CN116656577B - 一种植物乳杆菌胞外多糖及其在制备免疫佐剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种植物乳杆菌胞外多糖及其在制备免疫佐剂中的应用。该植物乳杆菌LP‑301，于2023年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26759。该植物乳杆菌LP‑301或其发酵物或其胞外多糖可以用于制备疫苗免疫佐剂。本申请发明人从蒙古国传统骆驼酸奶样品中分离纯化得到了植物乳杆菌LP‑301，并且植物乳杆菌胞外多糖具有优异的抗原的摄取和递呈能力，可以用于制备疫苗免疫佐剂或者装载抗原的递送系统，提高疫苗的免疫效果和抗原摄取和递呈效率，并且安全无毒，为新型安全、有效疫苗免疫佐剂的设计提供实验基础与理论指导。

Description

一种植物乳杆菌胞外多糖及其在制备免疫佐剂中的应用
技术领域
本发明涉及一种植物乳杆菌胞外多糖及其在制备免疫佐剂中的应用，属于医药及保健食品技术领域。
背景技术
开发安全有效的疫苗是预防疾病的有效手段，尽管在疫苗开发制备等方面做出了很多努力，但目前部分疫苗的免疫效果并不理想，要克服现有疫苗引起的免疫应答效应单一，免疫原性弱的缺点，需辅以更为有效的免疫佐剂来增强疫苗的免疫应答。理想的免疫佐剂能够在较少用量下刺激机体产生高效免疫应答，且自身无毒副作用，便于生产和使用。现有的免疫佐剂因不易代谢或易引起不良反应等缺点而越来越不满足市场的要求。因此，研发新型安全、有效的疫苗免疫佐剂来激发机体产生高效的天然和获得性免疫应答，提升体液和细胞免疫应答水平，丰富疫苗的免疫应答类型，充分发挥出疫苗的免疫保护作用，是未来新型免疫佐剂研发的重要发展方向。
抗原肽由于其优势特性而被广泛用于开发癌症疫苗，这些特性包括低毒性、低成本和易于合成。 然而，由于缺乏有效的免疫佐剂结合抗原肽激活树突状细胞， 这些多肽疫苗的最终治疗效果往往达不到预期，从而限制了它们在癌症治疗中的应用。目前改善癌症疫苗效果主要是选用佐剂活性更强的递送系统并实现佐剂在肿瘤内递呈抗原。
流感是一种传染性很强的疾病，每年在世界范围内造成高发病率和死亡率。目前，疫苗接种是预防病毒感染的一种有效且成功的方法。人流感疫苗主要包括灭活疫苗和减毒活疫苗，减毒活疫苗存在潜在的安全风险，限制了其应用，灭活疫苗安全性较好，但是疫苗的有效性低于100%。因此，通常需要佐剂作为疫苗成分来提高免疫反应的强度、广度和持久性。尽管一些佐剂（明矾、MF59、CpG1018、AS04、AS03、AS01和Matrix-M）已被纳入人类许可的疫苗中，但已发现这些佐剂的一些局限性，比如强烈的局部刺激或无效的细胞免疫、副作用和对分子机制的未知。因此，迫切需要开发一种新型安全、高效的佐剂来解决现有流感疫苗免疫佐剂的不足。
乳酸菌胞外多糖（Lactic acid bacteria exopolysaccharide，LAB EPS）是乳酸菌生长代谢过程中分泌到胞外的一种聚合物，因其来源广泛，周期短，具有广阔的市场前景和应用价值，近年来逐渐成为新型功能型多糖的开发热点。特殊的聚合物分子结构及较优的理化特性，使其易发生聚集或通过与蛋白、多糖等其他聚合物偶联形成纳米颗粒和纳米纤维被应用为抗原物质的递送载体，保护免疫过程中抗原的稳定性和缓释性。此外，具有类似病原体大小的胞外多糖纳米颗粒，可以模拟病原体的生物物理和生物化学信号，易被抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）等免疫细胞摄取，更好地激活先天和获得性免疫反应，对抗原靶向性、缓释性、激活机体免疫反应等方面作为疫苗免疫佐剂具有诸多优势。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌胞外多糖及其在制备免疫佐剂中的应用。
本发明的技术方案如下：
一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301，于2023年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.26759。
