CN115093981B - 一种在酸胁迫环境下提升产酒酵母产酒性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及酿酒技术领域，尤其是一种在酸胁迫环境下提升产酒酵母发酵性能的方法，所述方法包括将库德里阿兹威氏毕赤酵母与所述产酒酵母进行混合培养，所述产酒酵母包括：酿酒酵母和/或拜耳接合酵母，所述方法包括如下步骤：测定所述产酒酵母所在培养基中的糖含量；当测定的所述糖含量的重量百分比为0.5％‑2.5％时，将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母加入进行混合发酵培养。所述方法使得库德里阿兹威氏毕赤酵母菌在一个较低糖含量的酸胁迫环境下高效降解乳酸，提高了降乳酸效果，减少了库德里阿兹威氏毕赤酵母对葡萄糖消耗的同时，显著提升了产酒酵母在酸胁迫环境下的产酒性能，进一步解决了酸胁迫环境下产酒酵母发酵产酒力低的难题。
Description
技术领域
本发明属于酿酒技术领域，具体涉及一种在酸胁迫环境下提升产酒酵母产酒性能的方法。
背景技术
由于酱香型白酒酿造工艺轮次多、周期长，在窖内厌氧发酵过程中，乳酸菌等产酸微生物代谢产生大量的酸类物质，乳酸菌是白酒发酵过程中的主要微生物，乳酸菌的大量繁殖则会引起乳酸的积累，乳酸作为酒醅中主要的酸类物质，在中后期轮次酒醅中乳酸含量可达到20～40g/kg酒醅。研究证明，当乳酸含量达到20g/kg时会抑制酒醅中酵母菌的生长与代谢。据统计，目前的研究主要选育具有较强的乳酸耐受性的酵母菌菌株来提高白酒发酵高酸条件下的产酒力，但是中国白酒的酿造属于典型的混菌自然发酵的过程，需要依靠自然富集过程中获得的各种微生物进行发酵，并产生不同特征风味的物质。另外，降低发酵过程酒醅中乳酸含量也可以降低乳酸对产酒酵母的抑制。
目前，降低酒醅中乳酸主要有两种途径：一是物理除酸，但乳酸为不易挥发性酸，效果不理想；另一种途径是生物途径，即筛选能利用乳酸的微生物进行降酸，该方法能耗小、无污染且效率高，是当前的主流研究方向。
但因为中国白酒的酿造属于典型的混菌自然发酵的过程，如何能够在利用可以降解乳酸的酵母菌降低酒醅中乳酸含量的同时高效提高产酒酵母的产酒性能，这对提升白酒质量甚至整个白酒酿造工程都起着至关重要的作用，目前也暂未发现对该方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的之一在于将库德里阿兹威氏毕赤酵母用于在酸胁迫环境下提升产酒酵母的产酒性能。
本发明的另一目的之一在于提供一种在酸胁迫环境下提升产酒酵母产酒性能的方法。
据现有技术，可以通过筛选可以降解乳酸的毕赤酵母菌来降低酒醅中的乳酸含量，而针对是否以及如何能够在利用可以降解乳酸的酵母菌降低酒醅中乳酸含量的同时高效提高产酒酵母的产酒性能的问题时，发明人在研究中发现，因毕赤酵母的生长耗糖较多，所以在将毕赤酵母与酿酒酵母进行共同培养以提供乙醇含量时，培养环境中的糖含量一般较高，而在糖含量较高的情况下将毕赤酵母与产酒酵母共同培养，会降低降酸效果，且增加糖的消耗，相对的也会减少乙醇的提高量，而只有酸胁迫环境下的糖含量在低浓度范围内，毕赤酵母才会高效降解乳酸。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种在酸胁迫环境下提升产酒酵母产酒性能的方法。
一方面，本发明提供了一种在酸胁迫环境下提升产酒酵母产酒性能的方法，所述方法包括将库德里阿兹威氏毕赤酵母与所述产酒酵母进行混合培养，所述产酒酵母包括：酿酒酵母和/或拜耳接合酵母，所述方法包括如下步骤：
步骤一：测定所述产酒酵母所在培养基中的糖含量；
步骤二：当步骤一测定的所述糖含量的重量百分比为0.5％-2.5％时，将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母加入进行混合发酵培养。
在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：
监测所述产酒酵母进行发酵的时间；当所述步骤一测定的糖含量的重量百分比为0.5％-2.5％，且所述监测的所述产酒酵母进行发酵的时间为12h-36h时，将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母加入进行混合发酵培养。
在一些实施方案中，所述糖含量的重量百分比为1.0％-2.5％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.0％-2.0％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.5％-1.9％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.5％-1.6％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.6％-1.8％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.8％-1.9％；更优选地，所述糖含量的重量百分比为1.6％；更优选地，所述糖含量的重量百分比为1.83％；更优选地，所述糖含量的重量百分比为1.7％；更优选地，所述糖含量的重量百分比为1.9％。
在一些实施方案中，所述产酒酵母发酵的时间为18h-30h；优选地，所述产酒酵母发酵的时间为20h-28h；优选地，所述产酒酵母发酵的时间为22h-26h；更优选地，所述产酒酵母发酵的时间为24h-25h；更优选地，所述产酒酵母发酵的时间为24h。
在一些实施方案中，所述产酒酵母的初始接种浓度为：105～106CFU/ml。
在一些实施方案中，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的初始接种浓度为105～106CFU/ml。
在一些实施方案中，所述产酒酵母接种至所述培养基中的接种量为：2％-4％。
