CN112920957A - 一株光滑假丝酵母及其在葡萄酒酿造过程中增加品种香气的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株光滑假丝酵母及其在葡萄酒酿造中的应用。所述酿酒酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20634。该菌株经过检测具有良好的β‑葡萄糖苷酶活性，在葡萄酒发酵过程中在释放葡萄自身品种香气方面具有优势，可以酿造出香气更加馥郁，葡萄品种特征表现更加充分的葡萄酒。

Description

一株光滑假丝酵母及其在葡萄酒酿造过程中增加品种香气的 应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域。本发明具体涉及一株光滑假丝酵母及其在葡萄酒酿造过程中增加品种香气的应用。

背景技术

葡萄酒的品质和特性与酒中风味物质的含量和组成比例密切相关，其中香气是评价葡萄酒感官品质最重要的指标之一，平衡、典型且复杂的葡萄酒香气往往更受消费者青睐。葡萄酒的香气成分非常复杂，是来源于果实的品种香气、酵母发酵过程产生的香气以及陈酿过程产生的香气之间综合作用的结果。品种香气对于突显葡萄酒香气的典型性具有重要的作用。大部分的品种香气以糖苷结合态的形式存在，需要通过水解来释放活性香气成分，以β-葡萄糖苷酶来进行酶促水解可能是一种具有应用潜力的提高葡萄酒香气质量的方法。

非酿酒酵母中的β-葡萄糖苷酶相当丰富，对葡萄酒品质的提高可能具有一定的积极作用。然而，与法国等旧世界葡萄酒国家相比，我国在葡萄酒酵母的筛选及商业发酵剂的研发等方面的研究较为薄弱，多数研究的采样点也过于单一，这使得我国目前酿造葡萄酒所用的酵母菌株主要依赖进口。国内的酿酒师过度依赖商业酿酒酵母的使用，在一定程度上导致不同产区葡萄酒风格单一，同质化问题严重。非酿酒酵母的重要性长期被低估，但越来越多的研究表明非酿酒酵母在酿造产区和品种特色葡萄酒中具有出色的应用潜力。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一株具有良好β-葡萄糖苷酶活性的光滑假丝酵母，该酵母具有应用于葡萄酒发酵中，以提升葡萄酒特征香气表达的能力。

本发明的另一目的是提供一种高通量筛选高产β-葡萄糖苷酶的酵母的方案。

针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供的光滑假丝酵母(Candida glabrata)，名称为D18，属于假丝酵母属(Candida sp.)，分离自宁夏回族自治区贺兰山东麓葡萄园采摘成熟的红色酿酒葡萄品种——“赤霞珠”(Cabernet Sauvignon)葡萄果实。该菌株已于2020年9月4日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏地址：北京市朝阳区大屯路3号中国科学院微生物研究所，保藏号为:CGMCC No.20634，建议分类命名为：光滑假丝酵母(Candidaglabrata)。

除非特别指明，光滑假丝酵母(Candida glabrata)D18 CGMCC No.20634，在本文中简称D18。

本发明提供的D18可参与到葡萄酒的酿造过程中。利用D18参与酿造葡萄酒的优点在于：在筛选过程中，D18表现出了优秀的β-葡萄糖苷酶活性以及发酵能力。在随后的葡萄酒酿造过程中，使用D18的组别在香气上的表现好于其他组别，经过分析发现使用D18的组别更好的释放了属于葡萄品种本身的品种特征香气。因此，在发酵时，通过接种D18，可以利用本土特色酵母资源，更好的凸显酿造时的葡萄品种特征，有助于改善使用进口商业酿酒酵母带来的葡萄酒品质单一化等缺陷，能更好地呈现国产葡萄酒的特色，从而帮助中国葡萄酒产业形成自己的本土特色，促进整个产区葡萄酒产业发展。

本发明还提供了一种可以用于快速筛选具有良好β-葡萄糖苷酶活性，可以在实际工业生产验证前过滤掉大部分香气转化能力较弱的酵母，缩减筛选酵母的工作量。

附图说明

图1菌株D18在WL培养基上的菌落形态；

图2非酿酒酵母pNPG试验显色结果示意图；

图3β-葡萄糖苷酶提取物活性强度对比；

图4酿酒酵母S10与D18对比试验发酵记录。

生物保藏说明

生物材料D18，分类命名:光滑假丝酵母Candida glabrata，于2020年09月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.20634。

具体实施方式

为了更好地理解与实施，下面结合实施例和附图详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。

除非特别指明，以下实施例中所用的方法均为常规方法。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级别的试剂，且可从正规渠道商购获得。

