CN109517780A - 提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法 - Google Patents

提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109517780A
CN109517780A CN201811338020.4A CN201811338020A CN109517780A CN 109517780 A CN109517780 A CN 109517780A CN 201811338020 A CN201811338020 A CN 201811338020A CN 109517780 A CN109517780 A CN 109517780A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhodococcus
rhod
compatible material
growth
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811338020.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张怡轩
章朦玥
侯少阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenyang Pharmaceutical University
Original Assignee
Shenyang Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenyang Pharmaceutical University filed Critical Shenyang Pharmaceutical University
Priority to CN201811338020.4A priority Critical patent/CN109517780A/zh
Publication of CN109517780A publication Critical patent/CN109517780A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，涉及提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法，具体涉及一种在生物制药和生物去污领域提高菌株生长速度和防止菌株退化的方法。该方法是基于红球菌属内公开的菌种的全基因组序列，发现红球菌属已公开的全基因组序列中均含有相容性物质的生物合成基因簇。通过系列实验，发现通过添加合适浓度的相容性物质，不但可以明显提高菌株对抗不良环境的适应能力及高渗透压的耐受度，维持细菌形态防止菌株退化，还具有促进冻干保藏菌体的萌发速率和菌体的生长速度，缩短发酵周期，使菌株在不良环境下生长速度加快、生物量和遗传稳定性提高的作用。

Description

提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法，具体涉及一种在生物制药和生物去污领域提高菌株生长速度和防止菌株退化的方法。
背景技术
红球菌属类微生物在生物制药和治理环境污染方面都有重要的作用。以红球菌属类微生物制备的细胞壁肽聚糖类物质能增强体内巨噬细胞和自然杀伤细胞的免疫活力，具有抑制癌细胞、减少肿瘤复发的功能作用。同时，该类微生物还可作为生物去污的接种介体，可被红球菌属菌株降解、去污的污染物主要有烃类、氯化烃、芳香烃、硝基芳香化合物、多环芳烃化合物、放射性重金属及其聚合物。高渗环境会造成红球菌属在生长过程中发生细胞渗透压失衡、胞内水份外流导致细胞质壁分离，生长速度下降、生长受到抑制，甚至死亡，大大降低了生长存活力；并且会加速菌株的变异，当变异细胞达到一定程度，就会使菌株的某些特性发生改变或丧失，导致菌株的退化。
红球菌属类微生物的生长环境中溶液盐浓度增加会导致溶液渗透压的升高，菌体为了维持细胞内外的渗透压，通常会产生相容性物质，该类物质是一类极性的、易溶的并且可以在细胞内高浓度积累同时对细胞主要功能和蛋白质分子正确折叠起到促进作用的小分子物质。相容性物质在嗜盐菌属菌株中广泛存在，然而红球菌属在不良环境胁迫下是否表达或转运相容性物质，表达或转运的相容性物质是否对其具有抗胁迫作用及它们是否具有交互作用，还未见报道和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使红球菌属类微生物在不良环境的胁迫下提高其生长速度和防止菌株退化的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
在含有红球菌属类微生物的环境中添加相容性物质，所述的相容性物质为嘧啶类或氨基酸类相容性物质，选自四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、甲硫氨酸、组氨酸中的一种或几种；按照菌类的发酵液体积计算，其浓度为10～60mol/l，优选为15-60mol/l。
所述的含有红球菌属类微生物的环境中可以含有高渗盐。
所述的高渗盐选自：NaCl、NαSO4、KCl中的一种或几种，其浓度为：5％-20％。
本发明的相容性物质通过如下方法选择：
(1)对红球菌属类微生物进行基因组比对，根据比对结果确定红球菌属菌株具有相容性物质的生物合成基因簇；
(2)以红球菌(Rhodococcus ruber SYP-A8695,其16S rRNA序列在NCBI的接收号为MH712435，相容性物质四氢嘧啶合成基因簇序列在NCBI的接收号为MH720339)属菌株为实验对象，进行发酵培养和高盐胁迫性实验，确定菌株适宜的相容性物质需求浓度(10-40mmol/l)；
