의 향상이라는 성질을 부가할 수 있다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 일례로는, 도 13에 도시한 바와 같이, α 서브유닛이 배열 번호 135에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것을 들 수 있다. 여기에서는, N 말단부터 세서 73번째 내지 85번째에, 배열 번호 136으로 나타내는 아미노산 배열이 존재한다.

본 발명에서의 하나의 실시 양태에서는, 배열 번호 135에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁ 내지 X₈은 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타내고, X₉는 시스테인, 글루탐산, 페닐알라닌, 이소류신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

다른 실시 양태에서는, 배열 번호 135에 나타내는 아미노산 배열을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제에 있어서, X₁이 M(메티오닌), X₂가 A(알라닌), X₃이 S(세린), X₄가 L(류신), X₅가 Y(티로신), X₆이 A(알라닌), X₇이 E(글루탐산), X₈이 A(알라닌)이며, X₉는 시스테인, 글루탐산, 페닐알라닌, 이소류신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산이다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 다른 일례로는, 배열 번호 4로 나타내는 기지의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에 있어서, α 서브유닛의 85번째의 아미노산 잔기(히스티딘)가, X₉가 시스테인, 글루탐산, 페닐알라닌, 이소류신, 아스파라긴, 글루타민, 세린 또는 티로신으로 치환된 것을 들 수 있다.

이러한 아미노산 치환의 양태의 표기 예로는, Hα85C, Hα85E, Hα85F, Hα85I, Hα85N, Hα85Q, Hα85S, Hα85Y를 들 수 있다. 또한, 아미노산의 알파벳 표기는 통상의 1문자로 나타낼 수 있고, 치환 부위까지의 아미노산 잔기 수를 나타내는 숫자(예를 들어 "85")의 좌측에 표시한 알파벳은, 치환 전의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고, 우측에 표시한 알파벳은 치환 후의 아미노산의 1문자 표기를 나타내고 있다.

구체적으로는, 배열 번호 4에 나타내는 α 서브유닛의 아미노산 배열에 대해서, "Hα85C"라고 표기한 경우에는, α 서브유닛의 아미노산 배열(배열 번호 4) 중 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서(당해 N 말단의 아미노산 잔기를 포함해서 세서) 85번째의 히스티딘(H)이 시스테인(C)으로 치환된 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태를 의미한다.

본 발명의 보다 바람직한 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환의 양태는, 각각 이하의 1 내지 8의 표기로 나타낼 수 있다.

1. Hα85C

2. Hα85E

3. Hα85F

4. Hα85I

5. Hα85N

6. Hα85Q

7. Hα85S

8. Hα85Y

상기 아미노산 치환을 발생시키기 위한 염기 치환으로는, 이하의 양태를 바람직하게 들 수 있다.

<표 4>

(b-6) 니트릴 히드라타제 활성

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 활성은, 변이를 도입하기 전의 니트릴 히드라타제의 활성에 대하여 촉매 활성이 향상되어 있다.

여기서, "니트릴 히드라타제 활성"이란, 니트릴 화합물을, 대응하는 아미드 화합물로 변환하는 수화 반응(RCN+H₂O→RCONH₂)을 촉매하는 효소이다. 활성 측정은, 기질인 니트릴 화합물을 니트릴 히드라타제와 접촉시켜, 대응하는 아미드 화합물로 변환한 후, 당해 아미드 화합물을 정량함으로써 산출할 수 있다. 기질로는, 니트릴 히드라타제가 반응하면 어떠한 니트릴 화합물이라도 사용할 수 있지만, 아크릴로니트릴이 바람직하다.

반응 조건으로는, 기질 농도는 2.5%, 반응 온도는 10℃ 내지 30℃, 반응 시간은 10분 내지 30분의 범위에서 행한다. 효소 반응은 인산을 첨가하여 정지시킨다. 그 후, HPLC(고속 액체 크로마토그래피)나 가스 크로마토그래피에 의해, 생성된 아크릴아미드를 분석함으로써 아미드 화합물의 정량을 행할 수 있다.

"촉매 활성의 향상"이란, 개량형 니트릴 히드라타제를 갖는 형질 전환체의 배양물 또는 당해 형질 전환체로부터 단리한 개량형 니트릴 히드라타제의 활성 측정에 의해, 개량형 니트릴 히드라타제의 촉매 활성이 동일한 조건에서 측정한 친주(親株)의 활성 값보다 1할 이상 높은 것을 의미한다. 본 발명에서의 친주란, 변이 도입하는 주형 플라스미드가 도입된 형질 전환체를 의미한다.

아미드 화합물로는, 예를 들어 하기 화학식 (1):

R-CONH₂ (1)

(여기서, R은, 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 내지 10의 직쇄상 또는 분지상의 알킬기 또는 알케닐기, 치환되어 있어도 되는 탄소수 3 내지 18의 시클로알킬기 또는 아릴기, 또는, 치환되어 있어도 되는 포화 또는 불포화 복소환기를 나타냄)

로 표현되는 아미드 화합물을 들 수 있다. 특히, 식 중, R이 "CH₂=CH-"인 아크릴아미드가 바람직하다.

상기의 개량형 니트릴 히드라타제는, 니트릴 히드라타제를 아미노산 치환함으로써 얻어지는 것이며, 예를 들어 로도코커스·로도크로우스 J1주 유래의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열(배열 번호 2)을 개변하여, 촉매 활성이 향상된 니트릴 히드라타제를 선택함으로써 얻어진다.

또한, 로도코커스·로도크로우스 J1주는, FERM BP-1478로서 독립 행정법인 산업 기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 쯔쿠바시 동 1초메 1번지 1 중앙 제6)에 1987년 9월 18일자로 국제 기탁되어 있다.

J1균 이외의 니트릴 히드라타제에서도 상술한 변이의 위치, 변이하는 아미노산종, DNA 배열에 따라 촉매 활성이 향상되는 것으로 생각된다. 그와 같은 균으로는, 바람직하게는 로도코커스·로도크로우스 M8(SU1731814)(배열 번호 5), 로도코커스·루버 TH(배열 번호 6), 로도코커스·로도크로우스 M33(VKM Ac-1515D), 로도코커스·피리디노보란스 MW3(배열 번호 7), 로도코커스·피리디노보란스 S85-2(배열 번호 8), 로도코커스·피리디노보란스 MS-38(배열 번호 9), 로도코커스·루버 RH(CN101463358)(배열 번호 52), 노카르디아 sp.JBRs(배열 번호 10), 노카르디아· YS-2002(배열 번호 11), 로도코커스·로도크로우스 ATCC39384(배열 번호 12), 비배양 박테리아 SP1(배열 번호 42), 비배양 박테리아 BD2(배열 번호 43), 코마모나스·테스토스테로니(배열 번호 44), 지오바실러스·서모글루코시다시우스 Q6(배열 번호 45), 슈도노카르디아·서모필라 JCM3095(배열 번호 46), 로도코커스·로도크로우스 Cr4(배열 번호 47) 등을 들 수 있다. 또한, 로도코커스·로도크로우스 M33(VKM Ac-1515D)은, 상기 M8균(SU1731814)으로부터 자연 돌연변이에 의해 구성적으로 니트릴 히드라타제를 발현하는 주로서 선발된 균주이다. 그 니트릴 히드라타제 자체의 아미노산 배열 및 유전자 배열에 변이는 없다(미국 특허 제5,827,699호). 이들 균의 β 서브유닛에 있어서, N 말단에서부터 48번째의 아미노산 잔기를, 시스테인, 아스파라긴산, 글루탐산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린 또는 트레오닌으로 치환한 것을 들 수 있다.

니트릴 히드라타제를 아미노산 치환하는 방법으로는, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 미생물에 하이드록실아민이나 아질산 등의 변이원이 되는 약제를 접촉·작용시키는 방법, 자외선 조사에 의해 변이를 유발하는 방법, 니트릴 히드라타제를 코드하는 유전자에 PCR을 사용하여 랜덤으로 변이를 도입하는 Error prone PCR 방법 등을 채용할 수 있다.

(b-7) Error prone PCR

변이체를 사용한 단백질의 기능, 성질을 연구하는 방법의 하나로, 랜덤 변이 도입법이 있다. 랜덤 변이 도입법이란, 특정한 단백질을 코드하는 유전자에 대하여 랜덤한 변이를 도입하여, 변이체를 제작하는 방법이다. PCR에 의한 랜덤 변이 도입법에서는, DNA 증폭시에 엄밀도(엄격함)가 낮은 조건을 설정하여, 염기의 변이를 도입할(Error prone PCR) 수 있다.

이 Error prone PCR에서는, 증폭되는 DNA의 전역에 대하여 임의의 부위에 변이가 도입된다. 그러면, 얻어진 임의의 부위에 변이가 도입된 변이체의 기능을 검토함으로써, 단백질 고유의 기능에 중요한 아미노산이나 도메인의 정보를 얻을 수 있다.

Error prone PCR의 주형이 되는 니트릴 히드라타제는, 야생주 유래의 니트릴 히드라타제 유전자, Error prone PCR에 의한 증폭 산물인 DNA를 사용할 수 있다.

Error prone PCR의 반응 조건으로는, 예를 들어 반응액 내의 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 또는 dTTP) 중 어느 1종, 2종 또는 3종의 배합 비율을 다른 dNTP에 비해 저감시킨 조성으로 하는 조건을 들 수 있다. 이에 의해, DNA 합성시, 배합 비율을 저감시킨 dNTP가 필요한 부위에서는, 잘못해서 다른 dNTP가 사용될 가능성이 높아져, 변이가 도입된다. 또한, 다른 반응 조건으로는, 반응액 내의 MgCl₂ 및/또는 MnCl₂ 양을 증가시킨 조성으로 하는 조건도 바람직하게 들 수 있다.

(b-8) 개량형 니트릴 히드라타제

개량형 니트릴 히드라타제를 코드하는 DNA는, 기지의 니트릴 히드라타제 DNA를 기초로, 문허[Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)] 등에 기재된 부위 특이적 변위 유발법에 따라서 제조할 수 있다. DNA에 변이를 도입하기 위해서는, Kunkel법이나 Gapped duplex법 등의 공지 방법에 의해, 부위 특이적 돌연 변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 QuickChangeTM XL Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라테이진사 제조), GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등: 타카라바이오사 제조) 등을 사용하여 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 DNA로는, 당해 DNA의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA도 포함된다.

이러한 개량형 니트릴 히드라타제 DNA는, 상기와 같이 야성형 유전자에 변이를 도입함으로써 얻을 수 있지만, 당해 DNA 배열 또는 그 상보 배열, 또는 이것들의 단편을 프로브로 해서, 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크 하이브리다이제이션, 서던 블롯 등의 공지된 하이브리다이제이션법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리로부터 얻을 수도 있다. 라이브러리는, 공지된 방법으로 제작된 것을 이용하는 것이 가능하며, 시판되는 cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리를 이용하는 것도 가능하다.

"엄격한 조건"이란, 하이브리다이제이션 후의 세정시의 조건으로 염 농도가 300 내지 2000mM, 온도가 40 내지 75℃, 바람직하게는 염 농도가 600 내지 900mM, 온도가 65℃인 조건을 의미한다. 예를 들어, 2×SSC에서 50℃ 등의 조건을 들 수 있다. 당업자라면 이러한 버퍼의 염 농도, 온도 등의 조건 외에, 기타의 프로브 농도, 프로브의 길이, 반응 시간 등의 여러 조건을 가미하여, 본 발명의 니트릴 히드라타제를 코드하는 DNA를 얻기 위한 조건을 적절히 설정할 수 있다.

하이브리다이제이션법의 상세한 수순에 대해서는, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))] 등을 참조할 수 있다. 하이브리다이즈하는 DNA로는, 본 발명의 DNA에 대하여 적어도 40% 이상, 바람직하게는 60%, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 배열을 포함하는 DNA 또는 그 부분 단편을 들 수 있다.

(c) 재조합 벡터, 형질 전환체

니트릴 히드라타제 유전자는, 형질 전환되는 숙주 생물에서 발현 가능하도록 벡터에 내장할 필요가 있다. 예를 들어, 벡터로는 플라스미드 DNA, 박테리오파지 DNA, 레트로트랜스포존 DNA, 인공 염색체 DNA 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 숙주는, 상기 재조합 벡터가 도입된 후, 원하는 니트릴 히드라타제를 발현하는 것이 가능한 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 대장균 및 고초균 등의 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등을 사용할 수 있다. 대장균을 숙주로 할 경우, 발현 효율이 높은 발현 벡터, 예를 들어 trc 프로모터를 갖는 발현 벡터 pkk233-2(아머샴 바이오사이언스사 제조) 또는 pTrc99A(아머샴 바이오사이언스사 제조) 등을 사용하는 것이 바람직하다.

벡터에는, 니트릴 히드라타제 유전자 이외에, 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 마커, 리보솜 결합 배열(SD 배열) 등을 연결할 수 있다. 또한, 선택 마커로는, 예를 들어 카나마이신 내성 유전자, 디히드로 엽산 환원 효소 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.

세균을 숙주로 할 경우, 예를 들어 대장균(Escherichia coli)을 들 수 있고, 로도코커스균으로는, 예를 들어 로도코커스·로도크로우스 ATCC12674, 로도코커스·로도크로우스 ATCC17895, 로도코커스·로도크로우스 ATCC19140 등을 들 수 있다. 이들 ATCC주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수할 수 있다.

니트릴 히드라타제를 발현하는 형질 전환체의 제작시에, 숙주에 대장균을 사용한 경우, 발현한 대부분의 니트릴 히드라타제가 인클루전 바디가 되어 불용화하기 때문에, 촉매 활성이 낮은 형질 전환체가 얻어진다. 한편, 로도코커스균을 숙주로서 사용한 경우, 니트릴 히드라타제는 가용성 획분에 존재하기 때문에, 고활성의 형질 전환체가 얻어진다. 이들 형질 전환체는 목적에 따라서 선택하면 되는데, 엄격한 조건에서 개량형 효소를 선발하는 경우에는 고활성의 로도코커스균의 형질 전환체를 사용하는 것이 바람직하다.

세균으로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 세균에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있다.

효모를 숙주로 하는 경우에는, 예를 들어 사카로미세스·세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로미세스·폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피히아·파스토리스(Pichia pastoris) 등이 사용된다. 효모로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 아세트산 리튬법 등을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로 하는 경우에는, 원숭이 세포 COS-7, Vero, CHO 세포, 마우스 L 세포, 래트 GH3, 인간 FL 세포 등이 사용된다. 동물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예를 들어 일렉트로포레이션법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등을 들 수 있다.

