KR102028683B1

KR102028683B1 - 초산 발효능을 갖는 신규한 아세토박터 파스퇴리아누스 균주 및 그를 이용한 발효식초의 제조방법

Info

Publication number: KR102028683B1
Application number: KR1020170039860A
Authority: KR
Inventors: 이하연; 이재형; 권혜정; 안문섭; 박지선; 홍진호
Original assignee: 강원도; 농업회사법인 주식회사 부일농산
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2019-10-07
Also published as: KR20180110393A

Abstract

본 명세서는 신규한 초산 균주 및 그를 이용한 발효식초, 음료베이스, 음료, 및 이들의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 특유의 생육 특징을 갖는 신규한 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus) 균주와 이를 이용하여 초산 발효시켜 얻은 발효식초, 음료베이스 및 음료, 이들의 제조방법에 관한 것이며, 이를 활용하여 소비자의 성향과 웰빙 트렌드에 맞는 다양한 식초 제품의 생산이 가능하고, 국민건강 증진에 기여할 수 있을 것이다.

Description

초산 발효능을 갖는 신규한 아세토박터 파스퇴리아누스 균주 및 그를 이용한 발효식초의 제조방법{NOVEL ACETOBACTER PASTEURIANUS STRAIN CAPABLE OF ACETIC ACID FERMENTATION AND MANUFACTURING METHOD OF FERMENTED VINEGAR USING IT}

본 명세서는 초산 발효능을 갖는 신규한 아세토박터 파스퇴리아누스 균주, 이를 이용한 발효식초, 이를 이용한 음료 및 음료베이스의 제조방법에 관한 것이다.

식초는 주성분으로 아세트산을 함유하여 시고 약간 단맛이 있는 천연 조미료로, 음식물의 산성농도를 저하시켜 보존력을 높이고, 신맛을 통해 소화액의 분비를 자극시켜 입맛을 돋우며, 인체의 에너지 대사에 관여하여 피로를 빠르게 회복시켜 주는 특징이 있다고 알려져 있다.

또한 식초에는 아세트산, 구연산, 각종 아미노산 등 여러 유기산이 들어 있어 신진대사를 활발하게 해주며 체내 노폐물을 없애는 데 도움이 되고, 변비 예방에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 특히 식초 속 유기산들은 강력한 보존 작용과 살균작용을 하는 것으로도 잘 알려져 있다.

식초는 원료에 따라 크게 합성식초와 양조식초로 나누고, 양조식초는 다시 주정식초와 곡물식초와 과실식초로 나눌 수 있다. 상기 양조식초 중 전통누룩 곡자를 당화발효제로 자연발효시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 곡자 발효식초는 우리 고유의 전통식초로, 그 종류로는, 전통누룩 곡자와 곡물을 혼합 발효시켜 제조하는 곡물발효식초, 곡자와 곡물에 과일이나 약재 등의 부재료를 적당량 첨가하여 제조하는 혼합발효식초, 과일이나 약재 등에 곡자를 혼합하여 발효시킨 기타 발효식초로 세분화 할 수 있다.

초산균은 에탄올을 이용하여 초산을 생산할 수 있는 미생물로, 초산균에는 알코올을 산화하여 초산을 만드는 균과 포도당을 산화하여 글루콘산이나 케토산을 만드는 균으로 나누어진다. 전자는 Acetobacter, 후자는 Gluconobacter이다. Acetobacter는 Pseudomonadaceae에 속하는 호기성의 세균으로 타원 또는 단간상으로 세포는 단일 또는 짧은 연쇄상을 하고 있는 등 종류에 따라 다르다. 장기배양, 고온배양, 과잉식염, 알코올 첨가배양 등에 따라 실모양, 그래프 모양, 약간 부푼 것 등 특이한 모양을 보이는 경우도 있다. 포자는 형성하지 않지만 대부분은 액의 표면에 번식하여 균막을 만든다. 주편모나 극편모를 갖고 운동성이 있는 것과 편모를 갖지 않는 비운동성의 것이 있다. 젊은 세포는 Gram 음성이지만 오래된 세포는 Gram 양성이 되는 경우도 있다. Acetobacter속은 4종으로 분리되는데 A. aceti, A. liquefaciens, A. pasteurianus와 A. hansenii이다. Glucanobacter는 1속, 1종으로 글루콘산, 소르보스 등을 만든다.

초산발효는 초산균에 의하여 산화 반응을 하여 에틸 알코올에서 초산이 생기는 발효 현상을 말한다. 공기(산소)의 공급을 받아 행해지고, 식초의 제조에 이용하는 발효 과정이다. 상기 초산균은 초산을 비롯하여 TCA 순환(TCA cycle)에 관여하는 유기산을 다량 생산하므로, 상기 초산균에 의해 생성된 생성물은 체내에 젖산을 축적시키지 않고 TCA cycle을 순조롭게 진행시켜 과격한 운동이나 과로에 의한 피로회복에 좋으며, 혈액을 약 알칼리성으로 만들어 주는 작용을 한다. 상기 초산균에 대한 연구는 주로 양조식초와 관련되어 진행되어 왔다.

상기 초산균을 이용한 제품은 여러 가지 생리적 기능을 지니고 있는 것으로 보고되고 있다. 식초 함유 음료의 등장으로 인하여 현재 양조식초는 조미용 범위를 넘어 건강식품으로 선호되고 있고, 이러한 추세로 식초 및 식초 음료 시장규모는 점차 증가하고 있는 추세이다.

이러한 소비 추세와 웰빙 트렌드를 고려하여 다양한 제품 생산, 그 소비 촉진, 및 국민건강 증진에 기여할 수 있는 초산균주 연구 및 이를 이용한 제품 개발 노력이 지속되고 있으나 이를 충족시킬만한 성과가 미미한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0780653호(2007년11월23일)

본 명세서는 소비자의 성향과 웰빙 트렌드를 고려하여, 다양한 식초 제품을 생산하고 국민건강 증진에 기여할 수 있는 초산 균주를 발굴하고, 이를 이용한 식초 제품 및 식초 함유 제품을 개발하기 위한 것이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 명세서는 초산 발효능을 갖는 신규한 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus) 균주를 제공한다.

또한, 본 명세서는 상기 균주로 초산 발효시켜 얻은 발효식초를 제공한다.

또한, 본 명세서는 상기 발효식초를 포함하는 음료베이스 및 음료를 제공한다.

또한, 본 명세서는 상기 아세토박터 파스퇴리아누스 균주를 이용하여 초산 발효시키는 과정을 포함하는, 발효식초의 제조방법을 제공한다.

아울러, 본 명세서는 상기 발효식초를 과실청, 과실 착즙액, 과실 농축액, 올리고당, 구연산 및 정제수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는 곡물 추출물, 곡물 농축액, 곡물향, 올리고당, 구연산 및 정제수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상;과 배합하는 과정을 포함하는, 음료 또는 음료베이스의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따라, 다양한 발효식초 및 이를 이용한 식품을 제조할 수 있으므로, 소비자의 기호에 보다 부합하는 제품을 제공할 수 있게 되어 관련 산업 발전을 도모할 수 있고, 발효식초를 보다 널리 보급할 수 있어 국민건강 증진에도 기여할 수 있다.

도 1은 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus) AFY-4 균주의 16S rDNA 염기서열(서열번호 3)을 나타낸 것이다.
도 2는 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 계통수이다.
도 3은 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 주사전자현미경 관찰 사진이다.
도 4는 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 온도 조건에 따른 생육변화에 관한 그래프이다.
도 5는 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 pH 조건에 따른 생육변화에 관한 그래프이다.
도 6은 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 초기 알코올 도수 조건에 따른 생육변화에 관한 그래프이다.
도 7은 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 초기 산도에 따른 생육변화에 관한 그래프이다.
도 8은 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주로 제조한 다래 발효식초와 표준균주(Acetobacter pasteurianus KACC 17058)로 제조한 다래 발효식초 간의 대사체 생산 능력을 비교한 것이다.
도 9는 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주로 제조한 머루 발효식초와 표준균주(Acetobacter pasteurianus KACC 17058)로 제조한 머루 발효식초 간의 대사체 생산 능력을 비교한 것이다.
도 10은 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주로 제조한 현미 발효식초와 표준균주(Acetobacter pasteurianus KACC 17058)로 제조한 현미 발효식초 간의 대사체 생산 능력을 비교한 것이다.
도 11은 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주를 이용한, 세가지 색상을 나타내는 삼색 발효식초 식초, 음료베이스 및 음료 제조공정을 도식화한 것이다(“배합”은 음료베이스 또는 음료 제조를 위한 원료의 배합을 말한다).

