CN111961603B - 酿酒酵母和菌剂以及它们在制备发酵产品特别是怀涿盆地葡萄酒酿造中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及酿酒酵母和菌剂以及它们在制备发酵产品特别是怀涿盆地葡萄酒酿造中的应用。该酿酒酵母的保藏号为CGMCC No.20562。本发明提供的酿酒酵母发酵性能良好，产香能力强，且具有较高的耐受性。

Description

酿酒酵母和菌剂以及它们在制备发酵产品特别是怀涿盆地葡 萄酒酿造中的应用

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一株酿酒酵母，一种菌剂，所述酿酒酵母或所述菌剂在制备发酵产品中的应用，一种发酵制备葡萄酒的方法，所述方法发酵得到的发酵葡萄酒，一种发酵产品。

背景技术

葡萄汁发酵成为葡萄酒是一个复杂的微生物反应过程，在这个过程当中，有多种菌株参与，其中酵母菌在发酵过程中扮演重要角色。酵母菌不仅将葡萄果实中的糖转化为酒精，同时还产生对葡萄酒香气和口感有很大贡献的多种代谢物质，直接决定了葡萄酒的最终品质，酵母性状的好坏直接影响到酒质的优劣。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是推动葡萄酒酒精发酵最主要的一种酵母菌，其在生长代谢过程中产生多种发酵香气物质，包括醇类、酯类、酸类、醛类、萜烯类物质等，赋予了葡萄酒独特而又复杂的风味，是其香气构成的关键成分。醇类物质主要为高级醇，包括苯乙醇、异戊醇、异丁醇等，适宜浓度（<400 mg/L）的高级醇可增加葡萄酒香气复杂性。酯类物质分为乙酸酯类化合物和乙酯类化合物，前者主要包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯，后者主要包括乳酸乙酯等。其中乙酸乙酯赋予葡萄酒果香，乙酸异戊酯可为葡萄酒带来香蕉味，乳酸乙酯具有青苹果味。这些酯类物质在葡萄酒中的含量较高，对葡萄酒香气影响较大。

为了保持葡萄酒的风土特性，一些旧世界葡萄酒生产国的酒庄仍使用自然发酵法酿造葡萄酒，但该发酵方式起酵慢，产品品质不稳定且难控制，不适合大规模工业化生产。因此，近年来，一些新世界葡萄酒生产国开始使用人工筛选的酵母进行纯种发酵，在提高生产效率及可控性的同时，亦能提高凸显产地葡萄酒独特风格的风味物质，赋予当地葡萄酒丰富的本土特色。我国在葡萄酒酵母的研究利用方面起步较晚，为了加强对发酵环境的控制，降低腐败风险并应对葡萄酒香气不可预测的变化，当前我国葡萄酒厂在酿造中普遍采用商业活性干酵母进行发酵。但一些研究表明，连续使用商业酵母显著降低了本土酵母菌株的多样性和葡萄酒的香气复杂性，对葡萄酒的风土特征带来不良影响。为了改善葡萄酒的香气品质，突出葡萄酒的产区风格，本土酵母的分离筛选成为近年来国内的研究热点。本土酵母很好地适应了葡萄酒产区的微气候，并具有独特的区域特性，很大程度上影响葡萄酒最终的香气特性和口感风味特性。中国本土酵母种质资源丰富，多样性好，本土酵母的筛选和应用可以释放出更多具有产区特色甚至地块特色的风味物质，充分发挥葡萄酒的风土特征。另一方面，开发本土酵母资源可以改变目前国外商业酵母“垄断”葡萄酒发酵工艺的局面，完善产业链条，降低生产成本。

怀涿盆地属于温带大陆性季风气候，具有四季分明、雨热同季等特点。种植葡萄的土壤以卵石、沙土和粗骨土为主，疏松多孔、排水效果良好、矿物质浓度丰富。独特的地质地貌特性，造成了盆地内独特的气候特点，为葡萄的生长提供了绝佳的生存条件，十分适合葡萄生长、酿造品质优良的葡萄酒。怀涿盆地的葡萄栽培时间长，气候稳定，形成产区特有的微生物菌群。目前国内本土酵母主要是广适性筛选，针对特定产区筛选能够发挥产区特色酵母的研究相对较少，而怀涿盆地产区本土优良酵母的筛选仍处于起步阶段。随着当地葡萄酒产业的快速发展，加强怀涿盆地产区酿酒酵母资源的开发与利用迫在眉睫，开发能突出产区风格的酵母菌株对当地葡萄酒产业的发展具有重要意义。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供了一株酿酒酵母、一种菌剂、所述酿酒酵母或所述菌剂在制备发酵产品中的应用、一种发酵制备葡萄酒的方法、所述方法发酵得到的发酵葡萄酒和一种发酵产品。本发明提供的酿酒酵母发酵性能良好，产香能力强，且具有较高的耐受性。

