CN116925962B - 具有肠道菌群和免疫调节功能的解淀粉芽孢杆菌jm033产胞外多糖及其应用 - Google Patents

具有肠道菌群和免疫调节功能的解淀粉芽孢杆菌jm033产胞外多糖及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有肠道菌群和免疫调节功能的解淀粉芽孢杆菌JM033产胞外多糖及其应用，属于微生物技术领域。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM033保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCC NO：62989。解淀粉芽孢杆菌JM033产胞外多糖，BAP‑1是中性多糖，分子量为17.6kDa，构型为球形，BAP‑1由两种单糖组成，其中果糖占99.15%，葡萄糖占0.85%。本发明具有高产EPS的能力，新型胞外多糖BAP‑1，具有安全性和肠道菌群和宿主免疫方面的作用。

Description

具有肠道菌群和免疫调节功能的解淀粉芽孢杆菌JM033产胞 外多糖及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有肠道菌群和免疫调节功能的解淀粉芽孢杆菌JM033产胞外多糖及其应用。属于微生物技术领域。
背景技术
胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是由微生物产生的一种具有结构多样性的生物聚合物。因其结构的多样性决定了EPS具有多种生物学活性，如抗氧化、抗病毒、抗癌和免疫调节等。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)是属于芽孢杆菌属的益生菌，具有较强的酶和碳水化合物合成能力，其产生的EPS具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和抗氧化等多种生物学活性。芽孢杆菌属中越来越多的益生菌被发现，但对这些益生菌相关的研究却较少，所以对芽孢杆菌属益生菌产胞外多糖的研究具有重要意义。
解淀粉芽孢杆菌是属于芽孢杆菌属的一种益生菌，研究表明其可以产生包括EPS在内的多种代谢物质。EPS是微生物产生一类具有多种优良理化性质的生物聚合物。目前EPS的研究热点集中于乳酸菌上，而某些芽孢杆菌可以产生比乳酸菌更多且新型结构的EPS。芽孢杆菌属益生菌产EPS和特性是目前的研究热点，筛选和发现能产生新型EPS大分子的潜力菌株和对新型EPS的研究具有重要意义。故亟需一种解淀粉芽孢杆菌JM033、胞外多糖及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高产EPS能力的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JM033。
同时，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产新型胞外多糖BAP-1，具有安全性和肠道菌群和宿主免疫方面的作用。
同时，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖的制备方法，该法可将EPS产量从0.75mg/mL提高至5.34mg/mL，增加了6.12倍。
同时，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖在制备免疫调节药物中的应用。
同时，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖在制备缓解免疫抑制肠道菌群紊乱药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033，保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCC NO：62989。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖，BAP-1是中性多糖，分子量为17.6kDa，构型为球形，BAP-1由两种单糖组成，其中果糖占99.15％，葡萄糖占0.85％；BAP-1是重复单元主链为13个(2→1)链接的β-D-呋喃果糖，支链是(2→6)链接的β-D-呋喃果糖的混合型果聚糖。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
S01，根据解淀粉芽孢杆菌JM033可转运的碳源作为优化碳源种类并分别以100g/L添加到LB液体培养基中，结果显示蔗糖作为碳源的LB液体培养基中EPS产量最高，故最终优选蔗糖作为碳源；