곤충 세포를 숙주로 하는 경우에는, Sf9 세포, Sf21 세포 등이 사용된다. 곤충 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예를 들어 인산칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법 등이 사용된다.

식물 세포를 숙주로 하는 경우에는, 담배 BY-2 세포 등을 들 수 있는데, 이것들에 한정되는 것은 아니다. 식물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예를 들어 아그로박테리아법, 파티클건법, PEG법, 일렉트로포레이션법 등이 사용된다.

(d) 배양물 및 개량형 니트릴 히드라타제의 제조 방법

본 발명에서, 개량형 니트릴 히드라타제는, 상기 형질 전환체를 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 채취함으로써 제조할 수 있다.

본 발명은 당해 배양물로부터 개량형 니트릴 히드라타제를 채취하는 것을 특징으로 하는, 개량형 니트릴 히드라타제의 제조 방법도 포함한다.

본 발명에서, "배양물"이란, 배양 상청, 배양 세포, 배양 균체, 또는 세포 또는 균체의 파쇄물 모두를 의미하는 것이다. 본 발명의 형질 전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행해진다. 원하는 개량형 니트릴 히드라타제는, 상기 배양물 중에 축적된다.

본 발명의 형질 전환체를 배양하는 배지는, 숙주균이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하며, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것을 사용해도 된다. 탄소원으로는, 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 전분 등의 탄수화물, 아세트산 및 프로피온산 등의 유기산, 에탄올 및 프로판올 등의 알코올류를 들 수 있다. 질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산 암모늄 및 인산 암모늄 등의 무기산, 또는 유기산의 암모늄염, 또는 그 밖의 질소 함유 화합물을 들 수 있다.

그 외, 펩톤, 효모 엑기스, 육 엑기스, 옥수수 침지액, 각종 아미노산 등을 사용해도 된다. 무기물로는, 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 인산 마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 황산아연, 황산구리, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라, 배양 중의 발포를 방지하기 위하여 소포제를 첨가해도 된다. 또한, 배지에는 니트릴 히드라타제의 보결 분자인 코발트 이온이나 철 이온을 첨가하고, 효소의 유도제가 되는 니트릴류나 아미드류를 첨가해도 된다.

배양 중, 벡터 및 목적 유전자의 탈락을 방지하기 위하여 선택압을 건 상태에서 배양해도 된다. 즉, 선택 마커가 약제 내성 유전자일 경우에 상당하는 약제를 배지에 첨가하거나, 선택 마커가 영양 요구성 상보 유전자일 경우에 상당하는 영양 인자를 배지로부터 제거해도 된다.

또한, 선택 마커가 자화성 부여 유전자인 경우에는, 상당하는 자화 인자를 필요에 따라서 유일 인자로서 첨가할 수 있다. 예를 들어, 암피실린 내성 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환한 대장균을 배양할 경우, 배양 중, 필요에 따라 암피실린을 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양하는 경우에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)로 유도 가능한 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양할 때에는, IPTG 등을 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 인돌 아세트산(IAA)으로 유도 가능한 trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양할 때에는, IAA 등을 배지에 첨가할 수 있다.

형질 전환체의 배양 조건은, 원하는 개량형 니트릴 히드라타제의 생산성 및 숙주의 생육이 방해되지 않는 조건이면 특별히 한정되는 것이 아니지만, 통상, 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 37℃에서 5 내지 100시간 행한다. pH의 조정은, 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 사용해서 행하고, 예를 들어 대장균이면 6 내지 9로 조정한다.

배양 방법으로는, 고체 배양, 정치 배양, 진탕 배양, 통기 교반 배양 등을 들 수 있는데, 특히 대장균 형질 전환체를 배양할 경우에는, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양(자 퍼멘터)에 의해 호기적 조건하에서 배양하는 것이 바람직하다.

상기 배양 조건에서 배양하면, 고수율로 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제를 상기 배양물 중, 즉, 배양 상청, 배양 세포, 배양 균체, 또는 세포 또는 균체의 파쇄물 중 적어도 어느 하나에 축적할 수 있다.

배양 후, 개량형 니트릴 히드라타제가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써, 원하는 개량형 니트릴 히드라타제를 채취할 수 있다. 균체 또는 세포의 파쇄 방법으로는, 프렌치 프레스 또는 호모게나이저에 의한 고압 처리, 초음파 처리, 유리 비즈 등에 의한 마쇄 처리, 리소자임, 셀룰라아제 또는 펙티나아제 등을 사용하는 효소 처리, 동결 융해 처리, 저장액 처리, 파지에 의한 용균 유도 처리 등을 이용할 수 있다.

파쇄 후, 필요에 따라 균체 또는 세포의 파쇄 잔사(세포 추출액 불용성 획분을 포함함)를 제거할 수 있다. 잔사를 제거하는 방법으로는, 예를 들어, 원심 분리나 여과 등을 들 수 있고, 필요에 따라, 응집제나 여과 조제 등을 사용하여 잔사 제거 효율을 높일 수도 있다. 잔사를 제거한 후에 얻어진 상청은, 세포 추출액 가용성 획분이며, 조 정제한 개량형 니트릴 히드라타제 용액으로 할 수 있다.

또한, 개량형 니트릴 히드라타제가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우, 균체나 세포 그 자체를 원심 분리, 막 분리 등으로 회수하여, 미파쇄인 상태로 사용하는 것도 가능하다.

개량형 니트릴 히드라타제가 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리나 여과 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 필요에 따라 유안 침전에 의한 추출 등에 의해 상기 배양물 중에서 개량형 니트릴 히드라타제를 채취하고, 또한 필요에 따라 투석, 각종 크로마토그래피(겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등)를 사용하여 단리 정제할 수도 있다.

형질 전환체를 배양하여 얻어진 니트릴 히드라타제의 생산 수율은, 예를 들어 배양액당, 균체 습중량 또는 건조 중량당, 조 효소액 단백질당 등의 단위로, SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기 영동)나 니트릴 히드라타제 활성 측정 등에 의해 확인할 수 있는데, 특별히 한정되는 것은 아니다. SDS-PAGE는 당업자라면 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 또한, 니트릴 히드라타제 활성은, 상술한 활성 값을 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 생 세포를 전혀 사용하지 않고, 무세포 단백질 합성계를 채용하여 개량형 니트릴 히드라타제를 산생하는 것이 가능하다.

무세포 단백질 합성계란, 세포 추출액을 사용하여 시험관 등의 인공 용기 내에서 단백질을 합성하는 계이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 무세포 단백질 합성계에는, DNA를 주형으로 해서 RNA를 합성하는 무세포 전사계도 포함된다.

이 경우, 상기의 숙주에 대응하는 생물은, 하기의 세포 추출액이 유래하는 생물에 상당한다. 여기서, 상기 세포 추출액은, 진핵 세포 유래 또는 원핵 세포 유래의 추출액, 예를 들어 소맥 배아, 대장균 등의 추출액을 사용할 수 있다. 또한, 이들 세포 추출액은 농축된 것이나 농축되어 있지 않은 것이어도 된다.

세포 추출액은, 예를 들어 한외 여과, 투석, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전 등에 의해 얻을 수 있다. 또한 본 발명에서, 무세포 단백질 합성은, 시판하고 있는 키트를 사용하여 행할 수도 있다. 그러한 키트로는, 예를 들어 시약 키트 PROTEIOSTM(도요보), TNTTM System(프로메가), 합성 장치인 PG-MateTM(도요보), RTS(로슈·다이아그나스틱스) 등을 들 수 있다.

상기와 같이 무세포 단백질 합성에 의해 얻어지는 개량형 니트릴 히드라타제는, 상술한 바와 같이 적절히 크로마토그래피를 선택하여 정제할 수 있다.

2. 아미드 화합물의 제조 방법

상술한 바와 같이 제조된 개량형 니트릴 히드라타제는, 효소 촉매로서 물질 생산에 이용할 수 있다. 예를 들어, 니트릴 화합물에, 상기 개량형 니트릴 히드라타제를 접촉시킴으로써 아미드 화합물을 생성한다. 그리고, 접촉에 의해 생성되는 아미드 화합물을 채취한다. 이에 의해, 아미드 화합물을 제조할 수 있다.

효소 촉매로는, 상술한 바와 같이 분리 정제된 니트릴 히드라타제를 사용할 수 있다. 또한, 상술한 바와 같이 적당한 숙주 내에서 개량형 니트릴 히드라타제 유전자가 발현하도록 유전자 도입을 행하여, 숙주를 배양한 후의 배양물, 또는 당해 배양물의 처리물을 이용할 수 있다. 처리물로는, 예를 들어 배양 후의 세포를 아크릴아미드 등의 겔로 포함한 것, 글루타르알데히드로 처리한 것, 알루미나, 실리카, 제올라이트 및 규조토 등의 무기 담체에 담지한 것 등을 들 수 있다.

여기서, "접촉"이란, 개량형 니트릴 히드라타제와 니트릴 화합물을 동일한 반응계 또는 배양계에 존재시키는 것을 의미하며, 예를 들어 분리 정제한 개량형 니트릴 히드라타제와 니트릴 화합물을 혼합하는 것, 개량형 니트릴 히드라타제 유전자를 발현하는 세포의 배양 용기에 니트릴 화합물을 첨가하는 것, 당해 세포를 니트릴 화합물의 존재하에서 배양하는 것, 당해 세포의 추출액을 니트릴 화합물과 혼합하는 것 등이 포함된다.

기질로서 사용되는 니트릴 화합물은, 효소의 기질 특이성, 효소의 기질에 대한 안정성 등을 고려하여 선택된다. 니트릴 화합물로는, 아크릴로니트릴이 바람직하다. 반응 방법 및 반응 종료 후의 아미드 화합물의 채취 방법은, 기질 및 효소 촉매의 특성에 의해 적절히 선택된다.

효소 촉매는, 그 활성이 실활되지 않는 한, 리사이클 사용하는 것이 바람직하다. 실활의 방지나 리사이클을 용이하게 하는 것을 감안하여, 효소 촉매는 처리물의 양태로 사용되는 것이 바람직하다.

실시예

이하에, 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 로도코커스·로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1주는, FERM BP-1478로서 독립 행정 법인 산업 기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 쯔쿠바시 동 1초메 1번지 1 중앙 제6)에 기탁되어 있다(원기탁일: 1987년 9월 18일).

[제조예 1]

플라스미드 pSJ034의 제작

본 발명의 아미노산 치환을 도입하기 위한 주형이 되는 J1균의 니트릴 히드라타제 유전자를 갖는 플라스미드 pSJ034(도 1)를 이하의 방법으로 제작하였다.

pSJ034는, 로도코커스균에 있어서 니트릴 히드라타제를 발현하는 플라스미드이며, pSJ023으로부터 일본 특허 공개 평 10-337185호 공보에 나타내는 방법으로 제작하였다. 즉, 플라스미드 pSJ023을 XbaI의 부분 절단과 Sse8387I 링커 라이게이션에 의해, 1군데의 XbaI 사이트를 Sse8387I로 치환한 플라스미드 pSJ033을 제작하였다. 이어서, pSJ033을 Sse8387I로 부분 절단하고, 글레노브 절편을 사용하여 말단 평활화를 행하고, 셀프 라이게이션함으로써 플라스미드 pSJ034를 제작하였다. 또한, pSJ023은 형질 전환체 "R. rhodochrous ATCC12674/pSJ023"이며, 수탁 번호 FERM BP-6232로서 독립 행정 법인 산업 기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 쯔쿠바시 동 1초메 1번지 1 중앙 제6)에 1997년 3월 4일자로 국제 기탁되어 있다.

[제조예 2]

플라스미드 pFR005의 제작

(1) 변이 유전자 라이브러리의 구축

주형으로 한 플라스미드로는, β 서브유닛의 아미노산 배열(배열 번호 2)의 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 167 잔기 하류의 아미노산 잔기가 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로 변이하고, 또한, 상기 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 219 잔기 하류의 아미노산 잔기가 발린(V)에서 알라닌(A)으로 변이하고, 또한, 상기 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 57 잔기 하류의 아미노산 잔기가 세린(S)에서 메티오닌(M)으로 변이하고, 또한, 상기 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 114 잔기 하류의 아미노산 잔기가 리신(K)에서 티오신(Y)으로 변이하고, 또한, 상기 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 107 잔기 하류의 아미노산 잔기가 트레오닌(T)에서 리신(K)으로 변이한 플라스미드 pER855(일본 특허 공개 제2010-172295호 참조)의 개변물인 pER855A(도 5)를 사용하였다.

우선, 니트릴 히드라타제 유전자로의 변이 도입을 하기의 방법으로 행하였다.

<PCR 반응액 조성>

멸균수 20μl

pER855A(1ng/ml) 1μl

전방향 프라이머(Forward Primer)(10mM) 2μl

역방향 프라이머(Reverse Primer)(10mM) 2μl

PrimeSTAR MAX(2×) 25μl

합계 50μl

<PCR 반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃에서 90초)×30 사이클

<프라이머> β17의 포화 변이 프라이머

β17RM-F ggatacggaccggtcNNStatcagaaggacgag (배열 번호 63)

β17RM-R ctcgtccttctgataSNNgaccggtccgtatcc (배열 번호 64)

<반응 조건>

(94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 3분)×30 사이클

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 11kb의 증폭 단편을 확인하고, 1μl의 DpnI(키트에 부속)를 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜, 주형 플라스미드의 제거를 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste(프로메가 가부시끼가이샤)로 정제하고, 정제한 PCR 반응물을 사용하여 JM109로 형질 전환하였다. 얻어진 콜로니 수천 개를 플레이트로부터 회수하여, QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠사)를 사용해서 플라스미드 DNA를 추출, 변이 유전자 라이브러리로 하였다.

(2) 로도코커스균 형질 전환체의 제작

로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 대수 증식기의 세포를 원심 분리기에 의해 집균하고, 빙냉한 멸균수로 3회 세정하여, 멸균수에 현탁하였다. 상기 (1)에서 제조한 플라스미드 1μl와 균체 현탁액 10μl를 혼합하여 빙냉하고, 큐벳트에 플라스미드 DNA와 균체의 현탁액을 넣어, 유전자 도입 장치 Gene Pulser II(BIO RAD)에 의해 2.0KV, 200 OHMS로 전기 펄스 처리를 행하였다.

