CN113046269A - 一种植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌B3及其应用。本发明所述植物乳杆菌B3分离自蓝莓汁中，保藏编号为CGMCC NO.21610，该植物乳杆菌具有高效苹果酸发酵能力，在果酒发酵后具有显著的酒体香气表现和颜色稳定表现。

Description

一种植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其应用。
技术背景
苹果酸乳酸发酵是葡萄酒、苹果酒、蓝莓酒等多种果酒在果酒酿造过程中，由乳酸菌主导将苹果酸转化为乳酸的二次发酵，通常发生在酒精发酵结束之后，可以降低果酒的酸度，提高适口性，增强产品生物稳定性。苹果酸乳酸发酵可以自发进行，但容易出现杂菌生长或者发酵中断等问题，为了更好地实现发酵控制，传统的苹果酸乳酸发酵由耐高酒精度和低pH的酒球菌完成，并且大多数制酒企业选择酒球菌主导苹果酸乳酸发酵。但是近期的研究发现部分植物乳杆菌可以在低pH(pH＝3.5左右)、高酒精度(8-12％v/v)模拟酒环境中生存并且消耗苹果酸。相较于以往酒球菌主导的苹果酸乳酸发酵，植物乳杆菌主导的苹果酸乳酸发酵还会对果酒的颜色、香气等有积极影响。植物乳杆菌含有的多种酶可对果酒的感官特性有积极影响。
虽然植物乳杆菌被发现可以用于果酒苹果酸乳酸发酵，但是由于不同果酒的酒精发酵后的酒环境(pH、酒精度等)不同，且十分复杂，大多数植物乳杆菌在接入酒精发酵后的果酒中时会快速的死亡，从而使其苹乳发酵能力受到抑制。
蓝莓酒作为新兴的果酒产业，发展迅速，但同时在蓝莓酒的酿造过程中也面临一些问题：在蓝莓酒发酵过程中容易出现褪色、香气不明显等现象。结合植物乳杆菌苹果酸乳酸发酵的特点，利用植物乳杆菌对蓝莓酒进行苹果酸乳酸发酵，或许可以对蓝莓酒的香气和颜色有积极影响，不仅可以改进蓝莓酒发酵技术，也可以指导一些与蓝莓类似浆果的果酒的发酵。但现有的大多数植物乳杆菌都分离自葡萄汁，可能无法适应蓝莓酒低pH的酒环境，故需要从蓝莓汁中分离植物乳杆菌用于蓝莓酒发酵改善现存问题。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适于果酒发酵的植物乳杆菌。基于上述目的，本发明提供如下技术方案。
本发明提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3，其特征在于，所述植物乳杆菌B3保藏编号为CGMCC NO.21610。
在一些实施方式中，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3分离自蓝莓。
本发明还提供一种发酵菌剂，所述菌剂包含包上述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)B3。
本发明还提供一种组合物，所述组合物包含包上述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)B3。
本发明还提供一种上述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3在果酒发酵中的应用。
本发明还提供一种上述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3在发酵增加果酒花色苷类物质中的应用。
本发明还提供一种上述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3在发酵增加果酒挥发性香气化合物中的应用。
在一些实施方式中，所述果酒为蓝莓酒。
本发明还提供一种上述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3的果酒发酵方法，其特征在于，取发酵样品蓝莓汁，接种上述植物乳杆菌，设置初始pH≥3.2，优选的pH＝3.2；
在一些实施方式中，利用反向接种的方法进行发酵；
