CN108165512B - 一种产胞外多糖空间植物乳杆菌ss18-119及其在提高生物抗氧化活性中的应用 - Google Patents

一种产胞外多糖空间植物乳杆菌ss18-119及其在提高生物抗氧化活性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产胞外多糖空间植物乳杆菌SS18‑119及其在提高生物抗氧化活性中的应用。本发明公开的空间植物乳杆菌SS18‑119在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15150。本发明对空间植物乳杆菌SS18‑119高产胞外多糖的发酵条件进行优化，从发酵液中提取的胞外多糖具有对DPPH清除能力、对超氧阴离子自由基(O2 ‑·)清除能力、对Fe2+螯合能力和对提供氢原子物质阻断过氧化物形成的总还原能力或总抗氧化能力；此外，该菌株还具有胃肠道逆环境耐受特性，为胞外多糖在提高生物抗氧化活性中的应用提供实践依据。本发明填补了空间食品微生物工程菌的研究空白。

Description

一种产胞外多糖空间植物乳杆菌SS18-119及其在提高生物抗 氧化活性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种产胞外多糖空间植物乳杆菌SS18-119及其在提高生物抗氧化活性中的应用。
背景技术
乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是乳酸菌在亚优化生长条件下，为抵抗不良环境因素分泌于细胞表面的黏液多糖或荚膜多糖，是其重要的次级代谢产物，分子量在4.0×104～6.0×106Da之间。在自然环境中，EPS通常具有保护微生物细胞的作用，如避免细胞干燥脱水、免受巨噬细胞侵袭或噬菌体感染及抵御抗生素或有毒物质的作用，还可稳定渗透压，参与细胞信息传递和细胞构成等。许多研究表明，EPS 具有免疫调节作用、抗脂质过氧化活性、抗肿瘤作用或诱导癌细胞凋亡、促进肠道菌群平衡、降低血清胆固醇和甘油三酯水平，以及抑制脂肪肝形成等多种生理功能。此外，EPS常被作为稳定剂、增稠剂、凝胶剂和乳化剂等而应用于食品添加剂中。
空间微生物由于受到太空微重力效应、高真空、极端温差、弱磁场和高能粒子(电子、质子、重离子)辐射等诱变作用，可显著提高突变频率而发生基因突变，将导致其生物学性状(如个体形态、菌落特征、生理生化特性、免疫原性等)、发酵生产性能(如生物量、产物量、酶活力、效价、发酵速度等)发生改变。利用天宫2号和神舟11号宇宙飞船搭载返回地面经太空诱变后的植物乳杆菌，以地面原始的植物乳杆菌作对照，选育出发生正向突变的高产EPS的菌株，再利用遗传稳定且产EPS较高的空间植物乳杆菌，研究提高多糖产量的环境因素，优化其所产EPS的发酵合成条件，并检测在优化发酵条件下所产EPS的抗氧化活性，为EPS在提高生物抗氧化活性中的应用提供实践依据。目前国内外学者对空间微生物的研究主要集中在空间病原菌、空间腐蚀菌和微生物制药方面，而空间食品微生物工程菌的研究处于空白状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种产胞外多糖空间植物乳杆菌SS18-119及其在提高生物抗氧化活性中的应用。
本发明提供的空间植物乳杆菌SS18-119为植物乳杆菌(Lactobacillus
plantarum)Fullarton-H-SS18-119，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15150。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分为所述植物乳杆菌
(Lactobacillus plantarum)Fullarton-H-SS18-119。
所述菌剂的用途可为制备胞外多糖。
所述菌剂可为将所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
Fullarton-H-SS18-119在MRS培养基中进行培养得到的培养物。
所述MRS培养基由溶质和溶剂组成，所述溶剂为蒸馏水，所述溶质及其浓度分别为：酪蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸二铵2g/L、吐温-80 1mL/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L。所述MRS培养基的pH可根据具体情况利用酸性物质或碱性物质进行调节，在调节pH 时。
上述菌剂中，所述菌剂还可以包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为糖醇类、蛋白类或维生素类物质；所述糖醇类载体可为海澡糖、乳糖、蔗糖、麦芽糊精、麦芽糖、蔗糖、果糖、甘露醇和山梨醇中的至少一种；所述蛋白类载体为脱脂乳粉、乳清粉、酵母粉和酪蛋白的至少一种；所述维生素类载体可为维生素C和/或维生素E。所述液体载体可为甘油、植物油或水。所述菌剂中，所述活性成分可以以培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
本发明还提供了胞外多糖的制备方法，所述方法包括：利用所述植物乳杆菌
(Lactobacillus plantarum)Fullarton-H-SS18-119制备得到胞外多糖。
所述方法可包括培养所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
Fullarton-H-SS18-119，得到发酵液；从所述发酵液中提取得到胞外多糖。
上述方法中，所述培养所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
Fullarton-H-SS18-119可向发酵培养基中添加所述菌剂后进行所述培养。