본 명세서에서, 원료식초는 식초 또는 발효식초를 제조하기 위하여, 원료로 배합하거나 사용할 수 있는 식초를 말하며, 초산 발효능이 있는 균주가 상기 원료식초 등을 이용하여 발효과정을 거치면서 발효식초가 제조된다.

본 명세서에서, 알코올 발효물은 알코올 발효를 거친 결과물을 말하는데, 일반적으로 알코올 발효를 거쳐 제조된 주류를 포함한다. 상기 주류의 종류에는 제한이 없고, 과실주, 곡주, 증류주, 발효주 등을 포함하며, 바람직하게는 와인 또는 막걸리일 수 있다.

본 명세서에서, 과실청은 일정기간 동안 당류, 벌꿀 등에 절인 식물의 과실, 상기와 같이 절인 과실 내의 성분이 추출되거나 농축된 결과물 등을 포함한다. 본 발명의 일 측면에 의하면, 상기 과실청은 다래를 이용한 다래청, 머루를 이용한 머루청 등을 포함한다.

본 발명은 일 측면에서, 산도가 1.5 내지 2 %인 원료에 1.0 x 10⁸ 내지 1.0 x 10¹⁰cfu/mL의 균수로 접종하고 30 ℃에서 4주간 초산 발효시켰을 때 산도를 6.8 내지 7.4 %까지 증가시키는 초산 발효능을 갖는, 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus) 균주이다. 구체적으로 상기 산도는 7.42 내지 6.72 %로 증가될 수 있다.

일 측면에서, 상기 균수는 1 x 10⁸ cfu/mL 이상, 15 x 10⁸ cfu/mL 이상, 30 x 10⁸ cfu/mL 이상, 50 x 10⁸ cfu/mL 이상, 70 x 10⁸ cfu/mL 이상, 80 x 10⁸ cfu/mL 이상, 또는 90 x 10⁸ cfu/mL 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 균수는 10 x 10⁸ cfu/mL 이하, 90 x 10⁸ cfu/mL 이하, 80 x 10⁸ cfu/mL 이하, 70 x 10⁸ cfu/mL 이하, 50 x 10⁸ cfu/mL 이하, 30 x 10⁸ cfu/mL 이하, 15 x 10⁸ cfu/mL 이하, 또는 10 x 10⁸ cfu/mL 이하일 수 있다. 바람직하게는 1.0 x 10⁹내지 1.2 x 10⁹cfu/mL일 수 있다.

일 측면에서, 상기 균주는 산도가 1.5 내지 2 %, 알코올 농도 6 내지 8%인 원료에 1.0 x 10⁸ 내지 1.0 x 10¹⁰cfu/mL의 균수로 접종하고 30 ℃에서 4주간 초산 발효시켰을 때, D-(+)-글루쿠로닉산(D-(+)-Glucuronic acid)을 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 또는 8배 이상 증가시키는 것일 수 있고, 다른 측면에서, 상기 D-(+)-글루쿠로닉산(D-(+)-Glucuronic acid)을 9배 이하, 8배 이하, 7배 이하, 또는 6배 이하로 증가시키는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 균주에 의할 경우 D-(+)-글루쿠로닉산(D-(+)-Glucuronic acid)의 양은 표준균주인 아세토박터 파스퇴리아누스( Acetobacter pasteurianus) KTCC 17058에 의해 발효시킨 경우보다 1.5배 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 또는 3배 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 D-(+)-글루쿠로닉산(D-(+)-Glucuronic acid)의 양은 표준균주에 의해 발효시킨 경우보다 3.5배 이하, 3배 이하, 2.5배 이하, 또는 2배 이하일 수 있다.

일 측면에서, 상기 균주는 산도가 1.5 내지 2 %, 알코올 농도 6 내지 8%인 원료에 1.0 x 10⁸ 내지 1.0 x 10¹⁰cfu/mL의 균수로 접종하고 30 ℃에서 4주간 초산 발효시켰을 때, D-리보스(D-Ribose)를 2배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 또는 4배 이상 증가시키는 것일 수 있고, 다른 측면에서, 상기 D-리보스를 4.5배 이하, 4배 이하, 3.5배 이하, 3배 이하, 2.5배 이하 증가시키는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 균주에 의할 경우 D-리보스의 양은 표준균주인 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus) KTCC 17058에 의해 발효시킨 경우보다 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 2.5배 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 D-리보스의 양은 표준균주에 의해 발효시킨 경우보다 3배 이하, 2.5배 이하, 또는 2배 이하일 수 있다.

일 측면에서, 상기 균주는 산도가 1.5 내지 2 %, 알코올 농도 6 내지 8%인 원료에 1.0 x 10⁸ 내지 1.0 x 10¹⁰cfu/mL의 균수로 접종하고 30 ℃에서 4주간 초산 발효시켰을 때, 2-부테네디오익산(2-Butenedioic acid)을 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 7.5배 이상, 또는 8배 이상 증가시키는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 2-부테네디오익산을 8.5배 이하, 8배 이하, 7.5배 이하, 7배 이하, 6.5배 이하, 또는 6배 이하 증가시키는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 균주에 의할 경우 2-부테네디오익산의 양은 표준균주인 아세토박터 파스퇴리아누스( Acetobacter pasteurianus) KTCC 17058에 의해 발효시킨 경우보다 2배 이상, 2.5배 이상, 또는 3배 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 2-부테네디오익산의 양은 표준균주에 의해 발효시킨 경우보다 3.5배 이하, 3배 이하, 또는 2.5배 이하일 수 있다.

일 측면에서, 상기 균주는 산도가 1.5 내지 2 %, 알코올 농도 6 내지 8%인 원료에 1.0 x 10⁸ 내지 1.0 x 10¹⁰cfu/mL의 균수로 접종하고 30 ℃에서 4주간 초산 발효시켰을 때, Xylo-hexos-5ulose을 1.5배 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 또는 3배 이상 증가시키는 것일 수 있고, 다른 측면에서, 상기 Xylo-hexos-5ulose을 3.5배 이하, 3배 이하, 2.5배 이하, 또는 2배 이하 증가시키는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 균주에 의할 경우 Xylo-hexos-5ulose의 양은 표준균주인 아세토박터 파스퇴리아누스(Acetobacter pasteurianus) KTCC 17058에 의해 발효시킨 경우보다 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 2.5배 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 Xylo-hexos-5ulose의 양은 표준균주에 의해 발효시킨 경우보다 3배 이하, 2.5배 이하, 또는 2배 이하일 수 있다.