(3)在最适的相容性物质四氢嘧啶浓度下，通过比较高盐浓度下菌株的生长曲线和形态特征，发现相容性物质四氢嘧啶可以提高红球菌属菌株生长速度，并能维持菌体的正常形态、防止红球菌退化。
具体地，
本发明的相容性物质通过如下方法选择：具体步骤如下：
(1)对红球菌属类微生物已公开的全基因组序列进行基因水平次级代谢产物的预测，发现已公开的13株红球菌类微生物的全基因组均含有相容性物质四氢嘧啶合成基因簇；
(2)对红球菌属菌株在不同盐(NaCl)浓度(0～40％)下培养，检测相容性物质的产生；
(3)使用超纯水溶解相容性物质，得到不同浓度(0-40mol/l)的相容性物质溶液，使用0.22μm滤膜对相容性物质溶液过滤除菌；
(4)从冻干保藏管中活化红球菌属(Rhodococcus)目标菌株，观察冻干菌体在不同浓度(0-40mmol/l)相容性物质的培养基中的生长速度和生物量，将活化好的目标菌株接入到发酵培养基中，混匀；
(5)将步骤(3)中不同浓度(0-40mol/l)的相容性物质溶液加入到步骤(4)中的发酵培养基中，使发酵培养基中相容性物质的浓度为0-40mmol/l进行红球菌属菌株(如，Rhodococcus aerolatus,Rhodococcus aetherivorans,Rhodococcus agglutinans,Rhodococcus aichiensis,Rhodococcus antrifimi,Rhodococcus artemisiae或Rhodococcus aurantiacus，但不限于上述菌株)最适相容性物质浓度筛选；
(6)按照步骤(4)中筛选得到的对应菌株最适相容物质的浓度(10-40mmol/l)，进行目标菌株发酵；对在不同发酵条件中生长的菌体进行生长曲线的绘制和形态学观察，确定菌体的生长速度和稳定性。发现相容性物质不仅能提高菌种的生长速度和生物量，还具有防止菌种退化的作用。
步骤(1)中，所述的次级代谢产物预测平台为：
https://antismash.secondarymetabolites.org/#！/start；
所述红球菌属全基因组数据平台为：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/13525？；
所述的目标菌株为红球菌属，例如：
Rhodococcus ruber(Rhodococcus ruber SYP-A8695,MH712435),
Rhodococcus biphenylivorans(Rhodococcus sp.2G,NZ_CP018063.1),
Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.008,NZ_CP012749.1),
Rhodococcus cerastii(Rhodococcus sp.B7740,NZ_CP010797.1),
Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.BH4,NZ_CP014941.1)等。
以Rhodococcus ruber SYP-A8695为例，在15％高渗盐浓度下培养72h活菌数仅为6.2×106CFU·ml-1，而加入适量相容性溶质后，在15％高渗盐浓度的条件下培养72h后，活菌数可提高近100倍，达5.8×108CFU·ml-1，显著增加该菌株对不良环境的耐受。
本发明是将红球菌属菌体接种在不同浓度相容性物质的培养基中，从而提高菌体的生长速度、生物量。
所述的红球菌属菌体可以为冻干菌体。
本发明所述的提高红球菌属菌种生长速度和防止红球菌退化的方法，包括如下步骤：
(1)使用超纯水溶解相容性物质，得到相容性物质溶液，过滤除菌；
(2)将活化好的红球菌属菌株接入到发酵培养基中，混匀，所述的发酵培养基配方为：酵母浸粉4-5‰，葡萄糖4-5‰，麦芽粉2-3‰，复合维生素少许，微量盐1‰，蒸馏水1L；或蛋白胨10-15‰，酵母浸粉4-6‰，NaCl 4-6‰，琼脂15-20‰，蒸馏水1L；pH 7.0-7.2。
(3)将步骤(1)中的相容性物质溶液加入到步骤(2)中的发酵培养基中，观察菌株的生长曲线和形态特征。
以红球菌株(Rhodococcus ruber SYP-A8695,MH712435)及相容性物质四氢嘧啶为例，本发明将冻干保存并经长期保藏的菌体接种在含有不同浓度相容性物质的培养基中，可观察到菌体在含有相容性物质的培养基中生长速度和生物量相对于在不含相容性物质的培养基中生长速度加快，生物量增多；经过实验摸索合适的相容性物质浓度，在菌体发酵过程中通过投放合适浓度的相容性物质，发现相容性物质能促进菌体的生长，使菌体的生长速度加快、生物量提高，其具有以下优点：
1.本发明可使红球菌属菌株冻干菌体生长速度和生物量提升，使菌体在冻干保存后仍能保持良好的生长状态，遗传稳定性提高；
2.本发明还可应用在冻干菌体复苏中，提高冻干菌体的生长速度，缩短发酵周期，节约生产成本；
3.本发明可使红球菌属在胁迫条件下与非胁迫条件下保持近似的生长速度、生物量及菌体形态特征，防止细菌发生退化；提升菌体在不良环境下的生长速度，提高生物量；
4.本发明中的使用的相容性物质为嘧啶类或氨基酸类相容性物质，在提高菌体生长速度和防止菌体退化的同时，还能补充嘧啶和氨基酸，维持为菌体生长提供营养元素所使用的相容性物质，并且投入环境后无毒无害。
附图说明
图1红球菌属菌株相容性物质四氢嘧啶合成基因簇蛋白序列比对结果。