在所述菌剂中所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
Fullarton-H-SS18-119的活菌数量为4.8×109CFU/mL时，所述菌剂的接种量可为a11)或a22)或a33)：
a11)1.0％～5.0％(体积百分数)，即所述发酵的体系中所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Fullarton-H-SS18-119的活菌数为(0.5～2.4) ×108CFU/mL；
a22)2.0％～4.0％(体积百分数)，即所述发酵的体系中所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Fullarton-H-SS18-119的活菌数为(1.0～1.9) ×108CFU/mL；
a33)3.0％(体积百分数)，即所述发酵的体系中所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Fullarton-H-SS18-119的活菌数为1.4×108CFU/mL。
上述方法中，所述培养的体系中所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Fullarton-H-SS18-119的含量可为a1)或a2)或a3)：
a1)(0.5～2.4)×108CFU/mL；
a2)(1.0～1.9)×108CFU/mL；
a3)1.4×108CFU/mL。
所述培养的温度可为b1)或b2)或b3)：
b1)31℃～43℃；
b2)34℃～40℃；
b3)34℃或37℃。
所述培养所用所述发酵培养基的起始pH可为c1)或c2)或c3)：
c1)5.5～7.5；
c2)6.0～7.0；
c3)7.0。
所述培养基可为所述MRS培养基。
所述培养的时间可为d1)或d2)：
d1)12小时～20小时；
d2)18小时或20小时。
从所述发酵液中提取得到胞外多糖可包括：将所述发酵液进行离心，使胞外多糖进入上清液中，收集上清液，从所述上清液中得到胞外多糖。
上述从所述上清液中得到胞外多糖还可包括利用三氯乙酸除去所述上清液中的杂质和利用95％冷乙醇沉淀所述上清液中的胞外多糖，得到胞外多糖。
所述方法还可包括在利用三氯乙酸除去所述上清液中的杂质和利用95％冷乙醇沉淀所述上清液中的胞外多糖后进行透析。
本发明还提供了所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
Fullarton-H-SS18-119，或，所述菌剂在制备如下任一产品中的应用：
A1)具有提高生物体或生物细胞的抗脂质过氧化活性功能的产品；
A2)具有稳定生物细胞渗透压功能的产品；
A3)具有提高人和/或动物免疫能力功能的产品；
A4)具有保护生物细胞免受脱水影响的功能产品；
A5)具有抗肿瘤和/或诱导癌细胞凋亡功能的产品；
A6)具有促进人和/或动物肠道菌群平衡功能的产品；
A7)具有降低人和/或动物血清胆固醇和/或甘油三酯水平功能的产品；
A8)具有抑制人和/或动物脂肪肝形成功能的产品；
A9)具有耐受人和/或动物胃肠道逆环境功能的产品；
A10)稳定剂；
A11)增稠剂；
A12)凝胶剂；
A13)乳化剂。
本发明还提供了所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
Fullarton-H-SS18-119，或，所述菌剂，或，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Fullarton-H-SS18-119分泌的胞外多糖的下述任一应用：
B1)提高生物体或生物细胞的抗脂质过氧化活性；
B2)稳定生物细胞渗透压；
B3)提高人和/或动物免疫能力；
B4)保护生物细胞免受脱水的影响；
B5)抗肿瘤和/或诱导癌细胞凋亡；
B6)促进人和/或动物肠道菌群平衡；
B7)降低人和/或动物血清胆固醇和/或甘油三酯水平；
B8)抑制人和/或动物脂肪肝形成；
B9)耐受人和/或动物胃肠道逆环境；
B10)作为稳定剂；
B11)作为增稠剂；
B12)作为凝胶剂；
B13)作为乳化剂。
本发明还提供了利用所述方法得到的胞外多糖。
本发明还提供了具有如下任一功能的产品，其活性成分为所述植物乳杆菌
(Lactobacillus plantarum)Fullarton-H-SS18-119，或所述菌剂，或所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Fullarton-H-SS18-119分泌的胞外多糖：
B1)提高生物体或生物细胞的抗脂质过氧化活性；
B2)稳定生物细胞渗透压；
B3)提高人和/或动物免疫能力；
B4)保护生物细胞免受脱水的影响；
B5)抗肿瘤和/或诱导癌细胞凋亡；
B6)促进人和/或动物肠道菌群平衡；
B7)降低人和/或动物血清胆固醇和/或甘油三酯水平；
B8)抑制人和/或动物脂肪肝形成；
B9)耐受人和/或动物胃肠道逆环境。
本发明中，所述抗氧化活性可体现在对DPPH清除能力、对超氧阴离子自由基(O2 -·) 清除能力、对Fe2+螯合能力和/或对提供氢原子物质阻断过氧化物形成的总还原能力或总抗氧化能力。
本发明中，所述生物可为人和动物，所述生物细胞可为人和动物细胞。
本发明利用天宫2号和神舟11号宇宙飞船搭载返回地面经太空诱变后的植物乳杆菌，以地面原始的植物乳杆菌作对照，选育出发生正向突变的高产EPS的空间植物乳杆菌SS18-119菌株，该菌株遗传稳定且产EPS量高，且其所产EPS具有高抗氧化活性：空间植物乳杆菌SS18-119所产EPS在浓度为2mg/mL时，对DPPH清除率为85.60％；在浓度为10mg/mL时，对超氧阴离子自由基(O2 -·)清除率为79.00％；在浓度为10mg/mL 时，Fe2+螯合能力为36.30％；在浓度为4mg/mL时，总还原力吸光度值(A700nm)为0.5603。另外，该菌株还具有胃肠道逆环境耐受特性，为EPS在提高生物抗氧化活性中的应用提供实践依据。本发明填补了空间食品微生物工程菌的研究空白。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
