CN101914450B - 一种堆肥生物脱水真菌菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种堆肥生物脱水真菌菌剂及其制备方法，属于微生物发酵产品技术领域。该菌剂以草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株F12 CGMCCNo.3682为菌种，以PDA培养基为斜面培养基，液体发酵优化培养基为摇瓶菌种培养基和发酵罐培养基，经发酵、制备成液体真菌菌剂或固体真菌菌剂而获得。该菌剂接入高含水率畜禽粪便发酵10至15天后，含水量可下降10-20％，从而在堆肥制备过程中可减少辅料的添加用量，既降低了堆肥生产成本，又提高了有机肥的质量。本发明可在堆肥厂和菌剂生产企业中推广应用。

Description

一种堆肥生物脱水真菌菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵产品技术领域，尤其涉及一种用于堆肥生物脱水的真菌菌剂及其制备方法。 

背景技术

随着我国畜牧业的快速发展，全国集约化规模养殖奶牛、生猪和家禽的养殖量逐年增加。目前全国每年产生的畜禽粪便高达27亿吨，并且还有逐年增加的趋势。因此，解决好畜禽养殖污染问题，仍是农业面源污染治理和生态环境保护领域中一项十分艰巨的任务。堆肥，作为畜禽粪便资源化、无害化处理的重要技术手段之一，历来倍受国内外研究工作者及生产者的重视并广泛采用。然而，在畜禽粪便堆肥处理中，特别是猪、牛粪的高含水率是困扰堆肥快速升温发酵的难点之一。据测定非垫料或非冲洗畜禽粪便的含水量，猪粪一般在70％～80％，牛粪一般在80％～90％，鸡粪相对稍低。众多研究发现起始堆料的最适含水率在65％以下，因此要使畜禽粪便堆肥能快速发酵升温，首先降低粪便的起始含水量是至关重要的措施。但既要实现省本、高效、快速降低鲜粪中的水分，同时又要少添辅料以保持堆肥原料中的较高养分含量，是堆肥生产中的技术难点。 

常志州等(2006)研究了畜禽粪便水分特征后认为，畜禽粪便水分以三种形式存在：重力水、结合水和吸持水(吸持水即吸附水、毛细管水，占牛粪总含水率的60％～70％左右)；其中，去除重力水比较容易，因在自然状态下会缓慢渗出或蒸发；结合水属于结合态，需加热才能去除，但其所占比例最小；占比例最大部分的吸持水则较难除去，因为畜禽粪便中纤维和胶体表面的可变负电荷决 定了该水分的特征，原因可能是纤维和胶体形成致密的网状结构，而水溶性蛋白、胶体物质在网状结构中有利于水分的蓄积。因此，设法降低纤维素含量以改变其致密的网状结构，使吸持水转化为可以自然渗出的重力水，是实施畜禽粪便高效生物脱水的关键。 

国内外研究降低畜禽粪便含水率的技术与方法已较多：一是采用物理方法，通过沉淀、离心、过滤或过筛、冷冻、自然风干、直接烘干等；二是化学方法，主要有絮凝法；三是生物干燥法，即添加稻草、秸秆、树叶、木片、锯末和回流堆肥等辅料，调节新鲜粪便含水率至65％以下后，以利堆肥快速升温发酵。但这些方法都具有明显的不足之处：自然风干需要较大的场地，周期长，而且鲜猪、牛粪含胶体物较多，鲜粪表面容易结“皮”导致难以风干；絮凝法成本很高；生物干燥法不仅增加了畜禽粪便的处理成本，而且过多添加辅料会明显降低肥料的品质，而且近年来随着煤炭价格的不断上涨，大量锯末、砻糠等均被用作煤炭的能源替代材料，从而更加重了堆肥辅料的成本，因此，降低其用量是改进堆肥生产方法的迫切需要。目前，针对高含水率(≥70％)畜禽粪便生物脱水技术的研究国内外尚鲜有报道，尤其是运用纤维素分解菌、生物表面活性剂生产菌及酵母菌等，进行高含水率畜禽粪便堆肥原位高效生物脱水更是未见报道。 

发明内容

本发明目的在于，针对畜禽粪便的水分特征和现有堆肥脱水技术的缺陷，提供一种分解纤维素效率高，添加量少，生产成本低，对堆肥中高含水率畜禽粪便能快速、高效进行生物脱水的真菌菌剂；本发明的另一目的是提出该菌剂的制备方法；本发明的再一目的是提出该菌剂简单、有效的使用方法。 