A,ectA蛋白序列比对结果；1,Rhodococcus biphenylivorans(Rhodococcussp.2G,NZ_CP018063.1)；2,Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.008,NZ_CP012749.1)；3,Rhodococcus cerastii(Rhodococcus sp.B7740,NZ_CP010797.1)；4,Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.BH4,NZ_CP014941.1)；5,Rhodococcusbaikonurensis(Rhodococcus sp.H-CA8f,NZ_CP023720.1)；6,Rhodococcusmaanshanensis(Rhodococcus sp.MTM3W5.2,NZ_CP019572.1)；7,Rhodococcuspyridinivorans(Rhodococcus sp.p52,NZ_CP016819.1)；8,Rhodococcuscorynebacterioides(Rhodococcus sp.PBTS1,NZ_CP015219.1)；9,Rhodococcus cerastii(Rhodococcus sp.PBTS2,NZ_CP015220.1)；10,Rhodococcus jostii(Rhodococcus sp.S2-17,NZ_CP021354.1)；11,Rhodococcus ruber(Rhodococcus ruber SYP-A8695,MH720339)；12,Rhodococcus aetherivorans(Rhodococcus sp.WB1,NZ_CP015529.1)；13,Rhodococcusnanhaiensis(Rhodococcus sp.WMMA185,NZ_CP017014.1)；14,Rhodococcusqingshengii(Rhodococcus sp.YL-1,NZ_CP017299)；15,Bacillus halodurans ectA(ABP52051.1)；16,Chromohalobacter sp.NJS-2ectA(ABO87371.1)；17,Halobacillushalophilus DSM 2266ectA(ABX39523.1)；18,Halomonas elongata DSM 3043ectA(CAA09483.1)；19,Methylobacter alcaliphilus ectA(AAY96770.1)；20,Methylophagaalcalica M8ectA(ABY40744.1)；21,Nesterenkonia halobia DSM 20541ectA(ABS82494.1)；22,Nocardiopsis gilva YIM 90087ectA(ASU82339.1)；23,Prauserellaalba YIM 90005ectA(AEJ36139.1)；24,Streptomyces pactum ACT12ectA(AMY60488.1)；25,Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2ectA(ANV28159.1)；
B,ectB蛋白序列比对结果；1,Rhodococcus biphenylivorans(Rhodococcussp.2G,NZ_CP018063.1)；2,Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.008,NZ_CP012749.1)；3,Rhodococcus cerastii(Rhodococcus sp.B7740,NZ_CP010797.1)；4,Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.BH4,NZ_CP014941.1)；5,Rhodococcusbaikonurensis(Rhodococcus sp.H-CA8f,NZ_CP023720.1)；6,Rhodococcusmaanshanensis(Rhodococcus sp.MTM3W5.2,NZ_CP019572.1)；7,Rhodococcuspyridinivorans(Rhodococcus sp.p52,NZ_CP016819.1)；8,Rhodococcuscorynebacterioides(Rhodococcus sp.PBTS1,NZ_CP015219.1)；9,Rhodococcus cerastii(Rhodococcus sp.PBTS2,NZ_CP015220.1)；10,Rhodococcus jostii(Rhodococcus sp.S2-17,NZ_CP021354.1)；11,Rhodococcus ruber(Rhodococcus ruber SYP-A8695,MH720339)；12,Rhodococcus aetherivorans(Rhodococcus sp.WB1,NZ_CP015529.1)；13,Rhodococcusnanhaiensis(Rhodococcus sp.WMMA185,NZ_CP017014.1)；14,Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.YL-1,NZ_CP017299)；15,Bacillus halodurans ectB(ABP52052.1)；16,Chromohalobacter sp.NJS-2ectB(ABO87372.1)；17,Halobacillus halophilus DSM2266ectB(ABX39524.1)；18,Halomonas elongata DSM 3043ectB(CAA09484.1)；19,Methylobacter alcaliphilus ectB(AAY96771.1)；20,Methylophaga alcalica M8ectB(ABY40745.1)；21,Nesterenkonia halobia DSM 20541ectB(ABS82495.1)；22,Nocardiopsis gilva YIM 90087ectB(ASU82344.1)；23,Prauserella alba YIM90005ectB(AEJ36141.1)；24,Streptomyces pactum ACT12ectB(AMY60489.1)；25,Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2ectB(ANV28160.1)；