전기 펄스 처리액이 들어간 큐벳트를 빙냉하에 10분간 정치하고, 37℃에서 10분간 히트 쇼크를 행하였다. 그 후, 큐벳트에 MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백토 이스트 엑기스, 0.3% 백토 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 500μl를 첨가하고, 30℃, 5시간 정치한 후, 50μg/ml 카나마이신이 들어간 MYK 한천 배지에 도포하였다. 30℃, 3일간 배양 후의 콜로니를 형질 전환체로 하였다. 마찬가지로 비교주로서 pER855A의 형질 전환체를 제작하였다.

(3) 로도코커스균 형질 전환체의 아미드 처리

스크리닝에는, 상기 (2)에서 얻어진 니트릴 히드라타제 유전자를 포함하는 로도코커스균 형질 전환체 및 비교주인 ATCC12674/pER855A를 사용하였다. GGPK 배지(1.5% 글루코오스, 1% 글루탐산나트륨, 0.1% 효모 엑기스, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0.1% 요소, 50μg/ml 카나마이신, pH7.2)를 1ml씩 넣은 96 구멍 딥웰 플레이트에 상기 균주를 각각 접종하고, 30℃에서 3일간 액체 배양하였다.

이어서, 얻어진 배양액 30μl를 96 구멍 플레이트에 나누어 부어, 원심 분리에 의해 배지를 제거하고, 마지막으로 50% 아크릴아미드 용액을 40μl 첨가하여, 균을 현탁하였다. 고농도 아크릴아미드 용액에 현탁한 형질 전환체를 인큐베이터 중에 두고, 50℃의 온도하에, 30분간의 가열 처리로 비교가 되는 비교주를 완전히 실활시켰다. 잔존 니트릴 히드라타제 활성은 하기의 방법으로 측정하였다.

우선, 아크릴아미드 처리를 한 형질 전환체를 50mM 인산 완충액(pH7.0)으로 세정하고, 이하의 방법으로 활성 측정을 행하였다. 시험관에 세정한 형질 전환체와 50mM 인산 완충액(pH7.0)을 첨가해서, 30℃에서 10분간 프리 인큐베이트하고, 등량의 5% 아크릴로니트릴 용액(pH7.0)을 첨가하여 10분간 반응시키고, 1M 인산을 1/10양 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 다음으로 정지시킨 반응액으로부터 원심 분리에 의해 형질 전환체를 제거하고, 적당한 농도로 희석하여 HPLC에 의해 분석했다(WAKOSIL 5C8(와꼬 쥰야꾸사) 250mm, 5mM 인산을 포함한 10% 아세토니트릴, 이동상의 유속 1ml/min 및 자외 흡수 검출기 파장 260nm). 또한, 비교 대조로서 아크릴아미드 처리를 행하지 않은 각각의 무처리균을 사용하여 활성 측정을 행하여, 얻어진 활성 값을 기준으로 해서, 아크릴아미드 처리 후의 잔존 활성을 구하였다.

상기의 방법으로 변이 도입한 니트릴 히드라타제 유전자를 갖는 수백 개의 형질 전환체 중에서, 고농도 아크릴아미드에 내성을 갖는 변이 효소 pFR005를 선발하였다.

(4) 염기 배열의 확인

니트릴 히드라타제 유전자의 염기 배열의 확인을 하기 위해서, 얻어진 선발주로부터 플라스미드를 회수하였다. 로도코커스 형질 전환체를, 10ml의 MYK 배지(폴리펩톤 0.5%, 백토 이스트 엑기스 0.3%, 맥아 추출물 0.3%, 글루코오스 1%, 카나마이신 50μg/ml)에 식균하였다. 24시간 배양한 후에 최종 농도 2%가 되도록 멸균한 20% 글리신 용액을 첨가하여 24시간 더 배양하였다. 그 후, 원심 분리에 의해 균체를 회수하고, 균체를 TES(10mM Tris-HCl(pH8)-10mM NaCl-1mM EDTA) 완충액으로 세정한 후, 2ml의 50mM Tris-HCl(pH8)-12.5% 수크로오스-100mM NaCl-1mg/ml 리소자임에 현탁하여, 37℃에서 3시간 진탕하였다. 이것에 0.4ml의 10% SDS를 첨가해서 실온에서 부드럽게 1시간 진탕하고, 또한 2.1ml의 5M 아세트산 나트륨 완충액(pH5.2)을 첨가해서 얼음 중에서 1시간 정치하였다. 그 후, 4℃에서 10,000xg, 1시간 원심해서 상청을 얻었다. 이것에 5배량의 에탄올을 첨가하고, -20℃에서 30분 정치한 후, 10,000xg, 20분간 원심하였다. 침전물을 10ml의 70% 에탄올로 세정한 후, 100μl의 TE 완충액에 용해해서 DNA 용액을 얻었다.

이어서, 니트릴 히드라타제를 포함하는 배열을 PCR법으로 증폭하였다.

<PCR 반응액 조성>

주형 플라스미드 1μl

10×PCR Buffer(NEB사 제조) 10μl

프라이머 NH-19(50μM) 1μl

프라이머 NH-20(50μM) 1μl

2.5mM dNTPmix 8μl

멸균수 79μl

Taq DNA 폴리메라제(NEB사 제조) 1μl

<프라이머>

NH-19 GCCTCTAGATATCGCCATTCCGTTGCCGG (배열 번호 65)

NH-20 ACCCTGCAGGCTCGGCGCACCGGATGCCCAC (배열 번호 66)

<반응 조건>

(94℃에서 30초, 65에서 30초, 72℃에서 3분)×30 사이클

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 2.5kb의 PCR 증폭 산물의 검출을 행하였다. PCR 반응액은 Exo-SAP 처리(아머샴 파마시아) 후, 사이클 시퀀싱법에 의해 배열 해석용 샘플을 제조하고, Beckman CEQ-2000XL로 해석을 행하였다. 그 결과, pFR005의 변이 부위는, Nβ167S, Vβ219A, Sβ57M, Kβ114Y, Tβ107K, Pβ17G인 것을 확인하였다. 즉, pFR005는 β 서브유닛 17번째의 프롤린이 글리신으로, β 서브유닛 57번째의 세린이 리신으로, β 서브유닛 107번째의 티로신이 리신으로, β 서브유닛 114번째의 리신이 티로신으로, β 서브유닛 167번째의 아스파라긴이 세린으로, β 서브유닛 219번째의 발린이 알라닌으로 변이한 것이다.

실시예 1

개량형 니트릴 히드라타제의 제작

제조예 1에서 제작한 pSJ034를 사용하여 아미노산 치환을 행하였다. PCR은, 하기 반응액 조성, 반응 조건, 프라이머를 사용해서 행했다.

<PCR 반응액 조성>

멸균수 20μl

pSJ034(1ng/ml) 1μl

전방향 프라이머(10mM) 2μl

역방향 프라이머(10mM) 2μl

PrimeSTAR MAX(2×) 25μl

합 계 50μl

<PCR 반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃에서 90초)×30 사이클

<프라이머>

<표 5>

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, 11kb의 증폭 단편을 확인하고, 1μl의 Dpn I(키트에 부속)를 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜, 주형 플라스미드의 제거를 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste(프로메가 가부시끼가이샤)로 정제하고, 정제한 PCR 반응물을 사용해서 JM109를 형질 전환하였다. 얻어진 배양물로부터, QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠사)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고, 오토 시퀀서 CEQ 8000(베크만 코울터사)을 사용하여, 니트릴 히드라타제의 염기 배열을 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 이하와 같이 명명하였다.

<표 6>

실시예 2

로도코커스 형질 전환체의 제작

로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 대수 증식기의 세포를 원심 분리기에 의해 집균하고, 빙냉한 멸균수로 3회 세정하여, 멸균수에 현탁하였다. 실시예 1에서 제조한 플라스미드 1μl와 균체 현탁액 10μl를 혼합하여 빙냉하였다. 큐벳트에 DNA와 균체의 현탁액을 넣고, 유전자 도입 장치 Gene Pulser(BIORAD)에 의해 2.0kV, 200 OHMS로 전기 펄스 처리를 행하였다. 전기 펄스 처리액을 빙냉하에 10분 정치하고, 37℃에서 10분간 히트 쇼크를 행하고, MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백토 이스트 엑기스, 0.3% 백토 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 500μl를 첨가하여, 30℃, 5시간 정치하였다. 그 후, 50μg/ml 카나마이신이 들어간 MYK 한천 배지에 도포하고, 30℃에서 3일간 배양하였다. 30℃, 3일간 배양 후의 콜로니를 형질 전환체로 하였다.

상기의 공정에서 얻어진 각 형질 전환체를 MYK 배지(50μg/ml 카나마이신)에 각각 접종하고, 30℃에서 2일간 진탕 배양하여, GGPK 배지(1.5% 글루코오스, 1% 글루탐산나트륨, 0.1% 효모 엑기스, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% Mg₂O₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0.1% 요소, 50μg/ml 카나마이신, pH 7.2)에 1% 식균을 행하였다. 30℃에서 3일간 진탕 배양하고, 원심 분리에 의해 집균하였다. 그 후, 100mM 인산 완충액(pH7.0)으로 균체를 세정하여, 균체 현탁액을 제조하였다.

실시예 3

개량형 니트릴 히드라타제의 활성

균체 현탁액의 니트릴 히드라타제 활성의 측정은, 하기의 방법으로 행하였다. 균체액 0.2ml와 50mM 인산 완충액(pH7.0) 4.8ml를 혼합하고, 또한 5.0%(w/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH7.0) 5ml를 혼합액에 가하여, 10℃에서 10분간 진탕하면서 반응시켰다. 계속해서, 균체를 여과 분별하고, 가스 크로마토그래피를 사용해서 생성한 아크릴아미드의 양을 정량하였다.

<분석 조건>

분석 기기: 가스 크로마토그래프 GC-14B(시마즈 세이사꾸쇼 제조)

검출기: FID(검출 200℃)

칼럼: 포라팩 PS(워터스사 제조 칼럼 충전제)를 충전한 1m 유리 칼럼

칼럼 온도: 190℃

아크릴아미드의 양으로부터 니트릴 히드라타제 활성을 환산하였다. 여기서, 니트릴 히드라타제 활성은, 1분간에 1㎛ol의 아크릴아미드를 생성하는 효소량을 1U라고 정의한다. 효소 활성은 아미노산 치환을 도입한 친주를 1.0으로 한 상대 활성으로서 표 7에 나타내었다.

<표 7>

이상의 결과로부터, β 서브유닛 48번째의 아미노산을 아스파라긴산, 리신, 아스파라긴, 프롤린, 세린, 트레오닌으로 치환한 개량형 니트릴 히드라타제는, 촉매 활성이 향상되는 것을 알았다.

실시예 4

개량형 니트릴 히드라타제의 제작과 평가

주형 플라스미드로서 제조예 2에서 제작한 pFR005를 사용하여, β 서브유닛 48번째의 아미노산 치환을 행하였다.

즉, 실시예 1에 기재된 방법으로 아미노산 치환한 개량형 니트릴 히드라타제를 제작하고, 실시예 2의 방법으로 형질 전환체를 얻었다. 또한, 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 촉매 활성을 조사하였다. 결과를 표 8에 나타내었다.

<표 8>

이상의 결과로부터, 배열 번호 50으로 나타내는 아미노산 배열 중에서, X₄(β 서브유닛 48번째의 아미노산에 상당)를 시스테인, 글루탐산, 아스파라긴산, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린, 트레오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 함으로써, 변이가 도입된 니트릴 히드라타제에 대해서도 마찬가지의 효과를 갖는 것으로 나타났다.

실시예 5

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동

실시예 2에서 제조한 균체 현탁액을, 초음파 파쇄 장치 VP-300(다이테크, 일본)을 사용하여, 빙냉하면서 10분간 파쇄하였다. 이어서, 균체의 분쇄 용액을 13500rpm, 30분간의 원심 분리에 걸어, 상청으로부터 무세포 추출액을 얻었다. 얻어진 세포 추출액은 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동용 샘플 버퍼(0.1M Tris-HCl(pH6.8), 4% w/v SDS, 12% v/v β 머캅토 에탄올, 20% v/v 글리세롤, 미량 브로모페놀 블루)와 혼합하여, 5분간 끓여 변성 처리를 행하였다. 10% 폴리아크릴아미드 겔을 제작하고, 변성 처리 완료 샘플을 1래인당 단백질량으로서 등량이 되도록 어플라이하여, 전기 영동 분석을 했다(도 4).

그 결과, 모든 샘플에서 니트릴 히드라타제의 밴드 강도에 차가 없는 점에서, 니트릴 히드라타제의 발현량은 동일한 것을 알았다. 이상의 결과로부터, 촉매 활성의 향상은, 효소의 비활성이 향상되어 있는 것에 의한 것임을 알았다.

실시예 6

로도코커스·로도크로우스 M8주(이하, M8주라고 칭함) 유래 니트릴 히드라타제를 갖는 형질 전환체의 제작

(1) M8주로부터의 염색체 DNA 제조

M8주(SU1731814)는, 러시아 균주 센터 IBFM(VKPM S-926)으로부터 입수할 수 있다. M8주를 100ml의 MYK(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백토 이스트 엑기스, 0.3% 백토 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 배지(pH7.0) 중, 30℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심 분리하고, 집균한 균체를 염수(Saline)-EDTA 용액(0.1M EDTA, 0.15M NaCl(pH8.0)) 4ml에 현탁하였다. 현탁액에 리소자임 8mg을 첨가하여 37℃에서 1 내지 2시간 진탕한 후, -20℃에서 동결하였다.

이어서, 당해 현탁액에 10ml의 Tris-SDS액(1% SDS, 0.1M NaCl, 0.1M Tris-HCl(pH9.0))을 부드럽게 진탕하면서 첨가하였다. 또한, 당해 현탁액에 프로테이나제 K(머크사)(최종 농도 0.1mg)를 첨가해서 37℃에서 1시간 진탕하였다. 이어서, 등량의 TE 포화 페놀을 첨가해서 교반한 후(TE: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.0)) 원심하였다. 상층을 채취하고, 2배량의 에탄올을 첨가하여, 유리 막대로 DNA를 감아 취했다. 그 후, 이것을 순차 90%, 80%, 70%의 에탄올로 원심 분리해서 페놀을 제거하였다.

이어서, DNA를 3ml의 TE 완충액에 용해시키고, 리보누크레아제 A 용액(100℃, 15분간의 가열 처리 완료)을 10μg/ml가 되도록 첨가해서 37℃에서 30분간 진탕하였다. 또한, 프로테이나제 K(머크사)를 첨가해서 37℃에서 30분간 진탕하였다. 이것에 등량의 TE 포화 페놀을 첨가하여 원심 분리한 후, 상층과 하층으로 분리하였다.