S02，解淀粉芽孢杆菌JM033胞外粗多糖的制备：以蔗糖作为碳源，在37℃，pH为7.0的条件下发酵50h，接种量为2％、摇床转速为180rpm/min进行发酵的发酵液，经20000g离心15min；取上清液加入3倍体积提前预冷却至4℃的无水乙醇，于4℃静置沉淀48h；经12000g离心15min后取沉淀；将沉淀溶解于适量去离子水中，去离子水的加入量相当于沉淀的10倍体积，获得混悬液，加入相当于混悬液1/4体积的Sevage试剂，混匀后以180rpm震荡2h，离心，取水相并重复上述操作，直至水相与有机相的交界处没有蛋白存在，将水相置于透析袋中，透析袋截留分子量为8000-13000Da，透析3d，每8h换水，透析液进行真空冷冻干燥，最后获得粗多糖样品；
S03，离子交换纯化：粗多糖样品被应用于DEAE-纤维素柱，粗多糖样品用蒸馏水溶解后上样，以4mL/min的速度依次用蒸馏水洗脱，然后用0.1mol/L、0.2mol/L和0.3mol/L氯化钠洗脱；收集蒸馏水洗脱的馏分，浓缩，用蒸馏水透析48-72h，透析袋截留分子量为3000Da，获得BAP-1粗品；
S04，凝胶纯化：将BAP-1粗品加载到Sephacryl S-400HR柱上，BAP-1粗品用蒸馏水溶解后上样，用蒸馏水洗脱60个柱体积，流速为1.0mL/min，收集每个柱体积获得的溶液并检测多糖的含量和纯度，合并多糖纯度≥90％的组分，冻干，获得BAP-1。
DEAE-纤维素柱为26mm×400mm；每15mL接一管，蒸馏水洗脱液接26管，0.1mol/L氯化钠洗脱液接13管，0.2mol/L氯化钠洗脱液接10管，0.3mol/L氯化钠洗脱液接10管。
Sephacryl S-400HR柱为26mm×1000mm。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖在制备免疫调节药物中的应用。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JM033产胞外多糖在制备缓解免疫抑制肠道菌群紊乱药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本研究根据磷酸转移酶相关基因对B.amyloliquefaciens JM033发酵基质碳源进行筛选，优化发酵条件提高EPS产量。对B.amyloliquefaciens JM033所产EPS进行提取、分离和纯化，选取中性多糖组分(BAP-1)进行结构解析。根据结构解析结果进行构效分析，通过体外细胞试验证明BAP-1的安全性和免疫调节能力。通过环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)处理小鼠建立免疫抑制模型，在体内从细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞吞噬作用、NK细胞活性和肠道菌群调节能力等方面研究BAP-1在肠道菌群和宿主免疫方面的作用。
通过上述研究得到如下结果：
(1)通过单因素和响应面设计优化B.amyloliquefaciens JM033的发酵条件。根据磷酸转移酶相关基因的结果对备选发酵碳源进行筛选。得到以蔗糖作为碳源、发酵温度为37℃、初始pH值为7.0、发酵时间为50h时可将EPS产量从0.75mg/mL提高至5.34mg/mL，增加了6.12倍。
(2)BAP-1为一种新型的混合型果聚糖。B.amyloliquefaciens JM033产EPS通过阴离子柱纯化分离出两个组分(BAP-1和BAP-2)，选取中性多糖组分(分子量为17.6kDa的BAP-1)进行结构解析。结果显示BAP-1由两种单糖组成，其中果糖占99.15％，葡萄糖占0.85％。结合甲基化和核磁共振波谱分析得出BAP-1是一种重复单元主链为13个(2→1)链接的β-D-呋喃果糖，支链是(2→6)链接的β-D-呋喃果糖的混合型果聚糖。
(3)体内体外试验分别证明了BAP-1的免疫调节作用。通过体外细胞试验验证了BAP-1不具有细胞毒性并能促进RAW264.7细胞的中性红吞噬作用与NO、白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的分泌，具有体外的免疫增强能力。体内通过利用CTX构建免疫抑制小鼠模型研究BAP-1体内免疫增强能力，发现BAP-1可以从体液免疫、单核-巨噬细胞吞噬能力和NK细胞活性三个方面显著提高宿主免疫能力。