C,ectC蛋白序列比对结果；1,Rhodococcus biphenylivorans(Rhodococcussp.2G,NZ_CP018063.1)；2,Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.008,NZ_CP012749.1)；3,Rhodococcus cerastii(Rhodococcus sp.B7740,NZ_CP010797.1)；4,Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.BH4,NZ_CP014941.1)；5,Rhodococcusbaikonurensis(Rhodococcus sp.H-CA8f,NZ_CP023720.1)；6,Rhodococcusmaanshanensis(Rhodococcus sp.MTM3W5.2,NZ_CP019572.1)；7,Rhodococcuspyridinivorans(Rhodococcus sp.p52,NZ_CP016819.1)；8,Rhodococcuscorynebacterioides(Rhodococcus sp.PBTS1,NZ_CP015219.1)；9,Rhodococcus cerastii(Rhodococcus sp.PBTS2,NZ_CP015220.1)；10,Rhodococcus jostii(Rhodococcus sp.S2-17,NZ_CP021354.1)；11,Rhodococcus ruber(Rhodococcus ruber SYP-A8695,MH720339)；12,Rhodococcus aetherivorans(Rhodococcus sp.WB1,NZ_CP015529.1)；13,Rhodococcusnanhaiensis(Rhodococcus sp.WMMA185,NZ_CP017014.1)；14,Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.YL-1,NZ_CP017299)；15,Bacillus halodurans ectC(ABP52053.1)；16,Chromohalobacter sp.NJS-2ectC(ABO87373.1)；17,Halobacillus halophilus DSM2266ectC(ABX39525.1)；18,Halomonas elongata DSM 3043ectC(CAA09485.1)；19,Methylobacter alcaliphilus ectC(AAY96772.1)；20,Methylophaga alcalica M8ectC(ABY40746.1)；21,Nesterenkonia halobia DSM 20541ectC(ABS82496.1)；22,Nocardiopsis gilva YIM 90087ectC(ASU82345.1)；23,Prauserella alba YIM90005ectC(AEJ36140.1)；24,Streptomyces pactum ACT12ectC(AMY60490.1)；25,Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2ectC(ANV28161.1).
图2不同盐浓度下菌体可产生相容性物质四氢嘧啶。
A，不同盐浓度下细胞内四氢嘧啶含量；B，不同盐浓度下细胞外四氢嘧啶含量；C,菌体产生的四氢嘧啶HPLC检测结果。
图3不同浓度四氢嘧啶对菌体生物量的影响。
图4四氢嘧啶对冻干菌体萌发速率及生物量的影响。
图5四氢嘧啶对菌体生长的影响。
A,四氢嘧啶对菌落形态的实验结果；B，四氢嘧啶对菌体生长速度及生物量的影响结果。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限制。
如下实施例中：
次级代谢产物预测平台为：
https://antismash.secondarymetabolites.org/#！/start；
红球菌属全基因组数据平台为：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/13525？；
基因比对软件为：BioEdit Sequence Alignment Editor version 7.0.5.3；
发酵培养基配方(l-1)：4.0g酵母浸粉，2.0g麦芽粉，4.0g葡萄糖，复合维生素少许，1.0g盐,1000ml蒸馏水；
固体培养基：如上培养基配方添加20.0g琼脂即为固体培养基；
相容性物质采用四氢嘧啶；
实验菌株采用Rhodococcus ruber SYP-A8695。
实施例1红球菌属微生物相容性物质四氢嘧啶合成基因簇的发现及比对