상층을 또한 등량의 TE 포화 페놀을 첨가하여 원심 분리한 후, 상층과 하층으로 분리하였다. 이 조작을 다시 반복하였다. 그 후, 상층에 동일 량의 클로로포름(4% 이소아밀알코올 함유)을 첨가하여 원심 분리하고, 상층을 회수하였다. 계속해서, 상층에 2배량의 에탄올을 첨가해서 유리 막대로 DNA를 감아 취해 회수하여, 염색체 DNA를 얻었다.

(2) PCR을 사용한 M8주 염색체 DNA로부터의 개량형 니트릴 히드라타제의 제조

M8주 유래 니트릴 히드라타제는 비특허문헌(Veiko, V. P. et al, Cloning, nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia(Mosc.) 5, 3-5(1995))에 기재되어 있으며, β 서브유닛, α 서브유닛, 액티베이터의 배열을 각각 배열 번호 37, 배열 번호 38, 배열 번호 39에 나타내었다. 배열 정보에 기초하여, 배열표의 배열 번호 40 및 41에 기재된 프라이머를 합성하여, (1)에서 제조한 염색체 DNA를 주형으로 해서 PCR을 행하였다.

<PCR 반응 용액 조성>

멸균수 20μl

주형 DNA(염색체 DNA) 1μl

프라이머 M8-1(10mM) 2μl

프라이머 M8-2(10mM) 2μl

PrimeSTAR MAX(2×) 25μl

합 계 50μl

<프라이머>

M8-1: GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC(배열 번호 40)

M8-2: cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc(배열 번호 41)

<반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃ 30초)×30 사이클

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔(도진 가가꾸사 제조 아가로오스 I 사용; 아가로오스 농도 0.7중량%) 전기 영동에 제공하여, 1.6kb의 증폭 단편의 검출을 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste(프로메가 가부시끼가이샤)를 사용하여 정제하였다.

회수한 PCR 산물은 Ligation Kit(다까라 주조)를 사용하여 벡터(pUC118/HincII 부위)에 연결하고, 반응액에 의해 대장균 JM109의 컴피턴트 셀을 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체 콜로니로부터 수 클론을 LB-Amp 배지 1.5ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 진탕 배양하였다. 배양 후, 이 배양물을 원심 분리에 의해 집균하였다. QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠사)를 사용함으로써, 집균한 균체로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 얻어진 플라스미드 DNA에 대하여 시퀀싱 키트와 오토 시퀀서 CEQ 8000(베크만 코울터사)을 사용하여, 니트릴 히드라타제의 염기 배열을 확인했다(배열 번호 62).

이어서, 얻어진 플라스미드 DNA를 제한 효소 XbaI와 Sse8387I로 절단한 후, 0.7% 아가로오스 겔에 의해 전기 영동을 행하고, 니트릴 히드라타제 유전자 단편(1.6kb)을 회수하여, 플라스미드 pSJ042의 XbaI-Sse8387I 사이트에 도입하였다. 얻어진 플라스미드를 pSJ-N01A라고 명명하였다. 또한, pSJ042는 로도코커스균에 있어서 J1주 니트릴 히드라타제를 발현하는 플라스미드로서 일본 특허 공개 제2008-154552호 공보(참조함으로써, 본 명세서에 도입된다)에 나타내는 방법으로 제작된 것이며, pSJ042의 제작에 사용한 pSJ023은 형질 전환체 ATCC12674/pSJ023(FERM BP-6232)으로서 독립 행정법인 산업 기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 쯔쿠바시 동 1초메 1번지 1 중앙 제6)에 1997년 3월 4일자로 기탁되어 있다.

실시예 7

개량형 니트릴 히드라타제의 제작과 평가

실시예 6에서 얻어진 플라스미드 pSJ-N01A를 사용하여, β 서브유닛 48번째의 아미노산 치환을 행하였다. 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 아미노산 치환을 행하여, 개량형 니트릴 히드라타제를 제작하였다. 또한, 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 형질 전환체 및 그 균체 현탁액을 얻은 후에, 실시예 4와 마찬가지의 방법으로 촉매 활성을 측정하였다. 결과를 표 9에 나타내었다.

<표 9>

표 9의 결과로부터, β 서브유닛의 48번째의 아미노산을 치환한 개량형 니트릴 히드라타제는, 실시예 3과 마찬가지로 촉매 활성이 향상되는 것을 알았다.

실시예 8

개량형 니트릴 히드라타제의 제작

제조예 1에서 제작한 플라스미드 pSJ034를 사용하여, 아미노산 치환을 행하였다. PCR은, 하기 반응액 조성, 반응 조건, 표 2에 나타내는 프라이머를 사용해서 행했다.

<PCR 반응액 조성>

멸균수 20μl

pSJ034(1ng/ml) 1μl

전방향 프라이머(10mM) 2μl

역방향 프라이머(10mM) 2μl

PrimeSTAR MAX(2×) 25μl

합 계 50μl

<PCR 반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃에서 90초)×30 사이클

<프라이머>

<표 10>

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 11kb의 증폭 단편을 확인하고, 1μl의 DpnI(키트에 부속)를 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜, 주형 플라스미드의 제거를 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste(프로메가 가부시끼가이샤)로 정제하고, 정제한 PCR 반응물을 사용하여 JM109를 형질 전환하였다. 얻어진 배양물로부터, QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠사)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고, 오토 시퀀서 CEQ 8000(베크만 코울터사)을 사용하여, 니트릴 히드라타제의 염기 배열을 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 표 11과 같이 명명하였다.

<표 11>

실시예 9

로도코커스 형질 전환체의 제작

로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 대수 증식기의 세포를 원심 분리기에 의해 집균하고, 빙냉한 멸균수로 3회 세정하여, 멸균수에 현탁하였다. 실시예 1에서 제조한 플라스미드 1μl와 균체 현탁액 10μl를 혼합하여 빙냉하였다. 큐벳트에 DNA와 균체의 현탁액을 넣고, 유전자 도입 장치 Gene Pulser(BIORAD)에 의해 2.0kV, 200 OHMS로 전기 펄스 처리를 행하였다. 전기 펄스 처리액을 빙냉하에 10분 정치하고, 37℃에서 10분간 히트 쇼크를 행하고, MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백토 이스트 엑기스, 0.3% 백토 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 500μl를 첨가하여, 30℃, 5시간 정치하였다. 그 후, 50μg/ml 카나마이신이 들어간 MYK 한천 배지에 도포하여, 30℃에서 3일간 배양하였다. 30℃, 3일간 배양 후의 콜로니를 형질 전환체로 하였다.

상기의 공정에서 얻어진 각 형질 전환체를 MYK 배지(50μg/ml 카나마이신)에 각각 접종하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양하고, GGPK 배지(1.5% 글루코오스, 1% 글루탐산나트륨, 0.1% 효모 엑기스, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% Mg₂O₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0.1% 요소, 50μg/ml 카나마이신, pH 7.2)에 1% 식균을 행하였다. 30℃에서 3일간 진탕 배양하고, 원심 분리에 의해 집균하였다. 그 후, 100mM 인산 완충액(pH7.0)으로 균체를 세정하여, 균체 현탁액을 제조하였다.

실시예 10

개량형 니트릴 히드라타제의 활성

균체 현탁액의 니트릴 히드라타제 활성의 측정은, 하기의 방법으로 행하였다.

균체액 0.2ml와 50mM 인산 완충액(pH7.0) 4.8ml를 혼합하고, 또한 5.0%(w/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH7.0) 5ml를 혼합액에 가하여, 10℃에서 10분간 진탕하면서 반응시켰다. 계속해서, 균체를 여과 분별하고, 가스 크로마토그래피를 사용하여 생성한 아크릴아미드의 양을 정량하였다.

<분석 조건>

분석 기기: 가스 크로마토그래프 GC-14B(시마즈 세이사꾸쇼 제조)

검출기: FID(검출 200℃)

칼럼: 포라팩 PS(워터스사 제조 칼럼 충전제)를 충전한 1m 유리 칼럼

칼럼 온도: 190℃

아크릴아미드의 양으로부터 니트릴 히드라타제 활성을 환산하였다. 여기서, 니트릴 히드라타제 활성은, 1분간에 1㎛ol의 아크릴아미드를 생성하는 효소량을 1U라고 정의한다. 효소 활성은 아미노산 치환을 도입하지 않은 친주를 1.0으로 한 상대 활성으로서 표 12에 나타내었다.

<표 12>

이상의 결과로부터, β 서브유닛 37번째의 아미노산을, 알라닌, 발린, 아스파라긴산, 트레오닌, 페닐알라닌, 이소류신, 메티오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환한 효소는, 촉매 활성이 향상되는 것을 알았다.

실시예 11

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동

실시예 2에서 제조한 균체 현탁액을, 초음파 파쇄 장치 VP-300(다이테크, 일본)을 사용하여, 빙냉하면서 10분간 파쇄하였다. 이어서, 균체의 분쇄 용액을 13500rpm, 30분간의 원심 분리에 걸어, 상청으로부터 무세포 추출액을 얻었다. 얻어진 세포 추출액은 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동용 샘플 버퍼(0.1M Tris-HCl(pH6.8), 4% w/v SDS, 12% v/v β 머캅토 에탄올, 20% v/v 글리세롤, 미량 브로모페놀 블루)와 혼합하여, 5분간 끓여서 변성 처리를 행하였다. 10% 폴리아크릴아미드 겔을 제작하고, 변성 처리 완료 샘플을 1래인당 단백질량으로서 등량이 되도록 어플라이하여, 전기 영동 분석을 하였다.

그 결과, 모든 샘플에서 니트릴 히드라타제의 밴드 강도에 차가 없는 점에서, 니트릴 히드라타제의 발현량은 동일한 것을 알았다. 이상의 결과로부터, 촉매 활성의 향상은, 효소의 비활성이 향상되어 있는 것을 알았다.

실시예 12

개량형 니트릴 히드라타제의 제작과 평가

주형 플라스미드로서 하기의 pFR005를 사용하여, β 서브유닛 37번째의 아미노산 치환을 행하였다.

즉, 실시예 1에 기재된 방법으로 아미노산 치환한 개량형 니트릴 히드라타제를 제작하고, 실시예 2의 방법으로 로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 형질 전환체 및 그 균체 현탁액을 얻었다. 또한, 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 활성 측정을 조사하였다. 결과를 표 13에 나타내었다.

<표 13>

이상의 결과로부터, 본 발명의 아미노산 치환은 야생형 니트릴 히드라타제뿐만 아니라 변이가 도입된 니트릴 히드라타제에 대해서도 마찬가지의 효과를 갖는 것으로 나타났다.

실시예 13

개량형 니트릴 히드라타제의 제작

제조예 1에서 제작한 플라스미드 pSJ034를 사용하여, 아미노산 치환을 행하였다. PCR은, 하기 반응액 조성, 반응 조건, 표 2에 나타내는 프라이머를 사용해서 행했다.

<PCR 반응액 조성>

멸균수 20μl

pSJ034(1ng/ml) 1μl

전방향 프라이머(10mM) 2μl

역방향 프라이머(10mM) 2μl

PrimeSTAR MAX(2×) 25μl

합 계 50μl

<PCR 반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃에서 90초)×30 사이클

<프라이머>

<표 14>

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 11kb의 증폭 단편을 확인하고, 1μl의 DpnI(키트에 부속)를 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜, 주형 플라스미드의 제거를 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste(프로메가 가부시끼가이샤)로 정제하고, 정제한 PCR 반응물을 사용해서 JM109를 형질 전환하였다. 얻어진 배양물로부터, QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠사)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고, 오토 시퀀서 CEQ 8000(베크만 코울터사)을 사용하여, 니트릴 히드라타제의 염기 배열을 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 표 15와 같이 명명하였다.

<표 15>

실시예 14

로도코커스 형질 전환체의 제작

로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 대수 증식기의 세포를 원심 분리기에 의해 집균하고, 빙냉한 멸균수로 3회 세정하여, 멸균수에 현탁하였다. 실시예 1에서 제조한 플라스미드 1μl와 균체 현탁액 10μl를 혼합하여 빙냉하였다. 큐벳트에 DNA와 균체의 현탁액을 넣고, 유전자 도입 장치 Gene Pulser(BIORAD)에 의해 2.0kV, 200 OHMS로 전기 펄스 처리를 행하였다. 전기 펄스 처리액을 빙냉하에 10분 정치하고, 37℃에서 10분간 히트 쇼크를 행하고, MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백토 이스트 엑기스, 0.3% 백토 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 500μl를 첨가하여, 30℃, 5시간 정치하였다. 그 후, 50μg/ml 카나마이신이 들어간 MYK 한천 배지에 도포하여, 30℃에서 3일간 배양하였다. 30℃, 3일간 배양 후의 콜로니를 형질 전환체로 하였다.

상기의 공정에서 얻어진 각 형질 전환체를 MYK 배지(50μg/ml 카나마이신)에 각각 접종하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양하고, GGPK 배지(1.5% 글루코오스, 1% 글루탐산나트륨, 0.1% 효모 엑기스, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% Mg₂O₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0.1% 요소, 50μg/ml 카나마이신, pH7.2)에 1% 식균을 행하였다. 30℃에서 3일간 진탕 배양하고, 원심 분리에 의해 집균하였다. 그 후, 100mM 인산 완충액(pH7.0)으로 균체를 세정하여, 균체 현탁액을 제조하였다.

실시예 15

개량형 니트릴 히드라타제의 활성

균체 현탁액의 니트릴 히드라타제 활성의 측정은, 하기의 방법으로 행하였다.

균체액 0.2ml와 50mM 인산 완충액(pH7.0) 4.8ml를 혼합하고, 또한 5.0%(w/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH7.0) 5ml를 혼합액에 가하여, 10℃에서 10분간 진탕하면서 반응시켰다. 계속해서, 균체를 여과 분별하고, 가스 크로마토그래피를 사용하여 생성한 아크릴아미드의 양을 정량하였다.

<분석 조건>

분석 기기: 가스 크로마토그래프 GC-14B(시마즈 세이사꾸쇼 제조)

검출기: FID(검출 200℃)

칼럼: 포라팩 PS(워터스사 제조 칼럼 충전제)를 충전한 1m 유리 칼럼

칼럼 온도: 190℃

아크릴아미드의 양으로부터 니트릴 히드라타제 활성을 환산하였다. 여기서, 니트릴 히드라타제 활성은, 1분간에 1㎛ol의 아크릴아미드를 생성하는 효소량을 1U라고 정의한다. 효소 활성은 아미노산 치환을 도입하지 않은 친주를 1.0으로 한 상대 활성으로서 표 16에 나타내었다.