(4)BAP-1可以调节肠道菌群和刺激短链脂肪酸的产生。BAP-1的摄入可在门水平上显著提升有益菌如Verrucomicrobia的菌群丰度，同时降低潜在致病菌如Actinobacteria和Proteobacteria的菌群丰度。属水平上BAP-1的摄入可以显著提高免疫抑制小鼠肠道菌群中Akkermansia、Lachnospiraceae和Oscillospiracea等可以产生短链脂肪酸的下一代益生菌的菌群丰度。BAP-1的摄入还可以刺激免疫抑制小鼠的肠道中乙酸、丙酸和丁酸含量的显著升高。
附图说明
图1为发酵条件对EPS产量的影响图，其中，a)为发酵时间对EPS产量的影响；b)为发酵温度对EPS产量的影响；c)为初始pH对EPS产量的影响；
图2为离子柱层析纯化多糖洗脱图；
图3为凝胶纯化多糖洗脱图；
图4为胞外多糖的分子量测定图，其中，a)绝对分子量分析图；b)分子构型分析图；
图5为EPS的红外光谱扫描测定结果；
图6为单糖组成离子色谱图，其中，a)标准品离子色谱图；b)BAP-1离子色谱图；
图7为EPS(BAP-1)总离子流图；
图8为EPS(BAP-1)的1维NMR谱图；
图9为BAP-1的SEM扫描电镜结果图，其中，a)，b)，c)，d)，e)分别为BAP-1在500×、1000×、2000×、5000×和10000×的放大倍数下的微观图像；
图10为BAP-1体外免疫调节试验结果，其中，a)细胞毒性试验；b)中性红吞噬作用检测；c)NO分泌量；d)IL-6分泌量；e)TNF-α分泌量；数值表现为平均值±标准差(Mean±SD)，利用单因素ANOVA分析显著性，*P<0.5,**P<0.01；
图11为BAP-1对免疫抑制小鼠体重、胸腺和脾脏指数的影响，其中，a)各组小鼠体重变化；b)试验前后各组小鼠体重增加量；c)各组小鼠脾脏系数；d)各组小鼠胸腺系数；数值表现为平均值±标准差(Mean±SD)，利用单因素ANOVA分析显著性，*P<0.5，**P<0.01；
图12为BAP-1对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响，其中，a)各组小鼠淋巴细胞转化能力；b)各组小鼠被攻击前后肿胀程度。数值表现为平均值±标准差(Mean±SD)，利用单因素ANOVA分析显著性，*P<0.5，**P<0.01；
图13为BAP-1对免疫抑制小鼠体液免疫功能的影响，其中，a)各组小鼠抗体生成水平；b)各组小鼠溶血素水平。数值表现为平均值±标准差(Mean±SD)，利用单因素ANOVA分析显著性，*P<0.5，**P<0.01；
图14为BAP-1对免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞功能的影响，其中，a)各组小鼠碳廓清除能力；b)各组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率；c)各组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数；d)Model组巨噬细胞吞噬鸡红细胞显微镜成像照片(200x)；e)EPS组巨噬细胞吞噬鸡红细胞显微镜成像照片(200x)。数值表现为平均值±标准差(Mean±SD)，利用单因素ANOVA分析显著性，*P<0.5，**P<0.01；
图15为BAP-1对免疫抑制小鼠NK细胞活性的影响；
图16为BAP-1对肠道内容物中短链脂肪酸含量的影响，其中，a)肠道内容物中乙酸含量；b)肠道内容物中丙酸含量；c)肠道内容物中丁酸含量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
本发明中，解淀粉芽孢杆菌JM033的拉丁名为：Bacillus amyloliquefaciensJM033，保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCC NO：62989。菌株初始来源：东北传统发酵食品腐乳。
1.解淀粉芽孢杆菌JM033胞外多糖产量优化
1.1.发酵基质中碳源对解淀粉芽孢杆菌JM033胞外多糖产量的影响
考察B.amyloliquefaciens JM033基因组中磷酸转移酶系统相关基因结果，结果见表1，根据B.amyloliquefaciens JM033可转运的碳源作为优化碳源种类分别添加到LB液体培养基(即LB肉汤培养基、购自青岛海博生物技术有限公司)中，测定不同组合(具体见下表2)情况下的EPS产量，并与没有外源添加碳源的基础LB液体培养基的EPS产量进行对比，不同条件下的LB液体培养基中仅碳源成分不同。B.amyloliquefaciens JM033的发酵条件设定为：初始pH为7.0、接种量为2％、温度为37℃、摇床转速为180rpm/min、发酵时间为48h，对比LB液体培养基与不同碳源组合情况下EPS产量的差异，探究不同组合对EPS产量的实际影响。
