CN102358888A - 一株植物乳杆菌r23 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株植物乳杆菌R23(Lactobacillus plantarumR23)，其特征在于：所述植物乳杆菌于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC No.5105。所述植物乳杆菌R23不仅高产苹果酸乳酸酶，具有良好的生物降酸能力，而且具有以下所述的较强的益生特性：①较强的抗逆性，②较强的抗氧化能力，③较强的粘附能力。所述植物乳杆菌在含有苹果酸的果酒中能够优先利用苹果酸，经苹果酸乳酸发酵，实现生物降酸。所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型无菌果汁饮料，所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型乳酸菌活菌饮料。

Description

一株植物乳杆菌R23

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株具有益生特性、产苹果酸乳酸发酵酶的植物乳杆菌R23及其在果酒降酸等方面的应用，该菌为植物乳杆菌属的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为植物乳杆菌R23，该菌已于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC No.5105。

背景技术

果酒中高含量的苹果酸会导致酒体酸涩、粗糙感强，苹果酸-乳酸发酵(MLF)是乳酸菌以双羧基的L-苹果酸为底物，在苹果酸-乳酸酶(MLE)催化下转变成单羧基L-乳酸和CO₂的过程，此过程可使酒体变柔和，并起到风味修饰作用，是酿造优质果酒的重要生物降酸工序之一。但是果酒中高含量的二氧化硫和酒精浓度、低pH值，以及较低的发酵条件等均抑制了乳酸菌的生长，从而大大降低了乳酸菌的降酸效果；迫切需要选育一种耐高二氧化硫、高酒精度、低pH和酿酒特性好的乳酸菌种。

发明内容

为了解决现有技术所存在的问题，本发明提供了一株植物乳杆菌R23，它不仅高产苹果酸乳酸酶，具有良好的生物降酸能力，而且具有较强的益生特性。

本发明技术方案由以下几部分构成：

方案一：

一株植物乳杆菌R23(Lactobacillus plantarum R23)，其特征在于：所述植物乳杆菌于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.5105。

本发明所述的植物源乳杆菌是从自然发酵的“早钟六号”枇杷酒中分离、筛选出的具有较强的益生特性与产酶能力的乳酸菌，命名为植物乳杆菌R23(Lactobacillus plantarumR23)，简称R23。

所述植物乳杆菌具有以下形态特征：菌落直径1.0～1.8mm，呈圆形，表面光滑，边缘完整，中央突起，乳白色，不透明；液体培养无菌膜、无气泡、菌液浑浊、分层明显、菌体不易离心且底部有白色沉淀；细胞形态为杆状或椭圆，杆状菌体大小为0.37μm×2.25μm(长×宽)，椭圆状菌体大小为0.58μm×2.01μm(长×宽)，细胞常呈单个排列，无芽孢，不运动。

所述植物乳杆菌具有以下生理生化特性：菌株能在15℃以下生长，甲基红试验和0.1％美兰牛乳试验为阳性，兼性厌氧，接触酶试验、氧化酶试验、伏普试验、淀粉水解试验、吲哚试验、明胶水解试验、硫化氢试验、硝酸盐还原试验、葡萄糖酸盐试验及精氨酸产氨试验均为阴性；糖发酵试验结果表明，所述植物乳杆菌不能代谢山梨醇，对木糖呈阳性弱反应，其它15种碳源均可利用。

此外，所述植物乳杆菌具有以下益生特性：①较强的抗逆性：能耐受pH值大于等于2.5的酸度，能耐受高达0.5％的胆盐浓度；②较强的抗氧化能力：所述植物乳杆菌培养24h后的胞外代谢产物，对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别达77.8％和80.94％；③较强的粘附能力：表面疏水性达17.71％。

所述植物乳杆菌具有以下发酵特性：抗逆能力强，即所述植物乳杆菌能在具有如下一个以上条件的酒体内正常生长：

SO₂含量               120±10mg/L；

酒精度(v/v)           13±2％；

pH值                  3.3±0.2；

总酸(以苹果酸计)      1.0±0.2％；

培养温度              18±2℃。

所述植物乳杆菌具有苹果酸乳酸发酵特性，即所述植物乳杆菌产苹果酸乳酸酶，并且在植物乳杆菌菌体对数生长期内，产苹果酸乳酸酶量及其活力随着植物乳杆菌菌量的增加而增加，在稳定期的4-8h内酶活较高；所述植物乳杆菌菌体产苹果酸乳酸酶的培养条件为：发酵温度30±5℃，pH值6.5±0.5，L-苹果酸浓度4.5±0.5g/L；各因素对产苹果酸乳酸酶量的影响主次顺序是：起始L-苹果酸浓度＞发酵温度＞起始pH值。