在一些实施方案中，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母加入所述培养基中的接种量为：2％-4％。
在一些实施方案中，所述步骤一中，所述产酒酵母所在的培养基中的糖含量的测定方法为：利用高效液相色谱测定方法对所述培养基中的葡萄糖含量进行测定，包括如下步骤：取培养基于4℃、12000rpm离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，上机进行测定。
在一些实施方案中，利用高效液相色谱测定所述葡萄糖含量的色谱条件为：色谱柱采用300×7.8mm的Aminex HPX-87H有机酸柱；0.005M的稀硫酸溶液作为流动相A；色谱柱温度为60℃，示差折光检测器为联合安捷伦1260Infinity II RID，检测波长为210-280nm，流速0.6mL/min，进样量为10μL。
在一些实施方案中，所述步骤一中，所述培养基的原始糖含量的重量百分比为：大于或等于3％。优选地，所述原始糖含量的重量百分比为3％。
在一些实施方案中，所述步骤一中培养基的原始糖含量的重量百分比为：大于或等于3％、原始乳酸含量的重量百分比为：大于或等于2％；优选地，所述原始糖含量的重量百分比为3％、原始乳酸含量的重量百分比为2％-4％。
在一些实施方案中，所述步骤一中，所述培养基为高粱汁培养基，所述高粱汁培养基是以高粱为主要原料制备得到的；优选地，所述高粱汁培养基的制备方法包括：以体积比v/v为1：4向破碎后的高粱中加水浸泡过夜，加入淀粉酶搅拌均匀，115℃灭30min，加入淀粉酶和1-2倍体积的水煮至葡萄糖含量大于等于3％，冷却至60℃，2层纱布过滤，8000rpm离心5min，取上清液。
在一些实施方案中，所述高粱汁培养基的制备方法还包括：向所述上清液中加入乳酸至乳酸含量大于或等于2％。
在一些实施方案中，所述方法包括如下步骤：
监测所述产酒酵母进行发酵的时间；
当监测的所述产酒酵母发酵的时间为12h-36h时，将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母加入进行混合发酵培养。
在一些实施方案中，所述产酒酵母发酵的时间为18h-30h；优选地，所述产酒酵母发酵的时间为20h-28h；优选地，所述产酒酵母发酵的时间为22h-26h；优选地，所述产酒酵母发酵的时间为24h-25h；更优选地，所述产酒酵母发酵的时间为24h。
在一些实施方案中，所述产酒酵母进行发酵的培养基的原始糖含量的重量百分比为大于或等于3％；优选地，所述原始糖含量的重量百分比为3％。
在一些实施方案中，所述产酒酵母进行发酵的培养基的原始糖含量的重量百分比为大于或等于3％、原始乳酸含量大于或等于2％；优选地，所述原始糖含量的重量百分比为3％、原始乳酸含量的重量百分比为2％-4％。
在一些实施方案中，所述培养基为高粱汁培养基，所述高粱汁培养基是以高粱为主要原料制备得到的；优选地，所述高粱汁培养基的制备方法包括：以体积比v/v为1：4向破碎后的高粱中加水浸泡过夜，加入淀粉酶搅拌均匀，115℃灭30min，加入淀粉酶和1-2倍体积的水煮至葡萄糖含量大于等于3％，冷却至60℃，2层纱布过滤，8000rpm离心5min，取上清液。
在一些实施方案中，所述高粱汁培养基的制备方法还包括：向所述上清液中加入乳酸，至乳酸含量大于或等于2％。
在一些实施方案中，所述方法还包括对所述糖含量的确定，包括如下步骤：
1)将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母分别接种至含糖发酵培养基与不含糖发酵培养基中进行发酵培养，分别测定不同培养基中不同发酵时段的葡萄糖及乳酸的含量，分析所述库德里阿兹威氏毕赤酵母对葡萄糖及乳酸两种碳源的优先利用特性；
2)根据步骤1)确定的所述库德里阿兹威氏毕赤酵母对葡萄糖的碳源优先利用特性结果，对所述含糖发酵培养基中的不同发酵时段的葡萄糖含量及乳酸含量变化进行分析，当所述含糖发酵培养基中的乳酸含量开始显著变化时，该发酵时段对应的培养基中的葡萄糖含量，即确定为所述糖含量。
在一些实施方案中，所述含糖发酵培养基为：含有2％乳酸、5％葡萄糖、2％蛋白胨的发酵培养基。
在一些实施方案中，所述不含糖发酵培养基为：含有2％乳酸、2％蛋白胨的发酵培养基。
在一些实施方案中，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的初始接种浓度为105～106CFU/ml。
在一些实施方案中，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的接种量为1％-4％；优选地，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的接种量为2％-3％。
在一些实施方案中，对所述糖含量的确定还包括如下步骤：
根据步骤2)确定的糖含量，将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母接种至含有2％乳酸+2％葡萄糖+2％蛋白胨的发酵培养基中发酵培养，对步骤2)中确定的所述库德里阿兹威氏毕赤酵母能够高效降解乳酸时的糖含量进行进一步验证。
在一些实施方案中，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的初始接种浓度为105～106CFU/ml；
在一些实施方案中，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的接种量为1％-4％；优选地，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的接种量为2％-3％。
在一些实施方案中，所述对乳酸及葡萄糖含量的测定包括：利用高效液相色谱测定方法进行测定，具体如下：取培养基于4℃、12000rpm离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，上机进行测定。