上述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301或其培养物在制备胞外多糖中的应用。
一种植物乳杆菌胞外多糖，所述植物乳杆菌胞外多糖的主链结构由→4)-β-D-GalpA-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3-Manp-1→2-Man-1→2,6-Man-1→2, 6-Man-1→2,6-Man-1→组成，侧链由Manp-(1→6)-Manp-(1→、Manp-(1→和Manp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→组成；
所述植物乳杆菌胞外多糖的分子式如下所示：
。
进一步优选的，所述植物乳杆菌胞外多糖由植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301或其培养物制备得到。
上述植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括步骤如下：
将植物乳杆菌LP-301接种在MRS固体培养基上，在37 ℃下活化培养20~25 h得到种子液；然后按3~6%的体积百分比，将种子液接种至MRS液体培养基中，在37 ℃下发酵培养25~35h，得到发酵液；发酵液经过离心去除菌体、除蛋白、过夜醇沉、蒸馏水透析以及冻干机冻干后，得到植物乳杆菌胞外多糖。
上述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301或其发酵物在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下（a1）~（a4）中的至少一种：
（a1）作为疫苗免疫佐剂；
（a2）作为装载抗原的递送系统；
（a3）提高疫苗的免疫效果；
（a4）提高抗原摄取和递呈效率。
上述植物乳杆菌胞外多糖在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下（a1）~（a4）中的至少一种：
（a1）作为疫苗免疫佐剂；
（a2）作为装载抗原的递送系统；
（a3）提高疫苗的免疫效果；
（a4）提高抗原摄取和递呈效率。
一种产品，包括以上述胞外多糖；所述产品的用途为如下（a1）~（a4）中的至少一种：
（a1）作为疫苗免疫佐剂；
（a2）作为装载抗原的递送系统；
（a3）提高疫苗的免疫效果；
（a4）提高抗原摄取和递呈效率。
根据本发明优选的，以上任一（a3）中，所述疫苗具体可为H1N1流感病毒灭活疫苗或黑色素瘤短肽疫苗。
本发明的有益效果在于：
1、本申请发明人从蒙古国传统骆驼酸奶样品中分离纯化得到了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301，该植物乳杆菌能够稳定高效地生产胞外多糖。
2、本发明提供的植物乳杆菌胞外多糖（EPS）具有自组装特性，能够有效装载抗原形成形貌均一的纳米颗粒，包封率达到87%；并且装载抗原后的EPS@OVA具有pH响应性和良好的稳定性。
3、本发明提供的植物乳杆菌胞外多糖（EPS）具有优异的抗原的摄取和递呈能力，可以用于制备疫苗免疫佐剂或者装载抗原的递送系统，提高疫苗的免疫效果和抗原摄取和递呈效率，并且安全无毒，为新型安全、有效疫苗免疫佐剂的设计提供实验基础与理论指导。
4、本发明提供的植物乳杆菌胞外多糖（EPS）具有提高疫苗的免疫效果，可以用于制备流感灭活疫苗和黑色素瘤短肽纳米疫苗，为纳米疫苗的设计研究提供基础，具有极大的开发和应用前景。
附图说明
图1为菌株LP-301菌落形态。
图2为菌株LP-301革兰氏染色镜检图。
图3为植物乳杆菌胞外多糖（EPS）的扫描电镜图像（a）和原子力显微镜电镜图像（b）。
图4为植物乳杆菌胞外多糖（EPS）的透射电镜图像（a）和粒径大小分布图（b）。
图5为植物乳杆菌胞外多糖（EPS）的甲基化图谱。
图6为植物乳杆菌胞外多糖（EPS）的核磁图谱；
在图6中，a为EPS的1H NMR图谱；b为EPS的13C NMR图谱；c为EPS的1H-1H-COSY图谱；d为EPS的HSQC图谱；e为EPS的HMBC图谱；f为EPS的NOESY图谱。