所述植物乳杆菌菌体产苹果酸乳酸酶的最适培养条件为：发酵温度33.5℃，pH值6.2，L-苹果酸浓度4.0g/L。在此条件下植物乳杆菌R23厌氧发酵28h的产酶量为1.34mg/mL，酶活力为462.33u，总活力为619.52U。

所述植物乳杆菌在枇杷果酒中的生长及苹果酸乳酸发酵特性如下：所述植物乳杆菌在枇杷果酒的菌量总体呈下降趋势，厌氧条件能明显提高菌体细胞在枇杷果酒中的存活率和降酸效果；生长曲线的下降趋势与接种量、总二氧化硫浓度、酒精度及发酵温度呈正效应，与pH值呈负效应，完成苹果酸乳酸发酵后菌量下降速率加快；当接种量为10⁸CFU/mL、总二氧化硫≤70mg/L且酒精度≤12.7％(体积分数)时，能完全将枇杷果酒中的苹果酸转化为乳酸；当pH值≤3.3时，苹果酸乳酸发酵无法完成。

方案二：

方案一所述的植物乳杆菌R23在果酒酿造中的应用，其特性在于：所述植物乳杆菌在含有苹果酸的果酒中能够优先利用苹果酸，经苹果酸乳酸发酵，实现生物降酸。

发酵方法如下：将所述植物乳杆菌菌株在种子发酵培养基中活化后，以9.8×10⁷～5.6×10⁸cfu/mL接种量接入总硫浓度39.6～120.7mg/L、酒精度10～13％且总酸6.8～11.9g/L的果酒中，在22±1℃下恒温发酵4-5天。

所述植物乳杆菌适宜的种子发酵培养基LH18由以下组分构成：番茄汁100mL，酵母膏7.4g，牛肉膏10g，葡萄糖30g，硫酸镁0.36g，苹果酸钠20g，吐温1g，胰蛋白胨15g，柠檬酸铵2g，MnSO₄0.05g，加水补足1L。

所述含有苹果酸的果酒包括枇杷酒、猕猴桃酒和刺葡萄酒等：

①所述植物乳杆菌应用于枇杷酒酿造中，能将高含量的苹果酸转化为乳酸，降低枇杷酒中的苹果酸含量，增加酒体柔和度，提高枇杷酒质量，降酸率达30％以上，柔和指数提高33％以上。

②所述植物乳杆菌应用于“中华”猕猴桃酒生物降酸中，总酸下降31％以上，柔和指数提高27％以上。

③所述植物乳杆菌应用于“溪塔”刺葡萄酒生物降酸中，总酸下降28％以上，柔和指数提高20％以上。

方案三：

方案一所述的植物乳杆菌R23在生产发酵型无菌果汁饮料中的应用，其特性在于：所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型无菌果汁饮料，所生产的发酵型无菌果汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

方法如下：将所述植物乳杆菌菌株的扩培菌液以8.6×10⁷～2.1×10⁸cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95～100℃处理2min的果汁，人工调节发酵温度30℃±2℃、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的果汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20％的浑浊型乳酸发酵饮料，再灌装杀菌即可。

例如：所述植物乳杆菌能用于枇杷汁饮料加工中，生产发酵型无菌枇杷汁饮料，所生产的发酵型无菌枇杷汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

所述植物乳杆菌能用于葡萄汁饮料加工中，生产发酵型无菌葡萄汁饮料，所生产的发酵型无菌葡萄汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

所述植物乳杆菌能用于猕猴桃汁饮料加工中，生产发酵型无菌猕猴桃汁饮料，所生产的发酵型无菌猕猴桃汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

方案四：

方案一所述的植物乳杆菌R23在生产发酵性乳酸菌活菌饮料中的应用，其特性在于：所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型乳酸菌活菌饮料，所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，并含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

方法如下：将该菌株的扩培菌液以8.6×10⁷～2.1×10⁸cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95～100℃处理2min的果汁，人工调节发酵温度30℃±2℃、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的活性果汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20％的浑浊型活性乳酸发酵饮料，再灌装即可。

例如：所述植物乳杆菌能用于枇杷汁饮料加工中，生产发酵型枇杷汁乳酸菌活菌饮料，所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，或者含有活性植物乳杆菌以及所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

所述植物乳杆菌能用于葡萄汁饮料加工中，生产发酵型葡萄汁乳酸菌活菌饮料，所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，或者含有活性植物乳杆菌以及所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

所述植物乳杆菌能用于猕猴桃汁饮料加工中，生产发酵型猕猴桃汁乳酸菌活菌饮料，所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，或者含有活性植物乳杆菌以及所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