(1)在红球菌属基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/13525？)中寻找到13株已报道全基因组序列的菌株:Rhodococcusbiphenylivorans(Rhodococcus sp.2G,NZ_CP018063.1),Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.008,NZ_CP012749.1),Rhodococcus cerastii(Rhodococcus sp.B7740,NZ_CP010797.1),Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.BH4,NZ_CP014941.1),Rhodococcus baikonurensis(Rhodococcus sp.H-CA8f,NZ_CP023720.1),Rhodococcusmaanshanensis(Rhodococcus sp.MTM3W5.2,NZ_CP019572.1),Rhodococcuspyridinivorans(Rhodococcus sp.p52,NZ_CP016819.1),Rhodococcuscorynebacterioides(Rhodococcus sp.PBTS1,NZ_CP015219.1),Rhodococcus cerastii(Rhodococcus sp.PBTS2,NZ_CP015220.1),Rhodococcus jostii(Rhodococcus sp.S2-17,NZ_CP021354.1),Rhodococcus ruber(Rhodococcus ruber SYP-A8695,MH712435),Rhodococcus aetherivorans(Rhodococcus sp.WB1,NZ_CP015529.1),Rhodococcusnanhaiensis(Rhodococcus sp.WMMA185,NZ_CP017014.1),Rhodococcus qingshengii(Rhodococcus sp.YL-1,NZ_CP017299)；对13株已报道全基因组序列的红球菌进行次级代谢产物分析，发现13株已报道全基因组序列的红球菌均具有相容性物质四氢嘧啶合成基因ectABC。
(2)获取13株红球菌四氢嘧啶合成基因簇，分别与已知四氢嘧啶合成基因簇进行氨基酸水平比对，发现13株红球菌的四氢嘧啶合成基因簇与已知的可产生四氢嘧啶的合成基因ectABC蛋白质相似度分别达到68.48％,86.46％和84.78％(图1)，说明红球菌属类微生物可能具有四氢嘧啶合成基因。
实施例2以一株赤红球菌(Rhodococcus ruber SYP-A8695,MH712435)为例，说明不同盐浓度下，红球菌属类微生物可产生四氢嘧啶。
(1)分别配制含有0％，5％，10％，15％，20％NaCl的液体培养基，接种等量菌体于液体培养基中，28℃温度下培养，制备菌体发酵液；
(2)四氢嘧啶HPLC检测样品准备。
取菌体发酵液，11000rpm·min-1离心10min。
细胞外四氢嘧啶检测样品：菌体发酵液离心的上清液，可直接用于液相检测；
细胞内四氢嘧啶检测样品：即菌体发酵液离心的沉淀部分使用100mmol·l-1pH7.2磷酸盐缓冲液洗涤三次，将洗涤后的菌体分散在2ml 80％(v/v)乙醇溶液中，室温200rpm·min-1震摇过夜提取，11000rpm·min-1离心10min，取上清液备检；
(3)HPLC检测。
液相条件：流速1.0ml·min-1，柱温35℃，流动相乙腈/水(20/80，V/V)，检测波长210nm。
结果表明该菌株在NaCl压迫下可产生四氢嘧啶，不存在盐压迫时则不产生四氢嘧啶；随着培养基盐浓度的增高，细胞外的四氢嘧啶总量升高(图2)。
实施例3以赤红球菌为例，说明不同浓度四氢嘧啶，具有提高红球菌属类微生物的生物量的作用
(1)使用无菌双蒸水分别配制100mmol·l-1的四氢嘧啶，使用无菌0.22μm滤膜过滤四氢嘧啶溶液于无菌EP管中，4℃保存，备用；
(2)分别配制含有浓度为0mmol·l-1，5mmol·l-1，10mmol·l-1，15mmol·l-1，20mmol·l-1，30mmol·l-1，40mmol·l-1，50mmol·l-1，60mmol·l-1的四氢嘧啶液体培养基，接种等量菌体于含有15％NaCl的固体培养基上，适宜温度下培养5d；
(3)测定各培养基中的菌体干重。实验结果表明，当四氢嘧啶浓度为10-20mmol·l-1范围内菌体干重达到最大值；SYP-A8695最适的四氢嘧啶含量为15mmol·l-1时菌体干重达0.8g CDW，如图3所示。
实施例4以赤红球菌为例，说明在最适四氢嘧啶浓度下具有促进冻干菌体萌发速率的作用
(1)分别配制含有浓度为15mmol·l-1的四氢嘧啶固体培养基，接种等量菌体于固体培养基上，28℃下培养5d；
(2)取等量菌体制成牛奶冻干保藏管，4℃保存五个月；
(3)取制得的牛奶冻干管，于冻干管中加入500μl无菌生理盐水溶解，取50μl冻干管中的水溶液，接种于50ml液体培养基中测定菌体的生长曲线，观察相容性物质四氢嘧啶对冻干保藏菌生长速度及生物量的影响。实验结果表明在含有四氢嘧啶的条件下对菌体进行培养，经冻干保存后更有利于菌体的复苏，使菌体的复苏量增大、复苏时间缩短，维持菌体的遗传稳定性，如图4。
实施例5以赤红球菌为例，说明四氢嘧啶具有促进菌体生长的作用
(1)配制含有15％NaCl的固体培养基和液体培养基，灭菌后放冷至60℃左右，加入四氢嘧啶溶液，使四氢嘧啶的终浓度为15mmol·l-1，备用；
(2)接种等量菌种于上述培养基中，固体培养基28℃培养5d，观察菌体菌落形态；测定菌体在液体培养基中的生长曲线。说明四氢嘧啶可使菌体在盐压迫下生长速度加快、生物量提升，维持菌体菌落正常形态，如图5。

Claims (10)

1.提高红球菌属菌种生长速度和防止红球菌退化的方法，其特征在于，在含有红球菌属类微生物的环境中添加嘧啶类或氨基酸类相容性物质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
(1)使用超纯水溶解相容性物质，得到相容性物质溶液，过滤除菌；
(2)将活化好的红球菌属菌株接入到发酵培养基中，混匀；