本发明目的通过以下技术方案来实现。 

一种草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株F12的筛选与鉴定： 

一、菌株的采集与筛选：2009年从浙江金华、萧山、德清等地采集到18个牛粪样，以纤维素-刚果红培养基作为纤维素分解菌的初筛培养基，根据水解圈或红色沉积圈大小筛选得到15株初筛菌；再将该15株初筛菌株接入纤维素分解菌的复筛培养基中进行发酵培养，根据各菌株所产酶活力的高低进行复筛，最后获得一株产纤维素分解酶活力最高的菌株F12。 

二、菌株F12的形态特征、培养特征及基因测序： 

1.菌落形态及显微形态： 

麦芽汁培养基上生长局限，7天菌落直径22-30mm，灰绿色，薄，较平坦，菌落质地绒状；背面浅褐色；分生孢子结构大量形成，分生孢子梗壁光滑，无色，绝大多数双轮生，紧密，140-200×3.5-4.0μm；瓶梗柱状，颈部短，9.2-13×2.5-3μm；分生孢子椭圆形，壁光滑，串生，4.5-5.3×2.5-3μm；孢子易脱落。 

2、菌株F12的rRNA基因序列测定： 

包括18S rRNA片段，ITSl、5.8S rRNA、ITS2区全序列及28S rRNA序列片断 

5’-GAGGTCAACCTGGTTAAGATTGATGGTGTTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGGAAGCGGGGGGCGAGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTCAAGTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCGTTTGTGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGA-3’ 

三、菌株F12的鉴定与保藏： 

中国科学院微生物研究所根据该菌株F12的形态特征和基因测序进行分类，鉴定为草酸青霉(Penicillium oxalicum)，相似度为100％。 

草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株F12已于2010年3月20日在北京由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCCNo.3682。 

一种堆肥生物脱水真菌菌剂，该菌剂以草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株F12，CGMCC No.3682为菌种，以PDA固体培养基为斜面培养基，以由KH₂PO₄2g，(NH₄)₂SO₄ 2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 5mg，MnSO₄·H₂O 1.6mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，CoCl₂·6H₂O 1.7mg，Tween-80 1mL，麸皮和微晶纤维素按重量4∶1复合碳源20g，蒸馏水1000mL，pH4-6，配制而成的培养基为摇瓶菌种培养基和发酵罐培养基；经斜面菌种、摇瓶菌种及生产发酵罐培养制备成液体真菌菌剂，或将该剂以灭菌麸皮或草炭为吸附剂进一步制备成固体真菌菌剂而获得。 

一种堆肥生物脱水真菌菌剂的制备方法，该方法按以下步骤进行： 

(1)各级培养基的配制与吸附载体的准备，其中： 

a)斜面培养基：马铃薯蔗糖PDA固体培养基，备用； 

b)摇瓶菌种培养基：按以下组分和各组分的重量体积比配制而成：KH₂PO₄ 2g，(NH₄)₂SO₄ 2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 5mg，MnSO₄·H₂O 1.6mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，CoCl₂·6H₂O 1.7mg，Tween-80 1mL，麸皮和微晶纤维素按重量4∶1的复合碳源20g，蒸馏水1000mL，pH4-6，备用； 

c)生产发酵罐培养基：同摇瓶菌种培养基，备用； 

d)以麸皮或草炭为吸附载体，经高温灭菌、冷却至室温后，备用； 

(2)斜面菌种培养：将草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株F12 CGMCC No.3682接种于斜面培养基上，在28-32℃的培养箱中培养3-4天，取出后直接应用或放入冰箱中冷藏，保存； 

(3)摇瓶菌种扩繁：将斜面菌种制备成孢子悬液，将孢子悬液按4-6％接种量接入50ml摇瓶菌种培养基中，于28-32℃，120-220转/分摇床中，培养48-96小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，保存； 

(4)生产发酵罐培养：将生产发酵罐培养基放入发酵罐内，在罐内温度121℃，30分钟蒸汽高温灭菌后，保持罐体压力0.02-0.04MPa条件下，冷却至28-32℃；在火焰保护下通过接种阀门将步骤(3)摇瓶菌种按3-7％接种量迅速接入发酵罐内；在搅拌机转速120-220转/分，温度28-32℃，通气量4m³/h，罐压0.02-0.04MPa，pH4-6，培养96-144小时，至发酵液菌丝体鲜重为0.5g/ml以上完成培养； 

