CN116103171B - 一种耐环境胁迫及快速发酵产乙醇的酿酒酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐环境胁迫及快速发酵产乙醇的酿酒酵母及其应用，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CRR_GJM，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20222014，保藏地址为：中国·武汉市·武汉大学。本发明提供的酿酒酵母CRR_GJM具有较强的耐葡萄糖能力，能在含50％葡萄糖浓度的环境中生长，并且具有较强的糖代谢能力。本发明酿酒酵母CRR_GJM具有快速发酵产乙醇的能力，同时，可以增加米酒乙酸乙酯含量。

Description

一种耐环境胁迫及快速发酵产乙醇的酿酒酵母及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及到一种耐环境胁迫及快速发酵产乙醇的酿酒酵母及其应用。

背景技术

米酒是中国传统的发酵饮料，通常以大米、糯米作为发酵原料，通过浸泡、蒸煮、糖化等多个工艺酿造而成。在米酒发酵中，醇类、酯类、酸类以及醛类物质等为其主要的呈香物质，并且在其发酵过程中是必不可少的。各种呈香物质的含量和比例要恰当，过高或过低都会影响米酒的风味和口感，有时候甚至会带来不良的效果。随着社会进步和人们对生活质量的要求不断提高，健康问题越来越被人们所关注，人们也更重视酒的品质和健康饮酒。因此，如何生产出高质量的米酒产品，如何提高米酒生产效率，如何降低米酒生产成本，高效液态米酒酿造技术的研究显得尤为重要。

酿酒酵母是米酒发酵微生物体系中的主要真菌，酿酒酵母和非酿酒酵母的代谢活动对于米酒香气和风味形成有重要作用。由于非酿酒酵母不具有最佳酒精发酵能力，因此应用于米酒酿造的酵母菌主要是以酿酒酵母为主，它能耐受高糖和发酵中后期的高浓度乙醇，在米酒发酵性能和香气物质形成方面扮演着不可或缺的角色，是用于改善米酒风味的关键菌株。有研究表明，添加安琪酵母、酵母抽提物或葡萄糖水都有利于米酒的酿造，获得更多的香味物质，且米酒的产酒率也相对较好，所获得的米酒中醇类、酸类、酯类等香味物质之间更加平衡，即感官口感也较好。

米酒发酵前期通常要加入淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等将大米原料中的淀粉转化为糖类，供微生物所利用。然而，转化生成的较多糖类物质也将提高原料的利用率，那么在米酒发酵前期，高浓度的糖也是酵母所遭遇的环境胁迫，除此之外米酒在发酵中后期，乙醇不断积累，形成高浓度的乙醇胁迫。

因此，筛选优良的酿酒酵母并且评估其糖代谢和高效乙醇发酵能力，对于提高米酒生产效率、降低米酒生产成本，高效液态米酒生产具有极为重要的意义。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明中实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20222014，保藏地址为：中国·武汉市·武汉大学。

作为本发明所述酿酒酵母的一种优选方案，其中：所述酿酒酵母耐受高糖环境。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM在制备发酵米酒中的应用。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM发酵制备米酒，快速代谢米酒中的糖类物质；其中，糖类物质包括葡萄糖和蔗糖。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM发酵制备米酒，提高米酒发酵中的乙醇生成速率。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM发酵制备米酒，增加醇类风味物质含量。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：包括，通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM发酵制备米酒，提高酯类风味物质含量。

本发明有益效果：

(1)本发明提供酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20222014，保藏地址为：中国·武汉市·武汉大学，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CRR_GJM具有较强的耐糖能力，能在含有50％的葡萄糖浓度的环境中生长，并且具有较强的糖代谢能力。

(2)本发明的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM具有快速发酵产乙醇的能力，同时，增加米酒醇类风味物质、乙酸乙酯物质的含量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明实施例中酿酒酵母CRR_GJM在YPD琼脂培养基上的菌落形态图、显微镜下的形态图以及扫描电镜的图片；其中，(a)为酿酒酵母CRR_GJM在YPD琼脂培养基上的菌落形态图，(b)为酿酒酵母CRR_GJM在40倍显微镜下的形态图，(c)酿酒酵母CRR_GJM在6000×下的电镜图片。