일 측면에서, 상기 균주는 산도가 1.5 내지 2 %, 알코올 농도 6 내지 8%인 원료에 1.0 x 10⁸ 내지 1.0 x 10¹⁰cfu/mL의 균수로 접종하고 30 ℃에서 4주간 초산 발효시켰을 때, 2-푸란카복실릭산(2-Furancarboxylic acid)을 4배 이상, 4.5배 이상, 5배 이상, 또는 5.5배 이상 증가시키는 것일 수 있고, 다른 측면에서, 상기 2-Furancarboxylic acid을 6배 이하, 5.5배 이하, 5배 이하, 또는 4.5배 이하 증가시키는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 균주에 의할 경우 2-Furancarboxylic acid의 양은 표준균주인 아세토박터 파스퇴리아누스( Acetobacter pasteurianus) KTCC 17058에 의해 발효시킨 경우보다 2배 이상, 2배 이상, 또는 2.5배 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 2-Furancarboxylic acid의 양은 표준균주에 의해 발효시킨 경우보다 3배 이하, 2.5배 이하, 또는 2배 이하일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 균주는 최적 생육 온도 28 내지 35 ℃; 최적 pH 3 내지 7; 최적 알코올 농도 5 내지 8%의 생육 특성을 갖는 균주일 수 있다. 일 측면에서 상기 최적 생육 온도는 28 ℃ 이상, 30 ℃ 이상, 31℃ 이상, 32 ℃ 이상, 33℃ 이상, 34 ℃ 이상, 34.5 ℃ 이상, 또는 34.8 ℃ 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 온도는 35 ℃ 이하, 34.8 ℃ 이하, 34.5 ℃ 이하, 34 ℃ 이하, 33 ℃ 이하, 32 ℃ 이하, 31 ℃ 이하, 30 ℃ 이하, 29.5 ℃ 이하, 29 ℃ 이하, 또는 28.5 ℃ 이하일 수 있다.

일 측면에서, 상기 최적 pH는 3이상, 3.5이상, 4이상, 4.5이상, 4.8이상, 5이상, 5.3이상, 5.5이상, 6이상, 6.5이상 또는 6.8이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 pH는 7이하, 6.8이하, 6.5이하, 6이하, 5.8이하, 5.5이하, 5.2이하, 5이하, 4.8이하, 4.5이하, 4이하, 3.8이하, 3.5이하, 또는 3.2이하일 수 있다.

일 측면에서, 상기 최적 알코올 농도는 5% 이상, 5.2% 이상, 5.5% 이상, 5.8% 이상, 6% 이상, 6.2% 이상, 6.5% 이상, 6.8% 이상, 7% 이상, 7.2% 이상, 7.5% 이상, 또는 7.8% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 농도는 8% 이하, 7.8% 이하, 7.5% 이하, 7.2% 이하, 7% 이하, 6.8% 이하, 6.5% 이하, 6.2% 이하, 6% 이하, 5.8% 이하, 5.5% 이하, 또는 5.2% 이하일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 균주는 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주일 수 있고 기탁번호 KACC92166P의 균주일 수 있다. 상기 균주의 16S rDNA의 염기서열은 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 균주는 종전에 발견되지 않은 신규한 균주로서 상기와 같은 초산 발효능을 가지므로, 식품 특히 식초 등을 효과적으로 발효시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 다만, 상기 균주가 식초나 발효식초 제조에만 한정적으로 이용되는 것은 아니며, 상기 균주의 균학적 성질을 응용할 수 있는 어떤 식품 유형에도 적용될 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 상기 아세토박터 파스퇴리아누스 균주로 초산 발효시켜 얻은 발효식초이다. 일 측면에 따르면, 상기 균주로 발효시킬 수 있는 식품이나 식품용 원료는 제한이 없으나, 예컨대, 상기 식품이나 식품용 원료는 주류, 음료, 음료베이스, 빵류, 식초, 된장, 고추장 및 간장 등을 포함할 수 있고, 김치 및 젓갈 등의 소금절임류, 요구르트 및 치즈 등의 유제품류를 포함할 수 있다. 상기 식품은 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능식품은, 예컨대, 프로바이오틱스 제품일 수 있다. 프로바이오틱스 제품은 균주를 포함하는 발효유, 과립 또는 분말의 형태일 수 있다. 본 발명의 일 관점에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않는다. 다만, 본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 균주는 효과적으로 초산 발효 작용을 하므로, 식초를 특징적으로 발효시킬 수 있으므로, 그에 따른 발효식초는 본 발명의 일 측면일 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 발효식초는 과실 또는 곡물의 알코올 발효물을 초산 발효시켜 얻은 것일 수 있다. 상기 알코올 발효물은 예컨대 술 또는 주류일 수 있다. 상기 알코올 발효물의 유형은 제한이 없으나, 와인 또는 막걸리를 포함할 수 있다. 상기 알코올 발효물은 주류에 포함될 수 있는 부원료들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 설탕, 올리고당, 과당 등과 같은 당류, 정제수 등이 이러한 부원료에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 구현 예로서, 상기 과실은 다래 또는 머루이고, 상기 곡물은 현미일 수 있다. 일 관점에서 상기 과실의 알코올 발효물은 다래주(酒) 또는 머루주일 수 있고, 상기 곡물의 알코올 발효물은 현미주일 수 있다. 다른 관점에서 상기 다래주는 다래 와인일 수 있고, 상기 머루주는 머루 와인일 수 있으며, 상기 현미주는 현미 막걸리일 수 있다. 본 발명은 일 관점에서, 다래, 머루, 현미 등을 사용하여 세가지 색상의 술을 제조한 후 이를 이용하여 제조한 세가지 색상의 발효식초에 관한 것일 수 있다. 알코올 발효물을 이용하여 발효식초를 제조할 경우 알코올 함량 등에 의해 초산 발효가 제대로 이루어지지 않을 수 있음에 반해, 본 발명은 일 관점에 따른 상기 균주를 사용함으로써, 알코올 발효물이 포함된 원료에 대해서도 효과적으로 초산 발효를 달성하여 발효식초를 제조할 수 있다. 또한, 다래, 머루, 현미와 같은 원료는 초산 발효 과정에 포함되기에 적합하지 않은 원료일 수 있으나, 본 발명의 일 측면에 따른 상기 균주를 이용할 경우 효과적인 초산 발효가 가능하여, 그러한 원료도 발효식초의 제조에 사용할 수 있게 된다. 본 발명의 일 관점에 따라, 이처럼 다래, 머루, 현미를 이용하여 알코올 발효물을 제조하거나 상기 알코올 발효물을 원료의 일부로 포함시켜 발효식초를 제조할 경우 다래, 머루, 현미의 고유 색상, 맛, 향 등이 유지되어, 세가지 색상의 시각적 미감을 발휘하고, 원료에 따라 다른 맛과 향을 내는 발효식초를 소비자에게 제공할 수 있게 되므로, 소비자는 취향에 따라 제품을 선택할 수 있게 된다.

다른 구현 예로서, 상기 알코올 발효물은 효모 및 누룩 중 하나 이상에 의해 알코올 발효시킨 것일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 발효식초는 pH가 2.5 내지 3.5이고, 산도가 4 내지 10%이며, 당도가 3 내지 20 브릭스(^oBrix)일 수 있다. 일 측면에서, 상기 pH는 2.5이상, 2.6이상, 2.7이상, 2.8이상, 2.85이상, 2.88이상, 2.9이상, 2.95이상, 2.97이상, 3.0이상, 또는 3.3이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 pH는 3.5이하, 3.3이하, 3.0이하, 2.97이하, 2.95이하, 2.9이하, 2.88이하, 2.85이하, 2.8이하, 2.7이하, 또는 2.6이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 산도는, 4% 이상, 5% 이상, 5.5% 이상, 6% 이상, 6.06% 이상, 6.5% 이상, 6.72% 이상, 6.75% 이상, 6.8% 이상, 6.9% 이상, 7.0% 이상, 7.2% 이상, 7.4% 이상, 7.42% 이상, 7.5% 이상, 8% 이상, 9% 이상, 또는 9.5% 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 산도는 10% 이하, 9.5% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7.5% 이하, 7.42% 이하, 7.4% 이하, 7.2% 이하, 7.0% 이하, 6.9% 이하, 6.8% 이하, 6.75% 이하, 6.72% 이하, 6.5% 이하, 6.06% 이하, 6% 이하, 5.5% 이하, 5% 이하, 또는 4.5% 이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 당도는 3브릭스 이상, 4브릭스 이상, 5브릭스 이상, 5.2브릭스 이상, 5.4브릭스 이상, 5.46브릭스 이상, 5.6브릭스 이상, 6브릭스 이상, 6.2브릭스 이상, 6.4브릭스 이상, 6.8브릭스 이상, 7브릭스 이상, 7.4브릭스 이상, 7.8브릭스 이상, 8브릭스 이상, 9브릭스 이상, 10브릭스 이상, 11브릭스 이상, 12브릭스 이상, 14브릭스 이상, 15브릭스 이상, 15.1브릭스 이상, 15.5브릭스 이상, 16브릭스 이상, 또는 18브릭스 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 당도는 20브릭스 이하, 18브릭스 이하, 16브릭스 이하, 15.5브릭스 이하, 15.1브릭스 이하, 15브릭스 이하, 14브릭스 이하, 12브릭스 이하, 11브릭스 이하, 10브릭스 이하, 9브릭스 이하, 8브릭스 이하, 7.8브릭스 이하, 7.4브릭스 이하, 6.8브릭스 이하, 6.4브릭스 이하, 6.2브릭스 이하, 6브릭스 이하, 5.6브릭스 이하, 5.46브릭스 이하, 5.4브릭스 이하, 5.2브릭스 이하, 5브릭스 이하,또는 4브릭스 이하일 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 상기 발효식초를 포함하는 음료베이스이다. 본 발명의 일 측면에 다른 상기 발효식초를 사용할 수 있는 식품이나 식품용 원료에는 제한이 없으나, 본 발명의 일 측면에 따른 발효식초는 다른 가공 없이 직접 음용하거나, 다른 식품이나 식품용 원료와 병용, 혼합, 또는 희석하여 섭취할 수 있으므로, 상기 발효식초는 일 관점에서, 이를 포함하는 음료베이스 또는 음료 유형의 제품에 적합할 수 있다.