(5)液体或固体菌剂的制备：将步骤(4)发酵液装瓶，封口即为液体真菌菌剂；或将该发酵液与步骤(1)灭菌后吸附载体按重量1∶5比例拌匀，吸附，检测活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30％以下，装袋、封口，即为固体真菌菌剂。 

一种堆肥生物脱水真菌菌剂的使用方法，按以下步骤进行： 

1、将新鲜畜禽粪便与脱水真菌菌剂按重量份95-97∶5-3比备料； 

2、先取少量新鲜畜禽粪便与菌剂混匀，再将其均匀混入其余畜禽粪便之中，在室温下进行脱水发酵10-15天后，使该堆料含水量下降10-20％；若该堆料含水量已达65％以下，则直接进入第4步继续堆肥发酵； 

3、将脱水发酵预处理后含水量高于65％的堆料，通过添加锯末、砻糠等辅料，使其含水量下降至65％以下； 

4、继续堆肥发酵直至结束。 

本发明的有益效果是： 

一、本发明采用F12菌株为纤维素分解菌，经发酵制备成液体或固体菌剂，并加入堆肥中应用后，可发挥该发酵菌株快速降解纤维类底物的作用，达到畜禽粪便生物脱水的目的，为堆肥工艺改进提供了一种新的有效途径； 

二、使用本菌剂后可以加速对物料中纤维素的分解，使物料中的部分吸持水转为重力水而自然渗出，一般接入菌剂10至15天后，物料含水量可下降10-20％，从而在堆肥中可减少调节水分的辅料添加用量，这既降低了堆肥的成本，又提高了有机肥的质量； 

三、本发明制备菌剂所采用的土豆、麸皮和草炭等原料来源丰富，发酵工艺较简单，生产成本较低廉，该菌剂有效保质期在半年以上。 

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明，但以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的内容所限制。 

对所涉材料的说明： 

微晶纤维素：分析纯，国产； 

刚果红：指示剂，国产； 

蛋白胨：生化试剂，国产； 

新华滤纸：定性滤纸，国产； 

马铃薯：菜场购买； 

麸皮：面粉厂购买； 

稻草粉：田间采集； 

实施例1：(纤维素分解菌的初筛) 

1培养基 

以已有技术纤维素-刚果红培养基为初筛培养基：微晶纤维素粉2.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.5g，K₂HPO₄ 1.0g，NaCl 0.5g，刚果红0.4g，琼脂16g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌30min； 

马铃薯蔗糖固体培养基(PDA)：20％马铃薯浸出液1000ml+蔗糖20g，琼脂17g；其中，20％马铃薯浸出液的制备：称取去皮马铃薯块200g，加水1000ml煮至马铃薯块能被玻棒戳破为止，过滤，补足原来的水量； 

2试验步骤 

2.1培养基制备： 

配制纤维素-刚果红分离培养基和马铃薯蔗糖固体培养基(PDA)，制备PDA真菌斜面； 

2.2牛粪稀释液的制备 

(1)称取10g牛粪，加入100ml带有玻璃珠的无菌水后至500ml三角瓶中，振荡15分钟，即10^-1； 

(2)吸取上清液10ml，加入90ml无菌水后至500ml三角瓶中，即10^-2； 

(3)从(2)中吸取10ml，加入90ml无菌水后至500ml三角瓶中，即10^-3； 

2.3纤维素分解菌的分离 

(4)从(1)(2)(3)中分别吸取0.1ml，加入到分离培养基平板中进行涂布培养(28-30℃、3-5天)，各3个重复； 

(5)选择20-200菌落数的培养皿，挑取菌落进行斜面培养(28-30℃，3-5天)； 

2.4多个牛粪样 

(6)共18个牛粪样，每个牛粪样重复上述2.1～2.3步骤； 

2.5结果 

挑取有较大透明圈或红色沉积物的作为初筛菌株并保存于相应斜面，共分离到15株。 

实施例2：(纤维素分解菌的复筛) 

1、复筛培养基 

以已有技术纤维素分解菌培养基为复筛培养基：KH₂PO₄ 3.0g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂·2H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 7.5mg，MnSO₄·H₂O 2.5mg，ZnSO₄·7H₂O 2.0mg，CoCl₂·6H₂O 3.0mg，麸皮20.0g，蒸馏水1000mL，自然pH。 