<표 16>

이상의 결과로부터, α 서브유닛 83번째의 아미노산을 알라닌, 아스파라긴산, 페닐알라닌, 히스티딘, 메티오닌, 아스파라긴으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환한 효소는, 촉매 활성이 향상되는 것을 알았다.

실시예 16

개량형 니트릴 히드라타제의 제작과 평가

주형 플라스미드로서 하기의 pFR005를 사용하여, α 서브유닛 83번째의 아미노산 치환을 행하였다.

즉, 실시예 1에 기재된 방법으로 아미노산 치환한 개량형 니트릴 히드라타제를 제작하고, 실시예 2의 방법으로 로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 형질 전환체 및 그 균체 현탁액을 얻었다. 또한, 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 활성 측정을 조사하였다. 결과를 표 17에 나타내었다.

<표 17>

이상의 결과로부터, 본 발명의 아미노산 치환은 니트릴 히드라타제뿐만 아니라 변이가 도입된 니트릴 히드라타제에 대해서도 마찬가지의 효과를 갖는 것으로 나타났다.

실시예 17

로도코커스·로도크로우스 M8주(이하, M8주라고 칭함) 유래 니트릴 히드라타제를 갖는 형질 전환체의 제작

(1) M8주로부터의 염색체 DNA 제조

M8주(SU1731814)는, 러시아 균주 센터 IBFM(VKPM S-926)으로부터 입수할 수 있다. M8주를 100ml의 MYK(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백토 이스트 엑기스, 0.3% 백토 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 배지(pH7.0) 중, 30℃에서 72시간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심 분리하고, 집균한 균체를 염수-EDTA 용액(0.1M EDTA, 0.15M NaCl(pH8.0)) 4ml에 현탁하였다. 현탁액에 리소자임 8mg을 첨가하여 37℃에서 1 내지 2시간 진탕한 후, -20℃에서 동결하였다.

이어서, 당해 현탁액에 10ml의 Tris-SDS액(1% SDS, 0.1M NaCl, 0.1M Tris-HCl(pH9.0))을 부드럽게 진탕하면서 첨가하였다. 또한, 당해 현탁액에 프로테이나제 K(머크사)(최종 농도 0.1mg)를 첨가해서 37℃에서 1시간 진탕하였다. 이어서, 등량의 TE 포화 페놀을 첨가해서 교반한 후(TE: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.0)) 원심하였다. 상층을 채취하고, 2배량의 에탄올을 첨가하여, 유리 막대로 DNA를 감아 취했다. 그 후, 이것을 순차 90%, 80%, 70%의 에탄올로 원심 분리해서 페놀을 제거하였다.

이어서, DNA를 3ml의 TE 완충액에 용해시켜, 리보누크레아제 A 용액(100℃, 15분간의 가열 처리 완료)을 10μg/ml가 되도록 첨가해서 37℃에서 30분간 진탕하였다. 또한, 프로테이나제 K(머크사)를 첨가해서 37℃에서 30분간 진탕하였다. 이것에 등량의 TE 포화 페놀을 첨가하여 원심 분리한 후, 상층과 하층으로 분리하였다.

상층을 또한 등량의 TE 포화 페놀을 첨가하여 원심 분리한 후, 상층과 하층으로 분리하였다. 이 조작을 다시 반복하였다. 그 후, 상층에 동일 량의 클로로포름(4% 이소아밀 알코올 함유)을 첨가하여 원심 분리하고, 상층을 회수하였다. 계속해서, 상층에 2배량의 에탄올을 첨가해서 유리 막대로 DNA를 감아 취해 회수하여, 염색체 DNA를 얻었다.

(2) PCR을 사용한 M8주 염색체 DNA로부터의 니트릴 히드라타제 유전자의 제조

M8주 유래 니트릴 히드라타제는 비특허문헌(Veiko, V. P. et al, Cloning, nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia(Mosc.) 5, 3-5(1995))에 기재되고 있으며, β 서브유닛, α 서브유닛의 배열을 각각 배열 번호 17, 배열 번호 18에 나타내었다. 배열 정보에 기초하여, 배열표의 배열 번호 115 및 116에 기재된 프라이머를 합성하고, (1)에서 제조한 염색체 DNA를 주형으로 해서 PCR을 행하였다.

<PCR 반응 용액 조성>

멸균수 20μl

주형 DNA(염색체 DNA) 1μl

프라이머 M8-1(10mM) 2μl

프라이머 M8-2(10mM) 2μl

PrimeSTAR MAX(2×) 25μl

합 계 50μl

<프라이머>

M8-1: GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC(배열 번호 115)

M8-2: CCCCTGCAGGTCAGTCGATGATGGCCATCGATTC(배열 번호 116)

<반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃ 30초)×30 사이클

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔(도진 가가꾸사 제조 아가로오스 I 사용; 아가로오스 농도 0.7중량%) 전기 영동에 제공하여, 1.6kb의 증폭 단편의 검출을 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste(프로메가 가부시끼가이샤)를 사용하여 정제하였다.

회수한 PCR 산물은 Ligation Kit(다까라 주조)를 사용하여 벡터(pUC118/HincII 부위)에 연결하고, 반응액에 의해 대장균 JM109의 컴피턴트 셀을 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환체 콜로니로부터 수 클론을 LB-Amp 배지 1.5ml에 접종하고, 37℃에서 12시간 진탕 배양하였다. 배양 후, 이 배양물을 원심 분리에 의해 집균하였다. QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠사)를 사용함으로써, 집균한 균체로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 얻어진 플라스미드 DNA에 대하여 시퀀싱 키트와 오토 시퀀서 CEQ 8000(베크만 코울터사)을 사용하여, 니트릴 히드라타제의 염기 배열을 확인하였다.

이어서, 얻어진 플라스미드 DNA를 제한 효소 XbaI와 Sse8387I로 절단한 후, 0.7% 아가로오스 겔에 의해 전기 영동을 행하여, 니트릴 히드라타제 유전자 단편(1.6kb)을 회수하고, 플라스미드 pSJ042의 XbaI-Sse8387I 사이트에 도입하였다. 얻어진 플라스미드를 pSJ-N01A라고 명명하였다. 또한, pSJ042는 로도코커스균에 있어서 J1주 니트릴 히드라타제를 발현하는 플라스미드로서 일본 특허 공개 제2008-154552호 공보에 나타내는 방법으로 제작된 것이며, pSJ042의 제작에 사용한 pSJ023은 형질 전환체 ATCC12674/pSJ023(FERM BP-6232)으로서 독립 행정법인 산업 기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 쯔쿠바시 동 1초메 1번지 1 중앙 제6)에 1997년 3월 4일자로 기탁되어 있다.

실시예 18

개량형 니트릴 히드라타제의 제작과 평가

실시예 5에서 얻어진 플라스미드 pSJ-N01A를 사용하여, α 서브유닛 83번째의 아미노산 치환을 행하였다. 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 아미노산 치환을 행하고, 개량형 니트릴 히드라타제를 제작하였다. 또한, 실시예 2와 마찬가지의 방법으로 로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 형질 전환체 및 그 균체 현탁액을 얻은 후에, 실시예 4와 마찬가지의 방법으로 활성 측정을 조사하였다. 결과를 표 18에 나타내었다.

<표 18>

이상의 결과로부터, α 서브유닛의 83번째를 메티오닌으로 아미노산 치환을 행한 pSJR17은, 실시예 4와 마찬가지로 촉매 활성이 향상되는 것을 알았다.

실시예 19

개량형 니트릴 히드라타제의 제작

제조예 1에서 제작한 플라스미드 pSJ034를 사용하여, 아미노산 치환을 행하였다. PCR은, 하기 반응액 조성, 반응 조건, 표 2에 나타내는 프라이머를 사용해서 행했다.

<PCR 반응액 조성>

멸균수 20μl

pSJ034(1ng/ml) 1μl

전방향 프라이머(10mM) 2μl

역방향 프라이머(10mM) 2μl

PrimeSTAR MAX(2×) 25μl

합 계 50μl

<PCR 반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃에서 90초)×30 사이클

<프라이머>

α82의 포화 변이 프라이머

α82RM-F ATGCCGGTNNSCAGGCACACCAAATTT(배열 번호 129)

α82RM-R TGTGCCTGSNNACCGGCATAGCCCAAT(배열 번호 130)

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 11kb의 증폭 단편을 확인하고, 1μl의 DpnI(키트에 부속)를 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜, 주형 플라스미드의 제거를 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste(프로메가 가부시끼가이샤)로 정제하고, 정제한 PCR 반응물을 사용하여 JM109로 형질 전환하였다. 얻어진 배양물로부터, QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠사)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고, 오토 시퀀서 CEQ 8000(베크만 코울터사)을 사용하여, 니트릴 히드라타제의 염기 배열을 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 표 19와 같이 명명하였다.

<표 19>

실시예 20

로도코커스 형질 전환체의 제작

로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 대수 증식기의 세포를 원심 분리기에 의해 집균하고, 빙냉한 멸균수로 3회 세정하여, 멸균수에 현탁하였다. 실시예 2에서 제조한 플라스미드 1μl와 균체 현탁액 10μl를 혼합하여 빙냉하였다. 큐벳트에 DNA와 균체의 현탁액을 넣고, 유전자 도입 장치 Gene Pulser(BIORAD)에 의해 2.0kV, 200 OHMS로 전기 펄스 처리를 행하였다. 전기 펄스 처리액을 빙냉하에 10분 정치하고, 37℃에서 10분간 히트 쇼크를 행하고, MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백토 이스트 엑기스, 0.3% 백토 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 500μl를 첨가하여, 30℃, 5시간 정치하였다. 그 후, 50μg/ml 카나마이신이 들어간 MYK 한천 배지에 도포하여, 30℃에서 3일간 배양하였다. 30℃, 3일간 배양 후의 콜로니를 형질 전환체로 하였다.

상기의 공정에서 얻어진 각 형질 전환체를 MYK 배지(50μg/ml 카나마이신)에 각각 접종하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양하고, GGPK 배지(1.5% 글루코오스, 1% 글루탐산나트륨, 0.1% 효모 엑기스, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% Mg₂O₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0.1% 요소, 50μg/ml 카나마이신, pH 7.2)에 1% 식균을 행하였다. 30℃에서 3일간 진탕 배양하고, 원심 분리에 의해 집균하였다. 그 후, 100mM 인산 완충액(pH7.0)으로 균체를 세정하여, 균체 현탁액을 제조하였다.

실시예 21

개량형 니트릴 히드라타제의 활성

균체 현탁액의 니트릴 히드라타제 활성의 측정은, 하기의 방법으로 행하였다.

균체액 0.2ml와 50mM 인산 완충액(pH7.0) 4.8ml를 혼합하고, 또한 5.0%(w/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH7.0) 5ml를 혼합액에 가하여, 10℃에서 10분간 진탕하면서 반응시켰다. 계속해서, 균체를 여과 분별하고, 가스 크로마토그래피를 사용하여 생성한 아크릴아미드의 양을 정량하였다.

<분석 조건>

분석 기기: 가스 크로마토그래프 GC2014(시마즈 세이사꾸쇼 제조)

검출기: FID(검출 200℃)

칼럼: 포라팩 PS(워터스사 제조 칼럼 충전제)를 충전한 1m 유리 칼럼

칼럼 온도: 190℃

아크릴아미드의 양으로부터 니트릴 히드라타제 활성을 환산하였다. 여기서, 니트릴 히드라타제 활성은, 1분간에 1㎛ol의 아크릴아미드를 생성하는 효소량을 1U라고 정의한다. 효소 활성은 아미노산 치환을 도입하지 않은 친주를 1.0으로 한 상대 활성으로서 표 20에 나타내었다.

<표 20>

이상의 결과로부터, α 서브유닛 82번째의 아미노산을 시스테인, 페닐알라닌, 히스티딘, 이소류신, 리신, 메티오닌, 글루타민, 아르기닌, 트레오닌, 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환한 효소는, 촉매 활성이 향상되는 것을 알았다.

실시예 22

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동

실시예 3에서 제조한 균체 현탁액을, 초음파 파쇄 장치 VP-300(다이테크, 일본)을 사용하여, 빙냉하면서 10분간 파쇄하였다. 이어서, 균체의 분쇄 용액을 13500rpm, 30분간의 원심 분리에 걸어, 상청으로부터 무세포 추출액을 얻었다. 얻어진 세포 추출액은 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동용 샘플 버퍼(0.1M Tris-HCl(pH6.8), 4% w/v SDS, 12% v/v β 머캅토 에탄올, 20% v/v 글리세롤, 미량 브로모페놀 블루)와 혼합하여, 5분간 끓여서 변성 처리를 행하였다. 10% 폴리아크릴아미드 겔을 제작하고, 변성 처리 완료 샘플을 1래인당 단백질량으로서 등량이 되도록 어플라이하여, 전기 영동 분석을 하였다.

그 결과, 모든 샘플에서 니트릴 히드라타제의 밴드 강도에 차가 없는 점에서, 니트릴 히드라타제의 발현량은 동일한 것을 알았다. 이상의 결과로부터, 촉매 활성의 향상은, 효소의 비활성이 향상되어 있는 것을 알았다.

실시예 23

개량형 니트릴 히드라타제의 제작

제조예 1에서 제작한 플라스미드 pSJ034를 사용하여, 아미노산 치환을 행하였다. PCR은, 하기 반응액 조성, 반응 조건, 표 2에 나타내는 프라이머를 사용해서 행했다.

<PCR 반응액 조성>

멸균수 20μl

pSJ034(1ng/ml) 1μl

전방향 프라이머(10mM) 2μl

역방향 프라이머(10mM) 2μl

PrimeSTAR MAX(2×) 25μl

합 계 50μl

<PCR 반응 조건>

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃에서 90초)×30 사이클

<프라이머>

α85의 포화 변이 프라이머

α85RM-F CAGGCANNSCAAATTTCGGCGGTCTTC(배열 번호 133)

α85RM-R AATTTGSNNTGCCTGCTCACCGGCATA(배열 번호 134)

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 11kb의 증폭 단편을 확인하고, 1μl의 DpnI(키트에 부속)를 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜, 주형 플라스미드의 제거를 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste(프로메가 가부시끼가이샤)로 정제하고, 정제한 PCR 반응물을 사용하여 JM109를 형질 전환하였다. 얻어진 배양물로부터, QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠사)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하고, 오토 시퀀서 CEQ 8000(베크만 코울터사)을 사용하여, 니트릴 히드라타제의 염기 배열을 확인하였다. 얻어진 플라스미드를 표 21과 같이 명명하였다.

