CN116024133A - 一株耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌及其应用，本发明的耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌，其苹果酸的耐受度可达到30g/L，在MRS培养基中产苯乙醇的能力达到168mg/L，并将其应用于果蔬汁的发酵生产。该菌株能在果蔬汁中的高浓度苹果酸环境下正常生长繁殖并高产苯乙醇，生产过程可控，操作简单、方便；并且提高成品果蔬汁中的乳酸含量，大大提高成品果蔬汁的感官品质。
Description
技术领域
本发明涉及一株耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
乳酸菌是可以利用碳水化合物在发酵过程中产生乳酸的一类细菌，其均含有一定的蛋白酶和某些肽酶，能分解原料中的大分子酪蛋白，使其降解，或者分解蛋白质形成小肽或氨基酸；乳酸菌代谢产生的乳酸、乳酸乙酯、乙醛和双乙酰及其衍生物等物质可以极大程度改善乳酸菌发酵产品的风味；乳酸菌发酵产生的乳酸使pH值下降，在抑制其他细菌生长中起着主要作用，产生的其他少量物质，如过氧化氢、细菌素和乳链菌肽对其他细菌都有一定的抑制作用，能延长食品的保存期。
乳酸菌发酵果蔬制品由于其独特的风味和益生性能，受到越来越多的关注。乳酸菌发酵可以利用果蔬原料中的营养成分，积累乳酸、酯类物质等风味化合物，赋予发酵果蔬汁丰富的滋味和香气感官特征；同时，还可以增加果蔬汁中的生物活性物质，提高其抗氧化和抗菌等性能；同时乳酸菌发酵对部分果汁具有护色作用，例如在胡萝卜汁和苹果汁发酵后，颜色变得更加鲜艳亮丽，这与发酵过程中产生的还原力有关。
但是在不同果蔬原料中，有机酸组成差异非常显著，其对乳酸菌的生长和发酵存在显著抑制。在苹果、荔枝和水蜜桃汁中，苹果酸的含量通常高达10g/L以上，大部分乳酸菌在这个浓度下生长和发酵性能受到显著抑制。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一株耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌(L.plantarum)P-4及其应用，本发明通过菌种分离和筛选，得到了一株耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌P-4，其苹果酸的耐受度可达30g/L，在MRS培养基上产苯乙醇的能力达到168mg/L，并将其应用于苹果、荔枝和水蜜桃等这类苹果酸浓度较大的水果中发酵。该菌株能在苹果、荔枝和水蜜桃等高苹果酸环境下正常生长繁殖并高产苯乙醇，还能提高果蔬发酵终产品的乳酸含量，可大大提高发酵后果蔬的感官品质，生产出营养、安全并含有活性乳酸菌的发酵产品。
本发明的第一个目的是提供一株耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2022年11月4日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.26048。
本发明的第二个目的是提供所述耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌在发酵食品中的应用。
进一步地，所述食品为果蔬制品。
进一步地，所述果蔬制品为苹果汁、荔枝或水蜜桃汁。
进一步地，所述应用是将所述植物乳杆菌的种子液接种至果蔬汁中进行发酵。
进一步地，所述植物乳杆菌的种子液按照每千克发酵液添加0.05～2×1010个植物乳杆菌的接种量进行接种。
进一步地，所述发酵是在35～38℃培养36h-48h。
本发明的第三个目的是提供一种包含所述植物乳杆菌的微生物菌剂。
进一步地，所述微生物菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
本发明的第四个目的是提供一种采用所述植物乳杆菌发酵制备得到的果蔬汁。
本发明的有益效果是：
本发明的耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌，其苹果酸的耐受度可达到30g/L，在MRS培养基中产苯乙醇的能力达到168mg/L，并将其应用于果蔬汁的发酵生产。该菌株能在果蔬汁中的高浓度苹果酸环境下正常生长繁殖并高产苯乙醇，生产过程可控，操作简单、方便；并且提高成品果蔬汁中的乳酸含量，大大提高成品果蔬汁的感官品质。
生物材料保藏
植物乳杆菌P-4，分类命名为植物乳杆菌L.plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2022年11月4日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.26048。
附图说明：
图1为植物乳杆菌P-4在MRS固体培养基上的菌落特征。
图2为植物乳杆菌P-4在显微镜下的菌体形态。
图3为植物乳杆菌P-4与实验室分离的其他植物乳杆菌(L.plantarum)JN-7、M、L030、L031和F在添加苹果酸15g/L和30g/L的MRS体系下菌体生长状况。
图4为植物乳杆菌P-4基于16S rRNA基因发育树图。
图5为植物乳杆菌P-4基于16S rRNA基因电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌P-4和植物乳杆菌F的获得
分别称取10g醋醅加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，并加入灭菌的玻璃珠，旋涡振荡10min，充分散开醋醅。取上清液10倍梯度稀释，稀释梯度分别为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，10-8，用移液枪吸取0.5mL样液，采用平板涂布法，将样液均匀涂布于15g/L和30g/L苹果酸浓度的MRS筛选培养基上，将制备好的平板倒置于36℃恒温培养箱中培养3d，观察记录菌落特征形态。挑取能够在15g/L和30g/L苹果酸添加量的培养基上生长良好的菌株，进行多次划线分离出单克隆菌株，在15g/L苹果酸MRS平板上挑选出一株植物乳杆菌F，在30g/L苹果酸MRS平板上挑选出一株植物乳杆菌P-4，然后将在MRS斜面培养基上划线，保藏于4℃冰箱中备用。植物乳杆菌P-4的菌落形态、特征如图1和图2所示。