2、酶活力的测定 

2.1酶液制备 

试验菌株摇瓶发酵液在4000r/min、4℃离心15min，上清液即为用于测定的粗酶液； 

2.2纤维素酶活(CMCase)测定 

取适当稀释的酶液0.5mL，加入1.5mL 1％(W/V)的CMC-Na溶液(溶于乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 4.8)，50℃恒温水浴30min，加入DNS1.5mL沸水浴5min，终止反应，蒸馏水定容至10mL，测定还原糖含量； 

2.3滤纸酶活(FPA)测定 

取50mg(1×6cm)新华滤纸，加入经适当稀释的酶液0.5mL，再加1.5 mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.8)，50℃恒温水浴1h，加入DNS1.5mL沸水浴5min，终止反应，蒸馏水定容至10mL，测定还原糖含量。 

以上均以100℃水浴灭活5min的粗酶液为空白对照，酶活单位均使用国际单位(IU)。即1个酶活单位定义为1mL纤维素酶液每分钟催化底物成1μmol葡萄糖所需的酶量，以IU/mL表示。 

3、试验步骤 

3.1培养基制备： 

配制纤维素分解菌复筛培养基。 

3.2发酵条件 

发酵液装量50ml/250ml三角瓶，5％接种量(孢子悬液1×10⁸cfu/mL)，30℃、200r/min、3次重复，发酵6天后测定酶活。 

4、结果： 

菌株F12的CMC酶活为52.67IU/ml，滤纸酶活为5.13IU/ml，在参于复筛的15株菌株中居首位。 

实施例3：(菌株F12产纤维素酶优化发酵条件的试验) 

1、不同碳、氮源培养基试验 

1.1液体发酵基础培养基 

液体发酵基础培养基：KH₂PO₄ 2g，(NH₄)₂SO₄ 2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O.5mg，MnSO₄·H₂O 1.6mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，CoCl₂·6H₂O 1.7mg，Tween-80 1mL，CMC-Na 20g，蒸馏水1000mL，自然pH。 

1.2试验设计 

对菌株F12进行发酵培养试验，以液体发酵基础培养基为基础培养基，分别以稻草粉、麸皮(均过60目筛)、微晶纤维素三种纤维素物质及其它的复合物为碳源替换CMC-Na，添加量均为20g/L，以0.25％硫酸铵为氮源，250mL三角瓶装入50mL液体培养基，pH自然，接种5％孢子悬液(1×10⁸cfu/mL)，28℃，200r/min，每个试验组3个重复，摇床振荡培养120小时。 

以液体发酵培养基为基础培养基，以20g/L麸皮和微晶纤维素为复合碳源，添加0.25g/L不同氮源，其他培养条件同上，摇瓶培养。 

1.3试验结果 

纤维素酶属于诱导酶，只有在以纤维素类物质为碳源时，才能产出纤维素酶，而且不同的碳源对纤维素酶有不同的诱导效应。对菌株F12不同碳源进行发酵培养试验结果如表1所示，以麸皮和微晶纤维素配制的复合碳源效果最佳，可能是因为麸皮中含有丰富的营养，促进了菌体生长，而微晶纤维素对产酶有较强的诱导作用。以麸皮作为唯一碳源的效果最差，可能是由于麸皮中含有较多的淀粉，纤维素类成分较少，分解产生的葡萄糖对纤维素酶的合成有阻遏作用。 

表1不同碳源对纤维素酶活力的影响 

碳源	浓度(g·L-1)	CMCase/(IU·mL-1)	FPA/(IU·mL-1)
				稻草粉	20	34.7	5.6
麸皮	20	18.1	2.3
				微晶纤维素	20	38.4	3.1
稻草粉+麸皮	16+4	28.8	4.0
				稻草粉+微晶纤维素	16+4	30.9	3.7

麸皮+微晶纤维素

16+4

45.5

9.2

以麸皮和微晶纤维素配制的复合碳源，测定不同氮源对产酶的影响(见表2)，总的来看，无机氮优于有机氮，铵态氮优于硝态氮，其中以硫酸铵效果最佳，尿素的效果最差，尿素为氮源产酶低可能是由于尿素分解产生的缩二脲对微生物产生了一定的毒害作用有关。 