方案五：

含有方案一所述的植物乳杆菌R23的菌剂，其特征在于：所述菌剂为直投式发酵剂，其中含有植物乳杆菌，活菌数在10¹¹cfu/ml以上。

所述菌剂在4-6℃条件下保存1年，活菌数在10¹⁰cfu/ml以上，细胞存活率达70％以上。

所述菌剂可用于果酒降酸、果蔬汁饮料加工、发酵乳制品等。

此外，还可对所述植物乳杆菌生产的苹果酸乳酸酶进行提取纯化，制得酶制剂，用于果酒降酸、果蔬汁饮料加工等。

较之现有技术而言，本发明所提供的植物乳杆菌不仅具有较强的益生特性，而且高产苹果酸乳酸酶，可在MLE的作用下进行苹果酸乳酸发酵，能有效降低果酒、果汁中的苹果酸、增加乳酸及挥发酯等的含量，从而使果酒、果汁口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁，为提高果酒、果汁品质奠定基础；此外该菌还有一定的抑菌效果，对一些致病菌具有抑制作用。

附图说明

图1是植物乳杆菌R23和对照菌6045的表面疏水性对比示意图，参见实施例1。

图2是植物乳杆菌R23和对照菌6045的抗氧化能力对比示意图，参见实施例1。

图3-a是植物乳杆菌R23的生长曲线示意图，参见实施例2。

图3-b是植物乳杆菌R23在不同生长期的MLE产量及酶活力示意图，参见实施例2。

图4是发酵温度对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。

图5是pH值对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。

图6是L-苹果酸对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。

图7是NAD⁺的添加量对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。

图8是供氧条件对植物乳杆菌R23的MLE的影响示意图，参见实施例2。

图9是植物乳杆菌R23的抗氧化能力的阳性对照标准曲线示意图。

具体实施方式

以下将结合实施例说明本发明所述的植物乳杆菌的益生特性，诸如抗逆性、抗氧化能力、粘附能力等；产苹果酸乳酸酶特性，诸如产酶条件、影响因子等；以及植物乳杆菌在果酒酿造、生产发酵型无菌果汁饮料、生产发酵型乳酸菌活菌饮料等方面的应用。

实施例1：本发明所述的植物乳杆菌的益生特性

1.耐酸及耐胆盐能力

将收集的植物乳杆菌R23菌泥和对照菌6045分别用无菌生理盐水洗涤2次，并以原体积的十分之一制成悬悬菌，以1％的接种量分别接种于pH值为3.5、3.0、2.5、2.0、1.5和胆盐浓度为0％、0.1％、0.3％、0.5％的LH18培养基中，25℃控温培养4h，每2h取样进行活菌计数，平行3次取平均值。各菌株在不同pH值及胆盐浓度环境中培养4h后的菌量变化见表1、表2：植物乳杆菌R23在pH值2.5环境下培养4h的生物量仍达10⁶CFU/mL，而6045仅可耐受pH值3.0的酸度，在pH值2.5酸性条件下培养4h和2h均已死亡；植物乳杆菌R23可耐受0.5％胆盐，培养4h后的生物量仍可达10⁷CFU/mL，而6045仅可耐受0.3％胆盐浓度。结果表明，植物乳杆菌R23对酸度和胆盐的抗逆能力均优于对照菌6045。

表1各菌株的耐酸能力(lgCFU/mL，

)

备注：ND表示未能测到，下同。

表2各菌株对胆盐的耐受能力(lgCFU/mL，

)

2.黏附能力

在适当条件下，分别测定植物乳杆菌R23及对照菌6045的表面疏水性。结果由图1可以看出，植物乳杆菌R23的表面疏水性高于对照菌6045，达17.71％。菌株的表面疏水性越高，则菌株的黏附能力也高。

3.抗氧化能力

菌株分离后的各菌株发酵液对超氧阴离子和羟自由基均有一定的清除能力(见图2)，与培养基的差异均达极显著(P＜0.01)，说明各菌株的胞外代谢产物均有抗氧化能力，尤其是清除超氧阴离子自由基的能力。其中，以植物乳杆菌R23发酵液的清除自由基能力最强，发酵24h后的发酵液对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别达到77.8％和80.94％，分别比对照菌6045高36.72和5.81个百分点，V_C相当量为0.231mg/mL和0.167mg/mL。

