CN115353982A - 高产酚酸分枝横梗霉及其在清香型小曲白酒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高产酚酸分枝横梗霉及其在清香型小曲白酒中的应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年4月29日，保藏编号为CCTCC NO：M2022526。本发明的高产酚酸分枝横梗霉，可提升清香型小曲白酒中酚酸含量84％，并一定程度上提升了白酒质量。该分枝横梗霉是从种曲中分离出来，可用于白酒生产，为提升小曲白酒品质提供了新的功能菌株。

Description

高产酚酸分枝横梗霉及其在清香型小曲白酒中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体为高产酚酸分枝横梗霉及其在清香型小曲白酒中的应用。

背景技术

酚酸是一类含有酚环的有机酸，其苯环上带有多个-OH以及-COOH，具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗癌和抗氧化等生物学功能。在饮料酒中，酚酸属于健康因子，可以发挥一定的保健效果。2007年，郑伟提出不同香型的白酒中含有不同量的酚酸，其中酱香型白酒中含量最高，主要起到呈香的作用。2016年，黄蕴利等提出白酒中含有酚酸，并且简述了其具有抗氧化，防癌，抗血小板聚集，抑制血小板血栓素A2的生成，增强前列腺素活性，镇痛等作用。2019年，王戎等使用固相萃取的前处理方法对五粮液原酒处理，对样品中的酚酸化合物或其酯类化合物进行检测。其中白酒中的酚酸含量为1489.8μg/L，酚酸酯类化合物含量为1183.9μg/L。2020年，吴子阳等采用固相微萃取结合高效液相色谱的方法对市面上浓、酱、清以及芝麻香型共29种商品酒中阿魏酸、没食子酸、对香豆酸、丁香酸和(+)-儿茶素水合物5种酚类活性物质进行了定量分析，在不同香型白酒中，5种酚类活性化合物中，对香豆酸的平均含量最高，阿魏酸的平均含量最低，除(+)-儿茶素水合物外，其余4种酚类活性化合物均在4种不同香型的商品白酒中检出。5种酚酸的总量排序为：酱香型＞清香型＞芝麻香型＞浓香型。

白酒中酚酸的来源，目前尚未开展全面系统地探究，就目前的报道来看主要来源有两个：一是直接来源于白酒的酿酒原料。酚酸广泛存在于大麦、麦麸、大米、玉米等禾谷科作物中，其中阿魏酸的含量最丰富，其它有特征代表性的酚酸包括没食子酸、对香豆酸、丁香酸、儿茶素等，这些物质通过可以通过酿造过程部分进入酒体；其次来源于发酵过程中微生物的分解作用。如高粱中含有单宁，尤其壳内含量较高。发酵过程中，单宁可以在单宁酶的作用下释放出游离的没食子酸。

近几年生产健康白酒成为热门，已发现有益健康的成分130多种。酚酸作为白酒中重要的健康成分，除了具有广泛的生理活性外，其中阿魏酸还可作为香兰素、愈创木酚等芳香物质的前体物，进一步增强酒体风味。

在白酒生产过程中，微生物发酵产生酚酸主要是通过产生阿魏酸酯酶。因为植物细胞壁中含有丰富的酚酸，它们以酯键方式与半纤维素支链形成致密网状交联结构，使植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解受到限制。而阿魏酸酯酶可以协同木聚糖酶有效降解致密网状交联结构，打断羟基化肉桂酸与糖间的酯键，从而释放出酚酸，同时促进半纤维素、木质素与纤维素的降解。目前已报道的产阿魏酸酯酶菌株大多是从土壤中筛选得到，从白酒生产过程中筛选的较少，导致白酒发酵中产阿魏酸酯酶的微生物资源仍未被充分开发。2017年，李兵等通过基因的克隆表达及密码子优化，获得了一株性能优良、高产阿魏酸酯酶的毕赤酵母工程菌，而后将该酶应用于啤酒酿造过程中，成功改善了麦汁过滤性能和抗氧化能力，并提高了小麦啤酒典型风味物质4-乙烯基愈创木酚的含量。2018年李翠翠等从黄酒麦曲中筛选得到一株高产阿魏酸酯酶的枝状枝孢霉菌，产阿魏酸酯酶活力最高可达175.4U/L，并将其添加到黄酒酿造过程中，对黄酒阿魏酸含量的提高起到了积极作用。说明在糖化或发酵过程中添加筛选的产阿魏酸酯酶菌株是提高原酒中酚酸含量的有效措施。

鉴于酚酸具有一定的健康功能，其在白酒行业中具有较好的应用潜力。因此，有必要对产阿魏酸酯酶的菌株进行筛选并利用其提升清香型小曲白酒中酚酸的含量，以达到提升白酒抗氧化等生物性能的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一株分枝横梗霉，所述分枝横梗霉(Lichtheimia sp.)M198对白酒中酚酸含量具有提升作用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022526，保藏日期是2022年4月29日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明公开的分枝横梗霉M198菌株从清香型小曲白酒种曲中分离获得。该菌株在PDA平板上培养5d的菌落形态特征是：菌丝白色且丰富，菌落质地疏松，呈棉絮状，蔓延性强。

