CN115160030A - 一种白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸有机肥中的应用 - Google Patents

一种白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸有机肥中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物肥料技术领域，具体涉及一种白酒酿造底锅水在生产含γ‑聚谷氨酸有机肥中的应用。本发明提供了白酒酿造底锅水在生产含γ‑聚谷氨酸有机肥中的应用，结果表明：本发明制备得到的有机肥γ‑聚谷氨酸的含量为22～25g/L，γ‑聚谷氨酸的分子量为0.9×106～1.87×106g/mol；有机肥中的枯草芽孢杆菌的活菌数为1.0×108～2.1×108cfu/mL，含γ‑聚谷氨酸有机肥能提高种子活力和α‑淀粉酶活性。可见，本发明的生产方法为白酒酿造废水底锅水提供了一个高值化的技术方案，制备得到了含γ‑聚谷氨酸的有机肥，解决了白酒废水底锅水的处理问题，减少了白酒厂废水处理50％以上的成本。

Description

一种白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸有机肥中的应用
技术领域
本发明属于生物肥料技术领域，具体涉及一种白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸有机肥中的应用。
背景技术
白酒生产蒸馏阶段的甑桶底部加入有助于蒸馏的使用水被称为底锅水。底锅水由于受到蒸料及蒸酒过程中酒醅和酒尾的影响，水质成分相对复杂，通常含有较多的醇类、酸类(脂肪酸、氨基酸等)、酯、醛等，直接排放会引起严重的环境污染，因此如何实现底锅水的有效处理或者高值化的综合利用是白酒企业急需解决的难题。
γ-聚谷氨酸(Polyγ-glumatic acid，γ-PGA)是一种由D-谷氨酸单体和L-谷氨酸单体组成的生物可降解无毒害的阴离子均聚物，可以作为保水剂、果蔬鲜花储藏保鲜剂、生长发育促进剂、肥料增效剂、环境抗逆剂、土壤改良剂等广泛应用于农业领域。
现有技术中关于白酒酿造底锅水的利用方面的报道较少，如采用好氧发酵和厌氧发酵工艺进行处理，达到排放标准之后直接进行排放。再如中国专利CN102321508A中报道了底锅水经过5段蒸馏提取收集蒸馏液，所得蒸馏液用作加浆水。又如中国专利号CN102633400A中报道了将底锅水过滤、沉降后得到的，沉降的糟泥作为肥料出售。现有技术中还没有关于利用白酒酿造底锅水生产含γ-聚谷氨酸液态有机肥的报道。
发明内容
本发明的目的提供一种白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸有机肥中的应用，得到的液态有机肥的γ-聚谷氨酸的含量高达25g/L，γ-聚谷氨酸的分子量高达1.02×106g/mol，为白酒酿造废水底锅水提供了一个高值化的技术方案，解决了白酒废水底锅水的处理问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸液态有机肥中的应用。
优选的，所述含γ-聚谷氨酸液态有机肥的生产方法，包含以下步骤：
将枯草芽孢杆菌在液态发酵培养基中进行液态发酵培养，得到含γ-聚谷氨酸的液态有机肥；
以每升液态发酵培养基的体积计，所述液态发酵培养基包含以下原料：750～800mL浓香型白酒酿造底锅水、200～250mL玉米糖化液、2～8g蛋白胨和1～3g磷酸二氢钾。
优选的，所述液态发酵培养基制备时浓香型白酒酿造底锅水的pH值为5.5～6.5。
优选的，所述液态发酵培养的温度为37℃，时间为48～96h，转速为100～180rpm。
优选的，所述枯草芽孢杆菌在进行液态发酵培养之前先进行活化培养得到种子液，所述活化培养温度为35～38℃，转速为100～180rpm，时间为18～24h。
优选的，所述种子液接种到液态发酵培养基中，所述接种量为液态发酵培养基体积的1～5％。
优选的，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌YB18。
优选的，所述液态发酵培养时的装液量为装液容器体积的20％。