图7为EPS@OVA的透射电镜图像（a）和粒径大小分布图（b）。
图8为EPS@OVA的红外光谱图。
图9为EPS@OVA的紫外光谱图。
图10为EPS@OVA的圆二色谱图谱。
图11为EPS@OVA中OVA的pH响应性和稳定性验证；
在图11中，a为EPS@OVA为在不同pH条件下的释放率；b为EPS@OVA在PBS溶液、血清溶液和1640培养基溶液中稳定性。
图12为不同细胞与EPS@OVA-FITC 或 FITC-OVA 共孵育的共聚焦图像和毒性测试结果；
在图12中，a为BMDCs细胞与EPS@OVA-FITC 或 FITC-OVA共孵育的共聚焦图像；b为RAW264.7细胞与EPS@OVA-FITC 或 FITC-OVA共孵育的共聚焦图像；c为BMDCs细胞与EPS@OVA-FITC 或 FITC-OVA 共孵育的共定位情况；d为BMDCs细胞与EPS、OVA 和EPS@OVA 共培养 24 小时后的细胞毒性；e为RAW264.7细胞与EPS、OVA 和EPS@OVA 共培养 24 小时后的细胞毒性。
图13为小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的病理学观察。
图14为植物乳杆菌胞外多糖（EPS）作为免疫佐剂预防黑色素瘤效果结果图；
在图14中，a为皮下B16-OVA黑色素瘤模型的预防性实验介绍；b为每只小鼠个体肿瘤的生长曲线（n=10）；c为小鼠肿瘤平均体积的生长曲线（n=10）；d为不同预防疫苗组的小鼠生存曲线（n=10）；e为小鼠的体重变化曲线（n=10），（**p<0.01，***p<0.001）。
图15为植物乳杆菌胞外多糖（EPS）作为免疫佐剂治疗黑色素瘤效果结果图；
在图15中，a为皮下B16-OVA黑色素瘤模型的治疗性免疫结果；b为每只小鼠个体肿瘤的生长曲线（n=8）；c为小鼠肿瘤平均体积的生长曲线（n=8）；d为不同治疗性疫苗组的小鼠生存曲线（n=8）；e为小鼠的体重变化曲线（n=8），（**p<0.01）。
图16为植物乳杆菌胞外多糖（EPS）作为免疫佐剂配伍流感病毒免疫小鼠，攻毒后小鼠体重和存活率变化；
在图16中，a为攻毒后14天称量小鼠的体重大小变化；b为攻毒14天后统计小鼠存活率的变化（n=9）。
图17为植物乳杆菌胞外多糖（EPS）作为免疫佐剂配伍流感病毒免疫小鼠，攻毒后小鼠肺组织变化；
在图17中，a为攻毒后第5天肺组织病理变化；b为攻毒后第5天肺组织HE染色图像（100×）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施过程作进一步详述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，并不是全部的实施例。
下述的实施例中所使用的实验技术方法和科学术语如无特殊说明均与常规技术人员通常理解的含义相同。所涉及的实验耗材和试剂如无特殊备注均为一般商业途径可获取。
实施例中所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301，于2023年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.26759。
实施例中所述SPF级别雌性C57BL/6J小鼠在北京斯贝福生物技术有限公司（中国北京）有售，动物方案符合内蒙古大学动物护理伦理和实验规定。
实施例1：菌株的获得
1、菌株分离和纯化
将蒙古国传统骆驼酸奶样品用无菌水稀释100倍，然后吸取稀释液加入到其涂布至MRS固体培养基，倒置放于厌氧罐，厌氧条件下，37℃培养48h至生长出菌落；将菌落形态一致的菌株进行分离并标记，将分离的菌株进行反复地三区划线使其纯化，从中筛选出一株菌株，保种记为LP-301。
2、菌种鉴定
生理特性：将菌株LP-301在MRS培养基上活化，形态呈圆形，菌落中等大小，白色，菌落边缘整齐，具体如图1所示。将LP-301的菌液混匀后，经涂片、干燥、固定程序进行革兰氏染色，镜检，菌株LP-301革兰氏染色后在油镜下观察，呈现革兰氏阳性，菌体呈短杆状，具体如图2所示。