生物材料的菌株编号：Fullarton-H-SS18-119
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2018年01月02日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15150
附图说明
图1为培养基不同pH值对EPS产量的影响。
图2为不同发酵温度对EPS含量的影响。
图3为不同发酵时间对EPS含量的影响。
图4为不同接种量对EPS含量的影响。
图5为SS18-119菌株所产EPS对DPPH的清除率。
图6为SS18-119菌株所产EPS对超氧阴离子自由基的清除率。
图7为SS18-119菌株所产EPS对Fe2+的螯合能力。
图8为SS18-119菌株所产EPS总抗氧化能力测定。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的MRS液体培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度分别为：酪蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖10g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸二铵2g/L、吐温-80 1mL/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L，pH 7.0。MRS固体培养基为向MRS液体培养基中加入琼脂粉1.7g/L得到的培养基。
实施例1、对高产EPS的空间植物乳杆菌菌株的筛选
(一)菌株的分离纯化
1、菌株
空间植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SS18：由地面植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GS18(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC 1.485)经天宫2号和神州11号飞船搭载返回的太空诱变菌种，保藏于富乐顿生物工程科技(北京)有限公司航天微生物菌种库。为了区别航天搭载前后的菌株差异，将地面植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GS18搭载之后的太空诱变菌株记为空间植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SS18。
2、菌株活化
将冻存于-80℃冰柜的地面植物乳杆菌GS18和空间植物乳杆菌SS18甘油保藏管分别按2％～3％接入5mL MRS液体培养基甲中，37℃培养16h，连续三代活化后用于后续试验。
3、菌株的分离纯化
将地面植物乳杆菌GS18经天宫2号和神州11号飞船搭载返回，得到太空诱变菌种SS18，以地面植物乳杆菌GS18的个体形态和菌落特征为对照，在MRS固体培养基甲平板上从太空诱变菌种SS18中分离纯化得到120株菌株，分别标记菌株代号为 SS18-1至SS18-120。
分离纯化方法：取空间SS18菌种活化后的培养液1mL，以9mL无菌生理盐水+0.1％吐温80制备稀释菌液，漩涡充分振荡后，以平板划线法接种于MRS固体培养基甲平板，置于37℃培养后挑取黏性较高，且与地面GS18菌种的菌落特征差异较大的单菌落纯化培养于MRS固体培养基甲斜面试管，并镜检观察个体形态和纯度。将培养物转接连续传代培养，保种备用。
MRS液体培养基甲为将MRS液体培养基的pH由7.0替换为6.5得到的培养基。MRS 固体培养基甲为向MRS液体培养基甲中加入17g/L琼脂粉得到的固体培养基。
(二)空间植物乳杆菌高产胞外多糖菌株的选育
1、空间植物乳杆菌产EPS的发酵试验
将上述分离纯化的120株空间植物乳杆菌斜面培养物分别接种于MRS液体培养基甲中，增菌培养活化3～4代，再以2％接种量转接入10mL MRS液体培养基甲中，37℃培养14h，得到空间植物乳杆菌产EPS的发酵液。
2、空间植物乳杆发酵液中EPS的提取
按照下述方法分别提取上述120株空间植物乳杆菌发酵液中的EPS：将发酵液转入10mL离心管中(离心管均要灭菌后方可使用)，采用冷冻离心机以8000r/min，4℃离心10min，收集上清液；向上清液中加入是上清液1/5体积的pH5.0的10g/100mL 三氯乙酸水溶液于4℃振荡处理30min，得到处理液；将处理液以10000r/min，4℃离心10min，收集上清液；向上清液中加入是上清液3倍体积的95％冷乙醇于4℃处理11～ 12h，离心(10000r/min，4℃离心10min)，收集沉淀的多糖物质；将多糖物质以无菌蒸馏水溶解(加蒸馏水的量为初始发酵液体积的一半)，再以预处理的透析袋(截留分子量8000～14000Da)于4℃透析12h(期间换3次无菌蒸馏水)，透析液即为多糖提取液。
其中，CR3i冷冻离心机的型号为CR3i，美国Thermo公司生产。
3、葡萄糖标准曲线的制作
准确称取标准葡萄糖100mg于500mL容量瓶中，加水至刻度。各种试剂按表1所示的量在比色管中均匀混合操作，静置10min，摇匀，室温放置20min后于490nm测定EPS吸光值(以2.0mL蒸馏水按同样显色操作为空白调0)。以葡萄糖含量(100mg/L) 为横坐标，吸光度(A490nm)为纵坐标绘制标准曲线为y＝0.5985x+0.0223(R2＝0.9991)。