일 구현 예로서, 상기 음료베이스는, 과실청, 과실 착즙액, 및 과실 농축액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하거나; 곡물 추출물, 곡물 농축액, 및 곡물향으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 과실청은 다래청 또는 머루청일 수 있고, 상기 과실 착즙액은 다래 착즙액 또는 머루 착즙액일 수 있다. 또한 상기 과실 농축액은 다래 농축액 또는 머루 농축액일 수 있다. 상기 곡물 추출물, 곡물 농축액, 곡물향은 각각 현미 추출물, 현미 농축액, 쌀향일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 음료베이스는 pH가 2.5 내지 3.8일 수 있고, 산도가 1.5 내지 2.5 %일 수 있으며, 당도가 20 내지 35 브릭스(^oBrix)일 수 있다. 일 측면에서, 상기 pH는 2.5이상, 2.8이상, 3.0이상, 3.05이상, 3.07이상, 3.1이상, 3.2이상, 3.25이상, 3.28이상, 3.3이상, 3.36이상, 3.4이상, 3.5이상, 3.6이상, 또는 3.7이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 pH는 3.8이하, 3.7이하, 3.6이하, 3.5이하, 3.4이하, 3.36이하, 3.3이하, 3.28이하, 3.25이하, 3.2이하, 3.1이하, 3.07이하, 3.05이하, 3.0이하, 또는 2.8이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 산도는 1.5% 이상, 1.6% 이상, 1.7% 이상, 1.80% 이상, 1.85% 이상, 1.88% 이상, 1.90% 이상, 1.91% 이상, 1.92% 이상, 1.95% 이상, 1.98% 이상, 2.0% 이상, 2.2% 이상, 또는 2.4% 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 산도는 2.5% 이하, 2.4% 이하, 2.2% 이하, 2.0% 이하, 1.98% 이하, 1.95% 이하, 1.92% 이하, 1.91% 이하, 1.90% 이하, 1.88% 이하, 1.85% 이하, 1.80% 이하, 1.7% 이하, 또는 1.6% 이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 당도는 20브릭스 이상, 21브릭스 이상, 22브릭스 이상, 23브릭스 이상, 23.8브릭스 이상, 24브릭스 이상, 24.5브릭스 이상, 24.8브릭스 이상, 25브릭스 이상, 25.2브릭스 이상, 25.5브릭스 이상, 25.8브릭스 이상, 26브릭스 이상, 27브릭스 이상, 28브릭스 이상, 29브릭스 이상, 31브릭스 이상, 32브릭스 이상, 32.2브릭스 이상, 32.5브릭스 이상, 33브릭스 이상, 또는 34브릭스 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 당도는 35브릭스 이하, 34브릭스 이하, 33브릭스 이하, 32.5브릭스 이하, 32.2브릭스 이하, 32브릭스 이하, 31브릭스 이하, 29브릭스 이하, 28브릭스 이하, 27브릭스 이하, 26브릭스 이하, 25.8브릭스 이하, 25.5브릭스 이하, 25.2브릭스 이하, 25브릭스 이하, 24.8브릭스 이하, 24.5브릭스 이하, 24브릭스 이하, 23.8브릭스 이하, 23브릭스 이하, 22브릭스 이하, 또는 21브릭스 이하일 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 상기 음료베이스를 포함하는 음료이다.

일 구현 예로서, 상기 음료는 pH가 2.8 내지 4 일 수 있고, 산도가 0.5 내지 1.5 %일 수 있으며, 당도가 12 내지 20 브릭스(^oBrix)일 수 있다. 일 측면에서, 상기 pH는 2.8이상, 3이상, 3.1이상, 3.16이상, 3.18이상, 3.2이상, 3.3이상, 3.38이상, 3.4이상, 3.5이상, 3.54이상, 3.56이상, 3.6이상, 3.7이상, 또는 3.8이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 pH는 4이하, 3.8이하, 3.7이하, 3.6이하, 3.56이하, 3.54이하, 3.5이하, 3.4이하, 3.38이하, 3.3이하, 3.2이하, 3.18이하, 3.16이하, 3.1이하, 3이하, 또는 2.9이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 산도는 0.5% 이상, 0.7% 이상, 0.71% 이상, 0.75% 이상, 0.77% 이상, 0.79% 이상, 0.8% 이상, 0.9% 이상, 1% 이상, 1.1% 이상, 1.16% 이상, 1.18% 이상, 1.2% 이상, 1.3% 이상, 또는 1.4% 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 산도는 1.5% 이하, 1.4% 이하, 1.3% 이하, 1.2% 이하, 1.18% 이하, 1.16% 이하, 1.1% 이하, 1% 이하, 0.9% 이하, 0.8% 이하, 0.79% 이하, 0.77% 이하, 0.75% 이하, 0.71% 이하, 0.7% 이하, 또는 0.6% 이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 당도는 12브릭스 이상, 13브릭스 이상, 14브릭스 이상, 14.4브릭스 이상, 14.6브릭스 이상, 14.8브릭스 이상, 15브릭스 이상, 15.2브릭스 이상, 15.4브릭스 이상, 15.6브릭스 이상, 16브릭스 이상, 17브릭스 이상, 18브릭스 이상, 18.2브릭스 이상, 18.4브릭스 이상, 18.6브릭스 이상, 18.8브릭스 이상, 또는 19브릭스 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 당도는 20브릭스 이하, 19브릭스 이하, 18.8브릭스 이하, 18.6브릭스 이하, 18.4브릭스 이하, 18.2브릭스 이하, 18브릭스 이하, 17브릭스 이하, 16브릭스 이하, 15.6브릭스 이하, 15.4브릭스 이하, 15.2브릭스 이하, 15브릭스 이하, 14.8브릭스 이하, 14.6브릭스 이하, 14.4브릭스 이하, 14브릭스 이하, 13브릭스 이하, 또는 12.5브릭스 이하일 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 상기 아세토박터 파스퇴리아누스 균주를 이용하여 초산 발효시키는 과정을 포함하는, 발효식초의 제조방법이다.