测序鉴定：使用BioTeke细菌基因组提取试剂盒提取菌株LP-301的DNA，然后采用通用引物27F/1492R对菌株LP-301的16S rDNA序列进行扩增并测序，将该16S rDNA序列（SEQ ID NO.1）在GenBank数据库中进行Blast同源搜索，序列对比分析发现，菌株LP-301与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的16S rDNA同源比对的相似度极高。根据16SrDNA序列比对结果，将该菌株鉴定为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301。
实施例2、植物乳杆菌胞外多糖的获得
一种植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括步骤如下：
（1）将植物乳杆菌LP-301接种在MRS固体培养基，在37℃厌氧培养箱中活化培养24h；按4% (v/v)接种量接种至50 mL的MRS液体培养基中，在37℃厌氧培养箱中发酵培养30h；发酵后的菌液在8000 rpm，4℃离心15 min，弃去底部沉淀；向离心后的上清液中慢慢加入三氯乙酸，调整其浓度为40 mg/mL；4℃静置12 h以后8000 rpm，4℃离心15 min，倒去底部沉淀，收集上清；上清中加入无水乙醇至其总体积的80%，4℃醇沉24 h；4 ℃离心15 min后，收集底部所有的沉淀；将沉淀溶到60℃蒸馏水中，10000rpm，离心15 min，弃去底部不溶于水的沉淀；将上清装入截留分子量为8k~12kDa的透析袋，装入的透析液不要超过透析袋的三分之二；每 8 h透析液进行一次更换，连续透析3d。收集透析袋内全部溶液，真空冷冻干燥得到植物乳杆菌胞外粗多糖；
（2）植物乳杆菌胞外粗多糖的DEAE离子交换柱（DEAE-Sepharose Fast Flow）纯化
将实验室保存完好的DEAE-Sepharose Fast Flow填料装入在Column XK 26/40的色谱柱（高度：40 cm，内径：26 mm），当填料离层析柱顶端5 cm处停止装柱；依次使用超纯水、Tris-HCl溶液（55 mM，pH 7.8）以2 mL/min流速平衡柱子，洗脱2~3个柱体积；称取100mg植物乳杆菌胞外粗多糖充分溶解于10 mL的Tris-HCl中，0.22 μm滤膜过滤，上样，静置30min后，开始洗脱；Tris-HCl洗脱液和1M NaCl的洗脱液进行依次洗脱，流速为2 mL/min，每管收集6 mL，得到DEAE柱纯化后的植物乳杆菌胞外粗多糖；用苯酚-硫酸法测定洗脱液中多糖含量，在490nm处检测吸光值，绘制洗脱曲线；
（3）植物乳杆菌胞外粗多糖的Sepharose CL-6B分子筛纯化
将Sepharose CL-6B填料装入在Column XK 16/100的层析柱中（高度：100 cm，内径：16 mm），当填料离层析柱顶端10 cm处停止加填料；依次使用超纯水、Tris-HCl溶液（55mM，pH 7.8）以2 mL/min流速平衡柱子，洗脱2~3个柱体积；称取50mg经DEAE柱纯化后的植物乳杆菌胞外粗多糖样品，充分溶解在5 mLTris-HCl，0.22 μm滤膜过滤，上样；流动相使用Tris-HCl洗脱液洗脱，流速为2 mL/min，每管收集6 mL；苯酚-硫酸法测定多糖含量，绘制洗脱曲线；再经冻干后，得到植物乳杆菌胞外多糖。
经硫酸苯酚法测定，本实施例植物乳杆菌胞外多糖产量为0.80g/L。
实施例3、植物乳杆菌胞外多糖的结构表征
本发明制备的植物乳杆菌LP-301胞外多糖（EPS）结构的具体表征过程如下：
1、将EPS样品水解（pH=7）后，采用扫描电镜（S-4800，Tokyo，Japan）扫描EPS的形态学特征。原子力显微镜（AFM，Asylum Research，Cypher，USA）观察EPS的形态特征，结果如图3所示。
2、将EPS样品水解（pH=7）后，采用透射电镜（JEOL，JEM-2100，Japan）观察EPS的形貌特征，结果如图4所示。
由图3和图4可知，EPS的形态呈纤维状，并且在pH=7的水溶液中，EPS可以自组装成球形纳米颗粒，大小约为30nm。