在一些实施方式中，所述反向接种具体为：首先将活化好的植物乳杆菌以1×107
CFU/mL的接种浓度接种到蓝莓汁中，28℃发酵三天，再以1×106CFU/mL的接种浓度接种酵母菌做酒精发酵。
在一些实施方式中，所述果酒为蓝莓酒。
生物保藏说明：
生物材料：植物乳杆菌B3(Lactobacillus plantarum)，已于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.21610。
相比于现有技术，本发明至少具有如下有益效果在于：
1、本发明所述植物乳杆菌B3分离自蓝莓汁中，具有高效的苹果酸发酵能力，能够适应果酒低pH，低苹果酸等酒环境。
2、本发明所述植物乳杆菌B3经果酒发酵后挥发性香气化合物的种类以及含量都明显增加，更有利于酒体香气表现和后期贮藏的稳定性；
3、本发明所述植物乳杆菌B3处理的果酒中主要的原始花色苷消耗量比较大，都转化为了吡喃花色苷，其在后期的颜色表现持续稳定。
附图说明
图1三株植物乳杆菌发酵过程中苹果酸含量变化；
图2发酵最佳接种方式的选择；
图3蓝莓汁发酵最适pH选择；
图4植物乳杆菌B3在最适发酵条件下发酵的苹果酸含量变化；
图5不同实验组在发酵果酒中产生的挥发性成分；
图6不同实验组在发酵果酒中产生的花色苷类物质热图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
部分术语定义
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
本发明中所使用的“顺序接种”是指在果酒发酵过程中，酒精发酵结束后再接种乳酸菌的接种方式。
本发明中所使用的“补氮接种”是指在果酒发酵过程中，酒精发酵结束后，补充氮源后接种乳酸菌的接种方式。
本发明中所使用的“反向接种”是指在果酒发酵过程中，酒精发酵开始前先接种乳酸菌，三天后接种酵母的接种方式。比如，在一些特定具体的实施方式中，具体为将活化好的植物乳杆菌以1×107CFU/mL的接种浓度接种到蓝莓汁中，28℃发酵3天，再以1×106CFU/mL的接种浓度接种酵母菌做酒精发酵。
实施例1菌株分离鉴定
菌株分离与筛选：
实验原料：‘蓝丰’蓝莓，由大连森茂现代农业有限公司蓝莓基地提供，冷链运输。运达后于-20℃冰柜冷冻保藏。
实验试剂：牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨、碳酸钙、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、无水硫酸镁、一水合硫酸锰、吐温-80、纳他霉素、氯化钠购自上海麦克林生化科技有限公司；葡萄糖、乙酸钠购自北京化工厂；琼脂购自北京科百奥生物有限公司；L-苹果酸试剂盒购自爱尔兰Megazyme公司。
将蓝莓破碎后放入5L发酵罐中自然发酵，每2天从中取样1mL，在事先倒好的固体MRS培养基平板上涂布37℃培养24h。长出明显菌落之后，挑取具有溶钙圈并且菌落形态呈乳白色，表面光滑的单菌落至新的MRS平板中划线离，重复3-4次，挑取单菌落进行革兰氏染色并在显微镜下观察菌体形态。经反复筛选最终获得革兰氏阳性且轮廓呈杆状的3株菌株，在液体MRS培养基中纯化2代，纯化后的菌落接种于斜面培养基上，4℃冰箱保存。
菌株鉴定：将分离纯化后的3株产酸菌，接种到液体MRS培养基中，37℃培养8-12h，吸取菌液于灭好菌的2mL离心管中，6000rpm离心5min，倒掉上层培养基，离心菌体，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取筛选菌株的基因组DNA。用所提取的基因组作为模板进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增，选用细菌通用引物扩增片段进行测序。测序工作由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。使用NCBI Blast程序将所测定的菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中的已知细菌16S rRNA进行序列比较，结果与植物乳杆菌的同源性为95％以上，结合菌落形态和生理生化特征，这三株菌株鉴定为植物乳杆菌，分别命名为植物乳杆菌B3、植物乳杆菌B4、植物乳杆菌SS6，