本发明涉及的分枝横梗霉(Lichtheimia sp.)M198是按照如下方法获得的：

以实验室菌种库中保存的213株与清香型小曲白酒生产相关的真菌和细菌作为产阿魏酸酯酶筛选来源。首先通过筛选培养基进行初筛，筛选出产阿魏酸酯酶的菌株；再利用麸皮培养基对产酶菌株进行培养，培养结束后测定其阿魏酸酯酶活力，筛选出包括横梗霉(Lichtheimia sp.)M198在内的酶活高的菌株。

本发明还公开了包含分枝横梗霉M198的酿酒酒曲在清香型小曲原酒生产中的应用。所述高产酚酸分枝横梗霉经培养后接种至麸皮培养基中，分别放置在30℃-37℃的培养箱中培养，5-7天后取出在45℃烘箱中烘干水分，得到纯种麸皮菌剂；然后与桂花曲混合后制备成微生物复配曲进行发酵酿造。

纯种麸皮菌剂与桂花曲按照重量比1:5.5比例混合制备成微生物复配曲。

与现有技术相比，本发明具有如下有效效果：本发明的高产酚酸的分枝横梗霉，可提升清香型小曲白酒中酚酸含量84％，并一定程度上提升了白酒质量。该分枝横梗霉是从种曲中分离出来，可用于白酒生产，为提升小曲白酒品质提供了新的功能菌株。

附图说明

图1为实施例1绘制的标准曲线图；

图2为实施例1中阿魏酸酯酶酶活测定结果。

具体实施方式

应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一株分枝横梗霉的获取方法，包括如下步骤：

1.产阿魏酸酯酶菌株的筛选

1.1培养基的制备

①马铃薯琼脂固体培养基(PDA固体培养基)

马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

②LB固体培养基

胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

③筛选培养基

NaCl 0.3g，(NH₄)₂SO₄ 1.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，K₂HPO₄ 0.3g，琼脂粉20g，阿魏酸乙酯(称取10g溶解于30mL二甲基甲酰胺)3mL，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

④产酶培养基

在250mL三角瓶中称取10g麸皮，再加入10mL蒸馏水，于121℃灭菌30min。

⑤马铃薯葡萄糖水培养基(PDB液体培养基)

马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

⑥LB液体培养基

胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。

1.2产酶菌株平板初筛

将菌种库中保存的213株菌甘油管取出解冻后，在PDA(真菌)和LB(细菌)固体培养基上进行划线活化，分别放置在30℃与37℃培养箱中培养。培养2-3天后，挑取单菌落点在筛选培养基上，分别放入30℃与37℃培养箱中培养，观察透明圈变化。3-5天后取出，有明显透明圈的菌落为产阿魏酸酯酶的菌株(见表1)。

表1平板初筛结果

1.3分光光度法测定菌株阿魏酸酯酶酶活

将初筛阶段得到的23株产酶菌株接种至液体种子培养基中，30℃、160r/min培养48h，每瓶产酶培养基中接入1mL种子液，30℃、200r/min培养6天后进行酶活测定。

标准曲线制作：称取0.0025g阿魏酸，溶于乙醇，定容至100mL，即得0.025g/L母液，将母液分别稀释至0.0125、0.01、0.00625、0.0025、0.00125g/L，以乙醇为空白样，在320nm处测定上述溶液吸光度值，以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标制作标准曲线。

粗酶液提取：在发酵三角瓶中加入50mL磷酸缓冲液(pH 6.0)，搅拌均匀后，40℃水浴25min，过滤，滤液4℃、10000r/min离心15min，上清即为粗酶液。

酶活测定：2mL阿魏酸甲酯(0.5mmol/L)+2mL磷酸缓冲液(pH 6.0)，40℃水浴预热5min，加入1mL粗酶液，40℃反应30min后沸水浴5min终止反应，320nm处测定反应液吸光度值；粗酶液煮沸失活进行上述步骤即得空白对照。

酶活计算：在40℃、PH 6.0条件下，1mL酶液每分钟降解底物生成1μmol阿魏酸定义为一个酶活单位(U)。

标准溶液吸光度值测定结果如表2，绘制标准曲线如图1所示。

表2标准溶液吸光度值

对初筛得到的23株菌进行酶活测定，结果如图2，经测定得到四株酶活较高的菌株：M198(横梗霉)、M202(丛毛红曲霉)、B249(乳酸微球菌)和B263(芽孢杆菌)，酶活分别为16.53、55.65、13.78和13.17U/L。

2、高产酚酸菌株发酵验证

2.1微生物纯种菌剂制备

将筛选得到的4株菌分别在PDA(真菌)和LB(细菌)固体培养基上进行划线活化，分别放置在30℃与37℃培养箱中培养。培养3-4天后，在无菌操作台中将培养皿盖子打开，每个培养皿中倒入10mL无菌水，轻轻晃动培养皿使菌体/孢子与水混匀，吸取1mL菌液接种至麸皮培养基中，分别放置在30℃与37℃培养箱中培养，5-7天后取出在45℃烘箱中烘干水分。即为纯种麸皮菌剂。