3、甲基化分析：取EPS样品，经甲基化、水解、乙酰化后，采用岛津GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）进行GC-MS测定，结果如图5所示。
4、核磁共振图谱分析
称取50mg的EPS，将其溶于0.5mL的重水中并冷冻干燥。随后将冻干粉再溶于0.5mL的重水中，并继续冷冻干燥，重复以上过程，以充分交换活泼氢。然后将样品溶于0.5mL的重水中，在室温25℃下，采用核磁共振光谱仪（Bruker，Rheinstetten，Germany）进行NMR测定，结果如图6所示。
由图5和图6可知，本发明制备的植物乳杆菌胞外多糖EPS的主链结构由→4)-β-D-GalpA-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3-Manp-1→2-Man-1→2,6-Man-1→2, 6-Man-1→2,6-Man-1→组成，侧链由Manp-(1→6)-Manp-(1→、Manp-(1→和Manp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→组成；
所述植物乳杆菌胞外多糖的分子式如下所示：
。
实施例4、EPS@OVA的制备与表征
1、EPS@OVA的制备：配置浓度为1mg/mL的EPS溶液2mL，溶解在离子水中，然后将2mg的卵清蛋白（OVA）抗原溶解于2mL去离子水中，充分溶解，EPS溶液在室温搅拌下（300rpm）缓慢滴入2 mL的OVA溶液（2mL/h），磁力搅拌1h，收集产物冻干，即为EPS@OVA的纳米颗粒复合物。所述EPS@OVA为植物乳杆菌LP-301胞外多糖（EPS）负载卵清蛋白（OVA）的纳米颗粒复合物。
2、EPS@OVA的表征：
采用透射电镜（JEOL，JEM-2100，Japan）观察EPS@OVA纳米颗粒的形貌，结果如图7所示。
采用傅里叶变换红外光谱仪（Bruker，Karlsruhe，Germany）分析EPS@OVA红外光谱（FT-IR），结果如图8所示。
采用紫外可见分光光度计（himadzu，Tokyo，Japan）获得EPS@OVA紫外可见吸收光谱，结果如图9所示。
采用圆二色谱光谱仪(Chirascan，Application Photophysics，Leatherhead，Surrey，UK）获得EPS@OVA图谱，结果如图10所示。
采用50kDa透析袋测定37℃条件下EPS@OVA中OVA在不同pH条件下（pH=5.0、6.0和7.2）的释放率，采用纳米粒度仪（DLS）测定EPS@OVA在PBS溶液，血清溶液，和1640培养基溶液中稳定性，结果如图11所示。
采用动态光散射（Nanobrook,90Plus，Pals，US）测量EPS、OVA和EPS@OVA的尺寸和Zeta电位大小，结果如表1所示。将EPS@OVA液体吸入到50kDa的超滤管，用超速离心机（Thermo ST8 ST8R）以3000g/min离心30 min，收集离心后的液体，BCA蛋白试剂盒（Solarbio，beijing）测定OVA含量，根据公式计算EPS@OVA的负载能力：负载率=[(总OVA含量-游离OVA含量)/纳米粒子总重量]×100%；包封率按以下公式计算:包封率=[总OVA含量-游离OVA含量/总OVA含量]×100%，结果如表2所示。
由图7可知，EPS具有自组装特性，能够有效装载OVA抗原形成形貌均一的纳米颗粒EPS@OVA。并且EPS@OVA分散性良好，具有均匀的球形颗粒形态。动态光散射研究表明EPS和EPS@OVA 的平均尺寸为41.32±3.14 nm（聚合物分散指数PDI：0.121± 0.04）和83.98 ±1.62 nm（PDI：0.142 ± 0.06）。
由图8、图9和图10可知，EPS对抗原能够充分包裹，并且在约209和220 nm处显示双负波峰，表明α螺旋结构的CD谱结构稳定。
由图11可知，在pH 7.2条件下，25%的OVA抗原在24小时内释放，在pH 6.0和5.5条件下，分别有40%和60%的OVA释放，说明EPS@OVA对抗原的释放具有pH响应性。此外EPS@OVA在不同溶剂的稳定性结果表明，与PBS缓冲液、血清和细胞培养基共孵育 14 天后，EPS@OVA粒径尺寸大小没有发生改变，即EPS@OVA在不同溶液环境中具有良好的稳定性。