将植物乳杆菌P-4与实验室分离的其他植物乳杆菌(L.plantarum)JN-7、M、L030、L031和F在添加苹果酸15g/L和30g/L的MRS体系下进行培养，48小时后，菌体生长状况如图3所示。
实施例2：耐高浓度苹果酸植物乳杆菌P-4的16S rRNA鉴定实验
采用16S rDNA基因法对分离筛选的菌进行分子生物学的鉴定。根据原核生物体16SrDNA基因序列的高度保守性设计通用引物，以分离菌的DNA为模板扩增出细菌的16SrDNA基因片段，测定分离菌的16S rDNA基因序列(SEQ ID NO.1)，同GenBank中的基因序列进行同源性比对，以此确定分离菌的种属。植物乳杆菌P-4基于16S rRNA基因发育树图和电泳图如图3和图4。
采用常规方法进行16S rDNA扩增，将扩增后的PCR产物送样测序，测序由上海生工生物科技有限公司完成。
16S rDNA基因序列与NCBI数据库进行比对，菌株与L.plantarum有99.5％的同源性，故而鉴定菌株P-4为耐高浓度苹果酸植物乳杆菌(L.plantarum)，于2022年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26048。
实施例3：耐高浓度苹果酸植物乳杆菌P-4在苹果汁中的应用
(1)种子培养：从甘油管中取保藏的菌种P-4，按1％-3％接种量接种于MRS培养基中，37℃培养箱中静置密闭培养24h，得到植物乳杆菌P-2培养液。
(2)苹果汁制备：挑选完整，新鲜的苹果10Kg，清洗，去皮，破碎，榨汁，向汁液中加入娃哈哈超纯水1L，补蔗糖至Brix 12°，105℃灭菌5min，即得到苹果汁。
(3)苹果汁发酵：取植物乳杆菌的种子培养液6％接种于步骤(2)得到的苹果汁中，于37℃培养箱恒温密闭培养48h，发酵后测定样品中的总酸、有机酸，并进行感官评定测试，样品置于4℃冰箱保存。
总酸检测：采用酸碱滴定法测定。
有机酸检测：采用高效液相色谱法(HPLC)检测。
感官评定测试：按照以下表1的评定标准进行评分并进行统计。
实施例4：耐高浓度苹果酸植物乳杆菌P-4在荔枝中的应用
(1)种子培养：从甘油管中取保藏的菌种P-4，按1％-3％接种量接种于MRS培养基中，37℃培养箱中静置密闭培养24h，得到植物乳杆菌P-4培养液。
(2)荔枝汁制备：挑选完整，新鲜的荔枝10Kg，清洗，去皮，破碎，榨汁，向汁液中加入娃哈哈超纯水1L，补蔗糖至Brix 12°，105℃灭菌5min，即可得到荔枝汁。
(3)荔枝汁发酵：取植物乳杆菌的种子培养液6％接种于步骤(2)得到的荔枝汁中，于37℃培养箱恒温密闭培养48h，发酵后测定样品中的总酸、有机酸，并进行感官评定测试，样品置于4℃冰箱保存。
实施例5：耐高浓度苹果酸植物乳杆菌P-4在水蜜桃中的应用
(1)种子培养：从甘油管中取保藏的菌种P-4，按1％-3％接种量接种于MRS培养基中，37℃培养箱中静置密闭培养24h，得到植物乳杆菌P-4培养液。
(2)水蜜桃汁制备：挑选完整，新鲜的水蜜桃10Kg，清洗，去皮，破碎，榨汁，向汁液中加入娃哈哈超纯水1L，补蔗糖至Brix 12°，105℃灭菌5min，即可得到水蜜桃汁。
(3)水蜜桃汁发酵：取植物乳杆菌的种子培养液6％接种于步骤(2)得到水蜜桃汁中，于37℃培养箱恒温密闭培养48h，发酵后测定样品中的总酸、有机酸，并进行感官评定测试，样品置于4℃冰箱保存。
对比例1：
该实施例与实施例3使用的原料种类及发酵条件均相同，仅在对比例1中的步骤(3)中不添加耐高浓度苹果酸植物乳杆菌P-4。
对比例2：
该实施例与实施例4使用的原料种类及发酵条件均相同，仅在对比例2中的步骤(3)中不添加耐高浓度苹果酸植物乳杆菌P-4。
对比例3：
该实施例与实施例5使用的原料种类及发酵条件均相同，仅在对比例3中的步骤(3)中不添加耐高浓度苹果酸植物乳杆菌P-4。
表1乳酸菌发酵果蔬感官指标评分标准
实施例3-5与对比例1-3制备的果蔬发酵产品，其品质分析如表2：
表2果蔬发酵产品品质分析
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一株耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌，其特征在于，分类命名为植物乳杆菌L.plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2022年11月4日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.26048。
2.权利要求1所述耐高浓度苹果酸的植物乳杆菌在发酵食品中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述食品为果蔬制品。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述果蔬制品为苹果汁、荔枝或水蜜桃汁。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述应用是将所述植物乳杆菌的种子液接种至果蔬汁中进行发酵。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述植物乳杆菌的种子液按照每千克发酵液添加0.05～2×1010个植物乳杆菌的接种量进行接种。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述发酵是在35～38℃培养36h-48h。
8.一种包含权利要求1所述植物乳杆菌的微生物菌剂。
9.根据权利要求8所述微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液态菌剂或固态菌剂。
10.一种采用权利要求1所述植物乳杆菌发酵制备得到的果蔬汁。
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