CN110734938A - 枯草芽孢杆菌YB18及其在发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用 - Google Patents

枯草芽孢杆菌YB18及其在发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了枯草芽孢杆菌YB18及其在发酵生产高分子量聚γ‑谷氨酸中的应用，保藏编号为CGMCC No.17642，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏日期为2019年4月28日。上述应用为将所述枯草芽孢杆菌YB18以白酒副产物黄水为基质经液态深层发酵合成高分子量的聚γ‑谷氨酸。本发明筛选培育出的株枯草芽孢杆菌YB18可以利用白酒副产物黄水经液态深层发酵合成高产值的γ‑PGA，可以使白酒产业的副产物资源化利用，得到一高产值新产品γ‑PGA，有利于进一步提高白酒产业的效益。

Description

枯草芽孢杆菌YB18及其在发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中 的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地讲，涉及一种以黄水为基质进行微生物发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸的应用方法及其微生物。
背景技术
聚γ-谷氨酸(Polyγ-glumatic acid，以下简称γ-PGA)是一种可由微生物发酵合成，由D-和L-谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基形成的生物可降解无毒害的阴离子高分子量均聚物。γ-PGA既可以以不溶于水的酸性形式存在，也可以以水溶性的各种盐类形式(Na+、Mg2+、K+、NH4+或者Ca2+)存在，具有很好的生物相容性和可降解性，与其衍生物可广泛的应用于各个领域，有很大的商业价值。
1)γ-PGA在食品工业上的应用：γ-PGA在食品中可用于新型的食品添加剂、抗冻剂、矿质吸收促进剂、除涩剂、稳定剂等。
2)γ-PGA在医药领域的应用：不同分子量的γ-PGA可用作不同的药物缓释剂，由γ-PGA和L-苯丙氨酸合成的纳米粒子(γ-PGA-Phe NPs)有治疗视网膜疾病中的可能性，壳聚糖/γ-PGA PECs可以有效的抑制炎症细胞，γ-PGA聚合的高分子材料可用于药品的包装膜，可降解手术线等。
3)γ-PGA在环保领域的应用：γ-PGA可与多种有害物质发生相互作用，利用γ-PGA与这些污染物之间的黏附浓缩作用机制可对被污染的环境进行修复。如利用γ-PGA吸水与土壤结合，能提高土壤吸湿能力、通风性、保肥性能，在大规模改造荒山、沙漠方面能发挥积极作用。γ-PGA能吸收农药和化肥，防止流失并缓慢释放，改善作物栽培条件、提高肥料的利用率。γ-PGA作为生物絮凝剂治理水污染，可以被生物降解，长期使用也会对环境造成二次污染。
4)γ-PGA在农业领域的应用：γ-PGA作为吸水树脂、农药缓释劍、肥料包埋材料等应用于农业领域时，可表现出更好的生物相容性、超高的吸水性、良好的生物可降解性，可有效吸水保湿，改良土壤，抑制肥料或者农药的成分快速分解或流失，起到很好的缓释作用。
5)γ-PGA在工业领域的应用：利用γ-PGA聚合成高分子材料此类聚合物性质类似于塑料，可以用来制造皮革、纤维、食品包装膜等，具有适合的强度、透明度和较好弹性。
在传统白酒生产过程中，经微生物分解代谢后产生的大量游离水，这些水将酒醅中的酸、可溶性淀粉、酵母溶出物、还原糖、单宁、酒精及香味前体物质溶出，再与酒醅中未被微生物所利用的水逐渐沉降，最后慢慢沉积在窖池底部而形成棕褐色、呈流体状的液体，这种液体被称为之黄水。作为浓香型白酒酿造过程中的副产物之一，黄水又称黄浆水，含有醇类、酸类、醛类、酯类等呈香呈味物质，还含有经长期驯化的有益微生物、糖类物质、含氮化合物和少量的单宁及色素等有机物。
黄水的综合利用，不仅可以适当解决白酒行业头疼的“污染源”，还能有效提高经济和社会效益。目前，对黄水的综合利用主要有两条途径：一是用于提高产酒质量；二是用于开发新产品。促进窖泥老熟、进行人工培窖、窖池养护，拌糟醅二次发酵是黄水提高产酒质量的主要应用措施，另外还可以利用其中的有益微生物添加到大曲中做成强化大曲，采用酯化反应制得酯化液，用来勾调低档白酒，提高酒中的香味成分含量，增强酒体自然协调的浑厚感，从而提高低档白酒的品质。利用黄水中的有机营养物，开发的新产品有食醋、乳酸钙、丙酸、酱油等。
现有技术中并没有公开采用微生物对黄水进行发酵制备γ-PGA的相关技术方案。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的问题，提供一种利用白酒副产物黄水发酵合成高分子量的聚合物γ-PGA的应用方法及其微生物，不仅可以使白酒产业的副产物资源化利用，同时得到一高产值新产品γ-PGA。
本发明的一方面提供了枯草芽孢杆菌YB18，保藏编号为CGMCC No.17642，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，保藏日期为2019年4月28日。