2.2高产阿魏酸酯酶微生物复配曲制备

将4株纯种菌剂分别与桂花曲按照重量比1:5.5比例混合分别制备成微生物复配曲。

2.3清香型小曲白酒发酵

将高粱淘洗3次，加水没过粮食，65℃放置24小时。将浸泡好的粮食沥干水分，在灭菌锅中115℃蒸10分钟，取出后用热水浸泡5分钟，再沥干放入灭菌锅中111℃复蒸10分钟后自然冷却。

称取1kg蒸好的粮食至干净的托盘中，摊平放置冷却，分别加入1％上述制备的不同微生物复配曲，充分混合均匀后装入密封袋，敞口放置在30℃培养箱中糖化培菌24小时。然后，选择车间蒸馏后的发酵酒醅在121℃灭菌20min，冷却后称取糖化醅和灭菌酒醅各500g混合均匀(每个样品2个重复)，装入气体采集袋中进行厌氧发酵7天，即得发酵高粱样品。

2.4发酵高粱中酚酸含量检测

称取2g发酵高粱样品于50mL离心管中，加入25mL 70％乙醇，4℃提取过夜。第二天取出超声30min后，8000r/m离心10min。取上清10mL上样于HLB固相萃取小柱(规格：200mg，6mL，上柱前先用3mL甲醇和6mL1％乙酸水活化)，然后用3mL 1％乙酸-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液混匀，用0.22μm滤膜过滤后上机检测。色谱条件：C18色谱柱(4.6*250mm，5μm)，乙腈-0.1磷酸溶液梯度洗脱(见表3)，检测波长210nm，柱温30℃，进样量10μL，流速1.0mL/min。

表3梯度洗脱条件

液相色谱检测结果如表4，结果表明：M198微生物菌剂复配曲实验组与空白组(桂花曲发酵高粱)相比，酚酸含量提升了226％；M202微生物菌剂复配曲实验组与空白相比酚酸含量提升了65％；B263微生物菌剂复配曲实验组与空白相比酚酸含量提升33％；B249微生物菌剂复配曲实验组与空白相比酚酸含量提升0.85％。综上所述，M198微生物菌剂复配曲在白酒酿造过程中产生的酚酸含量最高，进一步对该菌剂发酵后的酒醅进行蒸酒，探究其对原酒中酚酸含量的影响。

表4酒醅样品酚酸含量

2.5清香型小曲原酒蒸馏

在蒸酒的锥形瓶内加入约500mL水，倒入发酵好的酒醅，将装有样品的锥形瓶塞入连接冷凝管的瓶塞，放置在电炉上加热，待看到导管中有酒液馏出时用量筒接取100mL酒液。

2.6原酒中酚酸含量及主要质量指标检测

酚酸含量检测：量取10mL样品上样于HLB固相萃取小柱，后续操作同2.4。

气相色谱检测：将原酒准确移取1mL于2mL样品瓶中，加入10μL三内标使用液(叔戊醇(IS1)：17028.1mg/L，乙酸正戊酯(IS2)：16864mg/L，2-乙基己醇(IS3)：12104.2mg/L)，盖上瓶盖，摇匀，采用气相色谱法测定原酒中各成分含量。色谱条件为：Agilent HP6890高效气相色谱仪，检测器FID，CP-WAX毛细管色谱柱(50m*0.2μm*0.25mm)。升温程序：柱温40℃保持8min，以5℃/min升至150℃。进样口温度250℃，检测器温度260℃，空气、氢气流速比300:30，载气为氮气，分流比30:1，柱流量1.0mL/min，进样方式：自动进样。

检测结果显示(见表5)，菌株M198制备成的微生物菌剂复配曲发酵后的清香型小曲原酒中，酚酸含量达到103.48μg/L，与现有对照组相比提升84％；且总酯含量提升43％，实现了本发明提升原酒酚酸含量目的。

表5酒样中酚酸含量及主要质量指标

上述实施例仅是对本发明的优选方式进行举例说明，并不包括所有的发明实施范围。本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求界定的范围为准。

Claims (8)

1.一种分枝横梗霉(Lichtheimia sp.)M198，其特征在于，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年4月29日，保藏编号为CCTCC NO：M2022526。

2.权利要求1所述分枝横梗霉在提升白酒酚酸含量中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述白酒为清香型小曲白酒。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，将包含有分枝横梗霉的微生物菌剂与桂花曲混合后进行发酵酿造。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包含有分枝横梗霉的微生物菌剂与桂花曲按照重量比1:5.5比例混合制备成微生物复配曲，用于发酵酿造。

6.一种微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1中的保藏编号为CCTCC NO：M2022526的分枝横梗霉(Lichtheimia sp.)M198。

7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的制备方法为：将高产酚酸分枝横梗霉经培养后接种至麸皮培养基中，放置在30℃-37℃的培养箱中培养，5-7天后取出在45℃烘箱中烘干水分，即得。

8.一种清香型小曲白酒，其特征在于，其由包含权利要求1中的保藏编号为CCTCC NO：M2022526的分枝横梗霉(Lichtheimia sp.)M198的微生物菌剂酿造而成。

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