因此，本发明第一方面提供一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），该酿酒酵母的保藏号为CGMCC No.20562。

本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

本发明第三方面提供如上所述的酿酒酵母或如上所述的菌剂在制备发酵产品中的应用。

本发明第四方面提供一种发酵制备葡萄酒的方法，该方法包括：将如上所述的酿酒酵母或如上所述的菌剂接种至含有葡萄汁的培养基中进行发酵，得到发酵葡萄酒。

本发明第五方面提供如上所述的方法发酵得到的发酵葡萄酒。

本发明第六方面提供一种发酵产品，该发酵产品含有如上所述的酿酒酵母或如上所述的菌剂，或者由如上所述的酿酒酵母或如上所述的菌剂发酵得到。

通过本发明的技术方案，能够获得如下的有益效果：

（1）本发明提供的酿酒酵母（简称SG15）具有较高的抗胁迫能力，可在16%v/v的酒精，600 g/L葡萄糖，pH 1.5，350 mg/L二氧化硫的条件下正常生长发酵。该菌株还可在低温（10℃）下启动发酵，可保证葡萄酒的正常酿造生产。

（2）与商业酵母RX60（RX60，法国Laffort公司生产，常用于干红葡萄酒酿造）相比，利用本发明提供的酿酒酵母生产出的干红葡萄酒优点在于，在怀涿盆地产区干红葡萄酒生产过程中，其发酵速度快，得到的葡萄酒中糖含量小于4 g/L，酒精含量为10-14%v/v，甘油产量6-10 g/L，硫化氢、乙酸等对葡萄酒风味不利的代谢物质产量较低，口感更具有复杂性。与此同时，该酵母总酯类物质产量更高，而总高级醇产量适中，具有更强的产香能力，由该酵母产生的酯类物质的总含量为81.28 mg/L，比对照商业酵母高出近13 mg/L，其中乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯明显高于商业对照，赋予干红葡萄酒更加丰富的果香味，对怀涿盆地干红葡萄酒品质的稳定和提高，以及发挥该产区西拉等干红葡萄酿造潜力均发挥重要作用。

（3）通过感官评价，与商业酵母VL2（VL2，法国Laffort公司生产，常用于干白葡萄酒酿造）相比，利用本发明提供的酿酒酵母生产出的干白葡萄酒优点在于，其果香浓郁新鲜，同时充满花香，香气层次丰富，复杂度高，充分地体现了怀涿盆地雷司令干白葡萄酒的典型品质。与商业酵母RX60相比，利用本发明提供的酿酒酵母生产出的干红葡萄酒优点在于，其有丰富的红色水果和黑色水果香，特别是黑李子、黑莓的味道；还有丰富的花香，紫罗兰香气，以及胡椒味，香气复杂优雅，有变化性；入口比较圆润，酸度适中，余味悠长。充分地体现了怀涿盆地西拉干红葡萄酒的典型品质，表现出了良好的酿酒品质。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），于2020年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.20562，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所（缩写为CGMCC），简称为SG15。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明酿酒酵母在YDP培养基上的菌落形态；

图2为本发明酿酒酵母在WL营养琼脂培养基上的菌落形态；

图3为本发明酿酒酵母的乙醇耐受性曲线；

图4为本发明酿酒酵母的糖耐受性曲线；

图5为本发明酿酒酵母的二氧化硫耐受性曲线；

图6为本发明酿酒酵母的pH耐受性曲线；

图7为本发明酿酒酵母的温度耐受性曲线；

图8为酿酒酵母SG15与商业酵母RX60细胞生长曲线；

图9为酿酒酵母SG15与商业酵母RX60糖消耗曲线；

图10为使用酿酒酵母SG15与商业酵母VL2发酵罐酿造的干白葡萄酒的感官评定结果；

图11为使用酿酒酵母SG15与商业酵母RX60发酵罐酿造的干红葡萄酒的感官评定结果。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），该酿酒酵母的保藏号为CGMCC No.20562。