由表1和表2可知，EPS和EPS@OVA的Zeta电位分别为-36.92±0.15和-17.01±0.90mV，EPS与OVA按w:w=1:1可高效负载抗原，EPS对抗原的包封率是87.30±2.64%，抗原的负载率是57.98±1.65%，表现出较高的包封率和负载率。
实施例5、EPS@OVA的细胞摄取实验
将BMDCs或RAW264.7细胞按照1×105个/mL的浓度均匀接种在24孔的细胞培养皿中培养24h，然后将这些细胞与FITC标记的OVA、EPS或EPS@OVA共孵育30h（OVA浓度为20μg/ml），孵育后用PBS缓冲液洗涤3次，再用4%多聚甲醛固定BMDCs和RAW264.7，接着每孔加入1mL含有50nM的Lyso-Tracker Red和DAPI分别对溶酶体和细胞核进行染色，染色后PBS缓冲液洗3次，最后将盖玻片正面盖在载玻片上，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，Zeiss LSM800，Germany）和ImageJ软件分别对BMDCs和RAW264.7细胞进行观察和分析。使用10倍镜观察细胞摄取，40倍镜观察细胞溶酶体逃逸，蓝色荧光为细胞核染色，绿色为样品荧光，红色为细胞溶酶体标记，结果如图12的a~c所示。
由图12的a~c可知，与OVA-FITC组相比，EPS@OVA组中的RAW264.7或BMDCs细胞内观察到更多的FITC信号，且EPS@OVA-FITC与RAW264.7或BMDCs细胞的溶酶体实现共定位，表明EPS@OVA-FITC比单独OVA对照组具有优异的抗原的摄取和递呈能力。
实施例6、细胞毒性实验和动物安全性评价
1、为检测EPS@OVA的细胞毒性，将巨噬细胞RAW264.7和树突状细胞BMDCs铺板于96孔板中，培养板放在培养箱中培养72h（37℃，5%CO2），按照100μL/板依次加入不同浓度（1、5、10、20、50、100μg/mL）的游离OVA、游离EPS和EPS@OVA共培养24h，同时设置空白对照孔，通过CCK-8试剂盒（CCK-8，BioSharp BS350B，China）检测细胞活力，结果如图12的d和e所示。
由图12的d和e可知，EPS@OVA在不同浓度下（1、5、10、20、50、100μg/mL）对RAW264.7和BMDCs细胞存活率达到80~120%，结果表明EPS作为纳米佐剂是无毒性，显示出良好的生物相容性。
2、在第一次免疫后35天处死小鼠，收集小鼠各脏器，进行HE观察，结果如图13所示。
由图13可知，小鼠各脏器未见明显的损伤。细胞毒性实验和动物安全性实验结果均表明表明EPS作为纳米佐剂具有良好的生物相容性，在小鼠体内也是无毒的。
实施例7、EPS作为疫苗免疫佐剂对肿瘤疫苗免疫效果的评价
B16-OVA细胞复苏和培养：将B16-OVA细胞接种到含有1640完全培养基（含10%FBS、1%双抗、1μg/mL嘌呤霉素）培养皿上，按照1:4两天一传，每次收集细胞需要胰蛋白酶进行消化，将消化好的B16-OVA黑色素瘤细胞用PBS洗涤1遍后，以1×107/mL重悬细胞。
B16-OVA肿瘤模型：待接种的小鼠使用1%水合氯醛腹腔注射麻醉，剃刀剪除背部接种点毛发，使用lmL注射器100μL/点将1×107个肿瘤细胞打入皮下，一周后持续测量肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。分析小鼠肿瘤浸润细胞一般选在肿瘤生长体积不超过1500mm3下进行，处死小鼠时一般对小鼠的肿瘤进行称重和拍照。
B16-OVA预防性肿瘤模型：取10只6~8周的雌性C57BL/6J小鼠随机分为5组，具体分组为PBS组、EPS组（注射EPS ，50μg/小鼠）、OVA257-264（注射OVA257-264，50μg/小鼠）、CpG@OVA257- 264（注射CpG，50μg/只；注射OVA257- 264，50μg/小鼠）和EPS@OVA257-264（注射EPS，50μg/小鼠；注射OVA257- 264，50μg/小鼠），皮下免疫，间隔一星期，持续三周。最后一次免疫后7天，将1×107个B16-OVA细胞皮下接种于小鼠背部右侧。小鼠的肿瘤体积和体重每两天测量一次，肿瘤体积按公式V=（长×宽2）/2计算。在小鼠肿瘤体积超过1500 mm3后安乐死处死小鼠，第40天后，统计小鼠存活率，结果如图14所示。