实施例2：植物乳杆菌R23产苹果酸乳酸酶特性

1.生长期的MLE产量及酶活力

以10⁷cfu/mL接入活化的植物乳杆菌R23菌种于LH18培养基中，25℃控温培养48h，每4h测定菌体密度、产酶量及其酶活力，并绘制生长曲线。

如图3-a所示，0h-4h为延滞期，菌体密度基本保持不变，随后进入对数生长期，接种24h后进入稳定期，菌量最大达5.53×10⁹cfu/mL，而后菌量开始缓慢下降。在0-28h内，MLE活了及总活力随着菌量的增加而迅速提高，在28h时达到最大值406.9u和357.67U，此后MLE活力和总活力开始逐渐下降；接种后植物乳杆菌R23的产酶量始终呈上升趋势(如图3-b所示)。试验结果表明植物乳杆菌R23产MLE的酶活力较高的时期是在进入稳定期的4-8h。酶活力与产酶量在细菌生长前期为正相关，后期为负相关。

2.温度和pH值对MLE产量及酶活力的影响

在LH18培养基中加入4g/L的L-苹果酸和100mg/L的NAD⁺，作为基础发酵液，接入10⁷cfu/mL活化好的植物乳杆菌R23，分别置于15、20、25、30、35、40、45℃下控温培养，结果如图4。在温度为15℃-35℃内，MLE活力和总活力随着发酵温度的上升而增高，35℃达到最高值为401.23u和351.88U，随后随发酵温度的升高而下降。25-35℃，发酵产酶量差异不显著(P＞0.05)，当温度提高到40℃以上时，其产酶量迅速增加，但酶活力却迅速下降。

将基础发酵液的pH值分别调节为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，接种10⁷cfu/mL活化好的植物乳杆菌R23，35℃恒温培养。结果如图5，较低的pH值对R23的产MLE活力有明显的抑制作用，其适宜的产酶pH值为6.0-7.0的范围内，pH值为6.0时植物乳杆菌R23的产酶量最高，而pH值为6.5时，R23的酶活力和总活力均最高。

3.L-苹果酸、NAD⁺对MLE产量及酶活力的影响

在去掉苹果酸根的LH18培养基中，分别添加0、1、2、3、4、5g/L L-苹果酸，并用4mol/LNaOH调整pH值为6.0；以LH18培养基为发酵液，分别添加0、50、100、150、200mg/L的NAD⁺；在两个处理中分别接入10⁷cfu/mL活化好的植物乳杆菌R23，35℃恒温培养。

从图6可以看出，随着L-苹果酸浓度的增大，R23产酶量、酶活力及总活力均呈先上升而后趋于稳定的趋势，L-苹果酸浓度在4.0g/L和5.0g/L时，R23的产酶量及其活力的差异不显著(P＞0.05)。试验结果表明，L-苹果酸对植物乳杆菌R23产酶具有促进作用，L-苹果酸浓度较为理想的添加量为4.0g/L。

苹果酸与MLE的结合须有NAD⁺的参与，因此NAD⁺的添加量对MLE的活力具有重要的影响。图7的结果表明，NAD⁺对植物乳杆菌R23的酶活力具有促进作用，其适宜的添加量为100mg/L。

4.供氧条件对MLE产量及酶活力的影响

以LH18培养基为培养液，加入4g/L的L-苹果酸和100mg/L的NAD⁺，分别接入10⁷cfu/mL活化好的植物乳杆菌R23，分成两组，一组配上发酵栓，以CO₂排空氧气，另一组直接加硅胶塞，两组均放置在35℃恒温培养。

在有氧条件下培养，植物乳杆菌R23的产酶量为0.74mg/mL，活力为398.13u，而在厌氧条件下，植物乳杆菌R23产酶量为0.91mg/mL，活力为422.56u，其总活力从295.41U上升到362.97U，差异达到极显著水平(P＜0.01，如图8所示)。试验结果表明厌氧条件能促进植物乳杆菌R23产酶，并提高其酶活力。

5.产MLE条件优化

在前期单因素试验的基础上，以MLE产量、酶活力为指标，以发酵温度、起始pH值、起始L-苹果酸浓度为自变量，做响应面分析试验。结果表明，对植物乳杆菌R23产MLE的总活力的影响次序是：起始L-苹果酸浓度＞发酵温度＞起始pH值。

所述植物乳杆菌菌体产苹果酸乳酸酶的适宜培养条件为：发酵温度30±5℃，pH值6.5±0.5，L-苹果酸浓度4.5±0.5g/L。

所述植物乳杆菌R23产苹果酸酸乳酸酶的最佳培养条件为：发酵温度33.5℃，pH值6.2，L-苹果酸浓度4.0g/L。在此条件下植物乳杆菌R23厌氧发酵28h的产酶量为1.34mg/mL，酶活力为462.33u，总活力为619.52U。

实施例3：植物乳杆菌R23在“中华”猕猴桃酒的酿造中的应用

将植物乳杆菌R23以5.8×10⁸cfu/mL接种量接入酒精度10％(v/v)、总酸14.9g·L^-1、总硫浓度为100mg·L^-1的猕猴桃酒醪中，22±1℃恒温培养，以纸层析监控MLF的进行，培养4天后的纸层析中苹果酸消失，表示MLF发酵结束，即可停止植物乳杆菌R23培养。