本发明所述的酿酒酵母CGMCC No.20562是从我国怀涿盆地沙城产区自然发酵的酿酒葡萄醪中筛选出的可用于食品的安全菌株。

具体的，本发明从我国怀涿盆地沙城产区自然发酵的酿酒葡萄醪中，在发酵不同阶段取样，梯度稀释分离后涂布平板，培养得到大量葡萄酒酵母单菌落。从中选取数株酵母进一步纯种培养、鉴定、性能评价并进行小型发酵试验对比得到一株发酵性能良好，产香能力强，能够突出产区风格的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），编号为SG15。

所述酿酒酵母CGMCC No.20562的形态学特征为：在YDP固体培养基上生长的菌落为乳白色，圆形，有光泽，边缘整齐，粘稠，易挑起；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色，菌落球形突起，表面光滑、不透明，奶油状。

本发明提供的酿酒酵母CGMCC No.20562的ITS rDNA序列如SEQ ID NO:1所示，与NCBI中数据比对，菌株SG15与Saccharomyces cerevisiae有100%的同源性。

SEQ ID NO:1：

ACCGGGGGATTGCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACCACGGACCA

本发明提供的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），于2020年8月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.20562，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所（缩写为CGMCC），简称为SG15。

本发明提供的酿酒酵母经过液体培养能够产生大量酿酒酵母活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述酿酒酵母增殖即可，例如可以按照10^5-7CFU/mL的接种量将酿酒酵母的活菌体接种于酿酒酵母培养基中，并且在好氧条件下，在25-40 ℃的温度下培养8-24小时后，得到培养液。所述酵母的培养基可以为本领域公知的各种适合酿酒酵母培养的培养基，例如可以为糖蜜、5^oBé麦芽汁和YPD培养基中的至少一种。

其中，所述YPD培养基可以是本领域常规使用的YPD培养基，优选地，其组成包括：酵母膏5-20g/L，蛋白胨10-40g/L，葡萄糖10-50g/L。若为固体培养基时，还含有琼脂15-20g/L。可以在115℃灭菌15min。

本发明可以进一步分离上述培养液中的酿酒酵母的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

第二方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

根据本发明，所述菌剂的形式可以不受特别的限制，比如可以为液体菌剂、半液体菌剂、浓缩菌剂、压缩菌剂或固体菌剂。其中，固体菌剂可以是干燥菌剂，例如，可以为冻干菌剂、喷雾干燥菌剂等。

优选地，该菌剂含有所述酿酒酵母的活菌体。所述菌剂中活菌体的数量可以在较宽的范围内选择，只要满足相关标准的要求即可，优选地，所述菌剂中活菌体的含量在2亿cfu/g菌剂以上。

根据本发明，所述菌剂可以按照本领域常规的方法进行制备，根据本发明一种具体的实施方式，所述菌剂的制备方法包括：将如上所述的酿酒酵母菌在发酵培养基中进行发酵培养，并使活菌数达到10⁸cfu/mL以上，得到液体菌剂；将所述液体菌剂浓缩，例如，通过固液分离，得到半液体菌剂；然后向所述半液体菌剂中加入冻干保护剂，并调整活菌浓度至10¹⁰cfu/mL以上，并将所得混合物料干燥后得到干燥菌剂。

根据本发明，所述发酵培养基可以为本领域常规的各种用于发酵酿酒酵母的发酵培养基，例如，可以为如上所述的YPD培养基，也可以为麦汁培养基和糖蜜培养基等各种适合于发酵酿酒酵母的培养基。

根据本发明，所述发酵培养的条件可以为本领域公知的常规的用于酵母发酵培养的条件，例如，所述发酵培养的温度可以为25-40℃。

根据本发明，所述固液分离的方法可以参照本领域常规的技术手段，例如，可以为离心、过滤等，只要不显著影响酿酒酵母的活性即可。根据本发明一种优选的实施方式，对所述发酵菌液进行离心以得到半液体菌剂。所述离心，例如，可以在冷冻离心机中以5000-12000rpm的速度离心5-20min获得菌体沉淀，从而得到半液体菌剂。

根据本发明，所述冻干保护剂可以为本领域常规的各种冷冻保护剂，例如，可以为脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油等中的至少一种。

根据本发明，优选的，在向所述半液体菌剂中加入冻干保护剂之前，优选的，该方法还包括使用缓冲液对所述半液体菌剂进行洗涤。其中，所述缓冲液可以为本领域常规的用于对菌体进行冲洗的缓冲液，例如，可以为生理盐水或PBS缓冲液。