表1苯酚-硫酸法测多糖标准曲线参数表
4、样品EPS含量的测定
采用苯酚-硫酸法测定多糖提取液的含糖浓度方法：取透析后的多糖提取液用蒸馏水将其定容到10mL，取2mL于25mL比色管中，向比色管中加入6％的苯酚2mL，迅速加入浓硫酸10mL，混合后，室温静置20min，以2.0mL蒸馏水按同样显色操作为空白调0，采用紫外分光光度计于490nm处测定EPS吸光度值(A490nm)，将测得样品吸光度y 值代入葡萄糖标准曲线回归方程y＝0.5985x+0.0223(R2＝0.9991)中，即得到多糖含量x值(g/L)，据此筛选EPS产量较高的空间植物乳杆菌菌株。空间植物乳杆菌所产胞外多糖的A490nm检测结果如表2所示。
其中，紫外分光光度计的型号为UV-2600，美国unico公司生产。
表2空间植物乳杆菌胞外多糖的多糖A490nm检测结果
由表2可见，与地面原始的植物乳杆菌GS18所产胞外多糖的A490nm相比较，第一次产糖发酵试验筛选出EPS产量较高的23菌株空间植物乳杆菌，经第二次产糖发酵验证试验筛选出产糖量较高的SS18-4、SS18-15、SS18-23、SS18-24、SS18-30、SS18-33、 SS18-37、SS18-82、SS18-116、SS18-117、SS18-118、SS18-119空间植物乳杆菌，说明该12株空间植物乳杆菌在太空环境条件下相关基因发生了正突变。其中SS18-33 菌株所产胞外多糖的A490nm最高，其次是SS18-119菌株所产胞外多糖的A490nm较高。
(三)空间植物乳杆菌株的遗传稳定性
将上述复验证筛选得到产EPS较高的罗伊氏乳杆菌SS18-4、SS18-15、SS18-23、SS18-24、SS18-30、SS18-33、SS18-37、SS18-82、SS18-116、SS18-117、SS18-118、 SS18-119空间植物乳杆菌，于5mL MRS液体培养基甲连续传代50代(接种量2％～3％， 37℃培养16h)，而后按步骤(二)进行空间植物乳杆菌产EPS的发酵试验，提取发酵液中的EPS，并采用苯酚-硫酸法测定EPS提取液的含糖量(A490nm)，结果如表3所示。将测得样品吸光度y值代入葡萄糖标准曲线回归方程y＝0.5985x+0.0223(R2＝0.9991) 中，即得到多糖产量x值(g/L)，结果如表4所示。
表3 50代传代的空间植物乳杆菌胞外多糖的A490nm结果
表4 50代传代的空间植物乳杆菌胞外多糖的产量结果
由表3和表4可见，经50代传代后，经过三次发酵产EPS验证试验，12株空间植物乳杆的EPS产量虽然均比地面GS18菌株较高，但其中有3株菌(SS18-4、SS18-23、 SS18-117菌株)EPS的A490nm均有不同程度下降，其余9株菌的多糖A490nm数值均明显高于地面GS18菌株，而且EPS的A490nm基本稳定。其中SS18-119菌株产糖量最高，多糖粗品产量为2.0g/L，比地面GS18菌株提高了53.85％；其次是SS18-33菌株，多糖粗品产量为1.9g/L，比地面GS18菌株提高了46.15％。显示该2菌株为发酵产EPS较高且遗传稳定较好的菌株。
结论：空间植物乳杆菌SS18-119为遗传稳定性最好，且发酵产胞外多糖最高的菌株，可成为开发具有抗氧化活性的益生菌类食品最有潜力菌株。
(四)空间罗伊氏乳杆菌的形态学鉴定与分子学鉴定
将SS18-119菌株进行革兰氏染色，结果显示SS18-119菌株为革兰氏阳性菌。形态学观察，SS18-119菌株的菌体呈短杆状或球杆状，单个或短链状排列；在MRS固体培养基平板上的菌落大小为1～2mm，灰白色、半透明、扁平、表面光滑湿润、边缘不整齐。
检测SS18-119菌株的16S rDNA，测序结果如序列表的序列1所示。16s rDNA鉴定结果显示SS18-119菌株与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的相似性达到 100％。经过形态学及16S rDNA鉴定，可以确定SS18-119菌株属于植物乳杆菌。
(五)空间植物乳杆菌SS18-119的保藏
将SS18-119菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Fullarton-H-SS18-119，于2018年01月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC NO.15150。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Fullarton-H-SS18-119简称为空间植物乳杆菌SS18-119。
实施例2空间植物乳杆菌SS18-119高产EPS发酵条件的优化
(一)空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂的制备
将空间植物乳杆菌SS18-119在MRS液体培养基甲中进行活化，得到活化后的MRS试管培养物，将活化后的MRS试管培养物以3％(体积百分数)接种量移入盛有100mL 灭菌MRS液体培养基甲的三角瓶中，37℃培养16h后，得到空间植物乳杆菌SS18-119 发酵剂。检测发酵剂中空间植物乳杆菌SS18-119的活菌数量为4.8×109CFU/mL。
空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂的检测方法：取1mL发酵剂放入含有99mL灭菌生理盐水中，采用拍击式匀质器以8 000～10 000r/min的速度处理2min，充分振荡后，制成10-2的均匀稀释液。再以9mL灭菌生理盐水做10倍递增稀释至10-8，取10-6～ 10-8的稀释液各1mL置于无菌平皿中，倒入溶化并冷却至46℃的MRS固体培养基甲约 15mL，迅速轻轻旋动平皿，使培养基与菌液充分混匀，每个稀释度3次重复。同时将 MRS固体培养基甲注入加有1mL无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。待培养基凝固后，翻转平板，置(36±1)℃温箱中培养(48±2)h，待菌落长出后即可计数。