由图14可知，在第21天后，EPS@OVA纳米疫苗组处理的小鼠平均肿瘤体积为502.56mm3，要明显小于PBS、EPS、OVA以及CpG@OVA组，在整个肿瘤生长过程中，纳米颗粒疫苗处理后的小鼠肿瘤生长速度远低于PBS对照组，两组小鼠肿瘤生长速度具有显著差异，PBS组肿瘤体积生长达到1500mm3时，EPS@OVA组的肿瘤体积是524mm3。并且当PBS组小鼠均死亡时，相比之下，EPS@OVA组的存活率为100%，此外，EPS@OVA组有三只小鼠的肿瘤完全消退，说明纳米颗粒疫苗能够有效抑制肿瘤的生长，并且显著提高小鼠的存活率。同时，在肿瘤预防过程中，各组小鼠体重没有出现减轻状况，表明EPS@OVA纳米疫苗对小鼠身体无明显伤害。
B16-OVA治疗性肿瘤模型：在第0天于C57BL/6小鼠的侧腹皮下注射1×107B16-OVA细胞，在第4、11和18天注射PBS、EPS（注射EPS ，50μg/只）、OVA257-264（注射OVA257-264，50μg/只）、CpG@OVA257-264（注射CpG，50μg/小鼠，50μg/只；注射OVA257- 264，50μg/只）和EPS@OVA257-264（注射EPS，50μg/小鼠；注射OVA257- 264，50μg/小鼠）。小鼠肿瘤大小和小鼠体重间隔两天测量一次，肿瘤体积公式=（长度×宽度2）/2。在第21天对小鼠实施安乐死，切除肿瘤并称重。在小鼠肿瘤体积超过1500 mm3后安乐死处死小鼠，第40天后，统计小鼠存活率，结果如图15所示。
由图15可知，在第21天后，EPS@OVA257-264纳米疫苗组处理的小鼠平均肿瘤体积为628.90mm3，要明显小于PBS、EPS、OVA257-264以及CpG@OVA257-264组。并且PBS组小鼠在40天时均出现死亡时，而EPS@OVA257-264组仍有30%的存活率，相比于其他对照组，EPS@OVA显著延长了小鼠的存活率，此外，进行了小鼠体重评估，各组小鼠之间无明显差异，说明EPS@OVA257-264纳米疫苗有效抑制黑色素瘤的生长，显著提高小鼠的存活率。
实施例7、EPS作为疫苗免疫佐剂对流感灭活疫苗免疫效果的评价
流感模型的建立：取6~8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠72只，随机分为6组，每组12只小鼠，具体分组为PBS组、EPS组、H1N1 WIV组，H1N1 WIV+Alum组，H1N1 WIV@EPS组和不攻毒的正常对照Normal组。
具体建立方法为：采用小鼠背部皮下多点注射免疫方式，间隔14d，共免疫两次，第二次免疫后14 d对每组小鼠以1×106PFU剂量滴鼻接种病毒H1N1，每只滴鼻50 μL，攻毒后每天观察小鼠14 d内健康状态，并记录小鼠体重及存活状况，结果如图16所示。攻毒后第5天无菌摘取小鼠肺脏组织用于组织病理学观察，结果如图17所示。
由图16可知，PBS和EPS对照组小鼠体重出现大幅下降情况并在第7天内全部死亡。在H1N1 WIV+Al阳性对照组和H1N1 WIV@ EPS疫苗组中，攻毒后小鼠4天内体重小幅度下降后开始缓慢升高并恢复正常。而H1N1 WIV组中小鼠攻毒后4天内下降至80%左右，第5天存活的小鼠体重开始缓慢升高并恢复正常。攻毒后14天后，H1N1 WIV@ EPS疫苗组的小鼠存活率为88.8%，而免疫H1N1 WIV+Al组的小鼠存活率为77.8%，PBS和EPS非免疫组小鼠全部死亡，而H1N1 WIV组中的小鼠出现部分死亡，存活率为66.7%，以上结果表明H1N1 WIV@ EPS疫苗对小鼠具有保护作用。