在一些实施方案中，测定所述乳酸及葡萄糖含量的色谱条件为：色谱柱采用300×7.8mm的Aminex HPX-87H有机酸住；0.005M的稀硫酸溶液作为流动相A；色谱柱温度为60℃，示差折光检测器为联合安捷伦1260Infinity II RID，检测波长为210-280nm，流速0.6mL/min，进样量为10μL。
在一些实施方案中，所述方法还包括对所述产酒酵母进行发酵的时间的确定，包括如下步骤：
(1)将所述产酒酵母接种至培养基中进行发酵培养，并测定不同发酵时段所述培养基中的葡萄糖含量；
(2)分析步骤(1)中不同发酵时段对应的培养基中的葡萄糖含量的变化，当所述培养基中的葡萄糖含量为0.5％-2.5％时，该葡萄糖含量对应的发酵时间即确定为所述产酒酵母进行发酵的时间。
在一些实施方案中，，所述产酒酵母的初始接种浓度为：105～106CFU/ml。
在一些实施方案中，所述产酒酵母接种至所述培养基中的接种量为：2％-4％。
在一些实施方案中，所述糖含量的重量百分比为1.0％-2.5％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.0％-2.0％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.5％-1.9％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.5％-1.6％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.6％-1.8％；优选地，所述糖含量的重量百分比为1.8％-1.9％；更优选地，所述所述糖含量的重量百分比为1.6％；更优选地，所述所述糖含量的重量百分比为1.83％；更优选地，所述所述糖含量的重量百分比为1.7％；更优选地，所述所述糖含量的重量百分比为1.9％。
在一些实施方案中，所述培养基为：葡萄糖含量为3％、乳酸含量为4％的高粱汁培养基。
在一些实施方案中，所述高粱汁培养基的制备方法包括：以体积比v/v为1：4向破碎后的高粱中加水浸泡过夜，加入淀粉酶搅拌均匀，115℃灭30min，加入淀粉酶和1-2倍体积的水煮至葡萄糖含量为3％，冷却至60℃，2层纱布过滤，8000rpm离心5min，取上清液，向所述上清液中加入乳酸，至乳酸含量为4％，即得到所述高粱汁培养基。
在一些实施方案中，所述葡萄糖含量的测定方法包括：利用高效液相色谱测定方法对所述培养基中的葡萄糖含量进行测定，具体包括：取培养基于4℃、12000rpm离心10min后，取上清液过0.22μm滤膜，上机进行测定。
在一些实施方案中，所述测定葡萄糖含量的色谱条件为：色谱柱采用300×7.8mm的Aminex HPX-87H有机酸柱；0.005M的稀硫酸溶液作为流动相A；色谱柱温度为60℃，示差折光检测器为联合安捷伦1260Infinity II RID，检测波长为210-280nm，流速0.6mL/min，进样量为10μL。
在一些实施方案中，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的保藏编号为CGMCC No：14068。
在一些实施方案中，所述酿酒酵母的保藏编号为CGMCC NO.19336。
在一些实施方案中，所述拜耳接合酵母的保藏编号为CGMCC No.4745。
另一方面，本发明还提供了一种所述库德里阿兹威氏毕赤酵母在酸胁迫环境中提升产酒酵母产酒性能的应用。
再另一方面，本发明还提供了一种所述的方法在酿酒领域中的应用。
在一些实施方案中，所述酿酒领域包括白酒酿造领域。
在一些实施方案中，所述酿酒领域包括利用所述产酒酵母进行白酒酿造。
在一些实施方案中，所述酿酒领域包括在酸胁迫环境下利用所述产酒酵母进行产酒。
在一些实施方案中，所述产酒酵母包括：酿酒酵母和/或拜耳接合酵母。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供了一种在酸胁迫环境下提升产酒酵母发酵性能的方法，该方法将一株可以降解乳酸的库德里阿兹威氏毕赤酵母用于在酸胁迫环境下提升产酒酵母发酵性能，且所述方法将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母与产酒酵母进行共同培养以提升产酒酵母的发酵性能，该方法使得库德里阿兹威氏毕赤酵母菌能够在一个较低糖含量的酸胁迫环境下高效降解乳酸，提高了库德里阿兹威氏毕赤酵母菌降解乳酸的效果，缓解了乳酸对产酒酵母产酒性能的抑制的同时，也减少了库德里阿兹威氏毕赤酵母对葡萄糖的消耗，且显著提升了产酒酵母在酸胁迫环境下的产酒性能，进一步解决了酸胁迫环境下产酒酵母发酵产酒力低的难题。
(2)本发明所提供的在酸胁迫环境下的糖含量适宜于库德里阿兹威氏毕赤酵母菌降解乳酸的情况下提升产酒酵母的发酵性能的方法相比于常规的产酒酵母发酵培养方法，解决了在白酒发酵过程中酸胁迫环境下因含糖量较高而导致库德里阿兹威氏毕赤酵母降乳酸效果不佳，从而抑制了产酒酵母的产酒性能，导致白酒酿造工程中产酒酵母产酒性能不佳的问题，本发明模拟白酒发酵过程中的酸胁迫环境(乳酸含量高于2％)、高含糖量发酵环境，探索出了一种在适宜于库德里阿兹威氏毕赤酵母菌可以高效降解的条件下，将降解乳酸的库德里阿兹威氏毕赤酵母与产酒酵母共同培养，提升产酒酵母产酒性能的新方法。
(3)相比于现有技术，本发明提供的在酸胁迫环境下提升产酒酵母发酵性能的方法，对产酒酵母的产酒性能提升高达97.8％，且酿造体系中的风味物质积累量也显著提升。
附图说明
图1本发明实施例中含糖发酵培养基与不含糖发酵培养基两种培养条件下库德里阿兹威氏毕赤酵母的生长情况结果图；
图2为本发明实施例中含糖发酵培养基与不含糖发酵培养基两种培养条件下库德里阿兹威氏毕赤酵母对乳酸的降解情况对比结果图；
图3为本发明实施例中含糖发酵培养基培养条件下库德里阿兹威氏毕赤酵母对乳酸及葡萄糖的利用情况对比结果图；
图4为本发明实施例中2％乳酸+2％葡萄糖培养条件下库德里阿兹威氏毕赤酵母菌降解乳酸及葡萄糖的情况对比结果图；
图5为本发明实施例中酿酒酵母和拜耳接合酵母在不同发酵时期对葡萄糖的利用情况结果图；