其中，所述干燥的方式可以不受特别的限制，比如可以为冻干、烘干、风干或喷雾干燥等方式。

根据本发明，所述菌剂还可以根据实际情况引入其他菌种，例如，其他的酵母菌，乳酸菌等。

第三方面，本发明提供了如上所述的酿酒酵母或如上所述的菌剂在制备发酵产品中的应用。

根据本发明，所述发酵产品可以为任意的需要使用酿酒酵母进行发酵而制备的产品，例如，发酵饮料，发酵啤酒、发酵面食（馒头、面包等）、发酵葡萄酒等等。

根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵产品为葡萄酒，更优选为干红葡萄酒或干白葡萄酒。

优选的，所述干红葡萄酒的酿造原料为西拉葡萄和/或雷司令葡萄，更优选为来自怀涿盆地产区的西拉葡萄。

优选的，所述干白葡萄酒的酿造原料为雷司令葡萄，更优选为来自怀涿盆地产区的雷司令葡萄。

第四方面，本发明提供了一种发酵制备葡萄酒的方法，该方法包括：将如上所述的酿酒酵母或如上所述的菌剂接种至含有葡萄汁的培养基中进行发酵，得到发酵葡萄酒。

根据本发明，所述发酵的条件可以为常规的发酵制备葡萄酒的条件，例如，温度为10-40℃，pH值为1.5-5。

优选的，所述发酵在搅拌的条件下进行。

所述发酵结束的标准可以参照常规葡萄酒发酵结束标准，例如，当还原糖浓度<4g/L时结束发酵。

根据本发明一种优选的实施方式，所述葡萄酒为干红葡萄酒或干白葡萄酒。

优选的，所述干红葡萄酒的酿造原料为西拉葡萄和/或雷司令葡萄，更优选为来自怀涿盆地产区的西拉葡萄。

优选的，所述干白葡萄酒的酿造原料为雷司令葡萄，更优选为来自怀涿盆地产区的雷司令葡萄。

根据本发明一种优选的实施方式，所述葡萄汁的还原糖浓度为200-250g/L，总酸量为5.5-6.5 g/L。

根据本发明，如上所述的酿酒酵母或如上所述的菌剂的接种量使得所述含有葡萄汁的培养基中所述酿酒酵母初始浓度为10⁵-10⁷CFU/mL。

根据本发明，优选地，所述酿酒酵母在接种前先经过活化处理，得到酿酒酵母活化液。

所述活化的方法可以为本领域常规的活化方法，优选地，所述活化的方法包括：将酿酒酵母菌种接种到活化培养基中，在好氧条件、28-32℃下培养36-48h。

在本发明的一种优选的实施方式中，将本发明的酿酒酵母分别YPD固体和液体培养基上传代，从YPD平板上挑取菌株接入装有已灭菌液体YPD培养基的三角瓶中，摇床（180rpm，30℃）培养20-30 h，然后按10⁵-10⁷CFU/mL接种于葡萄汁中，静置20-30 h，回温至20-25℃后得到活化的SG15。

第五方面，本发明提供了如上所述的方法发酵得到的发酵葡萄酒。

第六方面，本发明提供了一种发酵产品，该发酵产品含有如上所述的酿酒酵母或如上所述的菌剂，或者由如上所述的酿酒酵母或如上所述的菌剂发酵得到。

根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵产品为葡萄酒，更优选为干红葡萄酒或干白葡萄酒。

优选的，所述干红葡萄酒的酿造原料为西拉葡萄和/或雷司令葡萄，更优选为来自怀涿盆地产区的西拉葡萄。

优选的，所述干白葡萄酒的酿造原料为雷司令葡萄，更优选为来自怀涿盆地产区的雷司令葡萄。

实施例

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中YPD固体培养基配方如下：

酵母提取物，10 g/1000 mL；葡萄糖，20 g/1000 mL；蛋白胨，20 g/1000 mL；琼脂，1.5 g/1000 mL；自然pH值，121℃，灭菌15 min。

下述实施例中WL营养琼脂培养基配方如下：

酵母浸粉4g/1000 mL；氯化铁0.0025g/1000 mL；葡萄糖50g/1000 mL；硫酸锰0.0025g/1000 mL；氯化钾0.425g/1000 mL；溴甲酚绿0.022g/1000 mL；氯化钙0.125 g/1000 mL；琼脂20g/1000 mL；硫酸镁0.125g/1000 mL；酸水解酪蛋白5g/1000 mL；磷酸二氢钾0.55g/1000 mL； pH5.5.±0.2；121℃高压灭菌15min。