일 구현 예로서, 발효식초의 제조방법은 알코올 발효물을 제조하는 과정; 상기 알코올 발효물과 함께 원료식초 및 정제수를 배합하는 과정; 상기 아세토박터 파스퇴리아누스 균주를 접종하는 과정; 및 초산 발효시키는 과정;을 포함하는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 발효식초의 제조방법은 여과 과정을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 여과는 당업계에 일반적으로 알려져 있는 방법이면 어떤 것이든 가능하다.

다른 구현 예로서, 상기 접종은 상기 아세토박터 파스퇴리아누스 균주를 1.0 x 10⁸ 내지 1.0 x 10¹⁰cfu/mL의 균수로 접종하는 것일 수 있다.

일 측면에서, 상기 균수는 일 측면에서, 상기 균수는 1 x 10⁸ cfu/mL 이상, 15 x 10⁸ cfu/mL 이상, 30 x 10⁸ cfu/mL 이상, 50 x 10⁸ cfu/mL 이상, 70 x 10⁸ cfu/mL 이상, 80 x 10⁸ cfu/mL 이상, 또는 90 x 10⁸ cfu/mL 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 균수는 10 x 10⁸ cfu/mL 이하, 90 x 10⁸ cfu/mL 이하, 80 x 10⁸ cfu/mL 이하, 70 x 10⁸ cfu/mL 이하, 50 x 10⁸ cfu/mL 이하, 30 x 10⁸ cfu/mL 이하, 15 x 10⁸ cfu/mL 이하, 또는 10 x 10⁸ cfu/mL 이하일 수 있다. 바람직하게는 1.0 x 10⁹내지 1.2 x 10⁹cfu/mL일 수 있다.

다른 구현 예로서, 상기 알코올 발효물은 과실 또는 곡물을 알코올 발효시킨 것일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 알코올 발효물은 효모 및 누룩 중 하나 이상을, 과실 또는 곡물의 중량 대비 0.5 내지 10 중량%으로 배합하여 알코올 발효시킨 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 배합량은 상기 원료의 총중량 대비 0.5중량% 이상, 1중량% 이상, 1.5중량% 이상, 2중량% 이상, 2.5중량% 이상, 3중량% 이상, 3.5중량% 이상, 4중량% 이상, 4.5중량% 이상, 5중량% 이상, 5.5중량% 이상, 6중량% 이상, 7중량% 이상, 8중량% 이상, 또는 9중량% 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 배합량은 상기 원료의 총중량 대비 10중량% 이하, 9중량% 이하, 8중량% 이하, 7중량% 이하, 6중량% 이하, 5.5중량% 이하, 5중량% 이하, 4.5중량% 이하, 4중량% 이하, 3.5중량% 이하, 3중량% 이하, 2.5중량% 이하, 2중량% 이하, 1.5중량% 이하, 1중량% 이하, 또는 0.8중량% 이하일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 알코올 발효물의 배합량은 배합물 총부피 대비 30 내지 80 부피%일 수 있고, 상기 원료식초의 배합량은 배합물 총부피 대비 0.1 내지 6 부피%일 수 있으며, 상기 원료식초의 산도는 10 내지 20 %일 수 있다. 일 측면에서 상기 알코올 발효물의 배합량은 배합물 총부피 대비 30부피% 이상, 33부피% 이상, 35부피% 이상, 38부피% 이상, 40부피% 이상, 45부피% 이상, 45.01부피% 이상, 45.045부피% 이상, 45.5부피% 이상, 46부피% 이상, 48부피% 이상, 49부피% 이상, 50부피% 이상, 50.125부피% 이상, 50.2부피% 이상, 50.5부피% 이상, 55부피% 이상, 58부피% 이상, 60부피% 이상, 65부피% 이상, 68부피% 이상, 70부피% 이상, 71부피% 이상, 71.09부피% 이상, 71.3부피% 이상, 72부피% 이상, 74부피% 이상, 또는 75부피% 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 알코올 발효물의 배합량은 배합물 총부피 대비 80부피% 이하, 75부피% 이하, 74부피% 이하, 72부피% 이하, 71.3부피% 이하, 71.09부피% 이하, 71부피% 이하, 70부피% 이하, 68부피% 이하, 65부피% 이하, 60부피% 이하, 58부피% 이하, 55부피% 이하, 50.5부피% 이하, 50.2부피% 이하, 50.125부피% 이하, 50부피% 이하, 49부피% 이하, 48부피% 이하, 46부피% 이하, 45.5부피% 이하, 45.045부피% 이하, 45.01부피% 이하, 45부피% 이하, 40부피% 이하, 38부피% 이하, 35부피% 이하, 또는 33부피% 이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 원료식초의 배합량은 배합물 총부피 대비 0.1부피% 이상, 0.2부피% 이상, 0.25부피% 이상, 0.264부피% 이상, 0.27부피% 이상, 0.5부피% 이상, 1부피% 이상, 2부피% 이상, 3부피% 이상, 3.5부피% 이상, 3.8부피% 이상, 3.998부피% 이상, 4부피% 이상, 4.1부피% 이상, 4.2부피% 이상, 4.237부피% 이상, 4.3부피% 이상, 4.5부피% 이상, 4.8부피% 이상, 5부피% 이상, 5.3부피% 이상, 또는 5.5부피% 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 원료식초의 배합량은 배합물 총부피 대비 6부피% 이하, 5.5부피% 이하, 5.3부피% 이하, 5부피% 이하, 4.8부피% 이하, 4.5부피% 이하, 4.3부피% 이하, 4.237부피% 이하, 4.2부피% 이하, 4.1부피% 이하, 4부피% 이하, 3.998부피% 이하, 3.8부피% 이하, 3.5부피% 이하, 3부피% 이하, 2부피% 이하, 1부피% 이하, 0.5부피% 이하, 0.27부피% 이하, 0.264부피% 이하, 0.25부피% 이하, 또는 0.2부피% 이하일 수 있다. 일 측면에서, 상기 원료식초의 산도는 10% 이상, 12% 이상, 13% 이상, 14% 이상, 15% 이상, 16% 이상, 또는 18% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 산도는 20% 이하, 18% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 또는 12% 이하일 수 있다.

또 다른 구현 예로서, 상기 발효식초의 원료식초는 곡물식초일 수 있고, 바람직하게는 현미식초일 수 있다.

본 발명은 다른 측면에서, 상기 발효식초를 과실청, 과실 착즙액, 과실 농축액, 올리고당, 구연산 및 정제수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는 곡물 추출물, 곡물 농축액, 곡물향, 올리고당, 구연산 및 정제수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상;과 배합하는 과정을 포함하는, 음료 또는 음료베이스의 제조방법이다.

일 구현 예로서, 상기 발효식초의 배합량은 배합물의 총중량 대비 5 내지 40 중량%일 수 있다. 일 측면에서, 상기 발효식초의 배합량은 배합물의 총중량 대비 5중량 % 이상, 7중량 % 이상, 9중량 % 이상, 10중량 % 이상, 11중량 % 이상, 11.2중량 % 이상, 11.5중량 % 이상, 12중량 % 이상, 12.5중량 % 이상, 13중량 % 이상, 15중량 % 이상, 18중량 % 이상, 20중량 % 이상, 21중량 % 이상, 22중량 % 이상, 24중량 % 이상, 25중량 % 이상, 26중량 % 이상, 28중량 % 이상, 30중량 % 이상, 34중량 % 이상, 또는 38중량 % 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 발효식초의 배합량은 배합물의 총중량 대비 40중량 % 이하, 38중량 % 이하, 36중량 % 이하, 34중량 % 이하, 30중량 % 이하, 28중량 % 이하, 26중량 % 이하, 25중량 % 이하, 24중량 % 이하, 22중량 % 이하, 21중량 % 이하, 20중량 % 이하, 18중량 % 이하, 15중량 % 이하, 13중량 % 이하, 12.5중량 % 이하, 12중량 % 이하, 11.5중량 % 이하, 11.2중량 % 이하, 11중량 % 이하, 10중량 % 이하, 9중량 % 이하, 7중량 % 이하, 또는 6중량 % 이하일 수 있다.