“中华”猕猴桃酒主要感官指标的变化见表3，使用R23进行了MLF反应的猕猴桃酒的总酸、pH值、挥发酯和柔和指数都发生了较大的变化。使用植物乳杆菌R23的猕猴桃酒的苹果酸大量减少且总酸下降，明显达到了生物降酸的目的；适当含量的挥发酯有利于猕猴桃酒醇厚风味和酒香复杂性的形成，使用植物乳杆菌R23经过MLF作用后的酒样挥发酯总量略有增加，表明植物乳杆菌R23可以增加猕猴桃酒的香气与风味；植物乳杆菌R23还可以提高猕猴桃酒的柔和指数，改良果酒品质从而使猕猴桃酒口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁。

表3.“中华”猕猴桃酒主要感官指标的变化

实施例4：植物乳杆菌R23在“溪塔”刺葡萄酒的酿造中的应用

将植物乳杆菌R23以5.8×10⁸cfu/mL接种量接入酒精度11.8％(v/v)、总酸8.9g·L^-1、总硫浓度为110mg·L^-1的“溪塔”刺葡萄酒醪中，20±1℃恒温培养，以纸层析监控MLF的进行，纸层析中苹果酸消失表示MLF发酵结束，即可停止植物乳杆菌R23培养。

“溪塔”刺葡萄酒主要感官指标的变化见表4，使用R23进行了MLF反应的刺葡萄酒的总酸、pH值、挥发酯和柔和指数都发生了较大的变化。使用植物乳杆菌R23的刺葡萄酒的苹果酸大量减少且总酸下降，明显达到了生物降酸的目的；适当含量的挥发酯有利于刺葡萄酒醇厚风味和酒香复杂性的形成，使用植物乳杆菌R23经过MLF作用后的酒样挥发酯总量略有增加，表明植物乳杆菌R23可以增加刺葡萄酒的香气与风味；植物乳杆菌R23还可以提高刺葡萄酒的柔和指数，改良果酒品质从而使刺葡萄酒口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁。

表4“溪塔”刺葡萄酒主要指标的变化

实施例5：植物乳杆菌R23在生产发酵型无菌枇杷汁饮料中的应用

将植物乳杆菌R23的扩培菌液以8.6×10⁷cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95～100℃处理2min的枇杷果汁，人工调节发酵温度30℃±2℃、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的枇杷果汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20％的浑浊型乳酸发酵饮料，再灌装杀菌即可。

枇杷汁发酵过程中主要指标的变化如表5。经过48小时发酵，苹果酸几乎消失，乳酸大量生成；R23在发酵过程中优先以苹果酸为主要碳源进行MLF产生乳酸，总酸下降；MLF结束后以糖代谢为主，进行异型乳酸发酵，产物部分为乳酸，总酸随之增加。发酵48h，芳香族酪氨酸和脯氨酸突然增加，甚至超过了未发酵果汁，由风味评价分数来看，此时正是发酵果汁最佳风味形成期。

表5枇杷汁发酵过程中主要指标的变化

注：一级为有枇杷果香，发酵香浓郁，滋味好，90-100分；二级为有枇杷果香，发酵香较浓郁，滋味好，80-89分；三级为有枇杷果香，发酵香一般，滋味较好，70-79分；四级为枇杷果香淡，发酵香不明显，60-69分；五级为香气及滋味均不愉快，分值小于60分。请12个经培训过的专业人士进行独立打分，取平均值统计分析。下同。

实施例6：植物乳杆菌R23在生产发酵型无菌“桂葡1号”葡萄汁饮料中的应用

将植物乳杆菌R23的扩培菌液以2.1×10⁸cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95～100℃处理2min的葡萄汁，人工调节发酵温度30℃±2℃、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的葡萄汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20％的浑浊型乳酸发酵饮料，再灌装杀菌即可。

“桂葡1号”葡萄汁发酵过程中主要指标的变化如表6。经过48小时发酵，苹果酸几乎消失，乳酸大量生成；R23在发酵过程中优先以苹果酸为主要碳源进行MLF产生乳酸，总酸下降；MLF结束后以糖代谢为主，进行异型乳酸发酵，产物部分为乳酸，总酸随之增加。发酵48h，芳香族酪氨酸和脯氨酸突然增加，甚至超过了未发酵果汁，由风味评价分数来看，此时正是发酵果汁最佳风味形成期。