本发明还提供了上述技术方案得到的含γ-聚谷氨酸液态有机肥，白酒酿造底锅水生产得到的有机肥中γ-聚谷氨酸的含量为22～25g/L，γ-聚谷氨酸的分子量为0.9～1.87×106g/mol。
本发明还提供了上述技术方案得到的含γ-聚谷氨酸液态有机肥在提高种子活力或提高种子α-淀粉酶活性的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸有机肥中的应用，实施例结果表明：实施例结果表明：本发明制备得到的有机肥γ-聚谷氨酸的含量为22～25g/L，γ-聚谷氨酸的分子量为0.9×106～1.87×106g/mol；有机肥中的枯草芽孢杆菌的活菌数为1.0×108～2.1×108cfu/mL，提高种子活力和α-淀粉酶活性。可见，本发明的生产方法为白酒酿造废水底锅水提供了一个高值化的技术方案，制备得到了含γ-聚谷氨酸的有机肥，解决了白酒废水底锅水的处理问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1制备的液体有机肥中γ-PGA的紫外扫描光谱图；
图2为实施例1制备的液体有机肥中γ-PGA的红外光谱检测图；
图3为应用例3中α-淀粉酶活性测定时的麦芽糖标准曲线；
图4为实施例2制备的含γ-PGA液态有机肥对高粱种子、玉米种子和水稻种子α-淀粉酶活性的影响结果。
具体实施方式
本发明提供了一种白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸液态有机肥中的应用。底锅水是白酒产业主要废水，废水处理成本高，附加值低，本发明将底锅水用于发酵生产含益生菌和γ-聚谷氨酸液态有机肥，为底锅水的高值化利用提供一个方案，解决了底锅水的环境污染问题。液态有机肥中的γ-聚谷氨酸和益生菌对作物的生长和土壤的改良均有促进作用。
在本发明中，所述含γ-聚谷氨酸液态有机肥的生产方法优选包含以下步骤：
将枯草芽孢杆菌在液态发酵培养基中进行液态发酵培养，得到含γ-聚谷氨酸的液态有机肥。
在本发明中，以每升液态发酵培养基的体积计，所述液态发酵培养基包含以下原料：750～800mL浓香型白酒酿造底锅水、200～250mL玉米糖化液、2～8g蛋白胨和1～3g磷酸二氢钾。在本发明中，所述浓香型白酒酿造底锅水和玉米糖化液的体积总和作为液态发酵培养基的体积。如无特殊要求，本发明对各组分的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可。
本发明提供的液态发酵培养基原料每升液态发酵培养基包括750～800mL浓香型白酒酿造底锅水，优选为760～790mL，更优选为780mL。所述底锅水中含有还原糖、谷氨酸等17种氨基酸；其中谷氨酸可以作为γ-聚谷氨酸合成的底物，其余氨基酸及还原糖作为枯草芽孢杆菌生长的碳氮源。本发明对所述浓香型底锅水的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的即可；本发明以浓香型底锅水结合其他原料经本发明的处理均能得到理想的含γ-聚谷氨酸液态有机肥。
本发明提供的液态发酵培养基原料每升液态发酵培养基包括200～250mL玉米糖化液，优选为210～240mL，更优选为220mL。在本发明中，所述玉米糖化液为微生物生长碳源和能源。在本发明中，所述玉米糖化液的还原糖含量优选为20％；本发明可以采用常规市售玉米糖化液也可以自行制备得到；当自行制备玉米糖化液时，所述玉米糖化液按照标准的双酶糖化工艺制备，所述制备方法优选为：按照玉米粉和水的质量体积比为1:3(g：mL)的比例，将玉米粉加入到沸腾的水中，搅拌糊化，按10～12U/g的添加量加入α-耐高温淀粉酶，保温15min后，降温至65℃左右，用盐酸调pH值至4.5左右，按200U/g的添加量加入糖化酶，60℃保温4h后，加热煮沸10min，纱布过滤除渣，低温保存备用。
本发明提供的液态发酵培养基原料每升液态发酵培养基包括2～8g蛋白胨，优选为3～8g，更优选为6～8g。在本发明中，所述蛋白胨为微生物生长提供氮源。
本发明提供的液态发酵培养基原料每升液态发酵培养基包括1～3g磷酸二氢钾，优选为1.5～3g，更优选为2～3g。在本发明中，所述磷酸二氢钾的作用为提供给微生物生长繁殖过程中需要的K与P元素，保持微生物细胞的增殖。