除非特别指明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取统计平均值。

实施例中涉及的培养基配方如下：

YPD固体培养基(每1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g。

葡萄酒酵母WL鉴别培养基(每1L)：酵母粉4g，胰蛋白胨5g，葡萄糖50g，KH2PO40.55g，KCl0.425g，CaCl2 0.125g，MgSO4 0.125g，FeCl3 2.5mg，MnSO4 2.5mg，琼脂20g，溴甲酚绿22mg。

实施例1使用高通量方法筛选得到光滑假丝酵母D18

本发明一株酿造性能好的的光滑假丝酵母，是从宁夏回族自治区贺兰山东麓葡萄园赤霞珠葡萄品种中得到并保存，之后通过实验筛选所得，筛选过程如下：

取出在甘油管中冻存的菌株，解冻后按照10％的比例接种于液体YPD培养基中，在28℃恒温培养箱中培养48h。使用接种环蘸取少量菌液在WL固体培养基上进行平板划线，划线完成的平板在28℃恒温培养箱中培养48h；

用接种环挑取WL平板上的目标单菌落接种到液体YPD培养基中培养，然后重复上述平板划线的步骤，每种酵母做3个平行。若新的WL平板上没有出现杂菌，则可以用其进行后续试验，否则应该重复上述操作，直到将菌株纯化为止；

向96孔板每孔添加200μL的pNPG筛选培养基，待培养基凝固后，将纯化的菌液接种到96孔板上，每个孔接种15μL，每种菌液接种3个孔作为平行试验。记录好每个板孔所对应的单菌落编号，将96孔板置于28℃培养箱恒温培养72h后，向每个孔加入10μL浓度为1mol/L的碳酸钠溶液并静置10min，孔内黄色的深浅即反映了菌株β-葡萄糖苷酶活性的高低；如图2所示，通过颜色筛选，共获得8株高显色的菌株，进行下一步试验。

向液体YPD培养基中接种已经纯化的菌液，接种比例5％，并在28℃、180rpm的振荡培养箱中培养24h。培养完成后，再将菌液以10％的比例接种于产酶培养基，在28℃、150rpm的振荡培养箱中培养72h。将培养完成后的发酵液在4℃、12000rpm的高速离心机中离心15min，取上清液并经过0.45μm滤膜过滤，最终得到酵母菌株的β-葡萄糖苷酶提取液。

选用不同浓度的pNP标准溶液(以1mol/L的碳酸钠定容)，以碳酸钠溶液作为空白对照，用分光光度计在390-410nm进行全波长扫描，得到显色产物的最大吸收波长。然后在最大吸收波长处绘制pNP标准曲线。取0.2mL的β-葡萄糖苷酶提取液，加入1.5mLpH5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液后，在50℃的恒温水浴锅中预热10min。然后向反应体系加入1mmol/L的底物pNPG溶液，每个平行加入0.5mL。30min后立即加入1mol/L的碳酸钠溶液2mL终止反应。待样品冷却至室温之后，以加热失活的β-葡萄糖苷酶提取液作为对照组，测定反应液在最大吸收波长处的吸光值，并根据标准曲线计算出酶活力的大小。如图3所示，可以看出D18具有最高的酶活力，其结果具有统计学差异(p＜0.05)

实施例2光滑假丝酵母D18和商业酿酒酵母小型酿酒比较试验

将成熟琼瑶浆品种酿酒葡萄除梗破碎，以500mL玻璃广口瓶作为葡萄酒发酵容器，D18、一株商业酿酒酵母S10以及两者混合发酵共三组分别设置3个平行。酵母经活化后，接种于YPD液体培养基中，于28℃，150rpm条件下恒温振荡培养10h。向每个广口瓶中加400mL葡萄醪，0.4mL亚硫酸。酵母按3％接种量接入葡萄醪。用蘸有亚硫酸的纱布清理广口瓶口、瓶盖，瓶盖倒放，置于25℃下发酵。葡萄醪开始发酵后，每天进行温度、糖度和比重的检测并记录。根据发酵情况适时搅拌。当葡萄酒比重不再下降时，取上层清液灌装，密封置于4℃冰箱中保存。

通过高效液相色谱法(HPLC)对葡萄酒中还原糖、甘油、乙醇及部分有机酸含量进行测定，测定结果如表1所示。并根据GB/T 15038-2006对葡萄酒基本理化指标进行检测。

表1测试菌株小型酿酒试验后酒样基本糖酸含量

酿酒酵母

葡萄糖(g/L)

果糖(g/L)

琥珀酸(g/L)

乳酸(g/L)

甘油(g/L)

乙酸(g/L)

乙醇(V/V％)