(二)单因素多水平试验优化空间植物乳杆菌SS18-119菌株高产EPS发酵条件
1、发酵培养基起始pH的确定
在空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂接种量为2％(体积百分数)、发酵温度为37℃，发酵时间为14h的前提条件下，设计MRS液体培养基的起始pH为5.5、6.0、6.5、7.0、 7.5，分别进行SS18-119菌株产EPS的发酵试验，提取发酵液中的EPS，并采用苯酚- 硫酸法测定EPS提取液的含糖量[A490nm换算成多糖含量x(g/L)]，方法同实施例1步骤(二)，结果如图1所示。
培养基的起始pH对菌体的生长繁殖及EPS的产量有较大影响。当培养基的pH过低时(pH5.5～6.5)，一方面乳酸菌在生长繁殖过程中产生的酶类会降解已经合成的 EPS，另一方面会减少脂质载体中间体而减缓EPS的合成；当pH过高时(pH7.5)，不仅会影响菌体生长繁殖，而且降低EPS的积累。研究表明，培养基pH在接近中性或弱酸性时，有利于合成EPS，培养基的pH通过影响各种酶的活性，从而影响菌体的新陈代谢。由图1可知，培养基的pH为7.0时，EPS产量最高，这是由于此时参与合成EPS 的异戊二烯脂质载体活力最强，故确定SS18-119菌株高产EPS的发酵培养基的起始 pH为7.0。
2、发酵温度的确定
在上述确定发酵培养基的起始pH为7.0的试验结果基础上，于空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂接种量为2％，发酵时间为14h的前提条件下，设计发酵温度为31、 34、37、40、43℃，分别进行SS18-119菌株产EPS的发酵试验，提取发酵液中的EPS，并采用苯酚-硫酸法测定EPS提取液的含糖量[A490nm换算成多糖含量x(g/L)]，方法同实施例1步骤(二)，结果如图2所示。
发酵温度是影响菌体生长繁殖与EPS合成的重要因素。当发酵温度较低时(31℃～34℃)，菌体生长速度减缓，细胞壁合成速度亦减缓，从而使更多的异戊二烯脂质载体中间体用于合成EPS；当发酵温度较高时，菌体生长速度较快，发酵后期更易衰老自溶，同时温度较高还会使载体失活，降低EPS的产量。由图2可知，发酵温度为34℃时，EPS产量最高，故确定SS18-119菌株高产EPS的发酵温度为34℃。
3、发酵时间的确定
在上述确定发酵培养基的起始pH为7.0、发酵温度为34℃的试验结果基础上，于空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂接种量为2％的前提条件下，设计发酵时间为12h、14h、 16h、18h、20h，分别进行SS18-119菌株产EPS的发酵试验，提取发酵液中的EPS，并采用苯酚-硫酸法测定EPS提取液的含糖量[A490nm换算成多糖含量x(g/L)]，方法同实施例1步骤(二)，结果如图3所示。
发酵时间对EPS的产量影响亦较大。乳酸菌合成EPS主要在对数生长期的末期和稳定期产生，因而适当延长发酵时间有利于增加EPS产量。当发酵时间过短时，菌体可以充分利用营养物质生长繁殖，但不利于EPS的合成；当发酵时间过长时，菌体会产生降解多糖的酶类，同时菌体衰老自溶。由图3可知，发酵时间为18h时，EPS产量最高，故确定SS18-119菌株高产EPS的发酵时间为18h。
4、接种量的确定
在上述确定发酵培养基的起始pH为7.0、发酵温度为34℃、发酵时间为18h的试验结果基础上，设计空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂接种量为1％、2％、3％、4％、5％，分别进行SS18-119菌株产EPS的发酵试验，提取发酵液中的EPS，并采用苯酚-硫酸法测定EPS提取液的含糖量[A490nm换算成多糖含量x(g/L)]，方法同实施例1步骤(二)，结果如图4所示。
接种量的多少决定了菌体在培养基中的生长速度和菌体浓度。适宜的接种量有利于菌体在保证自身生长的同时增加EPS的产量。当接种量较少时，菌体浓度低，大量营养物质被用于菌体生长繁殖，不利于EPS的合成；当接种量较高时，菌体快速利用营养物质大量繁殖，发酵后期会因营养物质不足导致菌体消亡，而减少EPS的产量。由图4可知，接种量为3％时，EPS产量最高，故确定SS18-119菌株高产EPS的接种量为3％。
综上所述，通过单因素多水平试验，确定空间罗伊氏乳杆菌SS18-119高产EPS 的发酵条件为：发酵培养基起始pH为7.0、发酵温度为34℃，发酵时间为18h、空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂接种量为3％(体积百分数，发酵剂中空间植物乳杆菌 SS18-119的活菌数量为4.8×109CFU/mL，即发酵体系中空间植物乳杆菌SS18-119的活菌数为1.4×108CFU/mL)。
(三)正交试验优化空间植物乳杆菌SS18-119菌株高产EPS发酵条件
在根据单因素多水平试验确定菌株SS18-119高产EPS发酵条件结果基础上，设计培养基起始pH、发酵温度、发酵时间、接种量四因素三水平[L9(34)]正交试验(见表5)，按照实施例1中步骤(二)的方法分别进行SS18-119菌株产EPS的发酵试验，提取发酵液中的EPS，并采用苯酚-硫酸法测定EPS提取液的含糖量[A490nm换算成多糖含量x(g/L)]，通过对试验结果的极差分析和K值分析确定较优的高产EPS的发酵工艺条件，结果如表6所示。
表5四因素三水平[L9(34)]正交试验表
表6正交试验[L9(34)]优化菌株SS18-119高产EPS发酵条件结果
注：表中数据均为三次试验的测定平均值。