本发明的另一方面提供了上述所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用。
根据本发明枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用的一个实施例，将所述枯草芽孢杆菌YB18以白酒副产物黄水为基质经液态深层发酵合成高分子量的聚γ-谷氨酸，其中，所述黄水的预处理方法为利用碱液调整pH至4～8。
根据本发明枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用的一个实施例，将斜面培养基上的枯草芽孢杆菌YB18转接至液体种子培养基中，在20～45℃、100～300r/min下震荡恒温培养10～24h后得到液体种子。
根据本发明枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用的一个实施例，所述斜面培养基的配方包括：蛋白胨5.0～15.0g/L、牛肉粉1.0～10.0g/L、氯化钠5.0～15.0g/L和琼脂15.0～20.0g/L，pH值为6.5～7.4。
根据本发明枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用的一个实施例，所述液体种子培养基的配方包括：黄水0.2～0.8L/L、蛋白胨1.0～10.0g/L、玉米糖化液还原糖含量2.0～100.0g/L和NaCl 2～15.0g/L，pH值为4～8。
根据本发明枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用的一个实施例，将液体种子按1～10％(v/v)接种量接入发酵培养基中，在20～45℃、100～300r/min下震荡恒温培养10～100h后经后处理得到高分子量聚γ-谷氨酸。
根据本发明枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用的一个实施例，所述发酵培养基的配方包括：黄水0.2～0.8L/L、玉米糖化液还原糖含量2.0～100.0g/L、味精5～100g/L、氯化钠2.0～15.0g/L、K2HPO4 0.1～10.0g/L，pH值为4～8。
根据本发明枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用的一个实施例，所述后处理包括依次进行的稀释、离心、沉淀、溶解和冷冻干燥。
本发明的再一方面提供了上述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用所制得的高分子量聚γ-谷氨酸，其分子量为90～130Da。
本发明筛选培育出的株枯草芽孢杆菌YB18可以利用白酒副产物黄水经液态深层发酵合成高产值的γ-PGA，不仅可以使白酒产业的副产物资源化利用，同时得到一高产值新产品γ-PGA，有利于进一步提高了白酒产业的效益。
附图说明
图1示出了实施例中所得γ-PGA样品的紫外扫描分析图谱。
图2示出了实施例中所得γ-PGA样品的红外扫描分析图谱。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
根据本发明的示例性实施例，本发明首先筛选得到了一株枯草芽孢杆菌YB18(Bacillus subtilis YB18)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，邮政编码：100101，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.17642，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏时间为2019年4月28日。
首先对菌株的筛选方法进行具体说明。
1、样品处理
在超净工作台上，用小勺挖取一勺纳豆食品或吸取适量黄酱水于灭菌装有玻璃珠及50ml无菌水的250ml三角瓶中，用封口膜封口，置于30～37℃恒温振荡器中l0～30min。取上述处理过的样品1mL接种到装有50mL基础培养基250mL三角瓶中于30～37℃恒温震荡富集培养10～24h得到富集培养液。
2、菌种分离纯化
(1)分离：取上述富集培养液1mL，采用梯度稀释方法涂布于装有选择性培养基的平板上，30～39℃恒温培养20～36h观察菌落情况并记录，选择直径大有黏性的单菌落，经多次划线分离直至得到纯菌落，作为初筛菌株。
(2)复筛：将初筛菌株接种到新鲜液体种子培养基中，30～39℃恒温震荡培养12～24h后，按1％～10％(V/V)的接种量分别接种到装有50mL灭菌基础发酵培养基的250mL三角瓶中，在30～39℃下100～250r/min恒温振荡培养24～100h。发酵实验进行三次，检测发酵液中γ-PGA浓度，γ-PGA产量高者为优良菌株，斜面保藏备用。
3.、菌种的诱变及选育