图2为本发明实施例中酿酒酵母CRR_GJM鉴定的系统发育树图。

图3为本发明实施例中酿酒酵母CRR_GJM耐糖的生长曲线。

图4为本发明实施例中酿酒酵母在米酒发酵中代谢不同糖的折线图；其中，a为酿酒酵母CRR_GJM在发酵米酒中代谢葡萄糖的情况图，b为酿酒酵母CRR_GJM在发酵米酒中代谢蔗糖的情况。

图5为本发明实施例中酿酒酵母CRR_GJM在米酒中的乙醇生产速率对比图。

图6为本发明实施例中酿酒酵母CRR_GJM在米酒中代谢挥发性风味物质的热图。

图7为本发明实施例中酿酒酵母CRR_GJM应用于米酒中的感官评价结果。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明提供酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20222014，保藏地址为：中国·武汉市·武汉大学。

本发明提供的耐环境胁迫及快速发酵产乙醇的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM，是从内蒙古民间发酵酸奶中分离获得；所述酿酒酵母CRR_GJM，在YPD琼脂培养基上生长良好，菌落颜色为乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，椭球形，在电子显微镜下形似圆柱形。

本发明的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM，通过采用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增对其基因组总DNA为模板进行PCR扩增，得到目的基因序列，将测序得到的基因序列输入NCBI数据库进行比对，其与Genebank中的标准菌株Saccharomycescerevisiae相似率达99.42％，可初步鉴定该菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

本发明的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM的YPD平板送至上海晶诺生物科技公司进行测序，测得的DNA序列(如Seq_1所示)为：CCCACCTGATTTGAGGTCAAACTTTAAGAACATTGTTCGCCTAGACGCTCTCTTCTTATCGATAACGTTCCAATACGCTCAGTATAAAAAAAGATTAGCCGCAGTTGGTAAAACCTAAAACGACCGTACTTGCATTATACCTCAAGCACGCAGAGAAACCTCTCTTTGGAAAAAAAAACATCCAATGAAAAGGCCAGCAATTTCAAGTTAACTCCAAAGAGTATCACTCACTACCAAACAGAATGTTTGAGAAGGAAATGACGCTCAAACAGGCATGCCCCCTGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTTAATATTTTAAAATTTCCAGTTACGAAAATTCTTGTTTTTGACAAAAATTTAATGAATAGATAAAATTGTTTGTGTTTGTTACCTCTGGGCCCCGATTGCTCGAATGCCCAAAGAAAAAGTTGCAAAGATATGAAAACTCCACAGTGTGTTGTATTGAAACGGTTTTAATTGTCCTATAACAAAAGCACAGAAATCTCTCACCGTTTGGAATAGCAAGAAAGAAACTTACAAGCCTAGCAAGACCGCGCACTTAAGCGCAGGCCCGGCTGGACTCTCCATCTCTTGTCTTCTTGCCCAGTAAAAGCTCTCATGCTCTTGCCAAAACAAAAAAAAAAAAAAATCCATTTTCAAAATTATTAAATTTCTTTAAGGATCCTCCGAGTCCCCCCCCCCCCAGAGAGAGGGCCTTTACGGGACATTATACAATTTTTAAAAAGGGGTTTATTGTTATATTTTG

本发明的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CRR_GJM具有50％葡萄糖浓度的耐糖能力，具有快速发酵产乙醇的能力，同时，增加米酒醇类风味物质、乙酸乙酯物质的含量。

实施例1：酿酒酵母的分离

无菌条件下吸取1mL的内蒙古民间发酵乳加入0.9mL无菌水放入离心管中并进行振荡，稀释成10^-1浓度的菌悬液，然后再按照10倍稀释的方法分别稀释到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5浓度的菌悬液，最后涂布于YPD固体培养基上，在30℃培养箱培养48h，将培养基内单独的菌落挑取后采取三区划线法，纯化后至无杂菌进行甘油管的保藏。保存的菌株活化三次后进行生理生化实验。