在本发明中，所述浓香型白酒酿造底锅水在制备液态发酵培养基之前优选调节浓香型白酒酿造底锅水的pH值为5.5～6.5，进一步优选为5.7～6.3，更优选为6。本发明中的浓香型白酒酿造底锅水pH值为3.3，呈酸性，不利于枯草芽孢杆菌的生长与代谢，调节pH值后的浓香型白酒酿造底锅水更利于枯草芽孢杆菌的生长与代谢。
本发明对调节浓香型白酒酿造底锅水的pH值的溶液没有具体要求，采用常规的调节pH值的溶液即可。本发明实施例优选采用质量分数为50％的NaOH溶液进行调节。在本发明中，所述液态发酵培养基优选采用高温灭菌的方式进行灭菌，所述高温灭菌的温度优选为121℃；所述高温灭菌的时间优选为30min。
制备好液态发酵培养基之后，本发明将所述枯草芽孢杆菌在液态发酵培养基中进行液态发酵培养，得到含γ-聚谷氨酸的液态有机肥。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌优选包括枯草芽孢杆菌YB18。所述枯草芽孢杆菌YB18保藏编号为CGMCC No.17642，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，保藏日期为2019年4月28日。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌在进行发酵之前优选先进行活化培养得到种子液。在本发明中，所述种子液的活菌数优选为1×108～1×109cfu/g。
在本发明中，所述活化培养温度优选为35～38℃，进一步优选为36～37℃，更优选为37℃；转速优选为100～180rpm，进一步优选为140～160rpm，更优选为150rpm；时间优选为18～24h，进一步优选为19～23h，更优选为20h。
本发明中所述活化培养基没有特殊限定，采用常规的活化培养基即可。在本发明具体实施例中，所述活化培养基优选为牛肉膏蛋白胨培养基，所述牛肉膏蛋白胨培养基的组分为：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉3g/L、葡萄糖20g/L、氯化钠5g/L和蒸馏水1L。
在本发明中，所述活化培养时对接种方式没有具体限定，采用常规的接种方式即可，本发明优选利用接种环从枯草芽孢杆菌斜面菌种中挑取一环转接至种子培养基进行活化培养。
本发明所述枯草芽孢杆菌活化培养完成之后，获得种子液；本发明优选将种子液优选接种到液态发酵培养基中进行液态发酵培养。在本发明中，所述接种量优选为液态发酵培养基体积的1～5％，进一步优选为1～3％，更优选为1～2％。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌在液态发酵培养基中进行液态发酵培养时温度优选为32～40℃，进一步优选为36～38℃，更优选为37℃；时间优选为48～96h，进一步优选为48～60h，更优选为48h；转速优选为100～180rpm，进一步优选为130～170rpm，更优选为150rpm。
在本发明中，所述液态发酵培养时的装液量优选为装液容器体积的20％。本发明对装液容器的来源和大小没有特殊限定，采用常规产品即可。在本发明中，所述装液容器优选为三角瓶；在本发明实施例中液态发酵培养时具体应用的为250mL的三角瓶，每个三角瓶的装液量为50mL。本发明中装液量优选为三角瓶体积的20％是为了提高液态发酵培养基中的溶解氧含量，更好的促进枯草芽孢杆菌生长繁殖和好氧发酵。
本发明还提供了上述技术方案得到的含γ-聚谷氨酸液态有机肥。本发明以白酒酿造底锅水生产得到的有机肥中γ-聚谷氨酸的含量为22～25g/L，γ-聚谷氨酸的分子量为(0.9～1.87)×106g/mol。在本发明中，所述含γ-聚谷氨酸液态有机肥属于原液，需要根据具体的用途进行处理，比如用于种子处理，需要稀释；对于特定的植物，还需要与其他组分进行配比。
本发明通过在浓香型白酒酿造底锅水加入玉米糖化液、蛋白胨和磷酸二氢钾提供枯草芽孢杆菌生长繁殖需要的碳源、氮源、K与P元素促进枯草芽孢杆菌生长繁殖，本发明在特定的液态发酵培养基组分、发酵条件、微生物菌种的共同作用下进一步提升了液态有机肥中γ-聚谷氨酸的含量和枯草芽孢杆菌活菌数，枯草芽孢杆菌活菌数达到了108cfu/mL，解决了白酒废水底锅水的处理问题，并为企业带来附加收益。培养基中添加一定量的味精可以刺激枯草芽孢杆菌发酵合成γ-聚谷氨酸，并作为合成γ-聚谷氨酸的底物，但是量太多时，会有所抑制。底锅水中含有的谷氨酸量足够激活枯草芽孢杆菌发酵合成γ-聚谷氨酸并作为部分底物，当外加味精时，由于谷氨酸含量过大，对γ-聚谷氨酸的合成可能有所抑制，所以，本发明的液态发酵培养基未添加味精。