表6“桂葡1号”葡萄汁发酵过程中主要指标的变化

实施例7：植物乳杆菌R23在生产发酵型无菌“中华”猕猴桃汁饮料中的应用

将植物乳杆菌R23的扩培菌液以1.7×10⁸cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95～100℃处理2min的“中华”猕猴桃汁，人工调节发酵温度30℃±2℃、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的猕猴桃汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20％的浑浊型乳酸发酵饮料，再灌装杀菌即可。

“中华”猕猴桃汁发酵过程中主要指标的变化如表7。经过48小时发酵，苹果酸几乎消失，乳酸大量生成；R23在发酵过程中优先以苹果酸为主要碳源进行MLF产生乳酸，总酸下降；MLF结束后以糖代谢为主，进行异型乳酸发酵，产物部分为乳酸，总酸随之增加。发酵48h，芳香族酪氨酸和脯氨酸突然增加，甚至超过了未发酵果汁，由风味评价分数来看，此时正是发酵果汁最佳风味形成期。

表7“中华”猕猴桃汁发酵过程中主要指标的变化

实施例8：植物乳杆菌R23在生产发酵型活菌枇杷汁饮料中的应用

将植物乳杆菌R23的扩培菌液以8.6×10⁷cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95～100℃处理2min的枇杷果汁，人工调节发酵温度30℃±2℃、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的枇杷果汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20％的浑浊型乳酸发酵饮料，再灌装即可。

枇杷汁发酵过程中主要指标的变化如表8。经过48小时发酵，苹果酸几乎消失，乳酸大量生成；R23在发酵过程中优先以苹果酸为主要碳源进行MLF产生乳酸，总酸下降；MLF结束后以糖代谢为主，进行异型乳酸发酵，产物部分为乳酸，总酸随之增加；经48h发酵芳香族酪氨酸和脯氨酸突然增加，甚至超过了未发酵果汁，由风味评价分数来看，此时正是发酵果汁最佳风味形成期；菌量由初始的8.6×10⁷cfu/ml增加到1.9210⁹cfu/ml，R23作为益生菌中的一种，可在人体肠道内定植，成为人体消化道微生态环境改良剂。

表8枇杷汁发酵过程中主要指标的变化

实施例9：植物乳杆菌R23在生产发酵型活菌“桂葡1号”葡萄汁饮料中的应用

将植物乳杆菌R23的扩培菌液以2.1×10⁸cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95～100℃处理2min的葡萄汁，人工调节发酵温度30℃±2℃、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的葡萄汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20％的浑浊型乳酸发酵饮料，再灌装即可。

“桂葡1号”葡萄汁发酵过程中主要指标的变化如表9。经过48小时发酵，苹果酸几乎消失，乳酸大量生成；R23在发酵过程中优先以苹果酸为主要碳源进行MLF产生乳酸，总酸下降；MLF结束后以糖代谢为主，进行异型乳酸发酵，产物部分为乳酸，总酸随之增加。发酵48h，芳香族酪氨酸和脯氨酸突然增加，甚至超过了未发酵果汁，由风味评价分数来看，此时正是发酵果汁最佳风味形成期。菌量由初始的2.10×10⁸cfu/ml增加到5.56×10⁹cfu/ml，R23作为益生菌中的一种，可在人体肠道内定植，成为人体消化道微生态环境改良剂。

表9“桂葡1号”葡萄汁发酵过程中主要指标的变化

实施例10：植物乳杆菌R23在生产发酵型活菌“中华”猕猴桃汁饮料中的应用

将植物乳杆菌R23的扩培菌液以1.7×10⁸cfu/ml接种量，接入到无菌发酵罐内，该罐内装有经95～100℃处理2min的“中华”猕猴桃汁，人工调节发酵温度30℃±2℃、好氧发酵48小时后得到适度乳酸发酵的猕猴桃汁乳酸发酵液，过滤后进行饮料调配，制成含量在20％的浑浊型乳酸发酵饮料，再灌装即可。

“中华”猕猴桃汁发酵过程中主要指标的变化如表10。经过48小时发酵，苹果酸几乎消失，乳酸大量生成；R23在发酵过程中优先以苹果酸为主要碳源进行MLF产生乳酸，总酸下降；MLF结束后以糖代谢为主，进行异型乳酸发酵，产物部分为乳酸，总酸随之增加。发酵48h，芳香族酪氨酸和脯氨酸突然增加，甚至超过了未发酵果汁，由风味评价分数来看，此时正是发酵果汁最佳风味形成期。R23菌量由初始的1.92×10⁷cfu/ml增加到1.15×10⁹cfu/ml，R23作为益生菌中的一种，可在人体肠道内定植，成为人体消化道微生态环境改良剂。