下述实施例中BIGGY培养基配方如下：

柠檬酸铋铵 5g/1000mL；亚硫酸钠3 g/1000mL；葡萄糖10 g/1000mL；甘氨酸10 g/1000mL；酵母浸粉1 g/1000mL；琼脂16 g/1000mL；pH 6.8±0.2。煮沸不要超过1min，冷至45-50℃时，倾入无菌平皿，备用。

下述实施例中葡萄汁模拟培养基配方如下：

葡萄糖100g/1000 mL；果糖100g/1000 mL；酒石酸3g/1000 mL；柠檬酸0.3g/1000mL；L-苹果酸0.3g/1000 mL；硫酸铵0.3g/1000 mL；天冬酰胺0.6g/1000 mL；一水合硫酸锰4mg/1000 mL；一水合硫酸锌4mg/1000 mL；磷酸二氢钾2g/1000 mL；五水合硫酸铜1mg/1000mL；碘化钾1mg/1000 mL；硼酸1mg/1000 mL；（NH₄)6MO₇O₂₄·4H₂O1mg/1000 mL；COCl₂·6H₂O0.4mg/1000 mL；肌醇0.3g/1000 mL；生物素0.04mg/1000 mL；维生素B₁1mg/1000 mL；维生素B₆1mg/1000 mL；烟酸1mg/1000 mL；泛酸1mg/1000 mL；对氨基苯甲酸1mg/1000 mL；pH至5.8，过滤除菌。

实施例1

本实施例用于说明酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SG15菌株分离、纯化及其鉴定

使用怀涿盆地产区的西拉葡萄汁进行小试发酵，未杀菌的西拉葡萄汁加入发酵容器中至80%的体积，25℃恒温发酵。检测发酵过程中的还原糖含量，根据还原糖消耗量，在发酵不同阶段（糖消耗20%、50%、80%）取样，进行梯度稀释（10^-5、10^-6、10^-7）后涂布WL培养平板，获得大量葡萄酒酵母单菌落，从中挑选出在平板内长势比较好，生长较快，具有明显的形态特征，形成了较完整的单一菌落的209株。对获得的菌株进行菌落形态以及分子生物学鉴定（5.8 S-rDNA ITS方法），共鉴定出89株酿酒酵母和120株非酿酒酵母。使用高通量筛选平台评价筛选出耐受性强的10株酿酒酵母，对其各种酿造特性进行研究，在500mL锥形瓶中进行发酵初筛。将10株酿酒酵母分别在葡萄汁模拟培养基中以1×10⁶ CFU/mL的接种量接种，25℃发酵静置培养10 d，主要对其发酵能力的指标进行了监测，通过监测生长曲线（OD_{600 nm}）和二氧化碳失重曲线，判断发酵的进程，根据斜率的大小评判发酵能力的强弱及发酵的快慢，综合筛选出发酵能力较强的一株酿酒酵母，编号为SG15。

该菌株经过形态学观察、5.8S-ITS rDNA基因扩增测序，对所有鉴定结果综合分析。具体鉴定结果如下：

（1）形态学观察方法和结果：经过48 h培养，SG15号菌株在YDP固体培养基上生长的菌落为乳白色，圆形，有光泽，边缘整齐，粘稠，易挑起（如图1所示）；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色，菌落球形突起，表面光滑、不透明，奶油状（如图2所示）。

（2）ITS鉴定：取菌株总DNA，采用真菌ITSrDNA通用引物进行PCR扩增，PCR扩增体系（50μL）：10×PCR Buffer：5.0 μL，10mMdNTPs：1 μL，10 μM引物各0.5 μL，模板（基因组）：3-5 μL，5U/μLTaqDNA聚合酶：0.2 μL，加ddH₂O至50 μL，混匀。

PCR扩增程序：95℃预变形5min；94℃变形1min，55.5℃退火2 min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min，降温至12℃，取出产物。

序列测定工作由扩增后的PCR产物送样测序，测序由生工生物工程（上海）有限公司完成，菌株SG15的ITSrDNA序列如SEQ ID NO.1 所示。

（3）鉴定结果

ITSrDNA测序结果与NCBI中数据比对，菌株SG15与Saccharomycescerevisiae有100%的同源性，结合生理生化鉴定结果，综合认定为酿酒酵母。