将斜面保存的复筛菌种，取一环接种于装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，在30～40℃、100～300r/min条件下恒温振荡培养12～24h，使其处于对数生长期。然后取50mL培养液，4000r/min离心10min收集菌体，再用生理盐水洗涤菌体3～4次，用生理盐水调整菌浓度，制成细胞浓度为106-8个/mL的菌悬液。取5mL菌液于90mm的培养皿中(带磁棒)，置于超净工作中的磁力搅拌器上，调整培养皿与紫外灯的距离在10～30cm处，开启磁力搅拌器，打开皿盖，在黑暗中15～30W紫外灯下诱变处理5～15min，取处理液涂布接种于选择培养基中，30～39℃恒温培养24～48小时，挑取单菌落一一转接至斜面培养基上30～39℃恒温培养24～48小时备用。
然后，将斜面培养的菌种接种于液体基础发酵培养基中，培养结束测γ-PGA浓度，发酵实验重复3次，选取γ-PGA含量高的对应菌株作为选育的优良菌株，即得到YB18菌株。然后将YB18菌株在斜面培养基上连续传代10次，对YB18菌株进行遗传稳定性实验，每次传代后，进行发酵实验，并检测其γ-PGA含量。
4、菌种鉴定
对YB18菌株菌种进行细胞形态观察及生理生化特征实验，该菌株细胞形态为杆状、革兰氏染色阳性、课形成芽孢、孢囊不膨大，接触酶阳性、氧化酶阳性，能够利用α-D-葡萄糖、明胶、D-麦芽糖、D-果糖-6-磷酸、D-海藻糖、D-半乳糖醛酸、半乳糖酸内酯、葡萄糖醛酰胺、β-甲基-D-葡糖苷、N-乙酰-D-葡糖胺、蔗糖、龙胆二糖、甘油、肌醇、D-甘露醇、D-山梨醇、松二塘、D-甘露糖、D-果糖、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、果胶、D-葡糖酸、粘酸、糖质酸、L-乳酸、柠檬酸、L-苹果酸、糊精、甲酸生长，不能利用D-葡萄糖-6-磷酸、D-纤维二糖、D-葡萄糖醛酸、甘氨酸-L-脯氨酸、β-羟基-D,L-丁酸、D-半乳糖、肌苷、L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-岩藻糖、D-水杨苷、水苏糖、D-棉子糖、α-D-乳糖、D-蜜二糖、乙酸、丙酸、乙酰乙酸、α-丁酮酸、α-羟丁酸、γ-氨基丁酸生长，对萘啶酸、万古霉素、林可霉素、1％乳酸钠、醋竹桃霉素、十四烷硫酸钠敏感。
对以上YB18菌株进行16S rDNA测序，结果如下：
TCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCA
鉴定结果：筛选培育得到的是一种枯草芽孢杆菌YB18(Bacillus subtilisYB18)。
本发明将上述枯草芽孢杆菌YB18应用于以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中。具体地，将枯草芽孢杆菌YB18以白酒副产物黄水为基质经液态深层发酵合成高分子量的聚γ-谷氨酸，其中，黄水的预处理方法为利用碱液调整pH至4～8。
具体发酵生产时，将斜面培养基上的枯草芽孢杆菌YB18转接至液体种子培养基中，在20～45℃、100～300r/min下震荡恒温培养10～24h后得到液体种子。
其中，斜面培养基的配方优选地包括：蛋白胨5.0～15.0g/L、牛肉粉1.0～10.0g/L、氯化钠5.0～15.0g/L和琼脂15.0～20.0g/L，pH值为6.5～7.4；液体种子培养基的配方优选地包括：黄水0.2～0.8L/L、蛋白胨1.0～10.0g/L、玉米糖化液还原糖含量2.0～100.0g/L和NaCl 2～15.0g/L，pH值为4～8。
再将液体种子按1～10％(v/v)接种量接入发酵培养基中，在20～45℃、100～300r/min下震荡恒温培养10～100h后经后处理得到高分子量聚γ-谷氨酸，其中，发酵培养基的配方优选地包括：黄水0.2～0.8L/L、玉米糖化液还原糖含量2.0～100.0g/L、味精5～100g/L、氯化钠2.0～15.0g/L、K2HPO4 0.1～10.0g/L，pH值为4～8。
该后处理可以包括依次进行的稀释、离心、沉淀、溶解和冷冻干燥，例如在发酵结束后加入2～3倍体积的蒸馏水稀释后，8000～10000r/min离心10～20min，倒出上清液，加入2～4倍体积无水乙醇沉淀，弃掉上清后加蒸馏水充分溶解，在-80℃下预冻5～6h后，在-60℃下真空冷冻干燥，得到聚γ-谷氨酸。
经检测，本发明制得的聚γ-谷氨酸具有90～130Da的高分子量。
为了使本发明实现的技术手段、发明特征、达成目的与功效易于明白了解，下面通过实施例对本发明进行进一步的详细描述。
实施例1：菌种的分离筛选
1、样品处理
在超净工作台上，用小勺挖取一勺纳豆食品或吸取适量黄酱水于灭菌装有玻璃珠及50ml无菌水的250ml三角瓶中，用封口膜封口，置于35℃恒温振荡器中20min。取上述处理过的样品1mL接种到装有50mL基础培养基250mL三角瓶中于35℃恒温震荡富集培养20h得到富集培养液。2、菌种分离纯化
(1)分离：取上述富集培养液1mL，采用梯度稀释方法涂布于装有选择性培养基的平板上，38℃恒温培养30h观察菌落情况并记录，选择直径大有黏性的单菌落，经多次划线分离直至得到纯菌落，作为初筛菌株。
(2)复筛：将初筛菌株接种到新鲜液体种子培养基中，35℃恒温震荡培养20h后，按6％(V/V)的接种量分别接种到装有50mL灭菌基础发酵培养基的250mL三角瓶中，在35℃下100～250r/min恒温振荡培养60h。发酵实验进行三次，检测发酵液中γ-PGA浓度，γ-PGA产量高者为优良菌株，斜面保藏备用。