其中，具体活化过程如下：

(1)首先将低温保存管从-80℃低温保存条件中取出，置于37℃浴槽的试管架上进行溶解；

(2)然后用无菌微量吸管，从已溶解的低温保存管吸取1-2滴的菌液，滴入液态指定培养基中；

(3)最后将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养，培养液的OD_600nm为0.8-1.0，重复三次。

观察并记录菌落形态，菌落的大小、颜色、形状，菌落边缘、凸起和透明情况，如图1，其中，(a)挑取的菌落周围产生透明圈，菌落颜色以乳白色为主；外形以圆形为主，表面光滑、湿润，质地均匀，容易挑取；(b)在40倍光学显微镜下，可以看到椭球形的细胞形态；(c)在6000倍电子显微镜下可以更清晰地看到酿酒酵母表面较为光滑的圆柱体形态。

实施例2：酿酒酵母的分子生物学鉴定

将活化的菌株培养至对数期，取1mL菌液加入9mL的无菌水制成10^-1菌液，将10^-1菌液加入9mL的无菌水制成10^-2菌液，以此类推制成10^-3、10^-4、10^-5菌液，每个稀释度取3μL接种在平板上，观察菌落生长情况。

选取能在平板上形成单菌落的菌株进行鉴定。

DNA提取试剂盒步骤提取供试菌株的基因组，通过采用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增对其基因组总DNA为模板进行PCR扩增，得到目的基因序列，将PCR扩增产物送上海晶诺生物科技有限公司进行测序，将拼接好的序列结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性检索，再利用MEGA7构建系统发育树。用MEGA7中的邻接(Neighbour-joining)构建系统发育树，如图2。

实施例3：酿酒酵母糖耐高糖的生长曲线

将YPD液体培养基中的葡萄糖浓度分别调至10％、20％、30％、40％、50％,然后分别接入等量(2％)相同浓度(OD_600nm：0.8-1.0)的酿酒酵母CRR_GJM和商业酿酒酵母VIC两种液体种子，于30℃、120r/min条件下摇床培养24h，以未接菌的YPD培养液做校正，测定不同葡萄糖浓度的培养条件下发酵液的OD值，设置3个重复值，记录数据。结果见图3。

由图3可以看出，在不同浓度的葡萄糖中，酿酒酵母CRR_GJM比酿酒酵母VIC表现出更强的糖耐受能力。在10％、20％、30％、40％的葡萄糖浓度下，OD_600nm相差并不明显，但是在50％的葡萄糖浓度下，酿酒酵母CRR_GJM和酿酒酵母VIC的OD_600nm有较明显的差异，分别为1.818和0.861，说明酿酒酵母CRR_GJM具有更高的糖耐受能力。

其中，商业酿酒酵母VIC购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC32883。

实施例4：酿酒酵母糖代谢能力的比较

(1)将大米清洗至没有白色出现，浸泡24h。

(2)沥干水分，称取25g大米和50mL蒸馏水加入到250mL的锥形瓶中，进行高压蒸煮20min，控制温度在70℃，倒入70℃的100mL的灭菌水；

然后加α-淀粉酶0.025g，保温70℃、2小时，冷却至60℃后加糖化酶0.05g保温30min，加入蛋白酶0.0125g，中途隔段时间搅拌。

(3)最后，按接种量为高压灭菌完之后所加100mL水的2％计算。具体操作：吸取2mL的菌液离心，弃其上清液，加入灭菌水进行洗涤，离心，重复2-3次，然后用2mL的灭菌水将菌洗入大米汁中进行发酵米酒。