(3)将步骤(1)中的相容性物质溶液加入到步骤(2)中的发酵培养基中，观察菌株的生长曲线和形态特征。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的相容性物质为四氢嘧啶、羟基四氢嘧啶、甲硫氨酸、组氨酸中的一种或几种。
4.如权利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述的相容性物质的浓度为10～60mmol·l-1。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有红球菌属类微生物的环境中可以含有高渗盐。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的高渗盐选自：
NaCl、NaSO4、KCl中的一种或几种，其浓度为：5％-20％。
7.如权利要求1-6中任何一项所述的方法，其特征在于，所述的红球菌属菌种为Rhodococcus biphenylivorans,Rhodococcus qingshengii,Rhodococcus cerastii,Rhodococcus qingshengii,Rhodococcus baikonurensis,Rhodococcus maanshanensis,Rhodococcus pyridinivorans,Rhodococcus corynebacterioides,Rhodococcuscerastii,Rhodococcus jostii,Rhodococcus ruber,Rhodococcus aetherivorans,Rhodococcus nanhaiensis,Rhodococcus qingshengii。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的相容性物质通过如下方法获得：
(1)对红球菌属类微生物进行基因组比对，根据比对结果确定红球菌属菌株具有相容性物质的生物合成基因簇；
(2)以红球菌属菌株为实验对象，进行发酵培养和高盐胁迫性实验，确定菌株适宜的相容性物质需求浓度；
(3)在最适的相容性物质四氢嘧啶浓度下，通过比较高盐浓度下菌株的生长曲线和形态特征，发现可以提高红球菌属菌株生长速度，并能维持菌体的正常形态、防止红球菌退化的相容性物质。
9.嘧啶类或氨基酸类相容性物质在提高红球菌属菌种生长速度和防止红球菌退化中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的相容性物质为四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶。
CN201811338020.4A 2018-11-12 2018-11-12 提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法 Pending CN109517780A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811338020.4A CN109517780A (zh) 2018-11-12 2018-11-12 提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811338020.4A CN109517780A (zh) 2018-11-12 2018-11-12 提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109517780A true CN109517780A (zh) 2019-03-26

Family

ID=65774297

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811338020.4A Pending CN109517780A (zh) 2018-11-12 2018-11-12 提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109517780A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234634A (zh) * 2021-05-31 2021-08-10 辽宁大学 一种食醚红球菌及其在降解萘、蒽、菲、芴中的应用
CN117721058A (zh) * 2023-07-19 2024-03-19 山东福瑞达生物科技有限公司 低pH发酵乳酸链球菌素的发酵培养基及方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103130317A (zh) * 2013-03-04 2013-06-05 大连海事大学 一种提高微生物絮凝剂活性的方法
CN104293842A (zh) * 2014-10-21 2015-01-21 镇江拜因诺生物科技有限公司 一种利用醋糟废弃物发酵生产油脂的方法
CN104372042A (zh) * 2014-10-21 2015-02-25 镇江拜因诺生物科技有限公司 一种促进红球菌提高木质素转化率的方法
CN106754504A (zh) * 2016-12-19 2017-05-31 大连海事大学 一种高盐含氮废水抗逆协助脱氮方法
US20180282716A1 (en) * 2011-06-07 2018-10-04 Mitsubishi Chemical Corporation Nitrile hydratase

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180282716A1 (en) * 2011-06-07 2018-10-04 Mitsubishi Chemical Corporation Nitrile hydratase