表2不同氮源对纤维素酶活力的影响 

碳源	浓度(g·L-1)	CMCase/(IU·mL-1)	FPA/(IU·mL-1)
				尿素	2.5	15.6	3.0
蛋白胨	2.5	32.1	3.2
				硝酸钾	2.5	34.7	3.8
硝酸铵	2.5	37.3	4.0
				氯化铵	2.5	40.1	6.1
硫酸铵	2.5	45.7	9.5

2、不同初始pH培养试验 

2.1试验设计 

以液体发酵基础培养基为基础培养基，以20g/L麸皮和微晶纤维素为复合碳源，添加0.25g/L硫酸铵氮源，培养基初始pH分别调整为3、4、5、6、7、8、9，其他培养条件同实施例3中的试验1，摇瓶培养。 

2.2试验结果 

表3pH对纤维素酶活力的影响 

pH

CMCase/(IU·

FPA/(IU·mL-1)

	mL-1)
			3	26.3	3.5
4	38.1	8.1
			5	46.0	9.7
6	44.1	9.3
			7	37.9	7.3
8	30.4	5.0
			9	0	0

微生物生长过程中机体内发生的绝大多数反应是酶促反应，培养基初始pH值对微生物的生长和产酶有很大的影响，由表3可知，青霉菌株F12的最适产酶pH值在5～6之间，该菌株的CMCase和FPA表现基本一致，在pH值5～6以外，随着pH值增大或减小，CMCase和FPA均有减小的趋势，当pH值达到9时，几乎测不到酶活，说明该菌株产生的纤维素酶在pH9以上完全失活。 

3、不同接种量培养试验 

3.1试验设计 

以液体发酵基础培养基为基础培养基，以20g/L麸皮和微晶纤维素为复合碳源，添加0.25g/L硫酸铵氮源，初始pH调整为5～6，菌株F12接种量(％)分别为2、3、4、5、6、7、8，其他培养条件同实施例3中的试验1，摇瓶培养。 

3.2试验结果 

表4接种量对纤维素酶活力的影响 

接种量/％

CMCase/(IU·mL-1)

FPA/(IU·mL-1)

2	25.6	3.5
			3	31.7	6.6
4	42.3	9.0
			5	46.0	9.7
6	41.7	8.1
			7	29.2	6.4
8	25.0	5.1

接种量的大小对发酵产纤维素酶有很大影响，接种量过高会使菌种生长旺盛，迅速消耗培养基中的营养物质，且成本增加，而接种量过低会使菌种生长缓慢，不利于产酶。由表4可知，接种量在4％～6％时，培养基能为菌体提供较充足的营养，产酶效果较好。当接种量为5％时，CMCase和FPA酶活均最高，达到46.0IU/mL和9.7IU/mL。 

4、不同培养时间产酶测定 

4.1试验设计 

以液体发酵基础培养基为基础培养基，以20g/L麸皮和微晶纤维素为复合碳源，添加0.25g/L硫酸铵氮源，初始pH调整为5～6，F12接种量为5％，每24h采样测定发酵液酶活性，其他培养条件同实施例3中的试验1，摇瓶培养。 

4.2试验结果 

真菌纤维素酶是一类胞外酶，分泌过程中存在着产酶高峰期。培养时间对产纤维素酶的影响如表5所示，青霉菌株F12在前72h内酶活缓慢上升，72～120h内CMCase和FPA酶活迅速由16.5IU/mL和3.9IU/mL上升至46.2IU/mL和9.9IU/mL，产酶达到高峰，第120h之后酶活逐渐下降。 

表5培养时间对纤维素酶活力的影响 

时间/h	CMCase/(IU·m-1)	FPA/(IU·mL-1)
			24	5.1	2.2
48	11.5	3.2
			72	16.5	3.9
96	37.6	8.2
			120	46.2	9.9
144	43.7	9.5
			168	32.2	7.1
192	22.7	3.5

5、不同培养温度对纤维素活酶的影响试验 

5.1试验设计 

以液体发酵基础培养基为基础培养基，以20g/L麸皮和微晶纤维素为复合碳源，添加0.25g/L硫酸铵氮源，初始pH调整为5～6，F12接种量为5％，培养温度分别设置为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，培养120h测定发酵液酶活性，其他培养条件同实施例3中的试验1。 