<표 21>

실시예 24

로도코커스 형질 전환체의 제작

로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 대수 증식기의 세포를 원심 분리기에 의해 집균하고, 빙냉한 멸균수로 3회 세정하여, 멸균수에 현탁하였다. 실시예 2에서 제조한 플라스미드 1μl와 균체 현탁액 10μl를 혼합하여 빙냉하였다. 큐벳트에 DNA와 균체의 현탁액을 넣고, 유전자 도입 장치 Gene Pulser(BIORAD)에 의해 2.0kV, 200 OHMS로 전기 펄스 처리를 행하였다. 전기 펄스 처리액을 빙냉하에 10분 정치하고, 37℃에서 10분간 히트 쇼크를 행하고, MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백토 이스트 엑기스, 0.3% 백토 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 500μl를 첨가하여, 30℃, 5시간 정치하였다. 그 후, 50μg/ml 카나마이신이 들어간 MYK 한천 배지에 도포하여, 30℃에서 3일간 배양하였다. 30℃, 3일간 배양 후의 콜로니를 형질 전환체로 하였다.

상기의 공정에서 얻어진 각 형질 전환체를 MYK 배지(50μg/ml 카나마이신)에 각각 접종하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양하고, GGPK 배지(1.5% 글루코오스, 1% 글루탐산나트륨, 0.1% 효모 엑기스, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% Mg₂O₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0.1% 요소, 50μg/ml 카나마이신, pH7.2)에 1% 식균을 행하였다. 30℃에서 3일간 진탕 배양하고, 원심 분리에 의해 집균하였다. 그 후, 100mM 인산 완충액(pH7.0)으로 균체를 세정하여, 균체 현탁액을 제조하였다.

실시예 25

개량형 니트릴 히드라타제의 활성

균체 현탁액의 니트릴 히드라타제 활성의 측정은, 하기의 방법으로 행하였다.

균체액 0.2ml와 50mM 인산 완충액(pH7.0) 4.8ml를 혼합하고, 또한 5.0%(w/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH7.0) 5ml를 혼합액에 가하여, 10℃에서 10분간 진탕하면서 반응시켰다. 계속해서, 균체를 여과 분별하고, 가스 크로마토그래피를 사용하여 생성한 아크릴아미드의 양을 정량하였다.

<분석 조건>

분석 기기: 가스 크로마토그래프 GC2014(시마즈 세이사꾸쇼 제조)

검출기: FID(검출 200℃)

칼럼: 포라팩 PS(워터스사 제조 칼럼 충전제)를 충전한 1m 유리 칼럼

칼럼 온도: 190℃

아크릴아미드의 양으로부터 니트릴 히드라타제 활성을 환산하였다. 여기서, 니트릴 히드라타제 활성은, 1분간에 1㎛ol의 아크릴아미드를 생성하는 효소량을 1U라고 정의한다. 효소 활성은 아미노산 치환을 도입하지 않은 친주를 1.0으로 한 상대 활성으로서 표 22에 나타내었다.

<표 22>

이상의 결과로부터, α 서브유닛 85번째의 아미노산을 시스테인, 글루탐산, 페닐알라닌, 이소류신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환한 효소는, 촉매 활성이 향상되는 것을 알았다.

실시예 26

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동

실시예 3에서 제조한 균체 현탁액을, 초음파 파쇄 장치 VP-300(다이테크, 일본)을 사용하여, 빙냉하면서 10분간 파쇄하였다. 이어서, 균체의 분쇄 용액을 13500rpm, 30분간의 원심 분리에 걸어, 상청으로부터 무세포 추출액을 얻었다. 얻어진 세포 추출액은 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동용 샘플 버퍼(0.1M Tris-HCl(pH6.8), 4% w/v SDS, 12% v/v β 머캅토 에탄올, 20% v/v 글리세롤, 미량 브로모페놀 블루)와 혼합하여, 5분간 끓여서 변성 처리를 행하였다. 10% 폴리아크릴아미드 겔을 제작하고, 변성 처리 완료 샘플을 1래인당 단백질량으로서 등량이 되도록 어플라이하여, 전기 영동 분석을 하였다.

그 결과, 모든 샘플에서 니트릴 히드라타제의 밴드 강도에 차가 없는 점에서, 니트릴 히드라타제의 발현량은 동일한 것을 알았다. 이상의 결과로부터, 촉매 활성의 향상은, 효소의 비활성이 향상되어 있는 것을 알았다.

산업상 이용가능성

본 발명에 따르면, 촉매 활성이 향상된 신규의 개량형(변이형) 니트릴 히드라타제를 제공할 수 있다. 촉매 활성이 향상된 개량형 니트릴 히드라타제는, 아미드 화합물의 제조상 매우 유용하다.

본 발명에 따르면, 또한, 상기 개량형 니트릴 히드라타제를 코드하는 DNA, 당해 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체, 당해 형질 전환체의 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제 및 그 제조, 및 상기 단백질(개량형 니트릴 히드라타제) 또는, 당해 배양물 또는 당해 배양물의 처리물을 사용한 아미드 화합물의 제조 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면, 촉매 활성이 향상된, 신규의 개량형(변이형) 니트릴 히드라타제를 제공할 수 있다. 촉매 활성이 향상된 개량형 니트릴 히드라타제는, 아미드 화합물의 제조상 매우 유용하다.

본 발명에 따르면, 또한, 상기 개량형 니트릴 히드라타제를 코드하는 유전자 DNA, 당해 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체, 당해 형질 전환체의 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제 및 그 제조, 및 상기 단백질(개량형 니트릴 히드라타제) 또는, 당해 배양물 또는 당해 배양물의 처리물을 사용한 아미드 화합물의 제조 방법을 제공할 수 있다.

수탁번호

로도코커스·로도크로우스 J1주는, FERM BP-1478로서 독립 행정법인 산업 기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 쯔쿠바시 동 1초메 1번지 1 중앙 제6)에 1987년 9월 18일자로 국제 기탁되어 있다.

pSJ023은 형질 전환체 "R. rhodochrous ATCC12674/pSJ023"이며, 수탁 번호 FERM BP-6232로서 독립 행정법인 산업 기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 쯔쿠바시 동 1초메 1번지 1 중앙 제6)에 1997년 3월 4일자로 국제 기탁되어 있다.

[배열표의 설명]

배열 번호 1: 로도코커스·로도크로우스 J1(FERM BP-1478) 유래의 β 서브유닛의 염기 배열.

배열 번호 2: 로도코커스·로도크로우스 J1(FERM BP-1478) 유래의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 3: 로도코커스·로도크로우스 J1(FERM BP-1478) 유래의 α 서브유닛의 염기 배열.

배열 번호 4: 로도코커스·로도크로우스 J1(FERM BP-1478) 유래의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 5: 로도코커스·로도크로우스 M8(SU1731814)의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 6: 로도코커스·루버 TH의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 7: 로도코커스·피리디노보란스 MW33(VKM Ac-1515D)의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 8: 로도코커스·피리디노보란스 S85-2의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 9: 로도코커스·피리디노보란스 MS-38의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 10: 노카르디아 sp.JBRs의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 11: 노카르디아 SP.YS-2002의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 12: 로도코커스·로도크로우스 ATCC39384의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 13: β48C-F 프라이머.

배열 번호 14: β48C-R 프라이머.

배열 번호 15: β48D-F 프라이머.

배열 번호 16: β48D-R 프라이머.

배열 번호 17: β48E-F 프라이머.

배열 번호 18: β48E-R 프라이머.

배열 번호 19: β48H-F 프라이머.

배열 번호 20: β48H-R 프라이머.

배열 번호 21: β48I-F 프라이머.

배열 번호 22: β48I-R 프라이머.

배열 번호 23: β48K-F 프라이머.

배열 번호 24: β48K-R 프라이머.

배열 번호 25: β48M-F 프라이머.

배열 번호 26: β48M-R 프라이머.

배열 번호 27: β48N-F 프라이머.

배열 번호 28: β48N-R 프라이머.

배열 번호 29: β48P-F 프라이머.

배열 번호 30: β48P-R 프라이머.

배열 번호 31: β48Q-F 프라이머.

배열 번호 32: β48Q-R 프라이머.

배열 번호 33: β48S-F 프라이머.

배열 번호 34: β48S-R 프라이머.

배열 번호 35: β48T-F 프라이머.

배열 번호 36: β48T-R 프라이머.

배열 번호 37: M8주 유래 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 38: M8주 유래 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 39: M8주 유래 니트릴 히드라타제의 액티베이터의 아미노산 배열.

배열 번호 40: M8-1의 프라이머.

배열 번호 41: M8-2의 프라이머.

배열 번호 42: 비배양 박테리아 SP1의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 43: 비배양 박테리아 BD2의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 44: 코마모나스·테스토스테로니의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 45: 지오바실러스·서모글루코시다시우스 Q6의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 46: 슈도노카르디아·서모필라 JCM3095의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 47: 로도코커스·로도크로우스 Cr4의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 48: 철형 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 시스테인 클러스터의 아미노산 배열.

배열 번호 49: 코발트형 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 시스테인 클러스터의 아미노산 배열.

배열 번호 50: 본 발명에 사용하는 특정한 아미노산 배열.

배열 번호 51: 본 발명의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 52: 로도코커스·루버 RH(CN101463358)의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 53: 니트릴 히드라타제 J1D의 염기 배열.

배열 번호 54: 니트릴 히드라타제 203의 염기 배열.

배열 번호 55: 니트릴 히드라타제 414의 염기 배열.

배열 번호 56: 니트릴 히드라타제 855의 염기 배열.

배열 번호 57: 니트릴 히드라타제 D2의 α 서브유닛의 염기 배열.

배열 번호 58: 니트릴 히드라타제 005의 염기 배열.

배열 번호 59: 니트릴 히드라타제 108A의 염기 배열.

배열 번호 60: 니트릴 히드라타제 211의 염기 배열.

배열 번호 61: 니트릴 히드라타제 306A의 염기 배열.

배열 번호 62: 로도코커스·로도크로우스 M8의 양쪽 말단에 프라이머 배열을 포함하는 PCR 단편의 염기 배열.

배열 번호 63: β17RM-F 프라이머.

배열 번호 64: β17RM-R 프라이머.

배열 번호 65: NH-19 프라이머.

배열 번호 66: NH-20 프라이머.

배열 번호 67: β37A-F 프라이머.

배열 번호 68: β37A-R 프라이머.

배열 번호 69: β37D-F 프라이머.

배열 번호 70: β37D-R 프라이머.

배열 번호 71: β37F-F 프라이머.

배열 번호 72: β37F-R 프라이머.

배열 번호 73: β37I-F 프라이머.

배열 번호 74: β37I-R 프라이머.

배열 번호 75: β37M-F 프라이머.

배열 번호 76: β37M-R 프라이머.

배열 번호 77: β37T-F 프라이머.

배열 번호 78: β37T-R 프라이머.

배열 번호 79: β37V-F 프라이머.

배열 번호 80: β37V-R 프라이머.

배열 번호 81: 본 발명에 사용하는 특정한 아미노산 배열.

배열 번호 82: 본 발명의 β 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 83: α83A-F 프라이머.

배열 번호 84: α83A-R 프라이머.

배열 번호 85: α83C-F 프라이머.

배열 번호 86: α83C-R 프라이머.

배열 번호 87: α83D-F 프라이머.

배열 번호 88: α83D-R 프라이머.

배열 번호 89: α83E-F 프라이머.

배열 번호 90: α83E-R 프라이머.

배열 번호 91: α83F-F 프라이머.

배열 번호 92: α83F-R 프라이머.

배열 번호 93: α83G-F 프라이머.

배열 번호 94: α83G-R 프라이머.

배열 번호 95: α83H-F 프라이머.

배열 번호 96: α83H-R 프라이머.

배열 번호 97: α83M-F 프라이머.

배열 번호 98: α83M-R 프라이머.

배열 번호 99: α83P-F 프라이머.

배열 번호 100: α83P-R 프라이머.

배열 번호 101: α83S-F 프라이머.

배열 번호 102: α83S-R 프라이머.

배열 번호 103: α83T-F 프라이머.

배열 번호 104: α83T-R 프라이머.

배열 번호 105: 로도코커스·로도크로우스 M8(SU1731814)의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 106: 로도코커스·루버 TH의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 107: 로도코커스·피리디노보란스 MW33(VKM Ac-1515D)의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 108: 로도코커스·피리디노보란스 S85-2의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 109: 노카르디아 sp.JBRs의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 110: 노카르디아 sp.YS-2002의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 111: 비배양 박테리아 BD2의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 112: 비배양 박테리아 SP1의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 113: 슈도노카르디아·서모필라 JCM3095의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 114: 로도코커스·로도크로우스 Cr4의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 115: M8-1 프라이머.

배열 번호 116: M8-2 프라이머.

배열 번호 117: 철형 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 시스테인 클러스터의 아미노산 배열.

배열 번호 118: 코발트형 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 시스테인 클러스터의 아미노산 배열.

배열 번호 119: 본 발명에 사용하는 특정한 아미노산 배열.

배열 번호 120: 본 발명의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 121: 로도코커스·피리디노보란스 MS-38의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 122: 로도코커스·로도크로우스 ATCC39384의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 123: 시노히조비움·메디카에 WSM419의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 124: 지오바실러스 서모글루코시다시우스 Q6의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 125: 코마모나스·테스토스테로니의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 126: 로도코커스·루버 RH(CN101463358)의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 127: α83N-F 프라이머.

배열 번호 128: α83N-R 프라이머.

배열 번호 129: α82RM-F 프라이머.

배열 번호 130: α82RM-R 프라이머.

배열 번호 131: 본 발명의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 132: 본 발명에 사용하는 특정한 아미노산 배열.

배열 번호 133: α85RM-F 프라이머.

배열 번호 134: α85RM-R 프라이머.

배열 번호 135: 본 발명의 α 서브유닛의 아미노산 배열.

배열 번호 136: 본 발명에 사용하는 특정한 아미노산 배열.