CN103130317A (zh) * 2013-03-04 2013-06-05 大连海事大学 一种提高微生物絮凝剂活性的方法
CN104293842A (zh) * 2014-10-21 2015-01-21 镇江拜因诺生物科技有限公司 一种利用醋糟废弃物发酵生产油脂的方法
CN104372042A (zh) * 2014-10-21 2015-02-25 镇江拜因诺生物科技有限公司 一种促进红球菌提高木质素转化率的方法
CN106754504A (zh) * 2016-12-19 2017-05-31 大连海事大学 一种高盐含氮废水抗逆协助脱氮方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALVAREZ,HM 等: "Physiological and morphological responses of the soil bacterium Rhodococcus opacus strain PD630", 《FEMS MICROBIOLOGY ECOLOGY》 *
JUSTIN C LEBLANC 等: "Global Response to Desiccation Stress in the Soil Actinomycete Rhodococcus jostii RHA1", 《COMPARATIVE STUDY》 *
沈娥 等: "一株耐盐苯酚降解菌的分离、鉴定及耐盐机制研究", 《环境科学学报》 *
胡鑫 等: "一株烃降解菌的分离鉴定及耐盐机制", 《科学技术与工程》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113234634A (zh) * 2021-05-31 2021-08-10 辽宁大学 一种食醚红球菌及其在降解萘、蒽、菲、芴中的应用
CN117721058A (zh) * 2023-07-19 2024-03-19 山东福瑞达生物科技有限公司 低pH发酵乳酸链球菌素的发酵培养基及方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113264987B (zh) 具有抗真菌和清除自由基活性的环色-苏-缬-异亮-亮肽及制备方法
CN111018954B (zh) 具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽及制备方法
CN113307848B (zh) 具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-异亮-亮肽及制备方法
CN101597578B (zh) 一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法
Wang et al. Isolation of a novel alginate lyase‐producing Bacillus litoralis strain and its potential to ferment Sargassum horneri for biofertilizer
CN105602863B (zh) 一株高产脂肽抗生素和聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢杆菌菌株
CN107118973B (zh) 一种利用微生物生产对羟基苯甲醛的方法
CN110734938A (zh) 枯草芽孢杆菌YB18及其在发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用
CN106701627A (zh) 一种高产褐藻胶裂解酶的海洋弧菌及其应用
CN109517780A (zh) 提高红球菌属类微生物生长速度和防止菌种退化的方法
Jiang et al. Production potential of water-soluble Monascus red pigment by a newly isolated Penicillium sp
CN112080435A (zh) 一株淡紫紫孢菌及其在降解鸡毛中的应用
CN105695340A (zh) 一种米曲霉及其应用
CN103374537B (zh) 一种制备恩拉霉素的方法及其生产菌株
CN108277186B (zh) 一种作为农药表面活性剂的地衣芽孢杆菌及其应用
CN102061278A (zh) 一种食甲基菌mp688及其应用
CN109022318A (zh) 枯草芽孢杆菌l1及其在降解林可霉素菌渣中残留林可霉素的应用
CN102102095A (zh) 一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法
CN101165172B (zh) 一种重组甲基营养杆菌及其应用
CN104004693B (zh) 一种短小芽孢杆菌及其在控制白酒中土臭味的应用
CN104087526B (zh) 一种利用地衣芽孢杆菌控制白酒中土臭味的方法
CN103333912B (zh) 在Pichia pastoris中组成型表达菌丝霉素衍生物MP1102的方法
CN107267411B (zh) 一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依赖型产生菌及其发酵方法
CN102965310B (zh) 申氏杆菌及其在微生物降解对乙酰氨基酚中的应用
CN104830734A (zh) 一株费氏丙酸杆菌菌株及其发酵生产细菌素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190326

RJ01 Rejection of invention patent application after publication