일 측면에서, 상기 음료 또는 음료베이스의 제조방법은 여과 과정을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 여과는 당업계에 일반적으로 알려져 있는 방법이면 어떤 것이든 가능하다.

상기 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4은 2017년 2월 8일 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 기탁번호 KACC92166P로 기탁되었다.

이하, 실시예, 실험예 등을 들어 더욱 상세하게 설명한다. 다만, 하기 실시예, 실험예 등은 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 신규한 균주의 분리

막걸리(알코올 6%, 예를 들어 소양강 생 막걸리, 제조사: 소양강도가)를 구입하여 15℃에서 5일 동안 보관한 후, 초산균 분리를 위해 강원도 홍천군 농가에서 수집한 자연발효로 제조된 발효식초를 10%(v/v) 접종하고 흔들어 섞은 후, 30℃에서 30일 동안 정치 배양하였다. 5일 마다 초산균 분리 고체배지(YCM Agar; 0.5% 효모 추출물(yeast extract), 2.5% 만니톨(mannitol), 1.0% CaCO₃, 3.0% 에탄올, 1.5% 아가(agar))에 도말하여 투명환을 형성하는 균주 40점을 분리하였고, 고체 배지에 스트레킹하여 단일 콜로니를 분리하였다. 분리된 콜로니는 초산균 분리 액체배지(YCM Broth ; 0.5% 효모 추출물(yeast extract), 2.5% 만니톨(mannitol), 1.0% CaCO₃, 3.0% 에탄올)에 30℃에서 5일 동안 배양한 후 분리 동정하였다. 분리 균주 중 다시 고체배지에 피킹(picking)하여 투명환 형성능이 우수한 균주를 선별하였다. 선별된 신규 균주(아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4)은 2017년 2월 8일 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 기탁번호 KACC92166P로 기탁되었다.

[ 실험예 1] 신규한 아세토박터 파스퇴리아누스 균주의 동정

YCM 액체배지에서 5일간 배양 후 원심분리하여 확보한 초산균 균체로부터 지노믹 DNA(genomic DNA, gDNA) 추출 키트를 이용하여 염색체 DNA를 확보하였다. 이를 주형으로 유니버설 프라이머(universal primer)인 27F ( 5’- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3’: 서열번호 1)와 1492R ( 5’- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’: 서열번호 2)를 사용하여 PCR하여 16S rRNA 부위를 증폭하였다. PCR 산물은 전기영동법으로 확인 한 후에 DNA 정제 키트를 이용하여 정제 하였다. BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits(Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열 분석을 하였고, DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler(BioRad)를 이용하여 27F, 1492R 프라이머로 염기서열을 분석하였다. 반응이 끝난 후, dNTP와 반응물을 제거한 후, ABI 3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems) 에 로딩(loading)하여 염기서열 결과(도 1 : 서열번호 3)를 얻었고, 길이는 1,417 bp 였다.

[ 실험예 2] 신규한 아세토박터 파스퇴리아누스 균주의 계통수 작성

NCBI(National center for biotechnology)에서 제공하는 BLAST 검색을 통하여 염기서열의 상동성을 분석하였다. Acetobacter pasteurianus(Genbank에서의 Accession No. AB906396.1)와 99% 상동성을 나타내었다. Genbank에서 초산균의 16S rRNA 염기서열을 확보하였고, 염기서열 간 상동성은 Clustal W 프로그램을 사용하여 다중서열정렬 검색을 수행하였다. 계통수는 MEGA 4 프로그램을 사용하여 neighbor-joining법과 Kimura-nei 모델을 사용하여 작성하였고, 안정성 검사를 위해 1,000번의 부스트랩 리샘플링(boostrap resampling)을 실시하였다.

그 결과, 도 2와 같이 계통을 분류할 수 있었고, 상기 실험예를 통해 분리한 균주인 Acetobacter pasteurianus AFY-4는 다른 아세박터 균주와는 다른 새로운 균주임을 확인하였다.

[ 실험예 3] 주사전자현미경 관찰

초산균은 자라면서 산막을 형성하므로 콜로니가 생성되는 것이 확인(약 2-3일)되면 배양을 멈추고 저속 원심 분리로 적당히 균주를 셀다운(cell down)시킨 뒤, 상등액은 버리고 0.1M 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH 7.2)로 세포 펠렛(cell pellet)을 2회 워싱(washing)하였다. 반드시 장갑을 착용한 상태로 후드 안에서 세포 펠렛(cell pellet)의 10배수의 4% 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)를 세포 펠렛(cell pellet)을 건드리지 않도록 주의하면서 튜브(tube) 벽 주위에 피펫으로 천천히 넣어준 뒤, 2시간 동안 냉장보관하여 세포를 고정시켰다. 그리고 원심분리(13000rpm, 1 min)하여 상등액을 제거한 후, 0.1M 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH7.2)로 15~30분 동안 시료를 피펫팅(pipetting)하여 2회 세척하였다. 다시 30%, 50%, 70% 90% 에탄올을 이용하여 10~30분 동안 1회 세척한 후, 100% 에탄올로 30분간 2회 세척하였다. 남은 에탄올을 제거하기 위해 CPD(Critical Point Dryer)로 3~4시간 동안 건조시켰다. 시료를 코팅하기 위한 Pt 코팅은 30분~1시간 소요되었다. 기기는 고분해능 전자주사현미경(UHR-SEM;　Ultra High Resolution Scanning Electron Microscope, Hitachi S-4800, Hitachi, Japan)을 40K 배 확대하여 관찰하였다.

그 결과는 도 3으로 나타내었다.

[ 실험예 4] 신규 초산균의 생육특징

상기 신규 초산균(Acetobacter pasteurianus AFY-4)의 최적 생육 조건을 찾기 위해 온도별(15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃), pH별(pH2, pH3, pH4, pH5, pH6, pH7), 배지의 에탄올 함량별(5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%), 배지의 초산 함량별(0.2%, 0.4%, 0.8%, 1.6%, 3.2%, 4%)로 5일간 배양하여 흡광도와 산도를 측정하였다. 그 결과는 도 4 내지 도 7로 나타내었다. 도 4는 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 온도 조건에 따른 생육변화에 관한 그래프이고, 도 5는 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 pH 조건에 따른 생육변화에 관한 그래프이다. 또한, 도 6은 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 초기 알코올 도수 조건에 따른 생육변화에 관한 그래프이고, 도 7은 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주의 초기 산도에 따른 생육변화에 관한 그래프이다.

이를 통해, 상기 신규 초산균(Acetobacter pasteurianus AFY-4)이 잘 증식하는 생육 환경을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 2] 삼색 발효식초 제조용 술 제조

세가지 색상을 나타내는 삼색 발효식초의 제조를 위하여 다래, 머루는 와인으로 현미는 막걸리로 제조하였다. 다래와인은 원료(다래)의 20 중량%에 해당하는 물을 추가하고 당도를 24 ^oBrix에 맞추기 위해 설탕으로 보당하였다. 효모는 Saccharomyces cerevisiae MA8-3을 0.5% 효모추출물(yeast extract), 2.5% 만니톨(mannitol), 3.0% 에탄올(ethanol)을 함유하는 액체배지에 접종하여 진탕배양기에서 25℃ 에서 48시간 동안 200 rpm 조건으로 배양하였다. 이 효모 배양액을 원료(다래)의 2 중량%에 해당하는 양을 접종한 후, 25℃에서 7일간 알코올 발효하였다. 머루와인은 당도를 30 ^oBrix에 맞추기 위해 원료(머루)에 설탕을 넣고 다래와인과 동일한 방법으로 제조하였다. 현미막걸리는 원료(현미)를 3일 불린 후 쪄서 고두밥을 만든 후, 곡자 누룩을 원료(현미) 대비 10 중량%와 물 150 중량%를 넣고 Saccharomyces cerevisiae MA8-3 배양액을 원료(현미) 대비 5 중량%를 접종하여 25℃에서 7일간 알코올 발효하였다.