由图17可知，在PBS和EPS非免疫组中，小鼠肺脏出现充血并伴有出血，肺组织肿胀严重。H1N1 WIV组中小鼠肺脏有轻微出血，而H1N1 WIV@EPS疫苗组与正常小鼠肺组织相比并没有观察到以上病变。通过HE染色发现PBS和EPS非免疫组肺部组织表现出严重的病变，并伴有大量炎性细胞浸润，肺泡结构不清晰，肺气积血和组织边缘肺水肿。然而，H1N1WIV@EPS疫苗组的切片结果显示，小鼠肺脏肺泡结构清晰，表现出轻微的组织病理学变化。以上实验结果表明小鼠接种配伍多糖EPS纳米佐剂的H1N1 WIV疫苗受到病毒攻击时，可以显著减少炎性细胞浸润以及肺组织形态改变。
以上所有统计分析均使用 GraphPad Prism 8软件进行。结果表示为平均值士标准误差。两组之间的差异性P值用t tests分析，三组或三组以上用one-way ANOVA分析,群组数据用two-way ANOVA分析，P值小于0.05代表有统计学上的显著性差异，显著性差异具体表示如下:*P<0.05,*P<0.01,*P<0.001。并且以上所述仅为本发明所用较佳方案的实施例，但本发明的实施方式不受上述实施例限制，凡在本发明原则和精神内所做的任何修改、同等替换和改进，均在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301，其特征在于，所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301于2023年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.26759。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301或其发酵液在制备胞外多糖中的应用。
3.一种植物乳杆菌胞外多糖，其特征在于，所述植物乳杆菌胞外多糖的主链结构由→4)-β-D-GalpA-(1→3)-β-D-GlcpNAc-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→3-Manp-1→2-Man-1→2,6-Man-1→2, 6-Man-1→2,6-Man-1→组成，侧链由Manp-(1→6)-Manp-(1→、Manp-(1→和Manp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→组成；
所述植物乳杆菌胞外多糖的结构式如下所示：
。
4.权利要求3所述的植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
将权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301接种在MRS固体培养基上，在37 ℃下活化培养20~25 h得到种子液；然后按3~6%的体积百分比，将种子液接种至MRS液体培养基中，在37 ℃下发酵培养25~35h得到发酵液；发酵液经过离心去除菌体、除蛋白、过夜醇沉、蒸馏水透析以及冻干机冻干后，得到植物乳杆菌胞外多糖。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-301、或权利要求3所述的植物乳杆菌胞外多糖在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下（a1）~（a4）中的至少一种：
（a1）作为疫苗免疫佐剂；
（a2）作为装载抗原的递送系统；
（a3）提高疫苗的免疫效果；
（a4）提高抗原摄取和递呈效率。
6.一种产品，包括权利要求3所述的植物乳杆菌胞外多糖；所述产品的用途为如下（a1）~（a4）中的至少一种：
（a1）作为疫苗免疫佐剂；
（a2）作为装载抗原的递送系统；
（a3）提高疫苗的免疫效果；
（a4）提高抗原摄取和递呈效率。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述（a3）中，疫苗具体可为H1N1流感灭活病毒疫苗或黑色素瘤短肽疫苗。
8.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述（a3）中，疫苗具体可为H1N1流感灭活病毒疫苗或黑色素瘤短肽疫苗。
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