图6为本发明实施例中处理组1-3发酵液中不同发酵时段乳酸的变化结果图；
图7为本发明实施例中处理组1-3发酵液中不同发酵时段乙醇的变化结果图；
图8为本发明实施例中处理组1-3发酵液中各类风味物质的对比结果图；
图9为本发明实施例中处理组4-6发酵液中不同发酵时段乳酸的变化结果图；
图10为本发明实施例中处理组4-6发酵液中不同发酵时段乙醇的变化结果图；
图11为本发明实施例中处理组4-6发酵液中各类风味物质的对比结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明中的库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii，PK)的保藏编号为CGMCC No：14068；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，SC)的保藏编号为CGMCCNO.19336；拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii，ZB)的保藏编号为CGMCC No.4745。
本发明中的“糖含量”：指培养基或者发酵液中葡萄糖的含量(％)或浓度(g/L)，如：在总体积为1L的培养基或者发酵液中加入了50g葡萄糖，葡萄糖的含量为5％或葡萄糖的浓度为50g/L，即糖含量为5％或50g/L。
本发明中“酸胁迫环境”是指：发酵培养环境中的乳酸含量大于或等于2％或乳酸浓度大于或等于20g/L时，即为酸胁迫环境。
本发明中“产酒酵母”是指：在酿酒领域，主要用于产酒的酵母菌，如本发明中酿酒酵母菌、拜耳接合酵母菌。
含糖发酵培养基：2％乳酸+5％葡萄糖+2％蛋白胨；即20g乳酸，50g葡萄糖，20g蛋白胨，蒸馏水1L，115℃灭菌20min。
不含糖发酵培养基：2％乳酸+2％蛋白胨；即20g乳酸，20g蛋白胨，蒸馏水1L，115℃灭菌20min。
发酵培养基：2％乳酸+2％葡萄糖+2％蛋白胨；即20g乳酸，20g葡萄糖，20g蛋白胨，蒸馏水1L，115℃灭菌20min。
高粱汁培养基：以高粱与水体积比v/v为1：4向破碎的高粱中加水浸泡过夜，加入淀粉酶搅拌均匀，115℃灭30min，加入淀粉酶和1-2倍体积的水煮至葡萄糖含量3％左右，冷却至60℃，2层纱布过滤，8000rpm离心5min，取上清液即得到高粱汁培养基。
YPD液体培养基：酵母膏5g，葡萄糖10g，蛋白胨10g，蒸馏水1L，115℃灭菌20min。
本发明实施例中葡萄糖、乳酸及乙醇含量的测定为通过高效液相色谱(HPLC)测定方法进行测定，具体如下：取1mL培养基于4℃、12000rpm离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，上机；高效液相色谱的测定参数：色谱柱采用300×7.8mm的Aminex HPX-87H有机酸住；0.005M的稀硫酸溶液作为流动相A；色谱柱温度为60℃；示差折光检测器的型号为：联合安捷伦1260Infinity‖RID，检测波长为210-280nm，流速0.6mL/min，进样量为10μL。
本发明中培养基中的OD值的测定方法为：取未接菌的培养基为空白对照，于600nm波长处测发酵液的吸光度，既得到OD600值，当吸光度大于1.0时，稀释后测定。
本发明中培养基中各风味物质的测定方法为：利用顶空固相微萃取气质联用技术(HS-SPME GC-MS)对发酵液中各风味物质进行测定，具体步骤如下：将经高效液相色谱(HPLC)检测之后的培养基继续稀释至8mL和10μL内标-薄荷醇(100μg/mL)放入装有3gNaCl的20mL顶空瓶中；通过HS-SPME-GC-MS(GC6890N和MS5975；Agilent Technologies，SantaClara，CA)和DB-Wax色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，分析发酵液中的挥发性风味。每个色谱峰的质谱信息与美国国家标准技术研究所(NIST)质谱库之间的相似度至少为75％，且RIcal和RIlit之间的差异不超过30个单元，则认为该挥发性化合物已被初步鉴定。通过与内标物的峰面积比较，对鉴定出的挥发性化合物进行半定量分析和计算。
本发明实施例培养基中所使用的原料均可市场上购买获得，“乳酸”购买自国药集团化学试剂有限公司；“葡萄糖”购买自天津市科密欧化学试剂有限公司；“蛋白胨”购买自北京奥博星生物技术有限责任公司；“酵母膏”购买自北京奥博星生物技术有限责任公司。
实施例1在酸胁迫环境下库德里阿兹威氏毕赤酵母可以高效降解乳酸的适宜的葡萄糖含量的探究
(1)库德里阿兹威氏毕赤酵母在含糖发酵培养基与不含糖发酵培养基培养条件下对乳酸的降解情况
种子液的准备：将库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株接种在YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养24h-48h，稀释至105左右，即得到库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液，得到的库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液的浓度为1×105CFU/ml。
分别将库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液按照体积比(v：v)2％的比例分别接种至：①2％乳酸+5％葡萄糖+2％蛋白胨；②2％乳酸+2％蛋白胨的两种发酵培养基中，30℃静止培养4天，每隔12小时取样测定①中的OD值、葡萄糖含量、乳酸含量及②中的乳酸含量，探究库德里阿兹威氏毕赤酵母对乳酸的降解情况，以及在葡萄糖与乳酸共存情况，碳源的优先利用特性，结果如图1、图2、图3所示。