本发明还提供了上述技术方案得到的含γ-聚谷氨酸液态有机肥在提高种子活力或提高种子α-淀粉酶活性的应用。
在本发明中，所述种子优选包括高粱种子、玉米种子或水稻种子。
在本发明中，所述含γ-聚谷氨酸液态有机肥优选稀释后应用，所述复合微生物菌剂的稀释倍数优选为220～250倍。本发明所述稀释倍数根据含γ-聚谷氨酸液态有机肥中γ-聚谷氨酸含量和稀释后需要的液态有机肥中的γ-聚谷氨酸含量进行具体调整。在本发明实施例中，液态有机肥的γ-聚谷氨酸含量为23g/L，液态有机肥稀释后γ-PGA含量为0.1g/L，稀释倍数优选为230倍。
本发明所述含γ-聚谷氨酸液态有机肥稀释后γ-PGA含量优选为0.1～0.3g/L，进一步优选为0.1～0.2g/L，更优选为0.1g/L。
在本发明中，所述种子活力优选包括根长、芽长、发芽指数或简化活力指数。
本发明优选以所述含γ-聚谷氨酸液态有机肥对种子进行浸泡处理，所述浸泡时间优选为12h。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸有机肥中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)培养基组成
活化培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，其组分为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠5g/L和蒸馏水1L。
1L液态发酵培养基的组分为：210mL玉米糖化液、5g蛋白胨、2g磷酸二氢钾和浓香型白酒酿造底锅水790mL。将配置好的1L液态发酵培养基分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶的装液量为50mL，共20个三角瓶。液态发酵培养基进行高温灭菌，高温灭菌条件为121℃，30min。配制培养基之前浓香型白酒酿造底锅水利用质量分数为50％的NaOH调节pH值至6。
(2)白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸液态有机肥中的应用
将配置好的活化培养基分装于三角瓶高温灭菌，高温灭菌条件为121℃，30min，利用接种环将枯草芽孢杆菌YB18斜面菌种接种至灭菌后的三角瓶中，于37℃、150rpm条件下摇床培养20h获得种子液，种子液的活菌数为1×108～1×109cfu/mL。
每个三角瓶液态发酵培养基的装液量为50mL，取种子液1mL，即液态发酵培养基体积的2％接种于高温灭菌后的液态发酵培养基中进行液态发酵培养，培养转速为150rpm，温度37℃，培养时间为48小时，发酵完成之后将20个三角瓶中的发酵液混合之后得到含有枯草芽孢杆菌和聚谷氨酸双重功能因子的液态有机肥。
实施例2
1L液态发酵培养基组成为：250mL玉米糖化液、6g蛋白胨、1.5g磷酸二氢钾和浓香型白酒酿造底锅水750mL。
将种子液以1％接种量接种于高温灭菌后的液态发酵培养基中进行液态发酵培养，培养转速为150rpm，温度37℃，培养时间为96h，发酵完成之后将20个三角瓶中的发酵液混合之后得到含有枯草芽孢杆菌和聚谷氨酸双重功能因子的液态有机肥。其余条件同实施例1。
实施例3
1L液态发酵培养基组成为：220mL玉米糖化液、8g蛋白胨、3g磷酸二氢钾和浓香型白酒酿造底锅水780mL。
将种子液以2％接种量接种于高温灭菌后的液态发酵培养基中进行液态发酵培养，培养转速为160rpm，温度37℃，培养时间为72h，发酵完成之后将20个三角瓶中的发酵液混合之后得到含有枯草芽孢杆菌和聚谷氨酸双重功能因子的液态有机肥。其余条件同实施例1。
对比例1
1L液态发酵培养基组成为：250mL玉米糖化液、6g蛋白胨和浓香型白酒酿造底锅水750mL。
将种子液以1％接种量接种于高温灭菌后的液态发酵培养基中进行发酵培养，培养转速为150rpm，温度37℃，培养时间为96h，发酵完成之后将20个三角瓶中的发酵液混合之后得到含有枯草芽孢杆菌和γ-聚谷氨酸双重功能因子的液态有机肥。其余条件同实施例1。