表10“中华”猕猴桃汁发酵过程中主要指标的变化

实施例11：植物乳杆菌R23在直投式发酵剂制备中的应用

植物乳杆菌R23直投式发酵剂含有植物乳杆菌，活菌数在10¹¹cfu/ml以上。该菌剂可直接加入到果酒中进行发酵，因此省略了传统继代式发酵剂使用过程中的菌种活化、母发酵剂、中间发酵剂、生产发酵剂的扩大繁殖过程，减少了菌种车间的投资和空间，防止了菌种的退化和污染，可使果酒工业的劳动生产率和产品质量大大提高。接种量较传统继代式降低100-1000倍。

以上实验所涉及到的实验方法如下：

1.培养基

1)LH18培养基：番茄汁100mL，酵母膏7.4g，牛肉膏10g，葡萄糖30g，硫酸镁0.36g，苹果酸钠20g，吐温1g，胰蛋白胨15g，柠檬酸铵2g，MnSO₄ 0.05g，加水补足1L。

2)细菌培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水补足1L，pH7.0±0.2，121℃下灭菌20min。用于指示菌(大肠杆菌)液体培养。

3)TJA培养基：番茄汁50mL，酵母抽提液5g，牛肉膏10，乳糖20g，葡萄糖2g，磷酸氢二钾2g，吐温80.1g，乙酸钠5g，加蒸馏水至1L，pH6.8±0.2，121℃下灭菌20min。用于细胞活菌计数。

2.种子液制备

将植物乳杆菌R23菌株接入LH18培养基，25℃控温培养24h，菌体生物量达10⁸CFU/mL以上，将发酵液在3000r/min、4℃离心10min收集菌泥，备用。大肠杆菌(指示菌)在细菌培养基中25℃控温培养24h，菌体生物量达10⁷CFU/mL以上，将培养液3000r/min、4℃离心10min收集菌泥，备用。

3.体外黏附能力试验

1)菌体处理

将收集的植物乳杆菌R23和大肠杆菌分别用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.0)洗涤2次，并制成在波长600nm处的吸光度值为0.4±0.1的悬浮菌液。

2)自凝集能力

吸取各乳酸菌悬液4mL加入试管中，于25℃静置培养24h，测定各菌悬液在波长600nm处的吸光值。自凝集率公式：A％＝(A₀-A₂₄)/A₀×100。式中A₀和A₂₄分别为菌悬液在0h和24h的吸光值。

3)交互凝集能力

吸取各乳酸菌菌悬液2mL和大肠杆菌菌悬液2mL混合，振荡30s，于25℃静置培养24h，测定混合菌悬液在波长600nm处的吸光值。交互凝集率公式：A％＝(1-A₂₄/A₀)×100。公式中A₀和A₂₄分别为混合菌悬液0h及静置24h后的吸光值。

4)表面疏水性

采用BATH法，即菌体对碳氢化合物的黏附测定。将各乳酸菌菌泥分别用PBS制成在560nm处的吸光值为0.6±0.1的悬浮菌液，吸取5mL与1mL二甲苯涡旋混合30s，25℃下静置20min，取下层水相在波长560nm处测量吸光度值，以PBS为参比液。表面疏水率：H％＝(A₀-A_t)/A₀。式中A₀和A_t分别是与二甲苯混匀前、后的菌液在560nm处的吸光值。

4.无细胞发酵液的抗氧化能力测定

1)发酵液制备

将乳酸菌以10⁷CFU/mL的接种量接入LH18培养基中，将25℃控温发酵24h的发酵液在4800r/min、4℃离心10min，收集上清液即为无细胞发酵液。

2)超氧阴离子自由基清除率的检测

采用邻苯三酚自氧化法测定发酵液对超氧自由基的清除率。按照表5中配制溶液A₀₀、空白溶液A₀、样品空白溶液A₀’和样品测定溶液Ax，于25℃水浴中保持5min，而后迅速加入1mL 8mol/L HCl中止反应，测定吸光值。超氧阴离子自由基清除率(％)＝[A₀-(A_x-A₀’)]/A₀×100％。

表11超氧阴离子自由基清除率(O₂·)加样表(mL)

3)羟基自由基清除率

采用Fenton反应法测定发酵液对羟基自由基的清除率。按照表6配制溶液A₀₀、空白溶液A₀、样品空白溶液A₀’和样品测定溶液Ax，于37℃水浴中保持1h，测定吸光度。羟基自由基清除率(％)＝[A₀-(A_x-A₀’)]/A₀×100％。

表12羟基自由基(·OH)的清除率分析加样表(mL)