将酿酒酵母CRR_GJM、VIC和鲁氏结合酵母SC01单一和成对接种于大米汁体系中进行发酵，研究其各组的糖代谢能力。

用DNS法和折光仪分别测还原糖和蔗糖的含量，以此观察糖代谢的能力。

DNS法测还原糖的具体操作如下：

1mg/mL葡萄糖标准溶液：取适量葡萄糖，100℃下烘干2h。称取0.1000g葡萄糖于小烧杯中，加适量蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中定容。

绘制葡萄糖标准曲线：吸取0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL，1.2mL，1.4mL，1.6mL葡萄糖标准溶液(1mg/mL)，分别置入25mL比色管中，并补水至2mL，加1.5mLDNS溶液，摇匀后于沸水浴中加热5min，取出，冷却至室温，用无菌水定容至25mL，波长540nm，1cm比色皿，0号管为空白，测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

样品测定方法：取以适当倍数稀释后的(离心)样品溶液1mL置于25mL比色管中，补水至2mL，加1.5mLDNS溶液，充分摇匀，沸水浴加热5min，取出，用流动的水迅速冷却至室温，用无菌水定容至25mL，波长540nm，试剂空白，测定吸光度，再由稀释倍数换算出样品的糖含量。

6组不同菌株处理的发酵米酒中葡萄糖和蔗糖代谢结果如图4所示。

如图4a从不同处理组之间葡萄糖的代谢情况可以看出，在起始葡萄糖含量相同的情况下，米酒发酵1-2小时，CRR_GJM、CRR_GJM+VIC和CRR_GJM+SC01处理的米酒，相比其他菌株处理的米酒葡萄糖含量较低，说明CRR_GJM、CRR_GJM+VIC和CRR_GJM+SC01在发酵米酒中具有较强的葡萄糖代谢能力。

如图4b从不同处理组之间蔗糖的代谢情况可以看出，CRR_GJM和CRR_GJM+SC01处理的米酒，在第2天时，其蔗糖含量为4％，相比于其他组的米酒蔗糖含量低。第3天时，蔗糖含量分别为2.6％和2.8％，也处于一个较低的水平。说明酿酒酵母CRR_GJM在米酒体系中能快速代谢葡萄糖和蔗糖，具有较高的糖代谢能力，是提高酿造米酒品质的潜在菌株。

其中，酿酒酵母VIC购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC32883；鲁氏结合酵母SC01购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC1379；CRR_GJM+SC01为酿酒酵母CRR_GJM和商业的鲁氏结合SC01酵母按照1：1的比例共接种在米酒中；CRR_GJM+VIC酿酒酵母CRR_GJM和商业酿酒酵母VIC按照1：1的比例共接种在米酒中。

实施例5：酿酒酵母产乙醇能力的比较

(1)将大米清洗至没有白色出现，浸泡24h。

(2)沥干水分，称取25g大米和50mL蒸馏水加入到250mL的锥形瓶中，进行高压蒸煮20min，控制温度在70℃，倒入70℃的100mL的灭菌水；

然后加α-淀粉酶0.025g，保温70℃、2小时，冷却至60℃后加糖化酶0.05g保温30min，加入蛋白酶0.0125g，中途隔段时间搅拌。

(3)最后，按接种量为高压灭菌完之后所加100mL水的2％计算。具体操作：吸取2mL的菌液离心，弃其上清液，加入灭菌水进行洗涤，离心，重复2-3次，然后用2mL的灭菌水将菌洗入大米汁中进行发酵米酒。

米酒发酵7天结束，在此过程中每隔24h测一次酒精含量，不同处理组的米酒产乙醇的能力有明显的差异，如下图5。

其中，用蒸馏法测定乙醇的含量。

由下表1可以看出，在米酒发酵24小时，酿酒酵母CRR_GJM和VIC产酒精含量分别为3.1％vol和0.1％vol，酿酒酵母CRR_GJM产乙醇的速率较酿酒酵母VIC提高了30％，因此，酿酒酵母CRR_GJM是一株快速发酵产乙醇的菌株，可提高发酵米酒的效率。