由表6可见，根据正交试验极差分析RB＞RA＞RD＞RC可知，不同发酵条件对菌株SS18-119合成EPS的影响顺序为：发酵温度＞发酵培养基起始pH＞接种量＞发酵时间；根据正交试验K值分析KA2＞KA3＞KA1、KB3＞KB2＞KB1、KC3＞KC2＞KC1、KD2＞ KD3＞KD1可知，菌株SS18-119高产EPS发酵条件的最优组合为A2B3C3D2，即发酵培养基起始pH为7.0、发酵温度为37℃、发酵时间为20h、空间植物乳杆菌SS18-119 发酵剂接种量为3％(体积百分数，发酵剂中空间植物乳杆菌SS18-119的活菌数量为 4.8×109CFU/mL，即发酵体系中空间植物乳杆菌SS18-119的活菌数为1.4×108CFU/mL)。
(四)正交试验的验证试验
在上述正交试验得出的空间植物乳杆菌SS18-119高产EPS发酵条件基础上，将空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂按3％接种量移入500mL MRS液体培养基(培养基起始 pH为7.0)中，于37℃进行产EPS发酵20h，同时以对照条件(培养基起始pH为6.5、发酵温度37℃、发酵时间14h、空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂接种量2％)为对照组，发酵后提取发酵液中的EPS，并采用苯酚-硫酸法测定EPS提取液的含糖量[A490nm换算成多糖含量x(g/L)]，结果如表7所示。
表7发酵条件优化结果与初始发酵条件结果对照
注：表中数据均为三次试验的测定平均值。
由表7可见，在优化发酵条件下菌株SS18-119发酵液中EPS含量为2.42g/L，而对照组发酵液中EPS含量为1.88g/L。因此，在优化发酵条件下，空间植物乳杆菌 SS18-119发酵液中的EPS含量是优化前的1.29倍。
实施例3、空间植物乳杆菌SS18-119产EPS的抗氧化活性检测
(一)SS18-119菌株EPS粗品的制备
在上述正交试验得出的菌株SS18-119高产EPS发酵条件基础上，将空间植物乳杆菌SS18-119发酵剂按3％(体积百分数)接种量接入1000mL MRS液体培养基(培养基起始pH为7.0)中，于37℃进行产EPS发酵20h，得到发酵液；将发酵液用大容量台式冷冻离心机离心，以8000r/min，4℃离心10min，收集上清液；向上清液中加入是上清液1/5体积的pH5.0的10g/100mL三氯乙酸水溶液于4℃振荡处理30min，得到处理液；将处理液以10000r/min，4℃离心10min，收集上清液；向上清液中加入是上清液3倍体积的95％冷乙醇于4℃处理11～12h，离心(10000r/min，4℃离心10min)，收集含有多糖物质的沉淀；将沉淀用无菌蒸馏水溶解，再以预处理的透析袋利用无菌蒸馏水透析过夜(期间换3次无菌蒸馏水)，得到的透析液即为多糖提取液；将50～100mL 多糖提取液注入500mL无菌冻干瓶内，先于-35℃条件下预冻至冻结状态，而后利用真空冷冻干燥机将预冻的EPS提取液于-55℃、真空度0.16～0.18mBar的条件下，冻干 36～72h至完全干燥状态，干燥后的EPS粗品呈白色(或略带浅黄)结晶状态。
其中，大容量台式冷冻离心机的型号为Biofuge stratos，美国热电公司生产；真空冷冻干燥机的型号为6L LABCONCO，美国生产。
(二)检测空间植物乳杆菌SS18-119菌株EPS的抗氧化活性
1、SS18-119菌株EPS对DPPH清除能力的测定
以无水乙醇配制DPPH浓度为0.01mmol/L的DPPH乙醇溶液，分别取2mL不同浓度的EPS溶液(将实施例1得到的EPS粗品以去离子水配制成浓度为0、0.4、0.8、1.2、 1.6、2.0mg/mL的EPS溶液)，向每种浓度的EPS溶液中加入DPPH溶液2mL，混匀后黑暗下反应30min，以无水乙醇作为空白对照调0，测定波长为517nm处的吸光度值 (A517nm)。试验中每个浓度平行做3次，取其平均值，按以下公式计算清除率，结果如图5所示。
式中：Ai为EPS溶液+DPPH乙醇溶液吸光度值；
Aj为EPS溶液+无水乙醇吸光度值；
Ao为DPPH乙醇溶液+蒸馏水吸光度值。
DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基是一种人工合成的，以氮为中心的稳定有机化合物，其乙醇溶液呈深紫色，且在515～520nm范围有最大吸收峰，将自由基清除剂加入其中，DPPH溶液由深紫色变为浅黄色或无色，因此可通过吸光度的变化对自由基清除剂进行定量分析。由图5可知，空间植物乳杆菌SS18-119所产EPS清除 DPPH的能力与多糖浓度成正相关系，当EPS浓度为2mg/mL时，DPPH清除率为85.60％。可见，空间植物乳杆菌SS18-119所产EPS对DPPH自由基的清除能力处于较高水平。
2、空间植物乳杆菌SS18-119的EPS对超氧阴离子自由基(O2 -·)清除能力测定
在试管中分别加入1mL不同浓度的EPS溶液(将实施例1得到的EPS粗品以去离子水配制成浓度为0、2、4、6、8、10mg/mL的溶液)，按照下述方法测定不同EPS浓度下的超氧阴离子自由基(O2 -·)清除能力：向1mL EPS溶液中加入pH8.2，0.05mol/L 的Tris-盐酸缓冲液，于25℃水浴保温10min，然后再向反应体系中加入同样预温热处理的30mmol/L的邻苯三酚水溶液12μL，混匀后精确反应4min，以0.5mL浓盐酸终止反应，以Tris-盐酸缓冲液作为空白对照调0，测定在320nm处的吸光度值(A320nm)，按以下公式计算清除率，结果如图6所示。
式中：Ai为反应体系(Tris-盐酸+邻苯三酚)加入EPS溶液后的吸光度值；
Aj为EPS溶液的吸光度值；
Ao为反应体系(Tris-盐酸+邻苯三酚)的吸光度值。