SEQUENCE LISTING <110> Dia-Nitrix Co., Ltd. <120> Improved Nitrilehydrataze <130> PMR-9007WO <150> JP2011-127466 <151> 2011-06-07 <150> JP2011-144378 <151> 2011-06-29 <150> JP2011-145061 <151> 2011-06-30 <160> 136 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <400> 1 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <400> 2 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 3 <211> 612 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <400> 3 gtgagcgagc acgtcaataa gtacacggag tacgaggcac gtaccaaggc gatcgaaacc 60 ttgctgtacg agcgagggct catcacgccc gccgcggtcg accgagtcgt ttcgtactac 120 gagaacgaga tcggcccgat gggcggtgcc aaggtcgtgg ccaagtcctg ggtggaccct 180 gagtaccgca agtggctcga agaggacgcg acggccgcga tggcgtcatt gggctatgcc 240 ggtgagcagg cacaccaaat ttcggcggtc ttcaacgact cccaaacgca tcacgtggtg 300 gtgtgcactc tgtgttcgtg ctatccgtgg ccggtgcttg gtctcccgcc cgcctggtac 360 aagagcatgg agtaccggtc ccgagtggta gcggaccctc gtggagtgct caagcgcgat 420 ttcggtttcg acatccccga tgaggtggag gtcagggttt gggacagcag ctccgaaatc 480 cgctacatcg tcatcccgga acggccggcc ggcaccgacg gttggtccga ggaggagctg 540 acgaagctgg tgagccggga ctcgatgatc ggtgtcagta atgcgctcac accgcaggaa 600 gtgatcgtat ga 612 <210> 4 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <400> 4 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 5 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous M8 <400> 5 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 6 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus ruber TH <400> 6 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Ala Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 7 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus pyridinovorans MW33 <400> 7 Met Asp Gly Ile His Gly Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Glu His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 8 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus pyridinivorans S85-2 <400> 8 Met Asp Gly Ile His Gly Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Glu His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 9 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus pyridinivorans MS-38 <400> 9 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 10 <211> 229 <212> PRT <213> Nocardia sp. JBRs <400> 10 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 11 <211> 229 <212> PRT <213> Nocardia sp. YS-2002 <400> 11 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 12 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous ATCC39384 <400> 12 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Val Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Arg Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48C-F primer <400> 13 tcgtggtgcg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48C-R primer <400> 14 cttgtcgcac cacgatatgc ccttgag 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48D-F primer <400> 15 tcgtgggacg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48D-R primer <400> 16 cttgtcgtcc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48E-F primer <400> 17 tcgtgggagg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48E-R primer <400> 18 cttgtcctcc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48H-F primer <400> 19 tcgtggcacg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48H-R primer <400> 20 cttgtcgtgc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48I-F primer <400> 21 tcgtggatcg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48I-R primer <400> 22 cttgtcgatc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48K-F primer <400> 23 tcgtggaagg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48K-R primer <400> 24 cttgtccttc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48M-F primer <400> 25 tcgtggatgg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48M-R primer <400> 26 cttgtccatc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48N-F primer <400> 27 tcgtggaacg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48N-R primer <400> 28 cttgtcgttc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48P-F primer <400> 29 tcgtggccgg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48P-R primer <400> 30 cttgtccggc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48Q-F primer <400> 31 tcgtggcagg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48Q-R primer <400> 32 cttgtcctgc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48S-F primer <400> 33 tcgtggtccg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48S-R primer <400> 34 cttgtcggac cacgatatgc ccttgag 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48T-F primer <400> 35 tcgtggaccg acaagtcgcg gttcttc 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B48T-R primer <400> 36 cttgtcggtc cacgatatgc ccttgag 27 <210> 37 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus M8 <400> 37 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 38 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus M8 <400> 38 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 39 <211> 104 <212> PRT <213> Rhodococcus M8 <400> 39 Met Ser Glu Asp Thr Leu Thr Asp Arg Leu Pro Ala Thr Gly Thr Ala 1 5 10 15 Ala Pro Pro Arg Asp Asn Gly Glu Leu Val Phe Thr Glu Pro Trp Glu 20 25 30 Ala Thr Ala Phe Gly Val Ala Ile Ala Leu Ser Asp Gln Lys Ser Tyr 35 40 45 Glu Trp Glu Phe Phe Arg Gln Arg Leu Ile His Ser Ile Ala Glu Ala 50 55 60 Asn Gly Cys Glu Ala Tyr Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Ala Leu Glu Ala 65 70 75 80 Ser Val Val Asp Ser Gly Leu Ile Ser Glu Asp Glu Ile Arg Glu Arg 85 90 95 Met Glu Ser Met Ala Ile Ile Asp 100 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M8-1 primer <400> 40 ggtctagaat ggatggtatc cacgacacag gc 32 <210> 41 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M8-2 primer <400> 41 cccctgcagg tcagtcgatg atggccatcg attc 34 <210> 42 <211> 195 <212> PRT <213> unclutured bacterium SP1 <400> 42 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Pro Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro 195 <210> 43 <211> 166 <212> PRT <213> uncltured bacterium BD2 <400> 43 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asp Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Asn Gln Ser Glu Glu Tyr Glu Pro Ala Gly Thr His Thr 145 150 155 160 Val Pro Glu Ile Cys Ala 165 <210> 44 <211> 218 <212> PRT <213> Comamonas testosteroni <400> 44 Met Asn Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Ala His Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Tyr Arg Glu Pro Asn Glu Pro Val Phe Arg Tyr Asp Trp Glu Lys Thr 20 25 30 Val Met Ser Leu Phe Pro Ala Leu Phe Ala Asn Gly Asn Phe Asn Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg His Gly Ile Glu Arg Met Asn Pro Ile Asp Tyr Leu 50 55 60 Lys Gly Thr Tyr Tyr Glu His Trp Ile His Ser Ile Glu Thr Leu Leu 65 70 75 80 Val Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Thr Glu Leu Ala Thr Gly Lys Ala 85 90 95 Ser Gly Lys Thr Ala Thr Pro Val Leu Thr Pro Ala Ile Val Asp Gly 100 105 110 Leu Leu Ser Thr Gly Ala Ser Ala Ala Arg Glu Glu Gly Ala Arg Ala 115 120 125 Arg Phe Ala Val Gly Asp Lys Val Arg Val Leu Asn Lys Asn Pro Val 130 135 140 Gly His Thr Arg Met Pro Arg Tyr Thr Arg Gly Lys Val Gly Thr Val 145 150 155 160 Val Ile Asp His Gly Val Phe Val Thr Pro Asp Thr Ala Ala His Gly 165 170 175 Lys Gly Glu His Pro Gln His Val Tyr Thr Val Ser Phe Thr Ser Val 180 185 190 Glu Leu Trp Gly Gln Asp Ala Ser Ser Pro Lys Asp Thr Ile Arg Val 195 200 205 Asp Leu Trp Asp Asp Tyr Leu Glu Pro Ala 210 215 <210> 45 <211> 226 <212> PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 45 Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Lys Arg Asp Phe Gly Pro Ile 1 5 10 15 Ile Lys His Asp Gln Glu Pro Leu Phe His Glu Glu Trp Glu Ala Lys 20 25 30 Val Leu Ala Met His Phe Ala Leu Leu Gly Gln Gly Val Ile Asn Trp 35 40 45 Asp Glu Phe Arg His Gly Ile Glu Arg Met Gly Tyr Val Tyr Tyr Leu 50 55 60 Thr Ser Ser Tyr Tyr Glu His Trp Leu Ala Ser Leu Glu Thr Val Leu 65 70 75 80 Ala Glu Lys Asn Ile Ile Asn Ser Glu Gln Tyr Arg Lys Arg Ile Arg 85 90 95 Glu Ile Glu Tyr Gly Met Ser Val Pro Val Ser Glu Lys Pro Glu Leu 100 105 110 Lys Glu Ser Leu Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Thr Lys Ile Ser Ser 115 120 125 Glu Arg Arg Glu Ser Thr Val Ser Pro Arg Phe Arg Pro Gly Asp Arg 130 135 140 Val Arg Val Lys His Phe Tyr Thr Asn Lys His Thr Arg Cys Pro Gln 145 150 155 160 Tyr Val Met Gly Lys Val Gly Val Val Glu Leu Leu His Gly Asn His 165 170 175 Val Phe Pro Asp Ser Asn Ala His Gly Asp Gly Glu Ala Pro Gln Pro 180 185 190 Leu Tyr Asn Val Arg Phe Glu Ala Arg Glu Leu Trp Gly Gly Glu Ala 195 200 205 His Glu Lys Asp Ser Leu Asn Leu Asp Leu Trp Asp Ser Tyr Leu Thr 210 215 220 His Ala 225 <210> 46 <211> 230 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila JCM3095 <400> 46 Met Asn Gly Val Tyr Asp Val Gly Gly Thr Asp Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Asn Arg Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Arg Ala Glu Trp Glu Lys Val 20 25 30 Ala Phe Ala Met Phe Pro Ala Thr Phe Arg Ala Gly Phe Met Gly Leu 35 40 45 Asp Glu Phe Arg Phe Gly Ile Glu Gln Met Asn Pro Ala Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Pro Tyr Tyr Trp His Trp Ile Arg Thr Tyr Ile His His Gly 65 70 75 80 Val Arg Thr Gly Lys Ile Asp Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Glu Asn Pro Asp Ala Pro Leu Pro Glu His Glu Gln Lys 100 105 110 Pro Glu Leu Ile Glu Phe Val Asn Gln Ala Val Tyr Gly Gly Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Arg Glu Val Asp Arg Pro Pro Lys Phe Lys Glu Gly Asp Val 130 135 140 Val Arg Phe Ser Thr Ala Ser Pro Lys Gly His Ala Arg Arg Ala Arg 145 150 155 160 Tyr Val Arg Gly Lys Thr Gly Thr Val Val Lys His His Gly Ala Tyr 165 170 175 Ile Tyr Pro Asp Thr Ala Gly Asn Gly Leu Gly Glu Cys Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Thr Ala Gln Glu Leu Trp Gly Pro Glu Gly 195 200 205 Asp Pro Asn Ser Ser Val Tyr Tyr Asp Cys Trp Glu Pro Tyr Ile Glu 210 215 220 Leu Val Asp Thr Lys Ala 225 230 <210> 47 <211> 226 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous Cr4 <400> 47 Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Val 1 5 10 15 Asn Pro Glu Pro Gly Glu Pro Val Phe His Ser Arg Trp Glu Arg Ser 20 25 30 Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Met Ala Leu Ala Gly Ala Phe Asn Leu 35 40 45 Asp Gln Phe Arg Gly Ala Met Glu Gln Ile Pro Pro His Asp Tyr Leu 50 55 60 Thr Ser Gln Tyr Tyr Glu His Trp Met His Ala Met Ile His Tyr Gly 65 70 75 80 Ile Glu Ala Gly Ile Phe Asp Pro Asn Glu Leu Asp Arg Arg Thr Gln 85 90 95 Tyr Tyr Leu Glu His Pro Asp Glu Asp Pro Pro Leu Arg Gln Asp Pro 100 105 110 Gln Leu Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Ile Met His Gly Ala Asp Tyr 115 120 125 Arg Arg Pro Thr Asp Ala Glu Gly Val Phe Ala Val Gly Asp Lys Val 130 135 140 Val Val Arg Ser Asp Ala Ser Pro Asn Thr His Thr Arg Arg Ala Gly 145 150 155 160 Tyr Ile Arg Gly Arg Thr Gly Glu Ile Val Ala Ala His Gly Ala Tyr 165 170 175 Val Phe Pro Asp Thr Asn Ala Val Gly Ala Gly Glu His Pro Glu His 180 185 190 Leu Tyr Thr Val Arg Phe Ser Ala Thr Glu Leu Trp Gly Glu Thr Ala 195 200 205 Thr Ser Asn Ala Val Asn His Ile Asp Val Phe Glu Pro Tyr Leu Leu 210 215 220 Pro Ala 225 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodococcus N-771 <400> 48 Cys Ser Leu Cys Ser Cys 1 5 <210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <400> 49 Cys Thr Leu Cys Ser Cys 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (2)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> Xaa is Cys, Asp, Glu, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Ser or Thr <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 50 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Arg 1 5 <210> 51 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <220> <221> misc_feature <222> (45)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (50)..(51) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 51 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Xaa Xaa Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 52 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus ruber RH <400> 52 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Ala Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 53 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous J1D <400> 53 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggag caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgccgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 54 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous 204 <400> 54 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagaa gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggag caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgccgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 55 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous 414 <400> 55 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagaa gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggag ccggatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgccgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 56 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous 855 <400> 56 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagaa gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacaa ggacaggaag ccgtcgcggt acttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggag caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgccgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 57 <211> 612 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous D2 <400> 57 gtgagcgagc acgtcaataa gtacacggag tacgaggcac gtaccaaggc gatcgaaacc 60 ttgctgtacg agcgagggct catcacgccc gccgcggtcg accgagtcgt ttcgtactac 120 gaggacgaga tcggcccgat gggcggtgcc aaggtcgtgg ccaagtcctg ggtggaccct 180 gagtaccgca agtggctcga agaggacgcg acggccgcga tggcgtcatt gggctatgcc 240 ggtgagcagg cacaccaaat ttcggcggtc ttcaacgact cccaaacgca tcacgtggtg 300 gtgtgcactc tgtgttcgtg ctatccgtgg ccggtgcttg gtctcccgcc cgcctggtac 360 aagagcatgg ggtaccggtc ccgagtggta gcggaccctc gtggagtgct caagcgcgat 420 ttcggtttcg acatccccga tgaggtggag gtcagggttt gggacagcag ctccgaaatc 480 cgctacatcg tcatcccgga acggccggcc ggcaccgacg gttggtccga ggaggagctg 540 acgaagctgg tgagccggga ctcgatgatc ggtgtcagta atgcgctcac accgcaggaa 600 gtgatcgtat ga 612 <210> 58 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous 005 <400> 58 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtcgg gtatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagat gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacaa ggacaggaag ccgtcgcggt acttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggag caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgccgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 59 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous 108A <400> 59 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtcgg gtatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagat gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacaa ggacaggaag ccgtcgcggt acttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctcta gcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggag caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgccgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 60 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous 211 <400> 60 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtcgg gtatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagat gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacaa ggacaggaag ccgtcgcggt acttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctcta gcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggag caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gcacgccgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 61 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous 306A <400> 61 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtcgg gtatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagat gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacaa ggacaggaag ccgtcgcggt acttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggag caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gcacgccgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 62 <211> 1644 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous M8 <400> 62 ggtctagaat ggatggtatc cacgacacag gcggcatgac cggatacgga ccggtcccct 60 atcagaagga cgagcccttc ttccactacg agtgggaggg tcggaccctg tcgattctga 120 cctggatgca tctcaagggc atgtcgtggt gggacaagtc gcggttcttc cgggagtcga 180 tggggaacga aaactacgtc aacgagattc gcaactcgta ctacacccac tggctgagtg 240 cggcagaacg tatcctcgtc gccgacaaga tcatcaccga agaagagcga aagcaccgtg 300 tgcaggagat cctcgagggt cggtacacgg acaggaaccc gtcgcggaag ttcgatccgg 360 ccgagatcga gaaggcgatc gaacggcttc acgagcccca ctccctagca cttccaggag 420 cggagccgag tttctccctc ggtgacaagg tcaaagtgaa gaatatgaac ccgctgggac 480 acacacggtg cccgaaatat gtgcggaaca agatcgggga aatcgtcacc tcccacggct 540 gccagatcta tcccgagagc agctccgccg gcctcggcga cgatccccgc ccgctctaca 600 cggtcgcgtt ttccgcccag gaactgtggg gcgacgacgg aaacgggaaa gacgtagtgt 660 gcgtcgatct ctgggaaccg tacctgatct ctgcgtgaaa ggaatacgat agtgagcgag 720 cacgtcaata agtacacgga gtacgaggca cgtaccaagg caatcgaaac tttgctgtac 780 gagcgagggc tcatcacgcc cgccgcggtc gaccgagtcg tttcgtacta cgagaacgag 840 atcggcccga tgggcggtgc caaggtcgtg gcgaagtcct gggtggaccc tgagtaccgc 900 aagtggctcg aagaggacgc gacggccgcg atggcgtcat tgggctatgc cggtgagcag 960 gcacaccaaa tttcggcggt cttcaacgac tcccaaacgc atcacgtggt ggtgtgcact 1020 ctgtgttcgt gctatccgtg gccggtgctt ggtctcccgc ccgcctggta caagagcatg 1080 gagtaccggt cccgagtggt agcagaccct cgtggagtgc tcaagcgcga tttcggtttc 1140 gacatccccg atgaggtgga ggtcagggtt tgggacagca gctccgaaat ccgctacatc 1200 gtcatcccgg aacggccggc cggcaccgac ggttggtccg aggacgagct ggcgaagctg 1260 gtgagtcggg actcgatgat cggtgtcagt aatgcgctca caccccagga agtgatcgta 1320 tgagtgaaga cacactcact gatcggctcc cggcgactgg gaccgccgca ccgccccgcg 1380 acaatggcga gcttgtattc accgagcctt gggaagcaac ggcattcggg gtcgccatcg 1440 cgctttcgga tcagaagtcg tacgaatggg agttcttccg acagcgtctc attcactcca 1500 tcgctgaggc caacggttgc gaggcatact acgagagctg gacaaaggcg ctcgaggcca 1560 gcgtggtcga ctcggggctg atcagcgaag atgagatccg cgagcgcatg gaatcgatgg 1620 ccatcatcga ctgacctgca gggg 1644 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B17RM-F primer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 63 ggatacggac cggtcnnsta tcagaaggac gag 33 <210> 64 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B17RM-R primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 64 ctcgtccttc tgatasnnga ccggtccgta tcc 33 <210> 65 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NH19 primer <400> 65 gcctctagat atcgccattc cgttgccgg 29 <210> 66 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occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Xaa is Ala, Val, Asp, Thr, Phe, Ile or Met <220> <221> misc_feature <222> (10)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 81 Trp Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Asp 20 <210> 82 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (37) <223> Xaa is Ala, Val, Asp, Thr, Phe, Ile or Met <220> <221> misc_feature <222> (38)..(48) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 82 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala 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JBRs <400> 109 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 110 <211> 203 <212> PRT <213> Nocardia sp. YS-2002 <400> 110 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 111 <211> 203 <212> PRT <213> uncultured bacterium BD2 <400> 111 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 112 <211> 180 <212> PRT <213> uncultured bacterium SP1 <400> 112 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Val Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr 85 90 95 Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu 100 105 110 Tyr Arg Ser Arg Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp 115 120 125 Phe Gly Phe Asp Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser 130 135 140 Ser Ser Glu Ile Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr 145 150 155 160 Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser 165 170 175 Ile Ile Gly Val 180 <210> 113 <211> 205 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila JCM3095 <400> 113 Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu 1 5 10 15 Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly 20 25 30 Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn 35 40 45 Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr 50 55 60 Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys 65 70 75 80 Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val 85 90 95 Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser 100 105 110 Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu 115 120 125 Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys 130 135 140 Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala 195 200 205 <210> 114 <211> 207 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous Cr4 <400> 114 Met Thr Ala His Asn Pro Val Gln Gly Thr Phe Pro Arg Ser Asn Glu 1 5 10 15 Glu Ile Ala Ala Arg Val Lys Ala Met Glu Ala Ile Leu Val Asp Lys 20 25 30 Gly Leu Ile Ser Thr Asp Ala Ile Asp Tyr Met Ser Ser Val Tyr Glu 35 40 45 Asn Glu Val Gly Pro Gln Leu Gly Ala Lys Ile Ala Ala His Ala Trp 50 55 60 Val Asp Pro Glu Phe Lys Gln Arg Leu Leu Ala Asp Ala Thr Gly Ala 65 70 75 80 Cys Lys Glu Met Gly Val Gly Gly Met Gln Gly Glu Glu Met Val Val 85 90 95 Leu Glu Asn Thr Asp Thr Val Asn Asn Met Val Val Cys Thr Leu Cys 100 105 110 Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Tyr Lys 115 120 125 Tyr Pro Ala Tyr Arg Ala Arg Ala Ala Arg Asp Pro Arg Gly Val Met 130 135 140 Ala Glu Phe Gly Tyr Thr Pro Ala Ser Asp Val Glu Ile Arg Val Trp 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ala Glu Leu Arg Tyr Trp Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Glu Asn Phe Thr Glu Glu Gln Leu Ala Ala Leu Val Thr Arg 180 185 190 Asp Ser Leu Ile Gly Val Ser Val Pro Thr Ala Pro Asn Lys Ala 195 200 205 <210> 115 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M8-1 primer <400> 115 ggtctagaat ggatggtatc cacgacacag gc 32 <210> 116 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M8-2 primer <400> 116 cccctgcagg tcagtcgatg atggccatcg attc 34 <210> 117 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodococcus N-771 <400> 117 Cys Ser Leu Cys Ser Cys 1 5 <210> 118 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <400> 118 Cys Thr Leu Cys Ser Cys 1 5 <210> 119 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> Xaa is Ala, Leu, Met, Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Pro, Arg, Ser, Thr or Trp <400> 119 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa 1 5 10 <210> 120 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <220> <221> misc_feature <222> (74)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (79)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (83) <223> Xaa is Ala, Leu, Met, Asn, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Pro, Arg, Ser, Thr or Trp <400> 120 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa 65 70 75 80 Gly Xaa Xaa Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 121 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus pyridinivorans MS-38 <400> 121 Val Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 122 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous ATCC39384 <400> 122 Val Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 123 <211> 213 <212> PRT <213> Sinorhizobium medicae WSM419 <400> 123 Met Ser Glu His Arg His Gly Pro Gly Glu Glu His Gly His His His 1 5 10 15 Asp Asn His Leu Thr Asp Met Glu Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Thr 20 25 30 Val Leu Thr Glu Lys Gly Leu Ile Asp Pro Ala Ala Ile Asp Ala Ile 35 40 45 Val Asp Thr Tyr Glu Thr Lys Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Arg Val 50 55 60 Val Ala Lys Ala Trp Ser Asp Pro Asp Phe Ala Asp Trp Leu Arg Arg 65 70 75 80 Asp Ala Thr Ala Ala Ile Ala Ser Leu Gly Phe Thr Gly Arg Gln Gly 85 90 95 Glu His Met Arg Ala Val Phe Asn Thr Ser Glu Thr His Asn Leu Ile 100 105 110 Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Ala Val Leu Gly Leu Pro 115 120 125 Pro Val Trp Tyr Lys Ala Pro Pro Tyr Arg Ser Arg Ala Val Ile Asp 130 135 140 Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly Leu Asn Leu Pro Ala Glu Lys 145 150 155 160 Lys Ile Arg Val Trp Asp Ser Thr Ala Glu Leu Arg Tyr Leu Val Val 165 170 175 Pro Glu Arg Pro Ala Ala Thr Asp Asp Leu Gly Glu Asp Ala Leu Ala 180 185 190 Lys Leu Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Thr Gly Leu Ala Leu Ser 195 200 205 Pro Glu Ala Phe Arg 210 <210> 124 <211> 205 <212> PRT <213> Geobacillus thermoglucosidasius Q6 <400> 124 Met Ser Val Gln Lys Val His His Asn Val Leu Pro Glu Lys Pro Ala 1 5 10 15 Gln Thr Arg Thr Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Ile Glu Ser Gly Leu 20 25 30 Val Ser Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ile Ile Glu Ala Tyr Glu Asn Asp 35 40 45 Ile Gly Pro Met Asn Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ala Trp Val Asp 50 55 60 Pro Asp Tyr Lys Glu Arg Leu Leu Arg Asp Gly Thr Ser Ala Ile Ala 65 70 75 80 Glu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Gln Gly Glu His Met Val Val Val Glu 85 90 95 Asn Thr Pro Lys Val His Asn Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys 100 105 110 Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Ser Trp Tyr Lys Ser Ala 115 120 125 Ser Tyr Arg Ala Arg Ile Val Ser Glu Pro Arg Thr Val Leu Lys Glu 130 135 140 Phe Gly Leu Glu Leu Asp Asp Asp Val Glu Ile Arg Val Trp Asp Ser 145 150 155 160 Ser Ala Glu Ile Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr 165 170 175 Glu Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Lys Leu Val Thr Arg Asp Ser 180 185 190 Met Ile Gly Val Ala Lys Ile Lys Ser Pro Val Lys Lys 195 200 205 <210> 125 <211> 210 <212> PRT <213> Comamonas testosteroni <400> 125 Met Gly Gln Ser His Thr His Asp His His His Asp Gly Tyr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Pro Glu Asp Ile Ala Leu Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu 20 25 30 Ile Glu Lys Gly Leu Val Asp Pro Ala Ala Met Asp Leu Val Val Gln 35 40 45 Thr Tyr Glu His Lys Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Lys Val Val Ala 50 55 60 Lys Ala Trp Val Asp Pro Ala Tyr Lys Ala Arg Leu Leu Ala Asp Gly 65 70 75 80 Thr Ala Gly Ile Ala Glu Leu Gly Phe Ser Gly Val Gln Gly Glu Asp 85 90 95 Met Val Ile Leu Glu Asn Thr Pro Ala Val His Asn Val Val Val Cys 100 105 110 Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Thr Leu Gly Leu Pro Pro Ala 115 120 125 Trp Tyr Lys Ala Pro Pro Tyr Arg Ser Arg Met Val Ser Asp Pro Arg 130 135 140 Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly Leu Val Ile Pro Ala Lys Glu Ile Arg 145 150 155 160 Val Trp Asp Thr Thr Ala Glu Leu Arg Tyr Met Val Leu Pro Glu Arg 165 170 175 Pro Ala Gly Thr Glu Ala Tyr Ser Glu Glu Gln Leu Ala Glu Leu Val 180 185 190 Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Thr Gly Leu Pro Ile Gln Pro Thr Pro 195 200 205 Ser His 210 <210> 126 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus ruber RH <400> 126 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 127 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A83N-F primer <400> 127 ggtgagaacg cacaccaaat ttcggcg 27 <210> 128 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A83N-R primer <400> 128 gtgtgcgttc tcaccggcat agccc 25 <210> 129 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A82RM-F primer <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <400> 129 atgccggtnn scaggcacac caaattt 27 <210> 130 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A82RM-R primer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 130 tgtgcctgsn naccggcata gcccaat 27 <210> 131 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <220> <221> misc_feature <222> (74)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (79)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa is not wild type amino acid <400> 131 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa 65 70 75 80 Gly Xaa Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 132 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is not wild type amino acid <400> 132 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Gln 1 5 10 <210> 133 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A85RM-F primer <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> n is a, c, g, or t <400> 133 caggcannsc aaatttcggc ggtcttc 27 <210> 134 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A85RM-R primer <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> n is a, c, g, or t <400> 134 aatttgsnnt gcctgctcac cggcata 27 <210> 135 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous J1 <220> <221> misc_feature <222> (74)..(77) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (79)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (85)..(85) <223> Xaa is not wild type amino acid <400> 135 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa 65 70 75 80 Gly Xaa Gln Xaa Xaa Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 136 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Specific amino acid residue <220> <221> misc_feature <222> (2)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is not wild type amino acid <400> 136 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Gln Xaa Xaa 1 5 10

