CN115181708B - 高产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产γ‑氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌及其应用，乳杆菌的菌株号为NEAUs5‑1，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.24942。本发明采用上述的一种高产γ‑氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌及其在制备腌渍黄瓜中的应用，腌渍黄瓜酸味适中，口感柔和，并且高产γ‑氨基丁酸，操作简单，方便实现规模化生产。

Description

高产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵工艺技术领域，尤其是涉及一种高产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌及其在制备腌渍黄瓜中的应用。
背景技术
黄瓜因营养丰富，口感清脆，备受广大消费者的喜爱，并成为餐桌上常见的蔬菜之一。黄瓜可鲜食、可熟食，亦可经过浸泡或发酵制备成腌渍黄瓜食用。酸黄瓜在满足人民生活需求、补充淡季蔬菜不足中起着重要作用；品质优良的酸黄瓜也因入口脆爽、酸度适中，常作为饭前开胃小菜。
目前，市场售卖的酸黄瓜多数是用白醋浸泡而成，属于非发酵腌渍品，导致酸黄瓜酸味强烈，口感不够柔和，口味欠佳；且其中的微生物发酵不显著，氨基酸含量低。为了长期保存，还需要在其中添加抗氧化剂和防腐剂等，对身体造成危害。经过植物乳杆菌发酵制成的腌渍黄瓜，不仅口味纯正，并且经过发酵所产生的乳酸杆菌素可起到防腐的效果，同时保留黄瓜自身所含的大部分营养物质。
植物乳杆菌对人体具有免疫调节、抑制致病菌、降低胆固醇含量、促进营养物质吸收和抗癌等作用，其代谢产生的γ-氨基丁酸在人体内是一种重要的中枢神经系统抑制性神经递质，在改善睡眠、缓解焦虑、加速新陈代谢等方面起到了良好的保健作用。
目前，已经筛选得到多株产γ-氨基丁酸的生产菌，华东理工大学谢静莉等人（申请号：201510224855.7）筛选出一株产γ-氨基丁酸的乳酸菌，产量为50mg/L。黑龙江省乳品工业技术开发中心姜毓君等人（申请号：201110439694.5）筛选到一株产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌NDC75017，产量为138 mg/L。广西科技大学贤乾隆分离出两株乳酸菌，即植物乳杆菌（QL-14）和干酪乳杆菌（QL-20），加入10g/L谷氨酸钠后可分别产γ-氨基丁酸390 mg/L和584 mg/L，选用干酪乳杆菌（QL-20）作为酸奶发酵剂（添加谷氨酸钠）后产γ-氨基丁酸为224.2mg/L，且口感较好。齐齐哈尔医学院刘韩等人分离出一株嗜热链球菌QYWLYS-1可产γ-氨基丁酸2910 mg/L（添加谷氨酸钠），同时筛选出一株植物乳杆菌QYW-L-11，γ-氨基丁酸产量为1380 mg/L（添加谷氨酸钠）。以上研究中所获得的γ-氨基丁酸能力均不高，并多数在含谷氨酸钠条件下获取，且很少应用于生产中。所以，能够筛选出可以高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌对于食品安全和人类健康方面意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌及其在制备腌渍黄瓜中的应用，腌渍黄瓜酸味适中，口感柔和，并且高产γ-氨基丁酸。在制备腌渍黄瓜时操作简单，方便实现规模化生产。
为实现上述目的，本发明提供了一种高产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌，乳杆菌的菌株号为NEAUs5-1，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.24942。
一种NEAUs5-1植物乳杆菌在制备腌渍黄瓜中的应用。
一种NEAUs5-1植物乳杆菌的培养方法，步骤如下：
S1、将植物乳杆菌NEAUs5-1进行活化、制备种子液，培养基为pH=3.0的液体MRS培养基；
S2、将种子液接入到扩大发酵培养基中进行扩大培养；
扩大发酵培养基的组分为蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、牛肉膏5 g/L、胡萝卜汁100 ml/L，并以1 M的NaOH调整培养基pH为6.2-6.4。
步骤S1中，先将植物乳杆菌NEAUs5-1菌种菌液在MRS琼脂培养基上划线，37 ℃活化48 h，挑单菌落接种至不加琼脂的MRS液体中，37 ℃、150 rpm/min摇床培养48 h，即为植物乳杆菌液体种子。
一种NEAUs5-1植物乳杆菌制备腌渍黄瓜的方法，步骤如下：