超氧阴离子自由基(O2 -·)在有机体内是所有活性氧自由基的前体，可转化为其它活性氧自由基并对生物体的机体损伤、衰老与疾病有重大影响。由图6可知，空间植物乳杆菌SS18-119所产EPS清除超氧阴离子自由基的能力随着多糖浓度的升高而增加，当多糖浓度为10mg/mL时，清除率为79.00％。可见，空间植物乳杆菌SS18-119 所产EPS对超氧阴离子自由基具有良好的清除能力。
3、SS18-119菌株EPS对Fe2+螯合能力测定
分别取3mL不同浓度的EPS溶液(将实施例1得到的EPS粗品以去离子水配制成浓度为0、2、4、6、8、10mg/mL的溶液)，按照下述方法测定不同EPS浓度下的Fe2+螯合能力：向3mLEPS溶液中加入0.05mL的2mmol/L氯化亚铁水溶液和0.2mL的 5mmol/L菲啰嗪水溶液，经振荡混匀后室温静置10min。以蒸馏水作为空白对照调0，测定反应结束后的反应体系在562nm处的吸光度值(A562nm)，按以下公式计算空间植物乳杆菌SS18-119所产EPS的Fe2+螯合能力，结果如图7所示。
式中：Ao为对照组的吸光度值(使用蒸馏水替代样品)；
Ai为样品的吸光度值；
Aj为空白组的吸光度值(使用蒸馏水替代氯化亚铁溶液)。
金属离子在机体内能诱导脂质过氧化对机体生物膜和核酸造成损伤，因此螯合Fe2+的能力也是一项重要的抗氧化指标。由图7可知，空间植物乳杆菌SS18-119所产 EPS的Fe2+螯合能力亦与多糖浓度成正相关系，当多糖浓度为10mg/mL时，Fe2+螯合能力为36.30％。由此可见，空间植物乳杆菌SS18-119所产EPS螯合Fe2+能力在浓度较高时有一定抗氧化作用。
4、SS18-119菌株EPS对总还原能力(总抗氧化能力)的测定
分别取1mL不同浓度的EPS溶液(将实施例1得到的EPS粗品以去离子水配制成浓度为0、2、4、6、8、10mg/mL的溶液)，按照下述方法测定不同EPS浓度下的总还原能力：向1mLEPS溶液中加入0.2mol/L pH为6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL和质量分数为1％铁氰化钾溶液2.5mL，混匀后水浴50℃保温20min，经流水冷却后，再加入10 g/100mL三氯乙酸水溶液2.5mL，得到混合液；将混合液以3000r/min离心10min后取上清液2.5mL，向2.5mL上清液中加入2.5mL蒸馏水和2.5mL质量分数为0.1％氯化铁溶液，混匀室温静置10min，以蒸馏水作为无还原能力的样品作为空白对照调0，测定在700nm处吸光度值(A700nm)，结果如图8所示。
总还原能力是测定抗氧化能力的一项重要指标，具有还原力的物质可通过提供氢原子阻断过氧化物形成，从而使自由基链式反应无法进行。由图8可知，空间植物乳杆菌SS18-119所产EPS的总还原能力亦与多糖浓度成正相关系，当多糖浓度为10mg/mL时，总还原能力吸光度值(A700nm)为0.5603。由此可见，波长为700nm吸光度值越高，表明SS18-119菌株总抗氧化能力越好，并且其总抗氧化能力随着多糖浓度的提高而增强。
综上所述，体外抗氧化活性研究表明，空间植物乳杆菌SS18-119所产EPS在浓度为2mg/mL时，对DPPH清除率为85.60％；在浓度为10mg/mL时，对超氧阴离子自由基 (O2 -·)清除率为79.00％；在浓度为10mg/mL时，Fe2+螯合能力为36.30％；在浓度为 4mg/mL时，总还原力吸光度值(A700nm)为0.5603，显示空间植物乳杆菌SS18-119菌株具有较强的抗氧化活性。
实施例4、空间植物乳杆菌SS18-119菌株耐胃肠道逆环境试验
人工模拟胃液：含NaCl 0.2g/100mL、胃蛋白酶(酶活力为250U/mg)0.3g/100mL，用1mol/L HCl调pH至3.0，余量为去离子水，经0.22μm滤膜过滤除菌后备用。
人工模拟肠液：将胰蛋白酶(酶活力为1655U/mg)溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液 (pH8.0)中，使其终浓度为1g/L，加入牛胆盐并使其浓度为0.3g/100mL，经0.22 μm滤膜过滤除菌后备用。
待测菌株：地面植物乳杆菌GS18和空间植物乳杆菌SS18-119。
1、将待测菌株接种于10mL MRS液体培养基(pH为7.0)中，37℃、静置培养18h (菌体浓度为2.0×109CFU/mL～8.0×109CFU/mL)，6000r/min离心10min收集沉淀。
2、采用10mL 0.85％生理盐水洗涤步骤1得到的沉淀，6000r/min离心10min收集沉淀。
3、采用1mL人工模拟胃液重悬步骤2得到的沉淀，37℃、静置培养，分别于0h 和3h进行活菌数计数并统计存活率，结果如表8和表9所示。
4、完成步骤3后，取整个体系，6000r/min离心10min收集沉淀，采用9mL人工模拟肠液重悬沉淀，37℃静置培养，分别于0h和8h进行活菌数计数并统计存活率，结果如表8和表9所示。
活菌数计数和存活率计算方法为：取1mL菌液用9mL无菌生理盐水10倍递增稀释后，取其中2～3个适宜的稀释菌液，以倾注法接种于MRS固体培养基上，37℃培养 48h后对生长的菌落进行计数，并按以下公式计算存活率。
菌株存活率(％)＝[log N1/log N0]×100
式中：N1＝经过模拟胃液或肠液处理后的活菌数(CFU/mL)
N0＝未处理前活菌数(CFU/mL)
表8空间植物乳杆菌SS18-119菌株耐胃肠道逆环境试验活菌数结果
由表8可知，空间植物乳杆菌SS18-119菌株通过人工模拟胃液后的活菌数为 (8.6±0.53)×108CFU/mL，通过人工模拟肠液后的活菌数为(2.5±0.79)×106CFU/mL，空间植物乳杆菌SS18-119菌株通过胃肠模拟液的活菌数大于106CFU/mL，表明空间植物乳杆菌SS18-119菌株能够顺利通过胃肠道而发挥保健功效。
表9空间植物乳杆菌SS18-119菌株耐胃肠道逆环境试验存活率结果