5.2试验结果 

在微生物发酵过程中，温度过高和过低会引起微生物菌体中的蛋白质初步变性和抑制蛋白质的合成速度，从而影响产酶^[15]。由表6可知，温度在25～35℃之间时，酶活随温度的升高逐渐升高，当温度为35℃时，CMCase和FPA酶活均达到最高，为47.5IU/mL和11.1IU/mL。当培养温度高于35℃后，随温度的 升高，酶活急速降低，故菌株F12作为纤维素降解菌主要在堆肥前期发酵“起爆”效应过程中发挥作用。 

表6培养温度对纤维素酶活力的影响 

温度/℃	CMCase/(IU·mL-1)	FPA/(IU·mL-1)
			25	33.4	7.1
30	45.9	10.0
			35	47.5	11.1
40	28.2	6.4
			45	14.6	2.5

6、优化发酵条件 

综上所述，菌株F12的最适宜碳源为麸皮和微晶纤维素复合碳源，氮源为硫酸铵；产酶最佳培养条件为：pH值在5～6之间，接种量为5％左右，培养时间120h，培养温度30～35℃；在此条件下，该菌株发酵液的CMCase酶活达到47.5IU/mL，FPA酶活达11.1IU/mL。 

实施例4：(菌株F12脱水菌剂制备1) 

按以下步骤进行： 

(1)各级培养基的配制与吸附载体的准备，其中： 

a)斜面培养基：PDA固体培养基(同实施例1)，备用； 

b)摇瓶菌种培养基：KH₂PO₄ 2g，(NH₄)₂SO₄ 2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 5mg，MnSO₄·H₂O 1.6mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，CoCl₂·6H₂O 1.7mg，Tween-80 1mL，麸皮和微晶纤维素复合碳源(4∶1)20g，蒸馏水1000mL，pH4，备用； 

c)生产发酵罐培养基：同摇瓶菌种培养基，备用； 

d)以麸皮为吸附载体，高温灭菌冷却至室温后，备用； 

(2)斜面菌种培养：将菌株F12接种于步骤(1)斜面培养基上，在28-32℃的培养箱中培养4天，取出后直接应用或放入4-7℃冰箱中冷藏，保存； 

(3)摇瓶菌种扩繁：在无菌操作下将斜面菌种加入5ml无菌水后将真菌孢子刮下制备成“孢子悬液”；将孢子悬液按4％接种量接入50ml步骤(1)摇瓶菌种培养基中，PH4，于28-32℃，120转/分的摇床中，培养96小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，保存； 

(4)生产发酵罐培养：将步骤(1)生产发酵罐培养基放入发酵罐中，在罐内温度121℃，进行30分钟蒸汽高温灭菌后，在保压0.02-0.04MPa下冷却至28-32℃；在火焰保护下通过接种阀门将步骤(3)摇瓶菌种按3％的接种量迅速接入发酵罐内；在搅拌机转速220转/分，温度28-32℃，通气量4m³/h，罐压0.02-0.04MPa，培养144小时至发酵液菌丝体鲜重为0.5g/ml以上完成培养； 

(5)液体或固体菌剂的制备：将步骤(4)发酵液装瓶，封口即为液体真菌菌剂；或将该发酵液与步骤(1)灭菌后吸附载体麸皮按重量1∶5比例拌匀，吸附，检测活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30％以下，装袋、封口，即为固体真菌菌剂。 

实施例5：(菌株F12发酵液体菌剂制备2) 

本例中，步骤(1)摇瓶菌种培养基与生产发酵罐培养基的pH值为5；步骤(2)斜面菌种培养的时间为3.5天；步骤(3)摇瓶菌种扩繁中：孢子悬液接种量为5％，于28-32℃，170转/分的摇床中，培养72小时；步骤(4)生产发酵罐培养中：在保压0.02-0.04MPa下冷却至28-32℃；按5％的接种量接入发酵罐内；在转速170转/分，温度28-32℃，通气量4m³/h，罐压0.02-0.04MPa， 培养120小时，装瓶，即为本例的最终产品-液体真菌菌剂；其余步骤、工艺同实施例4。 

实施例6：(菌株F12发酵固体菌剂制备3) 