实施例2

本实施例用于说明酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SG15菌株耐受性评价

（1）菌株接种评价

将受试菌株单菌落接种于含无菌YPD液体培养基的96孔板中，30℃，200 rpm进行过夜培养。

1）乙醇浓度耐受性实验

将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至分别含6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%乙醇浓度的YPD培养基中进行乙醇浓度耐受性实验，30℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD_600nm值，绘制酿酒酵母的乙醇浓度耐受性曲线，如图3所示。

2）葡萄糖浓度耐受性实验

将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至分别含20%、30%、40%、50%、60%葡萄糖浓度的YPD培养基中进行葡萄糖浓度耐受性实验，30℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD_600nm值，绘制酿酒酵母的葡萄糖浓度耐受性曲线，如图4所示。

3）二氧化硫浓度耐受性实验

将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至分别含150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L二氧化硫浓度的YPD培养基中进行二氧化硫浓度耐受性实验，30℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD_600nm值，绘制酿酒酵母的二氧化硫浓度耐受性曲线，如图5所示。

4）pH耐受性实验

将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至分别含pH 1.5、pH 2.0、pH 2.5、pH3.0、pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0的YPD培养基中进行pH耐受性实验，30℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD_600nm值，绘制酿酒酵母的pH耐受性曲线，如图6所示。

5）温度耐受性实验

将96孔板中活化的菌株以3%的接种量转接至YPD培养基中进行温度耐受性实验，10℃、13℃、18℃、32℃、40℃、200 rpm过夜培养后，酶标仪测OD_600nm值，绘制酿酒酵母的温度耐受性曲线，如图7所示。

6）产硫化氢情况

将96孔板中活化的菌株点板至BIGGY培养基平板上，观察菌落生长情况。高产硫化氢的菌株可还原培养基中的亚硫酸铋，从而使菌落显褐色至黑色。根据菌落颜色评价酿酒酵母的产硫化氢情况。

（2）耐受性评价结果

结果表明（图3-图7），SG15可在16%v/v的酒精，600 g/L葡萄糖，pH 1.5，350 mg/L二氧化硫的条件下正常生长发酵。该菌株还可在低温（10℃）下启动发酵，可保证葡萄酒的正常酿造生产。SG15菌株不产硫化氢，不会给葡萄酒带来异味。

实施例3

本实施例用于说明酿酒酵母菌株（Saccharomyces cerevisiae）SG15号与商业酵母RX60酿酒效果对比实验

筛选得到的酿酒酵母SG15和商业酵母RX60在葡萄汁模拟培养基中的酿造特性的比较，具体方法如下：将保存于-80℃的自筛野生型酿酒酵母SG15和商业酿酒酵母RX60分别在YPD固体和液体培养基上传代，从YPD平板上挑取菌株分别接入装有100 mL已灭菌液体YPD培养基的三角瓶中，摇床（180 rpm，30℃）培养24 h，作为待接种的活化种子液。按10⁶CFU/mL接种于300 mL葡萄汁模拟培养基中（500 mL锥形瓶），初糖浓度200 g/L，以发酵栓液封，25℃条件下静置培养10-14 d，至最终糖含量＜4 g/L终止发酵。

按照下述方法检测葡萄酒的酿造特性：

发酵速率：斐林试剂法测定还原糖，监测糖消耗；

乙醇、果糖、葡萄糖、甘油、乙酸：液相色谱法（GB/T 15038-2006）；

酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量：用Agilent 6890 气相色谱（GC）和Agilent 5975 质谱（MS）联用仪（Agilent，美国）检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。具体条件为：毛细管柱HP-INNOWAX Polyethylene Glycol 60m×0.25mm×0.25μm（J&W scientific，美国）载气为高纯氦气，流速1 mL/min；顶空固相微萃取手动进样，采用不分流模式，插入气相色谱的进样口，进样口温度250℃，热解析25 min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5 min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2 min。质谱接口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式EI，离子能量70 ev，质量扫描范围20-450amu。