将三株菌分别接入蓝莓酒中进行苹果酸乳酸发酵，测试其苹果酸消耗能力以及对蓝莓酒颜色的影响。实验设置原汁组、red fruit、B3组B4组和SS6组。所述原汁组为蓝莓汁不接种酵母和乳酸菌，自然发酵；所述red fruit组为蓝莓汁接种酵母发酵；所述B3组为蓝莓汁接种酵母酒精发酵后植物乳杆菌B3发酵；所述B4组为蓝莓汁接种酵母酒精发酵后植物乳杆菌B4发酵；所述SS6组为蓝莓汁接种酵母酒精发酵后植物乳杆菌SS6发酵。
结果如图1和表1所示，接种三株植物乳杆菌在苹果酸消耗能力上不存在显著性差异，均能在接入三天后，将苹果酸消耗完毕。同时三株植物乳杆菌对蓝莓酒颜色有不同程度的影响，三株菌处理的酒都表现出a*下降，b*上升，C*下降，H*升高的特点，其中植物乳杆菌B3处理过的酒，与原汁差异最小，相对于原汁各项指标变化最小，最大程度的稳定了蓝莓酒的颜色。故选取植物乳杆菌B3为最佳发酵菌株，其保藏编号为CGMCC NO.21610。将其制成冻干菌粉，现保藏于CGMCC和北京林业大学食品生物工程创新研究室。
表1发酵前后蓝莓酒颜色特征参数表
L* a* b* △E* C* H*
原汁 31.91±0.70C 40.11±0.71A -5.18±1.15C — 40.46±0.57A -0.13±0.03C
Red fruit 37.73±0.94Bb 29.58±0.02Ba -0.64±0.66ABb 12.91±0.30b 29.59±0.04Ba -0.02±0.02BCb
B3 38.20±1.10Bb 27.50±0.33BCab -1.28±0.48Bb 14.67±0.55b 27.53±0.31Bab -0.05±0.02BCb
B4 41.00±0.45ABab 29.25±0.67Ba 0.62±0.28ABab 15.33±0.26b 29.26±0.66Ba 0.02±0.01ABab
SS6 41.97±0.49ABab 25.54±0.83BCab -0.19±0.39ABb 18.42±0.55a 25.55±0.83Bab -0.01±0.02BCb
实施例2植物乳杆菌B3接种方式的选择
鉴于植物乳杆菌在蓝莓酒中发酵的案例较少，探究植物乳杆菌B3在蓝莓酒苹乳发酵过程中所能起到的作用是十分有意义，所以选取实验酒样为蓝莓酒。根据前人的研究发现，植物乳杆菌在蓝莓酒酒精发酵结束后接种，其表现出生物活性快速丧失以及苹果酸消耗能力受到极大的抑制。故本发明探究了植物乳杆菌在蓝莓酒中最适的接种方式，分别采用：顺序接种(酒精发酵结束后接种)；补氮接种(酒精发酵结束后，补充氮源接种)；反向接种(酒精发酵开始时接种，三天后接种酵母)，监测发酵前后样品中苹果酸的含量。
结果如图2所示，顺序接种和补氮接种的苹果酸含量在发酵前后都没有明显下降，说明这两组中苹果酸并没有被接入的植物乳杆菌消耗，而反向接种的苹果酸在发酵前后有显著变化，发酵后苹果酸被植物乳杆菌完全消耗，说明反向接种可以避免植物乳杆菌活性被酒中物质抑制，从而使苹果酸得到消耗。故选取反向接种的方式作为接种植物乳杆菌B3的最适接种方式。
实施例3蓝莓酒最适pH选择
通过预实验发现植物乳杆菌B3在低pH的酒环境中发酵效果并不理想，具体表现为苹果酸消耗不完全、植物乳杆菌接入后迅速死亡以及各项指标与不接植物乳杆菌的对照组差异不大，因此，设计实验探索在反向接种条件下，接种前用小苏打调整蓝莓汁pH，设置三个pH条件：pH＝2.9；pH＝3.2；pH＝3.5(接种前pH)，监测发酵前后样品苹果酸含量的变化。
结果如图3所示，在pH＝2.9时，发酵前后苹果酸含量没有明显下降，可能是低pH抑制了植物乳杆菌的活性导致苹果酸没有被植物乳杆菌消耗，在pH＝3.2和pH＝3.5时，发酵前后苹果酸含量有显著变化，发酵结束时，所有苹果酸都被植物乳杆菌消耗，说明在pH≥3.2时，可以充分保证植物乳杆菌活性，使其完全消耗样品中苹果酸，故蓝莓酒最适pH选择pH≥3.2，优选的pH＝3.2。