S1、选料：挑选新鲜质嫩、无病虫害及机械损伤的新生乳黄瓜，进行前处理；
S2、清洗：将选好的乳黄瓜清洗干净，沥干水分，置于发酵容器中；
S3、发酵：在步骤S2的装有乳黄瓜的发酵容器中注入纯净水，然后按黄瓜质量分数的2%添加植物乳杆菌NEAUs5-1菌液，同时按黄瓜质量分数的2%添加食用盐；
最后加入芝麻、苏子籽、芥末籽、胡椒和香叶，密闭发酵获得酸黄瓜。
优选地，步骤S1中，前处理为去顶花、柄蒂，并将乳黄瓜用清水浸泡2.5 h。
优选地，步骤S3中，注入纯净水的量为液面没过乳黄瓜。
优选地，步骤S3中，发酵温度为20 ℃，发酵时间不少于30天，菌浓度为1-1.8×107cfu/mL。
优选地，步骤S3中，在加入食用盐同时，还加入按黄瓜质量分数1-2%的L-谷氨酸钠。
优选地，步骤S3中，在加入食用盐同时，还加入按黄瓜质量分数1%的红梅味素。
优选地，步骤S3中，密闭发酵后进行杀菌，杀菌温度为85 ℃，杀菌时间为10 min。
优选地，制备腌渍黄瓜中使用高效液相色谱分析法测定黄瓜、黄瓜汁中的γ-氨基丁酸含量。
一株高产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)NEAUs5-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC NO.24942，保藏日期为：2022年05月23日，分类命名为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)。
植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）NEAUs5-1菌落较小，为乳白色，呈圆形；显微镜下细胞呈短杆状；且革兰氏染色呈阳性；该菌株接触酶、氧化酶、葡萄糖产气、精氨酸产氨、明胶液化、淀粉水解、硝酸还原、V.P.反应均为阴性，果糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖等发酵为阳性；该菌株16S rDNA序列与植物乳杆菌的同源性达到99.79%。以上形态学、生理生化及16S rDNA序列鉴定该菌株为植物乳杆菌。
因此，本发明采用上述一种高产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌及其在制备腌渍黄瓜中的应用，所述植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）NEAUs5-1用于γ-氨基丁酸的生产，并应用于富含γ-氨基丁酸的黄瓜生产。
植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）NEAUs5-1菌，其具有高产γ-氨基丁酸的能力，γ-氨基丁酸是重要的抑制性神经递质，具有调节血压、健肝利肾、改善睡眠、醒酒等多种功效；在制备腌渍黄瓜过程中，可提高产品发酵的食用安全性和保健性。
本发明中植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）NEAUs5-1在MRS液体培养基中未添加L-谷氨酸钠，经高效液相色谱检测γ-氨基丁酸产量高达116.40 mg/L；添加1%L-谷氨酸钠，经高效液相色谱检测其产量高达337.10 mg/L。利用4°镇江白醋制备腌渍黄瓜，未添加L-谷氨酸钠，经高效液相色谱检测黄瓜中γ-氨基丁酸含量为177.78mg/L，利用NEAUs5-1发酵的黄瓜中γ-氨基丁酸含量为377.64 mg/L。利用NEAUs5-1发酵的黄瓜，分别添加1%、2%L-谷氨酸钠和1%的红梅味素，经高效液相色谱检测黄瓜汁中γ-氨基丁酸含量分别为893.67 mg/L、3315.11 mg/L和1968.31 mg/L，黄瓜中γ-氨基丁酸含量分别为1692.51mg/L、2710.50 mg/L和1770.06 mg/L。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是植物乳杆菌NEAUs5-1菌的显微镜图；
图2是植物乳杆菌NEAUs5-1的16S rDNA的系统发育树；
图3是实施例五中植物乳杆菌NEAUs5-1发酵液高效液相色谱图；其中A为γ-氨基丁酸标准品图谱，B为植物乳杆菌NEAUs5-1发酵液图谱，C为添加1%L-谷氨酸钠后植物乳杆菌NEAUs5-1发酵液图谱；D为添加2%L-谷氨酸钠后植物乳杆菌NEAUs5-1制备腌渍黄瓜图谱。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。
实施例一
一、植物乳杆菌NEAUs5-1的保存
将植物乳杆菌NEAUs5-1置于MRS液体培养基中，37 ℃、150 rpm/min振荡培养48h，将菌液与60%灭菌甘油以1:1的比例在灭菌管中混合均匀，置于-80 ℃下冷冻保存。NEAUs5-1的显微电镜图见图1。