本例中，步骤(1)摇瓶菌种培养基与生产发酵罐培养基的pH值为6；步骤(2)斜面菌种培养的时间为3天；步骤(3)摇瓶菌种扩繁中：孢子悬液接种量为6％，于28-32℃，220转/分的摇床中，培养48小时；步骤(4)生产发酵罐培养中：在保压0.02-0.04MPa下冷却至28-32℃；按7％的接种量接入发酵罐内；在转速120转/分，温度28-32℃，通气量4m³/h，罐压0.02-0.04MPa，培养96小时，装瓶，即为本例的液体真菌菌剂产品；步骤(5)固体菌剂的制备：将步骤(4)液体真菌菌剂与灭菌后草炭按重量1∶5比例拌匀，吸附，即为固体真菌菌剂；其余步骤、工艺同实施例4。 

实施例7：(F12滤纸和稻草秆崩解试验) 

1、培养基 

滤纸或稻草秆2.0g，(NH₄)₂SO₄ 3.0g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.4g，CaCl₂·2H₂O0.4g，自来水1000ml，自然pH。 

2、菌株F12“菌剂”(实施例4、5或6产品)按5％接种量接入培养基； 

3、培养条件 

培养基装量100ml/500ml三角瓶(分别以滤纸和稻草秆作为唯一碳源)，30℃培养箱中静置，每天观察时用手摇动几次。 

4、试验结果 

第3天滤纸边缘开始溃烂，溶液中有絮状物出现，第11天时培养基中的滤纸条全部崩解为碎片；5天后，稻草秆开始软化，17天后，稻草秆变得很细碎，松散。 

实施例8：(实验室脱水试验) 

1、培养基 

种子培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，切成小块，煮沸30min，用纱布过滤，水定容至1000mL，自然pH。 

脱水用培养基：稻草粉60g，0.6％的硫酸铵水溶液230mL，自然pH。 

2、种子发酵液制备 

菌种F12接入种子培养基中，培养基装量为50ml/250ml三角瓶，重复4个，30℃，200r/min摇床培养4天，4瓶种子发酵液混合。 

3、脱水发酵条件 

培养基装量290g/500ml三角瓶，3.3％的接种量，即10mL菌液，对照加10mL蒸馏水，即原始的含水量是80％。30℃培养箱中静置培养，每天摇晃2次。每处理重复4个，培养10天。 

4.脱水量测定方法 

4.1模拟堆肥中直接流出的水量测定方法 

连续培养10天后，将各处理中的物料通过布氏漏斗过滤，滤液量为模拟堆肥中吸持水转化为重力水自由流出的水量。 

4.2模拟堆肥中过滤后离心出的水量测定方法 

将模拟堆肥过滤后的物料于4200r/min，离心20min，倒出的水分含量即为模拟堆肥中吸持水转化为重力水离心出的水量。 

4.3模拟堆肥接种青霉F12后总脱水量的测定方法 

将4.1和4.2中的处理直接流出和离心出的水量之和减去对照直接流出和 离心出的水量之和即为模拟堆肥接种青霉F12后总脱水量。 

5.结果 

5.1接种青霉F12后直接从模拟堆肥中流出的水量 

表7各处理直接流出的水量 

项目	对照1	对照  2	对照  3	对照  4	接菌1	接菌  2	接菌  3	接菌  4
									滤出的水量(g)	0.0	0.0	0.0	0.0	25.9	13.7	8.9	16.1

5.2接种青霉F12后过滤再离心从模拟堆肥中离心出的水量 

表8各处理中过滤后再离心出的水量 

项目	对照1	对照  2	对照  3	对照  4	接菌1	接菌  2	接菌  3	接菌  4
									离心出的水量  (g)	0.0	0.0	0.0	0.0	20.2	28.7	18.4	35.2

5.3青霉F12对模拟堆肥的总脱水量 

表9各处理中脱离出的水量 

由表7-表9可得到，模拟堆肥中接入青霉F12可以加速物料中纤维素的分解，从而使物料中的部分吸持水转为重力水自然渗出，物料含水量下降11.4-21.4％。 

序列表 

<110>浙江省农业科学院 

<120>一种堆肥生物脱水真菌菌剂及其制备方法 

<140>201010177075.9 

<141>2010-5-19 

<160>1 

<170>PatentIn Version 2.1 

<210>1 

<211>553 

<212>RNA 

<213>草酸青霉(Penicillium oxalicum) 