实施例4植物乳杆菌B3在果酒苹果酸乳酸发酵中的应用
苹果酸含量是用来监测果酒苹果酸乳酸发酵的一个常用指标。为了评估植物乳杆菌B3的苹果酸消耗能力，特设计如下实验：取发酵样品蓝莓汁，根据上述实验结果，设置初始pH＝3.2，苹果酸＝1.3g/L，利用反向接种的方法进行发酵：首先将活化好的植物乳杆菌以1×107CFU/mL的接种浓度接种到蓝莓汁中，28℃发酵三天，再以1×106CFU/mL的接种浓度接种酵母菌做酒精发酵，接种酵母菌之前每天取样一次，接种酵母菌之后每3天取样一次，检测发酵过程中苹果酸含量变化。对照组只在第三天接种酵母菌，不接种植物乳杆菌。
结果如图4所示，蓝莓汁初始苹果酸含量为1.30±0.05g/L，经过3天的苹果酸乳酸发酵，与空白对照组，接种植物乳杆菌的蓝莓汁苹果酸被完全消耗，这说明该菌株有消耗苹果酸的能力，同时与一般的苹果酸乳酸发酵需要5-7天相比，该菌株可在3天之内将苹果酸完全消耗，说明其消耗苹果酸能力极其显著。
实施例5植物乳杆菌B3在增加果酒挥发性成分中的应用
根据已有研究表明，在果酒发酵过程中植物乳杆菌主导的苹果酸乳酸发酵会对果酒的香气产生影响，果酒中的挥发性成分通常是果酒中主要的呈香物质，故设计以下实验探究植物乳杆菌对蓝莓酒中挥发性成分的影响，实验方法：取发酵样品蓝莓汁，根据上述实验结果，设置初始pH＝3.2，苹果酸＝1.3g/L，利用反向接种的方法进行发酵：首先将活化好的植物乳杆菌以1×107CFU/mL的接种浓度接种到蓝莓汁中，28℃发酵三天，再以1×106CFU/mL的接种浓度接种酵母菌做酒精发酵，接种酵母菌之前每天取样一次，接种酵母菌之后每3天取样一次，检测发酵过程中苹果酸含量变化。另，以现有技术中的植物乳杆菌lp39做阳性对照，植物乳杆菌lp39来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CICC°6240。利用顶空固相微萃取(HP-SPME-GC-MS)检测样品中挥发性成分，并进行定性定量分析。具体实验组别设置如下：原汁组、red fruit、B3组、B4组、SS6组和LP39组，所述原汁组为蓝莓汁不接种酵母和乳酸菌，自然发酵；所述red fruit组为蓝莓汁接种酵母发酵；所述B3组为蓝莓汁接种酵母酒精发酵后植物乳杆菌B3发酵；所述B4组为蓝莓汁接种酵母酒精发酵后植物乳杆菌B4发酵；所述SS6组为蓝莓汁接种酵母酒精发酵后植物乳杆菌SS6发酵；所述LP39组为蓝莓汁接种酵母酒精发酵后植物乳杆菌LP39发酵。
如图5所示，蓝莓汁和蓝莓酒共检测到9种酯类、4种萜烯类、11种醇类、4种醛类、3种含苯环的化合物、4种酮类、1种酸类、1种挥发性酚类、和2种其他挥发性化合物共40种挥发性化合物。接种植物乳杆菌B3的酒相对于其他实验组，酸类、高级醇类、含苯环类化合物和醛类挥发性化合物含量较高，其中醇类中2,3-Butanediol的含量大幅高于其他实验组，而2,3-Butanediol在酒体中一般呈现出果香，甜香和黄油的味道；相对于原汁组，其新产生了大量的酯类、酮类、萜烯类挥发性香气化合物，酯类和萜烯类化合物是果酒中主要的呈香物质，酒体的香气复杂度明显增加，例如Isoamyl lactate被认为一般呈现香蕉味和果味；(E)-β-Damascenone一般呈现出蜂蜜、花香和甜香味。综合来看，接种植物乳杆菌B3的酒更有利于酒体香气的表现。
实施例6植物乳杆菌B3在增加果酒花色苷类物质中的应用
根据已有研究表明，在果酒发酵过程中植物乳杆菌主导的苹果酸乳酸发酵会对果酒的颜色产生消极或积极的影响，通常果酒中颜色的变化都与花色苷类物质的变化有关。故设计以下实验探究植物乳杆菌对蓝莓酒中挥发性成分的影响，实验方法：取发酵样品蓝莓汁，根据上述实验结果，设置初始pH＝3.2，苹果酸＝1.3g/L，利用反向接种的方法进行发酵：首先将活化好的植物乳杆菌以1×107CFU/mL的接种浓度接种到蓝莓汁中，28℃发酵三天，再以1×106CFU/mL的接种浓度接种酵母菌做酒精发酵，接种酵母菌之前每天取样一次，接种酵母菌之后每3天取样一次，检测发酵过程中苹果酸含量变化。对照组只在第三天接种酵母菌，不接种植物乳杆菌。利用UHPLC-MS/MS方法检测花色苷类物质。