对比例2
1L液态发酵培养基组成为：6g蛋白胨、1.5g磷酸二氢钾、味精40g、氯化钠8g和浓香型白酒酿造底锅水750mL。
将种子液以1％接种量接种于高温灭菌后的液态发酵培养基中进行发酵培养，培养转速为150rpm，温度37℃，培养时间为96h，发酵完成之后将20个三角瓶中的发酵液混合之后得到含有枯草芽孢杆菌和聚谷氨酸双重功能因子的液态有机肥。其余条件同实施例1。
对比例3
用自来水代替底锅水。
1L液态发酵培养基组成为：250mL玉米糖化液、6g蛋白胨、1.5g磷酸二氢钾、味精40g、氯化钠8g和自来水750mL。
将种子液以1％接种量接种于高温灭菌后的液态发酵培养基中进行发酵培养，培养转速为150rpm，温度37℃，培养时间为96h，发酵完成之后将20个三角瓶中的发酵液混合之后得到含有枯草芽孢杆菌和聚谷氨酸双重功能因子的液态有机肥。其余条件同实施例1。
对比例4
1L液态发酵培养基组成为：250mL玉米糖化液、6g蛋白胨、1.5g磷酸二氢钾、味精40g、氯化钠8g和浓香型白酒酿造底锅水750mL。
将种子液以1％接种量接种于高温灭菌后的液态发酵培养基中进行液态发酵培养，培养转速为150rpm，温度37℃，培养时间为96h，发酵完成之后将20个三角瓶中的发酵液混合之后得到含有枯草芽孢杆菌和聚谷氨酸双重功能因子的液态有机肥。其余条件同实施例1。
应用例1
对实施例1～3和对比例1～4制备得到的液态有机肥的枯草芽孢杆菌和γ-聚谷氨酸的含量进行测定，测定方法如下：
1、γ-聚谷氨酸含量检测(CTAB沉淀法)：
标准曲线的制备：准确量取0.0200gγ-聚谷氨酸(γ-PGA)标准样品，用离子水定容至100mL，配制成200μg/mL的γ-PGA母液，然后分别取母液0.75mL、1.50mL、2.25mL、3.00mL、3.75mL、4.50mL、5.25mL和6.00mL，定容至30mL，分别与2g/L的CTAB溶液(十六烷基三甲基溴化铵溶液，用5％(w/v)的NaOH溶液配制)1:1混合，待反应3min在250nm紫外可见分光光度计下测其吸光值，以γ-PGA含量作为横坐标，其吸光度作为为纵坐标，得到其回归曲线：y＝0.0161x-0.0005，R2＝0.9943。
发酵液的测定：取适量发酵液，稀释150倍后，12000r/min离心5min，加入2mL CTAB溶液反应，经过3min反应后在250nm紫外可见分光光度计下测出其吸光值，带入标准曲线并通过换算得出发酵液中γ-PGA的含量。结果如表1所示。
2、枯草芽孢杆菌生物量的检测，采用稀释涂布，平板活菌计数法。结果见表1。
表1实施例1～3和对比例1～4制备得到的液态有机肥的枯草芽孢杆菌活菌数和γ-聚谷氨酸的含量
Figure BDA0003733096420000091
应用例2
采用紫外扫描光谱分析和红外光谱检测技术对实施例1制备的液态有机肥中γ-PGA进行鉴定。
紫外扫描光谱分析方法如下：将液态有机肥经硅藻土过滤(使得液态有机肥澄清为止)、活性炭脱色(使得液态有机肥为无色为止)，之后再进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为-20℃预冻24h，-55℃冻干48h，冷冻干燥后得到液态有机肥冻干品，准确称取液态有机肥冻干品10mg溶于蒸馏水中，最后定容至10mL，制成1mg/mL的溶液，以蒸馏水做参比，进行紫外扫描，结果见图1。根据图1可知，液态有机肥样品的最大吸收波长位于216nm处，并且只出现一个峰，与γ-PGA的特征紫外吸收波长216nm吻合。且蛋白质在280nm有典型的吸收峰，而该物质在280nm没有出现峰说明该样品没有典型的肽链结构，不属于蛋白类。
红外光谱检测方法如下：有机肥经硅藻土过滤、活性炭脱色后冷冻干燥后，取样品0.2mg，与20mg KBr(溴化钾)研磨压片制样，然后用红外光谱仪扫描样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm-1，结果见图2。根据图2可知：该液态有机肥样品在3420cm-1处的吸收峰系N-H对称伸缩振动带；1594cm-1处系酞胺基中C＝O的伸缩振动带(酞胺吸收带)，1405cm-1吸收带来源于NH弯曲和C-N伸缩振动的偶合二两者结合证明了酞胺基的存在；1080cm-1和1027cm-1处的吸收峰表明了分子结构中存在脂肪烃类CH2或CH3(弯曲振动)，低频区域1000-500cm-1处的宽吸收峰系(CH2)n(n>4)的平面摇摆振动及面内弯曲振动，通过图谱解析可知该聚合物为聚酰胺。由此推知，本发明的液态有机肥中含有γ-PGA。