由表9可知，空间植物乳杆菌SS18-119在人工模拟胃液3h后存活率为93.73％，与地面植物乳杆菌GS18相比提高了15.28％，在人工模拟肠液8h后存活率为71.60％。显示空间植物乳杆菌SS18-119菌株耐受胃肠道逆环境能力较强。
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cagtcccaat gtggccgatt accctctcag gtcggctacg tatcattgcc atggtgagcc 1200
gttaccccac catctagcta atacgccgcg ggaccatcca aaagtgatag ccgaagccat 1260
ctttcaaact cggaccatgc ggtccaagtt gttatgcggt attagcatct gtttccaggt 1320
gttatccccc gcttctgggc aggtttccca cgtgttactc accagttcgc cactcactca 1380
aatgtaaatc atgatgcaag caccaatcaa taccagagtt cgtcga 1426

Claims (10)

1.植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Fullarton-H-SS18-119，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15150。
2.一种菌剂，其活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Fullarton-H-SS18-119。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂的用途是制备胞外多糖。
4.胞外多糖的制备方法，包括：利用权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）Fullarton-H-SS18-119制备得到胞外多糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法包括培养权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Fullarton-H-SS18-119，得到发酵液；从所述发酵液中提取得到胞外多糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养的体系中所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Fullarton-H-SS18-119的含量为a1）或a2）或a3）：
a1）（0.5～2.4）×108CFU/mL；
a2）（1.0～1.9）×108CFU/mL；
a3）1.4×108CFU/mL；
和/或，所述培养的温度为b1）或b2）或b3）：
b1）31℃～43℃；
b2）34℃～40℃；
b3）34℃或37℃；
和/或，所述培养所用发酵培养基的起始pH为c1）或c2）或c3）：
c1）5.5～7.5；
c2）6.0～7.0；
c3）7.0；
和/或，所述培养的时间为d1）或d2）：
d1）12小时～20小时；
d2）18小时或20小时。
7.权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Fullarton-H-SS18-119，或，权利要求2或3所述的菌剂在制备如下任一产品中的应用：
A1）具有提高生物体或生物细胞的抗脂质过氧化活性功能的产品；
A2）具有稳定生物细胞渗透压功能的产品；
A3）具有提高人和/或动物免疫能力功能的产品；
A4）具有保护生物细胞免受脱水影响的功能产品；
A5）具有抗肿瘤和/或诱导癌细胞凋亡功能的产品；
A6）具有促进人和/或动物肠道菌群平衡功能的产品；
A7）具有降低人和/或动物血清胆固醇和/或甘油三酯水平功能的产品；
A8）具有抑制人和/或动物脂肪肝形成功能的产品；
A9）具有耐受人和/或动物胃肠道逆环境功能的产品；
A10）稳定剂；
A11）增稠剂；
A12）凝胶剂；
A13）乳化剂。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抗脂质过氧化活性体现在对DPPH清除能力、对超氧阴离子自由基（O2 -·）清除能力、对Fe2+螯合能力和/或对提供氢原子物质阻断过氧化物形成的总还原能力或总抗氧化能力。
9.利用权利要求4-6中任一所述的方法得到的具有如下任一功能的产品，其活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Fullarton-H-SS18-119，或权利要求2或3所述的菌剂，或权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Fullarton-H-SS18-119分泌的胞外多糖：
B1）提高生物体或生物细胞的抗脂质过氧化活性；
B2）稳定生物细胞渗透压；
B3）提高人和/或动物免疫能力；
B4）保护生物细胞免受脱水的影响；
B5）抗肿瘤和/或诱导癌细胞凋亡；
B6）促进人和/或动物肠道菌群平衡；
B7）降低人和/或动物血清胆固醇和/或甘油三酯水平；
B8）抑制人和/或动物脂肪肝形成；
B9）耐受人和/或动物胃肠道逆环境。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于：所述抗脂质过氧化活性体现在对DPPH清除能力、对超氧阴离子自由基（O2 -·）清除能力、对Fe2+螯合能力和/或对提供氢原子物质阻断过氧化物形成的总还原能力或总抗氧化能力。
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