酿酒酵母SG15与商业酵母RX60细胞生长和糖消耗曲线分别见图8和图9。酿酒酵母SG15与商业酵母RX60在葡萄汁模拟培养基中酿造特性比较结果见表1及表2。

由细胞生长曲线（OD_600nm）（图8）可知，菌株SG15与商业菌株RX60的生长并没有很大的差异，当进入稳定期后，SG15的细胞量高于RX60，表明SG15具有较强的生长活力。糖消耗速度的快慢能够反映菌株的发酵活性，由图9可以看出，菌株SG15起酵速率和前期发酵速度高于RX60。SG15在发酵前期就开始呈现出较明显的糖下降趋势，且该趋势明显快于商业对照RX60。发酵结束时，SG15葡萄酒最终糖度为1.5g/L，比RX60（2.1 g/L）低0.6g/L，可以完成发酵（<4 g/L）。

两株菌酒精发酵后葡萄酒样的理化指标见表1所示。

表1测试菌株酒精发酵后葡萄酒样的理化指标

两株菌发酵完成后主要挥发性香气成分种类和含量的比较，见表2所示。

表2酿酒酵母SG15和对照商业菌株RX60酒精发酵后香气物质浓度

经过摇瓶发酵实验，对得到的酒样进行了一系列理化成分的检测以及香气成分种类和含量的测定，从表1和表2可以看出：除了糖浓度，SG15的糖含量低于RX60，其甘油产量显著高于对照商业菌株RX60，可增加葡萄酒圆润的口感。SG15在10d内完成发酵，残糖含量低于4g/L，符合干型葡萄酒的指标要求，表明SG15的酿造特性良好。由SG15所酿造得到的葡萄酒香气成分（表2）可知，该酵母高级醇产量、总酯产量高于商业酵母，且高级醇含量未超过不良风味最高值（400mg/L），具有更强的产香能力。由该酵母产生的酯类物质的总含量81.28mg/L，比对照商业酵母分别高出近13mg/L，其中乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯和乳酸乙酯明显高于商业对照，属于高产酯类的菌株。乳酸乙酯可为葡萄酒带来清甜的、带有酸味的水果香气，低浓度时具有菠萝和乳脂的味道；乙酸乙酯具有果香、酯香；乙酸异戊酯具有香蕉味，乙酸苯乙酯具有果香和玫瑰花香。SG15的苯乙醇产量也较高（160.52mg/L），比商业对照（121.94mg/L）高出近40mg/L，该物质可为葡萄酒带来玫瑰花和蜂蜜味。除此之外，SG15发酵所得葡萄酒中的酸类物质含量适中，保持葡萄酒的香气平衡。丰富的酯类物质、高级醇类物质及与其它挥发性组分相配合使得葡萄酒的整体香气得到了更好的体现，同时也构成了葡萄酒香气的特殊性。

由此可见，本实验优选得到的酿酒酵母SG15不仅能快速地完成整个葡萄酒的酿造过程使其符合国家标准，同时能够有效的提升葡萄酒香气，增加葡萄酒的香气浓郁性和复杂性。

实施例4

本实施例用于说明100 L发酵罐酿造的雷司令干白葡萄酒感官评定

筛选得到的酿酒酵母SG15和商业酵母VL2在怀涿盆地雷司令葡萄汁中的酿造特性的比较，葡萄汁还原糖含量（以葡萄糖计），221.09±0.45g/L；总酸量（以酒石酸计），6.63±0.35g/L。

具体方法如下：将保存于-80℃的自筛野生型酿酒酵母SG15和商业酿酒酵母VL2分别在YPD固体和液体培养基上传代，从YPD平板上挑取菌株分别接入装有100 mL已灭菌液体YPD培养基的三角瓶中，摇床（180 rpm，30℃）培养24 h，作为待接种的活化种子液。按10⁶CFU/mL接种于10 L雷司令葡萄汁中，静置24h，回温至22℃后得到活化的SG15和商业酵母VL2。将活化好的种子液加入100 L发酵罐中进行发酵，发酵结束（还原糖浓度<4g/L）后取样进行感官评价。

针对100 L发酵酿造酒样进行了专业的专家感官品评，十名专家有来自企业的国家级葡萄酒品酒师（五位），来自国内高校多年从事葡萄酒研究的教授、副教授（两位），葡萄酒专业硕士、博士研究生（三人），具有较高的权威性和合理性。各位品评人员对所试酒样给出的评分（取平均值）结果见图10及表3。

表3100 L发酵葡萄酒感官评定评分结果（专家盲评）

从感官评定评分结果看出，综合葡萄酒的香气和口感等各项指标的综合指标，十位专家给予了由SG15菌株所酿造的雷司令干白葡萄酒更高的评价，认为其在整体品质上优于由商业对照VL2。认为其充分地体现了怀涿盆地雷司令干白葡萄酒的典型品质，其果香浓郁新鲜，同时充满花香，香气层次丰富，复杂度高，表现出了良好的酿酒品质。