图1为①和②两种培养条件下库德里阿兹威氏毕赤酵母的生长情况图，由图1可以看出，库德里阿兹威氏毕赤酵母在12h后进入生长对数期，发酵60h后，菌株进入了稳定期，在发酵结束后，菌株在①培养基培养条件下生长OD值较高，推测是由于培养基中含有的碳源更丰富(葡萄糖和乳酸)，从图1中可以看出，库德里阿兹威氏毕赤酵母在②不含葡萄糖的培养基培养条件下，可以利用乳酸为碳源进行生长，表明本实施例中的库德里阿兹威氏毕赤酵母可以有效降解乳酸。
图2为①和②两种培养条件下库德里阿兹威氏毕赤酵母对乳酸的降解情况对比结果，从图2结果表明，培养时间为0-12h期间，①和②两种条件下培养液中的乳酸的含量均无显著性变化；培养时间为12h以后，库德里阿兹威氏毕赤酵母进入对数生长期，培养液中的乳酸含量开始显著下降，整体看来，相比于不含有葡萄糖的培养基②，在高浓度葡萄糖与乳酸共存的发酵培养基①中，乳酸含量的降解速率较慢，即，就碳源的优先利用特性来说，该库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株会优先利用葡萄糖，即根据图2的结果表明，在葡萄糖与乳酸共存的情况下，不利于菌株对乳酸的降解。
图3为①葡萄糖与乳酸共存培养基培养条件下，即乳酸与高浓度葡萄糖共存的培养基中，库德里阿兹威氏毕赤酵母对乳酸及葡萄糖的利用情况对比结果，从图3结果表明，发酵时间为0-12h期间，培养基中的葡萄糖和乳酸的含量均无显著性变化；培养时间12h以后，库德里阿兹威氏毕赤酵母进入对数生长期，发酵液中的葡萄糖开始显著下降，当发酵液中葡萄糖含量为1.6％时，此培养时间对应的培养基中的乳酸含量开始显著下降，即乳酸的降解速率开始增加，即初步确认培养基中的葡萄糖含量为1.6％或小于1.6％时，更有利于库德里阿兹威氏毕赤酵母高效降解乳酸。
基于上述图1、图2的对比结果分析，在乳酸与高浓度葡萄糖共存的发酵培养环境中，不利于库德里阿兹威氏毕赤酵母对培养环境中乳酸的降解，且在乳酸与高浓度葡萄糖共存的发酵培养环境中，当葡萄糖含量从5％的高浓度降解为1.6％时，库德里阿兹威氏毕赤酵母对乳酸的降解速率开始显著增加，有利于库德里阿兹威氏毕赤酵母对培养环境中乳酸的降解，即初步确定当发酵培养环境中的糖含量低于2％时，为乳酸与高浓度葡萄糖共存情况下库德里阿兹威氏毕赤酵母可以高效降解乳酸的适宜的糖含量。
(2)库德里阿兹威氏毕赤酵母在2％乳酸+2％葡萄糖培养条件下对乳酸的降解情况
基于上述步骤(1)中的实验结果，当培养基中的葡萄糖含量为1.6％时，库德里阿兹威氏毕赤酵母可以高效降解乳酸，该步骤进一步以培养基中的原始糖含量为2％为节点，进一步探究适宜于库德里阿兹威氏毕赤酵母可以高效降解乳酸的糖含量，具体步骤如下：
种子液的准备：将库德里阿兹威氏毕赤酵母菌株接种在YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养24h-48h，稀释至105左右，即得到库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液，得到的库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液的浓度为1×105CFU/ml。
将库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液按照体积比(v：v)2％的比例接种至2％乳酸+2％葡萄糖+2％蛋白胨的发酵培养基中，30℃静止培养4天，每隔12小时取样测定葡萄糖含量、乳酸含量，进一步探究库德里阿兹威氏毕赤酵母对乳酸及葡萄糖的降解情况，结果如图4所示。
图4为培养基中葡萄糖浓度为2％条件下库德里阿兹威氏毕赤酵母菌降解乳酸及葡萄糖的情况对比结果，从图4结果表明，培养时间为1-12h期间，发酵液中的乳酸及葡萄糖含量均无显著性变化；培养时间为12h以后的期间，库德里阿兹威氏毕赤酵母菌进入对数生长期，培养液中的葡萄糖含量开始显著下降；当培养液中葡萄糖浓度为1.83％时，此培养时间对应的培养液中的乳酸含量开始显著下降，即乳酸的降解速率开始显著增加。
所以综上图1-4结果表明：在高浓度葡萄糖与乳酸共存的发酵培养液中，库德里阿兹威氏毕赤酵母菌会优先利用葡萄糖，乳酸的降解效率较低，即在高浓度葡萄糖存在的情况下，不利于菌株对乳酸的降解；而在葡萄糖与乳酸共存的发酵培养液中，当发酵培养液中葡萄糖浓度降低至小于2％的范围时，如上述实验结果：葡萄糖含量为1.83％、1.6％时，库德里阿兹威氏毕赤酵母菌可以实现对乳酸的高效降解，上述过程完成了对乳酸与高浓度葡萄糖共存情况下库德里阿兹威氏毕赤酵母可以高效降解乳酸时的糖含量的确定，即当发酵培养基中的葡萄糖含量低于2％，如1.83％、1.6％时，库德里阿兹威氏毕赤酵母菌可以实现对乳酸的高效降解。
实施例2一种将库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)与酿酒酵母(SC)混合培养提升在酸胁迫环境下酿酒酵母发酵性能的方法
一、确定库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)的添加时机
(1)种子液的准备
将上述库德里阿兹威氏毕赤酵母、酿酒酵母两种酵母菌株分别接种在YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养24h-48h，稀释至105左右，作为种子液用于后续发酵实验，即分别得到库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液、酿酒酵母种子液，库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液的浓度为1×105CFU/ml，酿酒酵母种子液的浓度为1×105CFU/ml。
(2)酿酒酵母对葡萄糖利用情况的探究
向50mL离心管中加入15mL高粱汁培养基，121℃灭菌20min后，接入酿酒酵母种子液500μL，加入乳酸至含量为40g/L，即高粱汁培养基中加有4％的乳酸，30℃静置培养，每隔12h测定发酵液中葡萄糖含量，结果如图5所示；