图6是花色苷类物质在各组中峰面积的热图分析，颜色越深代表含量越高，颜色越浅代表含量越低，一共定性出34种花色苷类物质，其中8种单体花色苷、5种酰化单体花色苷、19种吡喃花色苷、2种黄烷醇结合的花色苷。热图可分为4个部分(P1-P4)：P1以乙醛吡喃化的花色苷为主，P2部分以单体花色苷以及酰化的单体花色苷为主，P3部分有多种花色苷其中乙基愈创木酚吡喃化的花色苷较多，P4部分全都是吡喃花色苷以及酰化的吡喃花色苷，其中以乙烯基儿茶醇吡喃化的花色苷最多。对比各组可以看出：在原汁中P2部分的花色苷最多，说明发酵过后果汁中原有的花色苷单体以及酰化的花色苷单体减少，其中不接种植物乳杆菌的组(Red
Figure BDA0002993888270000081
组)损失最多。对比Red
Figure BDA0002993888270000082
组的花色苷组成与其余实验组的花色苷组成可以看出：植物乳杆菌的接入有利于花色苷的衍生化，B3菌株的接入会使P1部分以及P3部分的花色苷显著增加。相较于其他几株菌，接种植物乳杆菌B3的酒中主要的原始花色苷消耗量比较大，都转化为了吡喃花色苷，主要表现为单体花色苷(mv-ara、pt-glc等)和酰化单体花色苷(del-cou-glc、mv-ace-glc等)含量相较于原汁有较大减少，乙醛加成的吡喃化花色苷(Ace add mv-ara、Ace add del-ara、Ace add mv-ace-glc等)和乙基愈创木酚吡喃化花色苷(Vg add mv-ara、Vg add mv-glc等)含量相较于其他实验组大幅增加，而吡喃化花色苷相较于原始花色苷更加稳定，因此接种植物乳杆菌B3的酒在后期的颜色表现会更持续稳定。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3，其特征在于，所述植物乳杆菌B3保藏编号为CGMCC NO.21610。
2.一种发酵菌剂或组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3在果酒发酵中的应用。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3在发酵增加果酒花色苷类物质中的应用。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3在发酵增加果酒挥发性香气化合物中的应用。
6.权利要求3-5任一所述应用，其特征在于，所述果酒为蓝莓酒。
7.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3的发酵方法，其特征在于，向果酒中接种权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3，设置初始pH≥3.2，优选的pH＝3.2。
8.权利要求7所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3的果酒发酵方法，其特征在于，所述接种的方式为反向接种。
9.权利要求8所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3的果酒发酵方法，其特征在于，所述反向接种具体为：将活化好的植物乳杆菌以1×107CFU/mL的接种浓度接种到蓝莓汁中，28℃发酵3天，再以1×106CFU/mL的接种浓度接种酵母菌做酒精发酵。
10.权利要求7-9任一所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)B3的果酒发酵方法，其特征在于，所述果酒为蓝莓酒。
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