GAGGTCAACC TGGTTAAGAT TGATGGTGTT CGCCGGCGGG CGCCGGCCGG GCCTACAGAG 60 

CGGGTGACGA AGCCCCATAC GCTCGAGGAC CGGACGCGGT GCCGCCGCTG CCTTTCGGGC 120 

CCGCCCCCCG GAAGCGGGGG GCGAGAGCCC AACACACAAG CCGTGCTTGA GGGCAGCAAT 180 

GACGCTCGGA CAGGCATGCC CCCCGGAATA CCAGGGGGCG CAATGTGCGT TCAAAGACTC 240 

GATGATTCAC TGAATTCTGC AATTCACATT ACTTATCGCA TTTCGCTGCG TTCTTCATCG 300 

ATGCCGGAAC CAAGAGATCC GTTGTTGAAA GTTTTAACTG ATTTAGTCAA GTACTCAGAC 360 

TGCAATCTTC AGACAAGAGT TCGTTTGTGT GTCTTCGGCG GGCGCGGGCC CGGGGGCGGA 420 

TGCCCCCCGG CGGCCGTGAG GCGGGCCCGC CGAAGCAACA AGGTACGATA AACACGGGTG 480 

GGAGGTTGGA CCCAGAGGGC CCTCACTCGG TAATGATCCT TCCGCAGGTT CACCTACGGA 540 

AACCTTGTTA CGA    553 

Claims (2)

1.一种堆肥生物脱水真菌菌剂，其特征在于该菌剂以草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株F12，CGMCC No.3682为菌种，以PDA固体培养基为斜面培养基，以由KH₂PO₄ 2g，(NH₄)₂SO₄ 2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O0.3g，FeSO₄·7H₂O 5mg，MnSO₄·H₂O 1.6mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，CoCl₂·6H₂O1.7mg，Tween-80 1mL，麸皮和微晶纤维素按重量4∶1复合碳源20g，蒸馏水1000mL，pH4-6，配制而成的培养基为摇瓶菌种培养基和发酵罐培养基；经斜面菌种、摇瓶菌种及生产发酵罐培养制备成液体真菌菌剂，或将该剂以灭菌麸皮或草炭为吸附剂进一步制备成固体真菌菌剂而获得。

2.一种堆肥生物脱水真菌菌剂的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

(1)各级培养基的配制与吸附载体的准备，其中：

a)斜面培养基：马铃薯蔗糖PDA固体培养基，备用；

b)摇瓶菌种培养基：按以下组分和各组分的重量体积比配制而成：KH₂PO₄2g，(NH₄)₂SO₄ 2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，CaCl₂·2H₂O 0.3g，FeSO₄·7H₂O 5mg，MnSO₄·H₂O 1.6mg，ZnSO₄·7H₂O 2mg，CoCl₂·6H₂O 1.7mg，Tween-80 1mL，麸皮和微晶纤维素按重量4∶1的复合碳源20g，蒸馏水1000mL，pH4-6，备用；

c)生产发酵罐培养基：同摇瓶菌种培养基，备用；

d)以麸皮或草炭为吸附载体，经高温灭菌、冷却至室温后，备用；

(2)斜面菌种培养：将草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株F12 CGMCCNo.3682接种于斜面培养基上，在28-32℃的培养箱中培养3-4天，取出后直接应用或放入冰箱中冷藏，保存；

(3)摇瓶菌种扩繁：将斜面菌种制备成孢子悬液，将孢子悬液按4-6％接种量接入50ml摇瓶菌种培养基中，于28-32℃，120-220转/分摇床中，培养 48-96小时，取出直接应用或放入冰箱中冷藏，保存；

(4)生产发酵罐培养：将生产发酵罐培养基放入发酵罐内，在罐内温度121℃，30分钟蒸汽高温灭菌后，保持罐体压力0.02-0.04MPa条件下，冷却至28-32℃；在火焰保护下通过接种阀门将步骤(3)摇瓶菌种按3-7％接种量迅速接入发酵罐内；在搅拌机转速120-220转/分，温度28-32℃，通气量4m³/h，罐压0.02-0.04MPa，pH4-6，培养96-144小时，至发酵液菌丝体鲜重为0.5g/ml以上完成培养；

(5)液体或固体菌剂的制备：将步骤(4)发酵液装瓶，封口即为液体真菌菌剂；或将该发酵液与步骤(1)灭菌后吸附载体按重量1∶5比例拌匀，吸附，检测活菌量达0.2亿cfu/g以上、含水率控制在30％以下，装袋、封口，即为固体真菌菌剂。