根据图5结果表明，当发酵时间为0-12h期间，酿酒酵母发酵液中的葡萄糖含量无明显变化，当发酵时间为12h及以后，酿酒酵母进入对数生长期，发酵液中葡萄糖含量显著下降，且当发酵时间为24h时，发酵液中的葡萄糖含量为1.7％，即通过上述实验过程探究结果表明，在高浓度葡萄糖与高浓度乳酸共存的高粱汁培养基中，当酿酒酵母单独发酵时间为24h时，发酵液中的葡萄糖含量为1.7％，即当酿酒酵母单独发酵时间为24h时，培养基中的葡萄糖含量达到实施例1所确定的低于2％的范围。即初步确认，当酿酒酵母单独发酵24h及之后，加入库德里阿兹威氏毕赤酵母混合培养，可以提升库德里阿兹威氏毕赤酵母降解乳酸的效率。
二、将库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)与酿酒酵母(SC)混合培养
基于上述步骤所确定的库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)的添加时机：酿酒酵母单独发酵时间为24h及之后，培养基中的葡萄糖含量达到低于2％的范围，将库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)与酿酒酵母(SC)按照如下方式进行混合培养：
量取500μL上述酿酒酵母种子液添加至15mL高粱汁培养基中，向高粱汁培养基加入乳酸至含量为40g/L，即高粱汁培养基中加有4％的乳酸，30℃静置培养24h后，向发酵液中加入500μL上述库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种子液，继续30℃静置培养，测定各发酵时段发酵液中乳酸、乙醇及各风味物质的含量。将该步骤的处理方式记为：处理组3。
同时开展如下对比处理组，包括处理组1、处理组2：
处理组1：量取1000μL上述酿酒酵母种子液添加至15ml的高粱汁培养基中，向高粱汁培养基加入乳酸至含量为40g/L，即高粱汁培养基中加有4％的乳酸，30℃静置培养，测定各发酵时段发酵液中的乳酸、乙醇及各风味物质的含量。
处理组2：分别量取500μL上述酿酒酵母种子液及库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液添加至15ml高粱汁培养基中，向高粱汁培养基加入乳酸至含量为40g/L，即高粱汁培养基中加有4％的乳酸，30℃静置培养，测定各发酵时段发酵液中乳酸、乙醇及各风味物质的含量。
由于固态白酒发酵过程中葡萄糖浓度最高可达3％左右，所以为了进一步模拟真实的白酒发酵环境，本实施例实验以葡萄糖浓度为3％的高粱汁培养基进行研究。
通过上述实验探究不同发酵时段向发酵培养环境中加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌对库德里阿兹威氏毕赤酵母菌降乳酸效果及酿酒酵母产酒效果的影响，具体结果如图6、图7、图8所示。
图6为处理组1-3发酵液中不同发酵时段乳酸的变化情况结果，从图6结果表明，处理组1-3在发酵24h及之前，发酵液中乳酸含量无显著差异，在发酵时段进入24h之后，即当发酵时间为48h时，处理1发酵液中的乳酸为8.75g/L，处理2发酵液中的乳酸为0.13g/L，处理3发酵液中的乳酸为0.08g/L，相比于处理组1(酿酒酵母单独发酵)、处理组2(同时加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌、酿酒酵母)，处理组3在酿酒酵母单独培养24小时后，即当发酵液中的糖含量为1.7％时，再加入库德里阿兹威氏毕赤酵母与酿酒酵母进行混合培养，降乳酸效果显著提高。
图7为处理组1-3发酵液中不同时段乙醇的变化情况结果，从图7结果表明，处理组1-3在发酵24h及24h之前，发酵液中的乙醇积累量无显著差异，同时加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌及酿酒酵母进行混合培养的处理2发酵液中乙醇的积累量略多于酿酒酵母单独发酵的处理组1；在发酵时段进入24h之后，即当发酵时间为48h时，处理组3发酵液中乙醇产量为7.75g/L，处理组2发酵液中乙醇产量为5.54g/L，处理组1发酵液中的乙醇产量为6.75g/L，处理2与处理1相比，乙醇产量有所降低；相比于处理1(酿酒酵母单独发酵)、处理2(同时加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌、酿酒酵母进行混合培养)，处理组3在酿酒酵母单独发酵培养24小时后，即当发酵液中的糖含量为1.7％时，添加库德里阿兹威氏毕赤酵母菌进行混合培养发酵，发酵液中的乙醇产量分别提高了14.8％、39.8％，即处理组3显著提高了酸胁迫环境下，酿酒酵母所在酿造体系中乙醇的产量。
图8为处理组1-3发酵液中各类风味物质的对比情况，从图8结果表明，与酿酒酵母单菌发酵的处理组1相比，共同培养的处理组2、处理组3发酵液中的风味物质含量明显增多。
CN111254085A筛选出了一株可以降解乳酸的毕赤酵母菌，且将该毕赤酵母与酿酒酵母共同培养时可以提高乙醇的产量，但是根据上述处理组2与处理组3的对比结果，发明人意外发现，虽然都是选择将降解乳酸的酵母菌与酿酒酵母混合培养发酵，但是选择不同的添加节点将库德里阿兹威氏毕赤酵母菌加入与酿酒酵母进行混合培养发酵，对酿酒酵母所在发酵体系的乙醇积累量及各风味物质的积累量具有显著的影响，即本发明处理组3选择在培养基的培养条件适宜于库德里阿兹威氏毕赤酵母菌高效降解乳酸时，加入与酿酒酵母混合培养发酵，显著提高了发酵液中的乙醇产量，即选择本发明所提供的技术方案，显著提高了酸胁迫环境下，酿酒酵母的产酒性能。
综合上述图6、图7、图8的结果进一步表明，处理组3在酿酒酵母单独培养24小时后即当发酵液中的糖含量为1.7％时，再加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌混合培养发酵，显著提高了库德里阿兹威氏毕赤酵母菌降解乳酸效果，使得乳酸对酿酒酵母产酒性能的抑制得到了有效缓解，从而进一步提升了在酸胁迫环境下，酿酒酵母所在酿造体系中乙醇的产量，即通过在酿酒酵母单独发酵培养24小时后，即当发酵液中的糖含量为1.7％时，添加库德里阿兹威氏毕赤酵母菌与酿酒酵母进行混合培养发酵，可以显著提升酿酒酵母的产酒性能。