应用例3
分析实施例2制备的含γ-PGA液态有机肥对种子活力和α-淀粉酶活性的影响，测定方法如下：
1、含γ-PGA液态有机肥对植物种子活力的影响
(1)种子预处理与发芽
将含γ-PGA液态有机肥稀释230倍，稀释所得液态有机肥中γ-PGA含量为0.1g/L。用稀释所得液态有机肥分别浸泡高粱种子、玉米种子和水稻种子12h，同时以清水作为空白对照组。
浸泡后，在水池中用流动的自来水冲洗干净，使其带走种子表面和培养皿上的发酵液残留。冲洗干净后培养皿中加入10毫升的清水，为种子萌发提供水分，继续盖好纱布放到培养箱中30℃培养。记录48h时培养皿中种子的发芽数，芽长以及根长，从而计算被处理种子相对发芽率、发芽系数和简化活力指数。
(2)种子发芽指标测定
种子相对发芽率(％)＝稀释后含γ-PGA发酵液液体有机肥浸泡种子发芽数/自来水浸泡种子发芽数*100％；
发芽系数＝种子相对发芽率*芽长*100；
简化活力指数＝种子相对发芽率×幼根长；
根长和茎长直接用尺子测量。
2、发芽种子α-淀粉酶活性测定
α-淀粉酶在种子萌发过程中形成的，酶活越高说明种子萌发效果越好。利用还原糖比色法测定萌发种子内α-淀粉酶的活性。
(1)酶液的提取：分别称取空白对照组和稀释后的含γ-PGA液态有机肥处理的高粱种子、玉米种子和水稻种子2g于研钵中，研磨成匀浆，倒入50mL的容量瓶中，定容至刻度线。混匀后放入摇床，提取15-20min。以3500r/min的离心机中离心20min，提取上清液备用。共6个处理，每个处理3个重复，共18个样品。
(2)淀粉酶活性的测定：每个样品设置两支对照管，两支测定管，共36支对照管，36支测定管。于每管中各加步骤(1)的酶提取酶液lmL，在70℃恒温水浴中(水浴温度的变化不应超过±0.5℃)准确加热15min，取出后迅速在冰浴中彻底冷却。在对照管和测定管中各加入1mL柠檬酸缓冲液，向两支对照管中各加入4mL 0.4M NaOH。将测定管和对照管置于40℃(士0.5℃)恒温水浴中准确保温15min再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2mL，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5min后取出，向两支测定管分别迅速加入4mL 0.4M NaOH，以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。
(3)麦芽糖的测定
①麦芽糖标准曲线的制作
取7支试管，分别加入麦芽糖标准液(1mg/mL)0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9，1.0mL。再用蒸馏水补充至1mL，摇匀后加入3,5-二硝基水杨酸溶液1mL，再次摇匀后在沸水浴中保持5min，取出冷却后用蒸馏水补充至15mL。摇匀后用分光光度计在520nm的波长下比色，记录其吸光度。以OD值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线为y＝0.6006x+0.0247，R2＝0.9629，麦芽糖标准曲线见图3。
②样品的麦芽糖含量测定
取步骤(2)中酶作用后的溶液各1毫升，再分别加入1毫升3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀，置沸水中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至15毫升，摇匀后用分光光度计在520nm的波长下比色，记录其吸光度。根据麦芽糖标准曲线进行样品对照管和测定管中麦芽糖含量的计算。
(4)α-淀粉酶活性的计算：
规定淀粉酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数(mg麦芽糖/min/g鮮重)。