구 분	술 배합비
구 분	다래	머루	현미
원물 (다래, 머루, 현미)	10 kg	10 kg	10 kg
설탕	4 kg	4 kg	-
누룩	-	-	1 kg
효모	0.2 kg	0.2 kg	0.5 kg
정제수	2 kg	2 kg	15 kg

[ 실시예 3] 삼색 발효식초 제조

상기 실시예 2에서 제조한 술과 물, 현미식초에 Acetobacter pasteurianus AFY-4 배양액을 접종하여 발효식초를 제조하였다. AFY-4 배양액은 0.5% 효모 추출물(yeast extract), 2.5% 만니톨(mannitol), 3.0% 에탄올을 함유한 액체 배지에서 30℃에서 3~5일간 배양하였다. 다래식초는 초기 알코올 7%, 초기 산도 1.5%, 원료 총배합량 대비 배양액 접종량 20 부피%가 되도록 맞췄다. 머루식초는 초기 알코올 6%, 초기 산도 2%, 원료 총배합량 대비 배양액 접종량 15 부피%가 되도록 맞췄다. 현미식초는 초기 알코올 8%, 초기 산도 2%, 원료 총배합량 대비 배양액 접종량 25 부피%가 되도록 맞췄다. 이렇게 만든 식초는 30℃에서 4주간 초산 발효하였다. 이 경우, 접종하는 균수는 약 1.1 x 10⁹cfu/mL 이었다.

삼색 발효식초 제조를 위한 원료 배합량

구 분 (단위 : mL)	배합량
구 분 (단위 : mL)	다래	머루	현미
술(실시예2)	710.90	450.45	501.25
AFY-4 배양액	200	150	250
현미식초(산도 14%)	42.37	39.98	2.64
정제수	46.73	499.57	386.11
합 계	1,000	1,000	1,000

[ 실험예 5] 발효식초의 대사체 비교 분석

표준균주(Acetobacter pasteurianus KACC 17058)를 이용하여 실시예 3과 동일한 제조방법으로 식초를 제조하고 이를 대조구로 하여 실시예 3의 AFY-4 균주를 이용한 발효식초와 대사체를 비교 분석하였다.

구체적으로, 상기 표준균주를 이용한 발효식초와 실시예 3의 발표식초의 샘플을 취하여 발효 전후(Zero time과 4주 후)의 대사체 함량을 비교하였다. 전처리를 위하여 각 발효식초와 메탄올을 1:1로 혼합하여 1시간 동안 교반하고, 4℃, 5,000 rpm에서 5분간 원심분리 후, 상등액만 취하였다. 그 후 Speed vaccum concentrator로 용매를 모두 증발시켰다(6시간 이상). 이후 메톡시아민 하이드로클로라이드(Methoxyamine hydrochloride) 5 μL(40 mg/mL in pyridine)를 첨가하여 30℃에서 60분간 반응시킨 뒤 N-methyl-N-trimethylsilyl trifluoracetaine(MSTFA) 45μL를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 0.2 μm polytetrafluoroethylene(PTFE) filter로 여과하였다. 분석기기로는 GC(Agilent 7890A, USA)와 Pegasus HT TOF MS(Leco, USA)를 이용하였다. 컬럼은 RTX-5MS(30 m x 0.25 mm, 0.25 μm film thichness, Resteck, USA)를 사용하였다. 운반기체로 고순도(99.999%) 헬륨가스를 유속 1.5 mL/min로 사용하였다. 주입구 온도는 200℃로 정하였고, Split mode 방법을 사용하였으며, 컬럼온도는 75℃에서 2분간 유지시킨 후, 15℃/min로 300℃까지 높였다. 매스 스펙트라(Mass spectra) 범위는 45-1000 m/z로 하였으며, Acquisition rate는 20 spectra/s로 하였다. 이온 소스와 전송라인 온도는 250-280 ℃로 설정하였다. Electron impact는 70 eV로 하여 분석하였다. Pegasus CT 소트트웨어를 사용하였고, Fisher ratio 값을 계산하여 값이 큰 순서로 정렬하여 주요 대사체들의 함량을 비교하였다.

그 결과를, 도 8(다래를 이용한 발효식초의 비교), 도 9(머루를 이용한 발효식초의 비교), 도 10(현미를 이용한 발효식초의 비교)으로 나타내었다(N-A1은 실시예 3의 발효식초를 zero time에서 측정한 것을 뜻하고, N-AC는 표준균주로 제조한 발효식초를 zero time에서 측정한 것을 뜻한다. F-A1은 실시예 3의 발효식초를 4주 후에 측정한 것을 뜻하고, F-AC는 표준균주로 제조한 발효식초를 4주 후에 측정한 것을 뜻한다).

도 8의 대사체 peak area 측정결과는 아래와 같다.

도 9의 대사체 peak area 측정결과는 아래와 같다.

도 10의 대사체 peak area 측정결과는 아래와 같다.

상기 결과에서 알 수 있듯, 같은 종의 균주라도 AFY-4 균주는 발효 후 대사체 생성 면에서 표준균주 보다 훨씬 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었고, 이를 통해 AFY-4 균주는 발효 효과 등의 면에서 표준균주 보다 현저하게 우수함을 알 수 있다.

[ 실시예 4] 삼색 발효식초 음료베이스 및 음료에 첨가하기 위한 부재료의 제조

청 제조는 다래, 머루, 현미를 설탕과 1:1 (w/w) 비율로 혼합하여 25℃에서 1개월 동안 항아리에서 숙성시켰다. 착즙액 제조는 다래, 머루를 상온에서 완전 해동 후, 착즙기를 이용하여 착즙액이 나오지 않을 때까지 착즙 후, 여과하여 사용하였다. 볶은현미추출물은 현미 500g을 볶음기를 사용하여 250℃에서 2시간 30분 동안 볶은 후, 정제수 5 kg을 첨가하여 0.4 ^oBrix에 도달할 때까지 추출하여 사용하였다. 농축액은 초고속진공저온농축추출기를 이용하여 80℃에서 50^oBrix 이상이 될 때까지 농축하여 사용하였다.

[ 실시예 5] 삼색 발효식초를 이용한 음료베이스 및 음료 제조

본 제조에 사용된 머루 농축액, 현미 농축액(조청), 다래청, 머루청, 다래 착즙액, 머루 착즙액, 현미 추출물은 상기 실시예 4와 같은 방법으로 직접 제조하였다. 올리고당은 춘천 신북읍 소재 대형마트, 구연산은 서울에프앤씨에서 구입하였고, 쌀향은 한빛향료에서 제공받았다. 다래, 머루, 현미 식초는 연구결과를 토대로 최적 제조 조건으로 발효 시킨 후 음료 베이스에 첨가하였다. 또한, 음료는 상기 음료 베이스를 정제수로 희석한 후 부재료를 혼합하여 제조하였다.