实施例3一种将库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)与拜耳接合酵母(ZB)混合培养提升在酸胁迫环境下拜耳接合酵母发酵性能的方法
一、确定库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)的添加时机
(1)种子液的准备
将上述库德里阿兹威氏毕赤酵母、拜耳接合酵母两种酵母菌分别接种在YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养24h-48h，稀释至105左右，作为种子液用于发酵实验，分别得到库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种子液、拜耳接合酵母种子液，库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液的浓度为1×105CFU/ml，拜耳接合酵母种子液的浓度为1×105CFU/ml。
(2)拜耳接合酵母对葡萄糖利用情况的探究
向50mL离心管中加入15mL高粱汁培养基，121℃灭菌20min后，接入拜耳接合酵母种子液500μL，加入乳酸至含量为40g/L，即高粱汁培养基中加有4％的乳酸，30℃静置培养，每隔12h测定发酵液中葡萄糖含量，结果如图5所示；根据图5结果表明，当发酵时间为0-12h期间，拜耳接合酵母发酵液中的葡萄糖含量无明显变化，当发酵时间为12h及以后，拜耳接合酵母进入对数生长期，发酵液中葡萄糖含量显著下降，且当发酵时间为24h时，发酵液中的葡萄糖含量为1.9％，即通过上述实验探究结果表明，在高浓度葡萄糖与高浓度乳酸共存的高粱汁培养基中，当拜耳接合酵母发酵时间为24h时，发酵液中的葡萄糖含量为1.9％，即当拜耳接合酵母单独发酵时间为24h及之后，培养基中的葡萄糖含量达到实施例1中确定的低于2％的范围。即初步确认，当拜耳接合酵母单独发酵24h及之后，加入库德里阿兹威氏毕赤酵母混合培养，可以提升库德里阿兹威氏毕赤酵母降解乳酸的效率。
二、库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)与拜耳接合酵母(ZB)混合培养
基于上述步骤所确定的库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)的添加时机：拜耳接合酵母(ZB)单独发酵时间为24h时，培养基中的葡萄糖含量达到所确认的低于2％的范围，进而将库德里阿兹威氏毕赤酵母(PK)与拜耳接合酵母(ZB)按照如下方式进行混合培养：
量取500μL上述拜耳接合酵母种子液添加至15ml的高粱汁培养基中，高粱汁培养基中加有4％的乳酸，30℃静置培养24h后，向培养基中加入500μL上述库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种子液，继续30℃静置培养，测定各发酵时段发酵液中乳酸、乙醇及各风味物质的含量。将该步骤的处理方式记为：处理组6。
同时开展如下对比处理组实验，包括处理组4、处理组5：
处理组4：量取1000μL上述库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液添加至15ml的高粱汁培养基中，高粱汁培养基中加有4％的乳酸，30℃静置培养，测定各发酵时段发酵液中乳酸、乙醇及各风味物质的含量。
处理组5：分别量取500μL上述库库德里阿兹威氏毕赤酵母种子液及拜耳接合酵母种子液添加至15ml的高粱汁培养基中，高粱汁培养基中加有4％的乳酸，30℃静置培养，测定各发酵时段发酵液中乳酸、乙醇及各风味物质的含量。
由于固态白酒发酵过程中葡萄糖浓度最高可达3％左右，所以为了进一步模拟真实的白酒发酵环境，本实施例实验以葡萄糖浓度为3％的高粱汁培养基进行研究。
通过上述实验探究选择不同发酵时段向发酵环境中加入库德里阿兹威氏毕赤酵母与拜耳接合酵母混合培养对库德里阿兹威氏毕赤酵母菌降解乳酸效果及拜耳接合酵母产酒性能的影响，具体结果如图9、图10、图11所示。
图9为处理组4-6发酵液中不同时段乳酸的变化情况结果，从图9结果表明，处理组4-6在发酵24h及之前，处理组之间发酵液中乳酸含量无显著差异，处理5发酵液中乳酸含量高于处理4，所以拜耳接合酵母和库德里阿兹威氏毕赤酵母菌共同发酵的前24小时内，库德里阿兹威氏毕赤酵母菌并没有起到降酸的作用；在发酵时段进入24h之后，即当发酵时间为48h时，处理4发酵液中的乳酸为16.39g/L，处理5发酵液中的乳酸为0.61g/L，处理6发酵液中的乳酸为0.035g/L，相比于处理组4(拜耳接合酵母单独培养)、处理组5(同时加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌与拜耳接合酵母混合培养)，处理组6在拜耳接合酵母单独培养24小时后，即发酵液中的糖含量为1.9％时，再加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌与拜耳接合酵母进行混合培养发酵，对发酵液中的降乳酸效果显著提高，且相比于处理组5(同时加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌与拜耳接合酵母混合培养)，处理组6在拜耳接合酵母单独培养24小时后，即发酵液中的糖含量为1.9％时，再加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌进行混合培养发酵，对发酵液中的降乳酸效果也显著提高。