二、植物乳杆菌NEAUs5-1菌种菌液的扩大培养
将植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）NEAUs5-1菌种菌液在MRS琼脂培养基上划线，37 ℃活化48 h，挑单菌落接种至MRS液体培养基中，37 ℃、150 rpm/min振荡床培养48 h，作为种子液，待扩大培养。
扩大发酵培养基配方为蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏5 g/L，胡萝卜汁100ml/L，并以1 M的NaOH调整培养基pH在6.2-6.4之间，121 ℃灭菌20 min，冷却至室温，接种植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）NEAUs5-1，在37 ℃下150 rpm/min振荡培养48 h，得到植物乳杆菌菌液备用。
实施例二
植物乳杆菌NEAUs5-1生理生化及菌种分子鉴定
形态学特征鉴定观察发现菌落为乳白色圆形菌落，直径为2-3 mm，显微镜下呈短杆状，且革兰氏染色为阳性。
依据《伯杰氏细菌学鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行常规生理生化试验鉴定，过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、精氨酸产氨试验、产气试验、运动性检查都为阴性，而甲基红试验、产酸反应、氧化酶试验均显示阳性，初步鉴定该菌初步鉴定为乳酸菌属。
利用16S rDNA通用引物，以菌液基因组为模板进行PCR扩增，扩增产物经纯化后进行测序。利用NCBI数据库对测序结果进行比对，该菌株与Lactiplantibacillus plantarum序列相似性高达99.79%，如图2。结合菌株NEAUs5-1形态学观察、生理生化及分子实验鉴定结果，确定NEAUs5-1为植物乳杆菌属（Lactiplantibacillus plantarum）的一个新菌株，菌株编号为NEAUs5-1。
实施例三
植物乳杆菌NEAUs5-1发酵高产γ-氨基丁酸
将植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）NEAUs5-1接种于MRS液体培养基上，37 ℃、150 rpm/min恒温活化获得种子液，将种子液活化至1×107-1.8×107cfu/mL。并按体积2%的接种量接种于pH为6.5的发酵培养基中（未添加/添加1%L-谷氨酸钠），在37℃条件下恒温，培养48 h。
采用高效液相色谱检测γ-氨基丁酸含量。检测柱为C18柱，检测器为紫外检测器，检测波长为338 nm。高效液相色谱检测结果见图3，通过与γ-氨基丁酸标准品，如图3（A），比对植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）NEAUs5-1发酵产物中含有γ-氨基丁酸，且在不添加L-谷氨酸钠时含量为116.40 mg/L（表1，发酵液1），图3（B）；添加1%L-谷氨酸钠，其含量高达337.10 mg/L（表1，发酵液2），图3（C）。
实施例四
一种植物乳杆菌NEAUs5-1菌种菌液制备腌渍黄瓜的工艺方法如下：
（1）挑选新鲜质嫩、无病虫害及机械损伤的当年新生乳黄瓜，去顶花、柄蒂；
（2）清洗：处理后的乳黄瓜用清水洗净，沥干水分，摆放至发酵容器中；
（3）发酵：在装有乳黄瓜的发酵容器中注入纯净水至没过乳黄瓜，然后按乳黄瓜质量添加2%食用盐，芝麻、苏子籽、芥末籽、胡椒和香叶少许，同时按乳黄瓜质量的2%接种植物乳杆菌菌液，20 ℃密闭发酵30 d，80 ℃杀菌10 min，即为腌渍黄瓜。采用高效液相色谱检测黄瓜和黄瓜汁中的γ-氨基丁酸含量。
对比例一
白醋腌制黄瓜
在装有乳黄瓜的发酵容器中注入白醋与纯净水为1:1醋液至没过乳黄瓜，然后按乳黄瓜质量添加2%食用盐，芝麻、苏子籽、芥末籽、胡椒和香叶少许，20 ℃密闭腌制30 d，80℃杀菌10 min，即为白醋黄瓜腌渍品。采用高效液相色谱检测黄瓜和黄瓜汁中的γ-氨基丁酸含量。
实施例五
一种植物乳杆菌NEAUs5-1菌种菌液制备腌渍黄瓜的工艺方法如下：
（1）挑选新鲜质嫩、无病虫害及机械损伤的当年新生乳黄瓜，去顶花、柄蒂；
（2）清洗：处理后的乳黄瓜用清水洗净，沥干水分，摆放至发酵容器中；
（3）发酵：在装有乳黄瓜的发酵容器中注入纯净水至没过乳黄瓜，然后按乳黄瓜质量添加2%食用盐，芝麻、苏子籽、芥末籽、胡椒和香叶少许，同时按乳黄瓜质量的2%接种植物乳杆菌菌液，按乳黄瓜质量的1%、2%添加L-谷氨酸钠，20 ℃密闭发酵30 d，80 ℃，杀菌10min，即为腌渍黄瓜。采用高效液相色谱检测黄瓜，图3（D）和黄瓜汁γ-氨基丁酸含量（表1）。
实施例六
一种植物乳杆菌NEAUs5-1菌种菌液制备腌渍黄瓜的工艺方法如下：