实施例5

本实施例用于说明100 L发酵罐酿造的西拉干红葡萄酒感官评定

筛选得到的酿酒酵母SG15和商业酵母RX60在怀涿盆地西拉葡萄汁中的酿造特性的比较，葡萄汁还原糖含量（以葡萄糖计），233.15±1.32g/L；总酸量（以酒石酸计），6.79±0.62g/L。

具体方法如下：将保存于-80℃的自筛野生型酿酒酵母SG15和商业酿酒酵母RX60分别在YPD固体和液体培养基上传代，从YPD平板上挑取菌株分别接入装有100 mL已灭菌液体YPD培养基的三角瓶中，摇床（180 rpm，30℃）培养24 h，作为待接种的活化种子液。按10⁶CFU/mL接种于10 L西拉葡萄汁中，静置24h，回温至22℃后得到活化的SG15和商业酵母RX60。将活化好的种子液加入100 L发酵罐中进行发酵，发酵结束（还原糖浓度<4g/L）后取样进行感官评价。

针对100 L发酵酿造酒样进行了专业的专家感官品评，十名专家有来自企业的国家级葡萄酒品酒师（五位），来自国内高校多年从事葡萄酒研究的教授、副教授（两位），葡萄酒专业硕士、博士研究生（三人），具有较高的权威性和合理性。各位品评人员对所试酒样给出的评分（取平均值）结果见图11及表4。

表4 100 L发酵葡萄酒感官评定评分结果（专家盲评）

从感官评定评分结果看出，综合葡萄酒的香气和口感等各项指标的综合指标，十位专家给予了由SG15菌株所酿造的干红葡萄酒更高的评价，认为其在整体品质上优于由商业对照RX60。认为其充分地体现了怀涿盆地西拉干红葡萄酒的典型品质，适口的同时香气更显浓郁怡人，给人带来愉悦的感觉，表现出了良好的酿酒品质。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中粮营养健康研究院有限公司

中粮长城桑干酒庄(怀来)有限公司

<120> 酿酒酵母和菌剂以及它们在制备发酵产品特别是怀涿盆地葡萄酒酿造中的应用

<130> I64885COF

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 588

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

accgggggat tgcttagtaa cggcgagtga agcggcaaaa gctcaaattt gaaatctggt 60

accttcggtg cccgagttgt aatttggaga gggcaacttt ggggccgttc cttgtctatg 120

ttccttggaa caggacgtca tagagggtga gaatcccgtg tggcgaggag tgcggttctt 180

tgtaaagtgc cttcgaagag tcgagttgtt tgggaatgca gctctaagtg ggtggtaaat 240

tccatctaaa gctaaatatt ggcgagagac cgatagcgaa caagtacagt gatggaaaga 300

tgaaaagaac tttgaaaaga gagtgaaaaa gtacgtgaaa ttgttgaaag ggaagggcat 360

ttgatcagac atggtgtttt gtgccctctg ctccttgtgg gtaggggaat ctcgcatttc 420

actgggccag catcagtttt ggtggcagga taaatccata ggaatgtagc ttgcctcggt 480

aagtattata gcctgtggga atactgccag ctgggactga ggactgcgac gtaagtcaag 540

gatgctggca taatggttat atgccgcccg tcttgaaacc acggacca 588

Claims (11)

1.一株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其特征在于，该酿酒酵母的保藏号为CGMCC No. 20562。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

3.权利要求1所述的酿酒酵母或权利要求2所述的菌剂在制备发酵产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述发酵产品为发酵葡萄酒。

5.一种发酵制备葡萄酒的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的酿酒酵母或权利要求2所述的菌剂接种至含有葡萄汁的培养基中进行发酵，得到发酵葡萄酒。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为10-40℃，pH值为1.5-5。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述葡萄汁来自怀涿盆地葡萄。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述怀涿盆地葡萄为雷司令葡萄和/或西拉葡萄。

9.权利要求5-8中任意一项所述的方法发酵得到的发酵葡萄酒。

10.一种发酵产品，其特征在于，该发酵产品含有权利要求1所述的酿酒酵母或权利要求2所述的菌剂，或者由权利要求1所述的酿酒酵母或权利要求2所述的菌剂发酵得到。

11.根据权利要求10所述的发酵产品，其中，所述发酵产品为发酵葡萄酒。

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