图10为处理组4-6发酵液中不同发酵时段乙醇的变化情况结果，从图10结果表明，处理组4-6在发酵24h及24h之前，发酵液中的乙醇积累量无显著差异，共同加入库德里阿兹威氏毕赤酵母及拜耳接合酵母进行发酵的处理5发酵液中乙醇的积累量略多于拜耳接合酵母单独发酵的处理组4；在发酵时段进入24h之后，即当发酵时间为48h时，处理组6发酵液中乙醇产量为9.67g/L，处理组5发酵液中乙醇产量为5.21g/L，处理组4发酵液中的乙醇产量为4.89g/L，相比于处理4(拜耳接合酵母单独发酵)、处理5(同时加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌与拜耳接合酵母混合培养)，处理组6在拜耳接合酵母单独发酵培养24小时后，即发酵液中的糖含量为1.9％时，添加库德里阿兹威氏毕赤酵母菌与拜耳接合酵母进行混菌发酵，发酵液中的乙醇产量分别提高了97.8％、85.6％，即本发明所提供的处理组6的技术方案显著提高了酸胁迫环境下，拜耳接合酵母所在酿造体系中乙醇的产量，即在拜耳接合酵母单独发酵培养24小时后，即发酵液中的糖含量为1.9％时，添加库德里阿兹威氏毕赤酵母菌进行共同混菌发酵，可以显著提升拜耳接合酵母的产酒性能。
图11为处理组4-6发酵液中各类风味物质的对比情况，从图11结果表明，与拜耳接合酵母单菌发酵的处理组4相比，共同培养的处理组5、处理组6发酵液中的醇类、酯类风味物质含量明显增多。
综合上述图9、图10、图11的结果进一步表明，处理组6在拜耳接合酵母单独培养24小时后，即发酵液中的糖含量为1.9％时，再加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌与拜耳接合酵母进行混合培养发酵，显著提高了库德里阿兹威氏毕赤酵母菌降解乳酸的效果，使得培养基中高浓度乳酸对拜耳接合酵母产酒性能的抑制得到了有效缓解，从而进一步显著提升了在酸胁迫环境下，拜耳接合酵母所在酿造体系中乙醇的产量，即在拜耳接合酵母单独发酵培养24小时后，即发酵液中的糖含量为1.9％时，再加入库德里阿兹威氏毕赤酵母菌与拜耳接合酵母进行混合培养发酵，可以显著提升拜耳接合酵母的产酒性能。
在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，使得本领域技术人员能够更加准确地理解本发明的发明思路以及操作方案，并不是对本发明的进一步限制，本领域技术人员在此基础上作出的非突出的实质性特征和非显著进步的改进，均属于本发明的保护范畴。
Claims (11)
1.一种在酸胁迫环境下提升产酒酵母产酒性能的方法，其特征在于，所述方法包括将库德里阿兹威氏毕赤酵母与所述产酒酵母进行混合培养，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的保藏编号为CGMCC No：14068，所述产酒酵母为保藏编号为CGMCC NO.19336的酿酒酵母，所述方法包括如下步骤：
步骤一：测定所述产酒酵母所在培养基中的葡萄糖含量；
步骤二：当步骤一测定的所述葡萄糖含量的重量百分比为1.6%-1.8%时，将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母加入进行混合发酵培养；
所述酸胁迫环境是指：发酵培养环境中的乳酸含量大于或等于2％或乳酸浓度大于或等于20g/L。
2.一种在酸胁迫环境下提升产酒酵母产酒性能的方法，其特征在于，所述方法包括将库德里阿兹威氏毕赤酵母与所述产酒酵母进行混合培养，所述产酒酵母为保藏编号为CGMCC No.4745的拜耳接合酵母，所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的保藏编号为CGMCC No：14068，所述方法包括如下步骤：
步骤一：测定所述产酒酵母所在培养基中的葡萄糖含量；
步骤二：当步骤一测定的所述葡萄糖含量的重量百分比为1.8%-1.9%时，将所述库德里阿兹威氏毕赤酵母加入进行混合发酵培养；
所述酸胁迫环境是指：发酵培养环境中的乳酸含量大于或等于2％或乳酸浓度大于或等于20g/L。
3.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述产酒酵母的初始接种浓度为：105~106CFU/ml；所述库德里阿兹威氏毕赤酵母的初始接种浓度为105~106CFU/ml。
4.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述产酒酵母接种至所述培养基中的接种量为：2%-4%；所述库德里阿兹威氏毕赤酵母加入所述培养基中的接种量为：2%-4%。
5.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述培养基的初始葡萄糖含量的重量百分比为：大于或等于3%，所述培养基的初始乳酸含量的重量百分比为：大于或等于2%。
6.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述培养基的初始葡萄糖含量的重量百分比为3%，所述培养基的初始乳酸含量的重量百分比为2%-4%。
7.如权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述培养基为高粱汁培养基，所述高粱汁培养基是以高粱为主要原料制备得到的。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高粱汁培养基的制备方法包括：以体积比v/v为1：4向破碎后的高粱中加水浸泡过夜，加入淀粉酶搅拌均匀，115℃灭菌30min，加入淀粉酶和1-2倍体积的水煮至葡萄糖含量大于等于3%，冷却至60℃，2层纱布过滤，8000rpm离心5min，取上清液；向所述上清液中加入乳酸至乳酸含量大于或等于2%。
9.如权利要求1-8任一所述的方法在酿酒领域中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述酿酒领域包括白酒酿造领域。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述酿酒领域包括在酸胁迫环境下提升产酒酵母的产酒性能。
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