（1）挑选新鲜质嫩、无病虫害及机械损伤的当年新生乳黄瓜，去顶花、柄蒂；
（2）清洗：处理后的乳黄瓜用清水洗净，沥干水分，摆放至发酵容器中；
（3）发酵：在装有乳黄瓜的发酵容器中注入纯净水至没过乳黄瓜，然后按乳黄瓜质量添加2%食用盐，芝麻、苏子籽、芥末籽、胡椒和香叶少许，同时按乳黄瓜质量的2%接种植物乳杆菌菌液，按乳黄瓜质量的1%添加红梅味素，20 ℃密闭发酵30 d，80 ℃杀菌10 min，即为腌渍黄瓜。采用高效液相色谱检测黄瓜和黄瓜汁γ-氨基丁酸含量（表1）。
分别测定发酵液、NEAUs5-1发酵黄瓜和发酵黄瓜汁液中γ-氨基丁酸含量，测定具体结果见表1。
表1 NEAUs5-1菌株在发酵培养基溶液、发酵黄瓜和发酵黄瓜汁液中γ-氨基丁酸含量
Figure SMS_1
由表1可知，本发明提供的菌株发酵黄瓜可高产γ-氨基丁酸，在未添加L-谷氨酸钠情况下，较白醋腌渍黄瓜提高γ-氨基丁酸2.12倍；在添加L-谷氨酸钠和红梅味素后较白醋腌渍黄瓜提高γ-氨基丁酸9.52-15.2倍。添加2%L-谷氨酸钠情况下，黄瓜中γ-氨基丁酸含量低于黄瓜汁；添加1%L-谷氨酸钠后，黄瓜中γ-氨基丁酸含量远远高于黄瓜汁中γ-氨基丁酸含量；添加红梅味素后，黄瓜中γ-氨基丁酸含量与黄瓜汁接近。
利用本发明的菌株制备腌渍黄瓜，不仅γ-氨基丁酸含量高，而且酸味均衡，口感脆嫩、营养丰富，还具有各种香料的香气，可使该黄瓜的口味更加纯正，如需提高γ-氨基丁酸产量可适当添加L-谷氨酸钠，适于大规模工业化生产。
因此，本发明采用上述一种高产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳杆菌及其在制备腌渍黄瓜中的应用，腌渍黄瓜酸味适中，口感柔和，并且高产γ-氨基丁酸。在制备腌渍黄瓜时操作简单，方便实现规模化生产。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），该植物乳植杆菌的菌株号为NEAUs5-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.24942。
2.根据权利要求1所述的一种产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳植杆菌的培养方法，其特征在于，步骤如下：
S1、将植物乳植杆菌NEAUs5-1进行活化、制备种子液，培养基为pH=3.0的液体MRS培养基；
S2、将种子液接入到扩大发酵培养基中进行扩大培养；
扩大发酵培养基的组分为蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、牛肉膏5 g/L、胡萝卜汁100ml/L，并以1 M的NaOH调整培养基pH为6.2-6.4。
3.根据权利要求1所述的一种产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳植杆菌在制备腌渍黄瓜中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳植杆菌在制备腌渍黄瓜中的应用，其特征在于：腌渍黄瓜为富含γ-氨基丁酸的黄瓜。
5.根据权利要求1所述的一种产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳植杆菌制备腌渍黄瓜的方法，其特征在于，步骤如下：
S1、选料：挑选新鲜质嫩、无病虫害及机械损伤的新生乳黄瓜；
S2、清洗：将选好的乳黄瓜清洗干净，置于发酵容器中；
S3、发酵：在步骤S2的装有乳黄瓜的发酵容器中注入纯净水，然后按黄瓜质量分数的2%添加植物乳植杆菌NEAUs5-1菌液，同时按黄瓜质量分数的2%添加食用盐；
最后加入芝麻、苏子籽、芥末籽、胡椒和香叶，密闭发酵获得腌渍黄瓜。
6.根据权利要求5所述的一种产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳植杆菌制备腌渍黄瓜的方法，其特征在于：步骤S3中，发酵温度为20℃，发酵时间不少于30天。
7.根据权利要求5所述的一种产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳植杆菌制备腌渍黄瓜的方法，其特征在于：步骤S3中，在加入食用盐同时，还加入按黄瓜质量分数2%的L-谷氨酸钠。
8.根据权利要求5所述的一种产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳植杆菌制备腌渍黄瓜的方法，其特征在于：步骤S3中，在加入食用盐同时，还加入按黄瓜质量分数1%的红梅味素。
9.根据权利要求5所述的一种产γ-氨基丁酸的耐酸型植物乳植杆菌制备腌渍黄瓜的方法，其特征在于：制备腌渍黄瓜中使用高效液相色谱分析法测定黄瓜、黄瓜汁中的γ-氨基丁酸含量。
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