4)抗氧化能力的阳性对照标准曲线

以不同质量浓度(0-0.30mg/mL)的V_C作为阳性对照，测定其对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率。Vc添加量对超氧阴离子自由基及羟基自由基清除率符合方程y＝2.8315x+0.1112(R²＝0.9921)和y＝0.6677x-0.0086(R²＝0.9933)，两曲线均为线性相关(见图9)。

5)统计分析

采用DPS软件进行显著性分析，所有数据均以

表示，结果以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

5.MLE酶液的提取与提纯

将发酵液在9000r/min条件下4℃离心20min收集菌体，用细胞缓冲液洗涤2次，重新等体积悬浮。将悬浮液于冰浴条件下以150W超声波破碎15min，在9000r/min条件下4℃离心20min，上清液即为粗酶液。粗酶液经过不同浓度的硫酸铵三级沉淀进行初步提纯，硫酸铵最终饱和度为75％。

6.MLE酶活力的测定

取2mL初步提纯的酶液加入3mL酶活力测定液中，在25℃下反应20min，使用L-乳酸试剂盒测定L-乳酸的生成量。酶活力的定义为：在反应体系中，每mg蛋白质每分钟生成的1μmolL-乳酸的量为1个酶活力单位(u)，表示为μmol/mg.min。

7.酶蛋白质的测定：Lowry法，单位mg/mL。

8.酶总活力(U)：酶活力(μmol/mg.min)×酶蛋白质的量(mg/mL)，单位为μmol/mL.min。

9.乳酸菌细菌总数：采用GB/T4789.35，平板菌落计数法。

10.总酸：指示计法(GB/T15038-2006)，以苹果酸计。

11.总硫、游离硫：直接碘量法(GB/T15038-2006)。

12.酒精度：酒精计法(GB/T15038-2006)。

13.挥发酯：GB/T17946-2008。

14.柔和指数＝酒精度-(总酸+单宁)，总酸以每升枇杷酒中相当于硫酸的克数来表示，单宁以g/L计。

注：柔和指数＜5，表示酒体比较单薄、粗重；5≤柔和指数＜6，表示酒体较柔和；6≤柔和指数＜7表示酒体丰满、醇厚。

15.苹果酸-乳酸发酵(MLF)：采用纸层析法定性分析。

16.有机酸组分及含量：采用LPLC法。

17.存活率的计算：细胞存活率＝(冻干后1g样品中测得的活菌数×菌粉重量)/(冻干前1mL样品中测得的活菌数×混悬液体积)×100％。

Claims (8)

1.一株植物乳杆菌R23(Lactoabcillus plantarum R23)，其特征在于：所述植物乳杆菌于2011年8月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC No.5105。

2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌R23，其特征在于：所述植物乳杆菌具有以下益生特性：①较强的抗逆性：能耐受pH值大于等于2.5的酸度，能耐受高达0.5％的胆盐浓度；②较强的抗氧化能力：所述植物乳杆菌培养24h后的胞外代谢产物，对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别达77.8％和80.94％；③较强的粘附能力：表面疏水性达17.71％。

3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌R23，其特征在于：所述植物乳杆菌具有以下发酵特性：抗逆能力强，即所述植物乳杆菌能在具有如下一个以上条件的酒体内正常生长：

SO₂含量                 120±10mg/L；

酒精度(v/v)             13±2％；

pH值                    3.3±0.2；

总酸(以苹果酸计)        1.0±0.2％；

培养温度                18±2℃。

4.根据权利要求1所述的植物乳杆菌R23，其特征在于：所述植物乳杆菌在枇杷果酒的菌量总体呈下降趋势，厌氧条件能明显提高菌体细胞在枇杷果酒中的存活率和降酸效果。

5.如权利要求1-4中任一项所述的植物乳杆菌R23在果酒酿造中的应用，其特性在于：所述植物乳杆菌在含有苹果酸的果酒中能够优先利用苹果酸，经苹果酸乳酸发酵，实现生物降酸。

6.如权利要求1-4中任一项所述的植物乳杆菌R23在生产发酵型无菌果汁饮料中的应用，其特性在于：所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型无菌果汁饮料，所生产的发酵型无菌果汁饮料含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

7.如权利要求1-4中任一项所述的植物乳杆菌R23在生产发酵型乳酸菌活菌饮料中的应用，其特性在于：所述植物乳杆菌能用于果汁饮料加工中生产发酵型乳酸菌活菌饮料，所生产的发酵型乳酸菌活菌饮料含有活性植物乳杆菌，并含有所述植物乳杆菌的益生型代谢产物、细胞碎片或分泌物中的至少一种。

8.一种含有权利要求1-4中任一项所述的植物乳杆菌R23的菌剂，其特征在于：所述菌剂为直投式发酵剂，其中含有植物乳杆菌，活菌数在10¹¹cfu/ml以上。

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