3.、菌种的诱变及选育
将斜面保存的复筛菌种，取一环接种于装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，在35℃、200r/min条件下恒温振荡培养20h，使其处于对数生长期。然后取50mL培养液，4000r/min离心10min收集菌体，再用生理盐水洗涤菌体3次，用生理盐水调整菌浓度，制成细胞浓度为106-8个/mL的菌悬液。取5mL菌液于90mm的培养皿中(带磁棒)，置于超净工作中的磁力搅拌器上，调整培养皿与紫外灯的距离在20cm处，开启磁力搅拌器，打开皿盖，在黑暗中20W紫外灯下诱变处理10min，取处理液涂布接种于选择培养基中，38℃恒温培养36小时，挑取单菌落一一转接至斜面培养基上38℃恒温培养36小时备用。
然后，将斜面培养的菌种接种于液体基础发酵培养基中，培养结束测γ-PGA浓度，发酵实验重复3次，选取γ-PGA含量高的对应菌株作为选育的优良菌株，即得到YB18菌株。然后将YB18菌株在斜面培养基上连续传代10次，对YB18菌株进行遗传稳定性实验，每次传代后，进行发酵实验，并检测其γ-PGA含量。
4、菌种鉴定
经鉴定为一种枯草芽孢杆菌YB18(Bacillus subtilis YB18)。
实施例2：液态发酵生产γ-PGA
1.种子培养
斜面培养基上的枯草芽孢杆菌YB18转接至液体种子培养基中，在30℃、100-300r/min震荡恒温培养18h。
斜面种子培养基配方：蛋白胨10g/L、牛肉粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂18g/L，pH值为6.8；
液体种子培养基配方为：黄水0.6L/L、蛋白胨5g/L、玉米糖化液还原糖含量50g/L、NaCl 10g/L，pH值为7。
2.液态发酵产生γ-PGA
将培养成熟的液体种子按6％(v/v)接种量接入发酵培养基中，在30℃、200r/min震荡恒温培养50h。
发酵培养基配方：黄水0.5L/L，玉米糖化液还原糖含量50g/L，味精60g/L，氯化钠9g/L，K2HPO4 4g/L，pH值为5。
实施例3：发酵产物γ-PGA鉴定
发酵结束后，加入2倍体积的蒸馏水稀释后，10000r/min离心10min，倒出上清液，加入2倍体积无水乙醇沉淀，弃掉上清，加蒸馏水充分溶解后，在-80℃下预冻6h后，在-60℃下真空冷冻干燥，得到γ-PGA样品。
1.γ-PGA样品紫外扫描分析
准确称取10.00mgγ-PGA样品溶于10.00mL双蒸水中，定容至5.00mL，在波长200～450nm范围内进行紫外扫描，结果如图1所示。γ-PGA样品的最大吸收峰在216nm处，与已发表γ-PGA的特征吸收波长一致。
2.红外扫描光谱分析
取样品0.2mg，与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm-1。聚酰胺由于具有一系列特征吸收、可由红外光谱鉴定，其结果如图2所示。
波长3420cm-1处分子间氢键O-H伸缩振动(3500～3200cm-1)、1027cm-1和1152cm-1处C-O伸缩振动(1300～1000cm-1)、740.59cm-1处的O-H面外弯曲振动(769～659cm-1)均系醇和酚类的特征吸收峰，但其主要特征吸收峰为C-O和O-H伸缩振动，故可否定此类物质为醇和酚类；3420cm-1处N-H对称伸缩振动带((3500～3100cm-1))、1594cm-1和1633cm-1处C＝O的伸缩振动带(1680～1630cm-1)和N-H弯曲振动(1655～1590cm-1)、1405cm-1C-N伸缩振动(1420～1400cm-1)覆盖了酰胺类的四大特征吸收峰，由此可推断该聚合物为聚酰胺类物质γ-PGA。
3.分子量检测
将γ-PGA样品送至北京市理化分析测试中心，检测其分子量，检测结果显示其Mw为1.221×106g/mol。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川轻化工大学
<120> 枯草芽孢杆菌YB18及其在发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1420
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis
<400> 1
tcggcggctg gctcctaaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga 180
tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga 480
cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540
ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat 600
gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg 660
cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag 720
ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc 780
gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc 840
tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac 900
gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960
tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtaccgcc ctattcgaac ggtacttgtt 1020
cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080
gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140
gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gttgccttgg 1200
tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga 1260
agccaccttt tatgtttgaa ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt 1320
cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380
aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgactgca 1420

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌YB18，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.17642，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏日期为2019年4月28日。
2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用。
3.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌YB18以白酒副产物黄水为基质经液态深层发酵合成高分子量的聚γ-谷氨酸，其中，所述黄水的预处理方法为利用碱液调整pH至4～8。
4.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用，其特征在于，将斜面培养基上的枯草芽孢杆菌YB18转接至液体种子培养基中，在20～45℃、100～300r/min下震荡恒温培养10～24h后得到液体种子。
5.根据权利要求4所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用，其特征在于，所述斜面培养基的配方包括：蛋白胨5.0～15.0g/L、牛肉粉1.0～10.0g/L、氯化钠5.0～15.0g/L和琼脂15.0～20.0g/L，pH值为6.5～7.4。
6.根据权利要求4所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用，其特征在于，所述液体种子培养基的配方包括：黄水0.2～0.8L/L、蛋白胨1.0～10.0g/L、玉米糖化液还原糖含量2.0～100.0g/L和NaCl 2～15.0g/L，pH值为4～8。
7.根据权利要求4所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用，其特征在于，将液体种子按1～10％(v/v)接种量接入发酵培养基中，在20～45℃、100～300r/min下震荡恒温培养10～100h后经后处理得到高分子量聚γ-谷氨酸。
8.根据权利要求7所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方包括：黄水0.2～0.8L/L、玉米糖化液还原糖含量2.0～100.0g/L、味精5～100g/L、氯化钠2.0～15.0g/L、K2HPO40.1～10.0g/L，pH值为4～8。
9.根据权利要求7所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用，其特征在于，所述后处理包括依次进行的稀释、离心、沉淀、溶解和冷冻干燥。
10.如权利要求2至9中任一项所述枯草芽孢杆菌YB18在以黄水为基质微生物液态深层发酵生产高分子量聚γ-谷氨酸中的应用所制得的高分子量聚γ-谷氨酸，其分子量为90～130Da。
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