Claims (10)

1. 하기 (b)의 특징을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제.
   (b) β 서브유닛에 있어서, 하기 서열로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제이며,
   WEGRX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁LKGX₁₅X₁₆X₁₇X₁₈D
   (W는 트립토판, E는 글루탐산, G는 글리신, R은 아르기닌, L은 류신, K는 리신, D는 아스파라긴산, X₃ 내지 X₆, X₈ 내지 X₁₁, 및 X₁₅ 내지 X₁₈은 각각 독립된 임의의 아미노산 잔기를 나타냄)
   X₇이 알라닌, 발린, 아스파라긴산, 트레오닌, 페닐알라닌, 이소류신 및 메티오닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산인 것을 특징으로 하는 개량형 니트릴 히드라타제.
2. 제1항에 있어서,
   상기 서열 중 X₃이 T(트레오닌), X₄가 L(류신), X₅가 S(세린), X₆이 I(이소류신), X₈이 T(트레오닌), X₉가 W(트립토판), X₁₀이 M(메티오닌), X₁₁이 H(히스티딘)인 것을 특징으로 하는, 개량형 니트릴 히드라타제.
3. 제1항에 있어서,
   상기 서열에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 니트릴 히드라타제가, 배열 번호 82에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는, 개량형 니트릴 히드라타제.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 니트릴 히드라타제가, 로도코커스속 세균 또는 노카르디아속 세균 유래인, 개량형 니트릴 히드라타제.
5. 제1항의 개량형 니트릴 히드라타제를 코드하는 DNA.
6. 제5항의 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
7. 제6항의 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체.
8. 제7항의 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제.
9. 제7항의 형질 전환체를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 니트릴 히드라타제를 채취하는 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타제의 제조 방법.
10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 개량형 니트릴 히드라타제, 또는 제5항의 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물, 또는 당해 배양물의 처리물을 니트릴 화합물에 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 아미드 화합물의 제조 방법.

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