α-淀粉酶活性(mg麦芽糖/min/g鮮重)＝[(A-A')×样品稀释总体积]/[样品重(g)×5]
式中：A'—a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量；
A—a-定粉酶的对照管中麦芽糖量；
样品稀释总体积为50mL；
样品重2g；
5是反应时间，单位是min。
含γ-PGA发酵液液体有机肥浸种对植物种子活力的影响的结果见表2。本发明制备的含γ-PGA发酵液液体有机肥可以提高高粱种子、玉米种子和水稻种子的根长、芽长和发芽系数。
表2含γ-PGA发酵液液体有机肥浸种对植物种子活力的影响
Figure BDA0003733096420000121
根据图3的标准曲线和测定的样品对照管和测定管的吸光度值计算得到高粱发芽种子、玉米发芽种子和水稻发芽种子酶液中a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量，再根据α-淀粉酶活性公式计算出高粱发芽种子、玉米发芽种子和水稻发芽种子α-淀粉酶活性值，高粱发芽种子、玉米发芽种子和水稻发芽种子α-淀粉酶活性的测定结果见表3和图4，可见含γ-PGA液态有机肥浸种玉米种子，可以显著提高玉米种子的α-淀粉酶活性，高粱种子的α-淀粉酶活性也有一定程度的提高，但是含γ-PGA(γ-聚谷氨酸)液态有机肥反而稍稍降低了水稻种子的α-淀粉酶活性。
表3高粱发芽种子、玉米发芽种子和水稻发芽种子的α-淀粉酶活性(单位：mg麦芽糖/min/g鮮重)
Figure BDA0003733096420000131
综上所述，本发明制备的液态有机肥γ-PGA含量高，γ-PGA可以作为保水剂、生长发育促进剂、肥料增效剂、环境抗逆剂、土壤改良剂，同时本发明的液态有机肥枯草芽孢杆菌含量高，对一些植物病虫害有防治作用，还能促进植物根系的生长。可见，本发明制备的液态有机肥应用前景广阔，在解决了白酒废水的处理问题的同时提高了白酒行业效益，具有较高的实际应用价值。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种白酒酿造底锅水在生产含γ-聚谷氨酸液态有机肥中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述含γ-聚谷氨酸液态有机肥的生产方法，包含以下步骤：
将枯草芽孢杆菌在液态发酵培养基中进行液态发酵培养，得到含γ-聚谷氨酸的液态有机肥；
以每升液态发酵培养基的体积计，所述液态发酵培养基包含以下原料：750～800mL浓香型白酒酿造底锅水、200～250mL玉米糖化液、2～8g蛋白胨和1～3g磷酸二氢钾。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述液态发酵培养基制备时浓香型白酒酿造底锅水的pH值为5.5～6.5。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述液态发酵培养的温度为37℃，时间为48～96h，转速为100～180rpm。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在进行液态发酵培养之前先进行活化培养得到种子液，所述活化培养温度为35～38℃，转速为100～180rpm，时间为18～24h。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述种子液接种到液态发酵培养基中，所述接种量为液态发酵培养基体积的1～5％。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌YB18。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述液态发酵培养时的装液量为装液容器体积的20％。
9.权利要求1～8任一项所述的应用得到的含γ-聚谷氨酸液态有机肥，其特征在于，白酒酿造底锅水生产得到的有机肥中γ-聚谷氨酸的含量为22～25g/L，γ-聚谷氨酸的分子量为(0.9～1.87)×106g/mol。
10.权利要求9所述的含γ-聚谷氨酸液态有机肥在提高种子活力或提高种子α-淀粉酶活性中的应用。
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