다래식초를 이용한 음료베이스 제조를 위한 원료 배합량

재료	중량 (g)
다래식초 (산도 7.42%, 당도 7.8^oBrix)	20
다래청 (57.8^oBrix)	30
다래착즙액 (12.6^oBrix)	10
올리고당 (77.5^oBrix)	5
정제수	35
합계	100

머루식초를 이용한 음료베이스 제조를 위한 원료 배합량

재료	중량 (g)
머루식초 (산도 6.06%, 당도 15.1^oBrix)	25
머루청 (57.9^oBrix)	30
머루착즙액 (20.2^oBrix)	10
머루농축액 (54.5^oBrix)	5
구연산	0.02
정제수	29.98
합계	100

현미식초를 이용한 음료베이스 제조를 위한 원료 배합량

재료	중량 (g)
현미식초 (산도 6.72%, 당도 5.46^oBrix)	25
볶은현미추출물 (0.4^oBrix)	30
현미농축액 (62.5^oBrix)	20.02
올리고당 (77.5^oBrix)	23.12
쌀향	0.1
정제수	1.76
합계	100

다래식초를 이용한 음료 제조를 위한 원료 배합량

재료	중량 (g)
다래식초	12
다래청 (57.8^oBrix)	20
다래착즙액 (12.6^oBrix)	8
올리고당 (77.5^oBrix)	2
정제수	58
합계	100

머루식초를 이용한 음료 제조를 위한 원료 배합량

재료	중량 (g)
머루식초	10
머루청 (57.9^oBrix)	20
머루착즙액 (20.2^oBrix)	8
머루농축액 (54.5^oBrix)	2
구연산	0.02
정제수	59.98
합계	100

현미식초를 이용한 음료 제조를 위한 원료 배합량

재료	중량 (g)
현미식초	11.20
볶은현미추출물 (0.4^oBrix)	50
현미농축액 (62.5^oBrix)	13
올리고당 (77.5^oBrix)	13.02
쌀향	0.1
정제수	12.68
합계	100

[ 실험예 6] 삼색 발효식초, 이를 이용한 음료베이스 및 음료의 품질 확인

실시예 3과 실시예 5에서 제조한 발효식초, 이를 이용한 음료 및 음료베이스에 대한 알코올, 산, pH, 당도 변화에 관한 실험을 실시하였다. 알코올 도수는 알코올 측정 기계를 이용하여 측정하였으며, 산 함량 변화 측정은 NaOH 0.1N 적정법을 이용하여 구연산으로 환산하는 방법으로 측정을 수행하였고, pH 변화 측정은 pH meter를 이용하여 측정하였고, 당도 변화 측정은 당도계를 이용하여 측정하였다.

삼색 발효식초 이화학적 특성

품질 특성	식초
품질 특성	다래	머루	현미
pH	2.97	2.88	2.95
산도(%)	7.42	6.06	6.72
당도(^oBrix)	7.8	15.1	5.46

삼색 발효식초를 이용한 음료베이스의 이화학적 특성

품질 특성	음료 베이스
품질 특성	다래	머루	현미
pH	3.07	3.28	3.36
산도(%)	1.92	1.90	1.80
당도(^oBrix)	23.8	25.5	32.0

삼색 발효식초를 이용한 음료의 이화학적 특성

품질 특성	음료
품질 특성	다래	머루	현미
pH	3.16	3.38	3.54
산도(%)	1.16	0.71	0.79
당도(^oBrix)	14.4	15.2	18.6

국립농업과학원 농업유전자원정보센터

KACC92166P

20170208

<110> GANGWONDO AGRICULTURAL CORPORATION BUIL NONG SAN <120> NOVEL ACETOBACTER PASTEURIANUS STRAIN CAPABLE OF ACETIC ACID FERMENTATION AND MANUFACTURING METHOD OF FERMENTED VINEGAR USING IT <130> 17P117/ind <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal primer 27F <400> 1 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R <400> 2 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 3 <211> 1417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rDNA <400> 3 ggggtaagga taggtctgct acgctaccat gcagtcgcac gaaggtttcg gccttagtgg 60 cggacgggtg agtaacgcgt aggtatctat ccatgggtgg gggataacac tgggaaactg 120 gtgctaatac cgcatgacac ctgagggtca aaggcgcaag tcgcctgtgg aggagcctgc 180 gtttgattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gatgatcaat agctggtttg 240 agaggatgat cagccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300 tggggaatat tggacaatgg gggcaaccct gatccagcaa tgccgcgtgt gtgaagaagg 360 tcttcggatt gtaaagcact ttcgacgggg acgatgatga cggtacccgt agaagaagcc 420 ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg ggctagcgtt gctcggaatg 480 actgggcgta aagggcgtgt aggcggtttg tacagtcaga tgtgaaatcc ccgggcttaa 540 cctgggagct gcatttgata cgtgcagact agagtgtgag agagggttgt ggaattccca 600 gtgtagaggt gaaattcgta gatattggga agaacaccgg tggcgaaggc ggcaacctgg 660 ctcattactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta 720 gtccacgctg taaacgatgt gtgctagatg ttgggtgact tagtcattca gtgtcgcagt 780 taacgcgtta agcacaccgc ctggggagta cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 840 acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt 900 accagggctt gaatgtagag gctgcaagca gagatgtttg tttcccgcaa gggacctcta 960 acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1020 acgagcgcaa cccctatctt tagttgccat caggttgggc tgggcactct agagagactg 1080 ccggtgacaa gccggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc ctcatggccc ttatgtcctg 1140 ggctacacac gtgctacaat ggcggtgaca gtgggaagct aggtggtgac accatgctga 1200 tctctaaaag ccgtctcagt tcggattgca ctctgcaact cgagtgcatg aaggtggaat 1260 cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1320 cccgtcacac catgggagtt ggtttgacct taagccggtg agcgaaccgc aatgacgcag 1380 ccgaccactt gagttcactc gatcgatatt attttct 1417

Claims

삭제
삭제
초산 발효능을 갖는 아세토박터 파스퇴리아누스 AFY-4 균주(기탁번호 KACC92166P)인, 아세토박터 파스퇴리아누스 균주.
제3항의 아세토박터 파스퇴리아누스 균주로 초산 발효시켜 얻은 발효식초.
제4항에 있어서, 상기 발효식초는 과실 또는 곡물의 알코올 발효물을 초산 발효시켜 얻은 것인, 발효식초.
제5항에 있어서, 상기 과실은 다래 또는 머루이고, 상기 곡물은 현미인, 발효식초.
제5항에 있어서, 상기 알코올 발효물은 효모 및 누룩 중 하나 이상에 의해 알코올 발효시킨 것인, 발효식초.
제7항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)인, 발효식초.
삭제
제5항의 발효식초를 포함하는 음료베이스.
제10항에 있어서, 상기 음료베이스는, 과실청, 과실 착즙액, 및 과실 농축액으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하거나;
곡물 추출물, 곡물 농축액, 및 곡물향으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것인, 음료베이스.
제10항에 있어서, 상기 음료베이스는 pH가 2.5 내지 3.8이고, 산도가 1.5 내지 2.5 %이며, 당도가 20 내지 35 브릭스(^oBrix)인, 음료베이스.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 음료베이스를 포함하는 음료.
삭제
제3항의 아세토박터 파스퇴리아누스 균주를 이용하여 초산 발효시키는 과정을 포함하는, 발효식초의 제조방법.
제15항에 있어서, 발효식초의 제조방법은
알코올 발효물을 제조하는 과정;
상기 알코올 발효물과 함께 원료식초 및 정제수를 배합하는 과정;
상기 아세토박터 파스퇴리아누스 균주를 접종하는 과정; 및
초산 발효시키는 과정;
을 포함하는, 발효식초의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 접종은 상기 아세토박터 파스퇴리아누스 균주를 1.0 x 10⁸ 내지 1.0 x 10¹⁰cfu/mL의 균수로 접종하는 것인, 발효식초의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 알코올 발효물은 과실 또는 곡물을 알코올 발효시킨 것인, 발효식초의 제조방법.
제18항에 있어서, 상기 알코올 발효물은 효모 및 누룩 중 하나 이상을, 과실 또는 곡물의 중량 대비 0.5 내지 10 중량%으로 배합하여 알코올 발효시킨 것인, 발효식초의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 알코올 발효물의 배합량은 배합물 총부피 대비 30 내지 80 부피%이고, 상기 원료식초의 배합량은 배합물 총부피 대비 0.1 내지 6 부피%이며, 상기 원료식초의 산도는 10 내지 20 %인, 발효식초의 제조방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 발효식초를 과실청, 과실 착즙액, 과실 농축액, 올리고당, 구연산 및 정제수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는 곡물 추출물, 곡물 농축액, 곡물향, 올리고당, 구연산 및 정제수로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상;과 배합하는 과정을 포함하는, 음료 또는 음료베이스의 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 발효식초의 배합량은 배합물의 총중량 대비 5 내지 40 중량%인, 음료 또는 음료베이스의 제조방법.