商业酵母S10

0.17±0.05

1.04±0.04

1.42±0.13

未检出

7.84±0.05

0.65±0.01

12.67±0.07

D18

8.73±0.80

44.29±2.92

1.75±0.06

未检出

7.59±0.36

0.52±0.07

9.32±0.59

混合发酵

1.99±0.07

3.45±0.85

1.86±0.10

0.26±0.02

8.50±0.26

0.94±0.05

12.14±0.24

小型酿酒试验结果显示，D18在单独发酵时残留较多糖分，其酒精转化能力较弱，但在混合发酵时则能较好的完成发酵，并且提供更多能给葡萄酒带来醇厚、甘甜口感的甘油以及酸度，使葡萄酒更加清爽可口。

参照GB10220-2012中描述性检验步骤及GB15038-2006中的葡萄酒评分细则，邀请10位专业葡萄酒品评师对试验酒样进行盲品打分。参照葡萄酒评价比赛中的感官分析用表(sensorial analysis tasting sheet for wine judging competitions)，使用五点评分法对葡萄酒的香气进行评分，并制作雷达图。感官品评分析结果见图4。

感官品评试验结果显示，以光滑假丝酵母D18酿制的葡萄酒具有更好的香气，在柑橘类水果香、热带水果香和花香上的得分远高于商业酿酒酵母S10，且在酒精气味上的得分低于S10，表明其酿造的葡萄酒香气更为丰富和突出，更好的表达了琼瑶浆葡萄的特性。

Claims (4)

1.一株光滑假丝酵母，其特征在于，保藏编号:CGMCC No.20634。

2.如权利要求1所述的光滑假丝酵母在生产葡萄酒中的应用。

3.一种生产葡萄酒的方法，是利用如权利要求1所述的光滑假丝酵母通过独立发酵葡萄原料或混合酿酒酵母发酵葡萄原料，得到葡萄酒。

4.一种高通量筛选具有高产β-葡萄糖苷酶特征的酵母的方法，可得到如权利要求1所述的光滑假丝酵母，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取出在甘油管中冻存的菌株，解冻后按照10％的比例接种于液体YPD培养基中，在28℃恒温培养箱中培养48h，使用接种环蘸取少量菌液在WL固体培养基上进行平板划线，划线完成的平板在28℃恒温培养箱中培养48h；

(2)用接种环挑取WL平板上的目标单菌落接种到液体YPD培养基中培养，然后重复上述平板划线的步骤，每种酵母做3个平行，若新的WL平板上没有出现杂菌，则可以用其进行后续试验，否则应该重复上述操作，直到将菌株纯化为止；

(3)向96孔板每孔添加200μL的pNPG筛选培养基，待培养基凝固后，将(2)所得纯化的菌液接种到96孔板上，每个孔接种15μL，每种菌液接种3个孔作为平行试验，记录好每个板孔所对应的单菌落编号，将96孔板置于28℃培养箱恒温培养72h后，向每个孔加入10μL浓度为1mol/L的碳酸钠溶液并静置10min，孔内黄色的深浅即反映了菌株β-葡萄糖苷酶活性的高低；

(4)向液体YPD培养基中接种已经纯化的菌液，接种比例5％，并在28℃、180rpm的振荡培养箱中培养24h，培养完成后，再将菌液以10％的比例接种于产酶培养基，在28℃、150rpm的振荡培养箱中培养72h，将培养完成后的发酵液在4℃、12000rpm的高速离心机中离心15min，取上清液并经过0.45μm滤膜过滤，最终得到酵母菌株的β-葡萄糖苷酶提取液，该提取液置于4℃条件下保存，可应用于β-葡萄糖苷酶活性和和酶学性质的研究；

(5)选用不同浓度的pNP标准溶液(以1mol/L的碳酸钠定容)，以碳酸钠溶液作为空白对照，用分光光度计在390-410nm进行全波长扫描，得到显色产物的最大吸收波长，然后在最大吸收波长处绘制pNP标准曲线，取0.2mL的β-葡萄糖苷酶提取液，加入1.5mL pH 5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液后，在50℃的恒温水浴锅中预热10min，然后向反应体系加入1mmol/L的底物pNPG溶液，每个平行加入0.5mL，30min后立即加入1mol/L的碳酸钠溶液2mL终止反应，待样品冷却至室温之后，以加热失活的β-葡萄糖苷酶提取液作为对照组，测定反应液在最大吸收波长处的吸光值，并根据标准曲线计算出酶活力的大小；

(6)通过以(5)所得结果对比(4)显色的结果，筛选得到具有高产β-葡萄糖苷酶的酵母菌株。

Images