表1酿酒酵母发酵米酒产生的乙醇含量

上表中CRR_GJM+SC01代表酿酒酵母CRR_GJM和鲁氏结合酵母SC01按1：1的比例同时添加到米酒中，VIC+SC01代表商业酿酒酵母VIC和鲁氏结合酵母SC01按1：1的比例同时添加到米酒中，CRR_GJM+VIC代表酿酒酵母CRR_GJM和商业酿酒酵母VIC按1：1的比例同时添加到米酒中。

实施例6：酿酒酵母在米酒酿造风味的改善

发酵液中的挥发性成分采用HS-SPME-GC-MS法测定，取2mL样品于15mL顶空瓶中，加入30μL2-辛醇(20ppm)作为内标，于60℃、600r/min条件下平衡20min。在相同的温度和转速，插入经老化的50/30μmDVB/CAR/PMDS萃取头顶空吸附30min。吸附结束后，将萃取头插入气相色谱仪(gaschromatography，GC)进样口，于250℃解吸15min。GC条件：起始温度为40℃保持3min，以4℃/min上升到150℃保持1min，再以8℃/min上升到250℃保持6min。以氦气为载气，进样口温度为250℃，进样时间1min。MS条件：离子源温度200℃，接口温度220℃，溶剂延迟时间1.5min，电离方式为EI，70eV扫描质量范围为33～500m/z，扫描速率为3.00scans/s。根据NIST11数据库检索选取相似度≥80％的化合物，并结合离子碎片及保留指数进行定性。

在单菌和混菌发酵米酒时，产生多种挥发性风味物质，并且各组之间存在明显的差别，如下图6。由下表2可以看出，在单菌处理的米酒中，酿酒酵母CRR_GJM相比于酿酒酵母VIC发酵的米酒醇类含量提高了4.46倍，酯类含量提高了25％。按照1：1的比例同时接种进行混菌发酵米酒，由CRR_GJM+SC01处理的米酒醇类物质和酯类物质分别为56.339mg/L和106.781mg/L，CRR_GJM+VIC处理的分别为20.743mg/L和69.711mg/L都高于未有CRR_GJM处理的米酒。说明酿酒酵母CRR_GJM具有快速发酵产醇和提高酯类含量的能力，与感官评价分析相一致。

表2酿酒酵母发酵的风味物质变化

上表2中CRR_GJM+SC01代表酿酒酵母CRR_GJM和鲁氏结合酵母SC01按1：1的比例同时添加到米酒中，VIC+SC01代表商业酿酒酵母VIC和鲁氏结合酵母SC01按1：1的比例同时添加到米酒中，CRR_GJM+VIC代表酿酒酵母CRR_GJM和商业酿酒酵母VIC按1：1的比例同时添加到米酒中。

实施例7：酿酒酵母发酵米酒的感官评价

酿造米酒感官特性表对不同菌株处理发酵的米酒指定了风味物质的感官评价表。然后选择了10名训练有素的小组成员来评估米酒样本的香气物质。并且团队成员在正式感官评估之前接受了几次训练，训练包括定义和描述。最后将样品(50mL)用3位数标记，放入一个塑料杯中进行感官评价。

感官评价结果如图7所示，可以看出酿酒酵母CRR_GJM处理过的米酒较其他组别，醇类和酯类的得分较高，因此，醇香和酯香的更加浓厚，与GC-MS测的挥发性物质相一致。表明酿酒酵母CRR_GJM的加入提升了液态米酒酿造的整体风味，快速产乙醇和酯类物质含量的提高赋予了米酒醇香和浓郁的酯香。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CRR_GJM，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M20222014，保藏地址为：中国·武汉市·武汉大学。

2.权利要求1所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CRR_GJM在制备发酵米酒中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：包括，通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CRR_GJM发酵制备米酒，快速代谢米酒中的糖类物质；其中，糖类物质包括葡萄糖和蔗糖。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：包括，通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CRR_GJM发酵制备米酒，增加醇类风味物质含量。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于：包括，通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CRR_GJM发酵制备米酒，提高酯类风味物质含量。