表1 B.amyloliquefaciens JM033中与磷酸转移酶系统(PTS)相关的基因
选择葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖四种碳源在LB液体培养基基础上进行替换，比较结果见表2，显示：蔗糖作为碳源的培养基质中EPS产量最高可达2.32mg/mL。
表2碳源优化前后EPS的产量
1.2.发酵温度对B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖产量的影响
采用上述碳源的优化结果，作为单因素试验中B.amyloliquefaciens JM033发酵所用的基质，其他条件设定为：初始pH为7.0、接种量为2％、摇床转速为180rpm/min、发酵时间为48h，分别在31℃、34℃、37℃、40℃、43℃温度条件下进行发酵并测定EPS产量，如图1所示，可以观察不同发酵温度对EPS产量的影响。结果：37℃时EPS产量最大，达3.31mg/mL。
1.3发酵时间对B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖产量的影响
采用上述碳源的优化结果，作为单因素试验中B.amyloliquefaciens JM033发酵所用的基质，其他条件设定为：初始pH为7.0、接种量为2％、摇床转速为180rpm/min、发酵温度为37℃，分别发酵24h、36h、48h、60h和72h并测定EPS产量，观察不同发酵时间对EPS产量的影响。如图1所示，可以看出当发酵时间在48h时EPS产量达到最大达3.47mg/mL。表明48h为较理想的发酵时间。
1.4发酵pH对B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖的影响
采用上述碳源的优化结果，作为单因素试验中B.amyloliquefaciens JM033发酵所用的基质，其他条件设定为：发酵温度为37℃、接种量为2％、摇床转速为180rpm/min、发酵时间为48h，分别在初始pH为5.0、6.0、7.0、8.0及9.0发酵并测定EPS产量，观察不同发酵时间对EPS产量的影响。如图1所示，可以观察到到pH为7时EPS产量最高可以达到3.33mg/mL。
1.5响应面试验优化B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖制备条件
建立了相应的预测模型：
Y＝5.11+0.26A-0.14B+0.29C+0.032AB+0.085AC-0.33BC-0.66A2-1.13B2-1.7
2C2。
结果：随着发酵时间、发酵温度和初始pH的变化在一定区域上EPS产量均得到了提升。结合预测模型进行分析得知理论上三个变量的最佳值应为A＝0.205，B＝-0.071和C＝0.095，即在36.79℃，pH为7.10的条件下发酵50.46h理论上B.amyloliquefaciens JM033的EPS产量最高可达5.16mg/mL。为贴合实际情况，我们对以上条件实际数值进行微调，在37℃，pH为7.0的条件下发酵50h得到EPS的实际产量为5.34mg/mL，与理论预测值差异为3.5％，表明建立的预测模型预测效果较好，且响应面试验结果提高了EPS的产量。综上从培养基质的碳源选择、发酵时间、发酵温度和初始pH等因素进行优化，使B.amyloliquefaciens JM033的EPS产量从0.75mg/mL提升至5.34mg/mL，增加了6.12倍。
2.B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖分离纯化
2.1粗多糖的制备
按照响应面优化后的条件(以蔗糖作为碳源，在37℃，pH为7.0的条件下发酵50h，接种量为2％、摇床转速为180rpm/min)进行发酵的发酵液，经20000g离心15min。取上清液加入3倍体积提前预冷却后的无水乙醇，于4℃静置沉淀48h。经12000g离心15min后取沉淀。将沉淀溶解于适量去离子水中，加入1/4体积的Sevage试剂(正丁醇：氯仿，1:5)，混匀后剧烈震荡2h，离心，取水相并重复上述操作，直至水相与有机相的交界处没有蛋白存在，将水相置于透析袋(截留分子量为8000-13000Da)中，透析3d，每8h换水，透析液进行真空冷冻干燥，最后获得粗多糖样品。
2.2离子交换纯化
样品被应用于DEAE-纤维素柱(26mm×400mm)，以4mL/min的速度依次用蒸馏水洗脱，然后用0.1mol/L、0.2mol/L和0.3mol/L氯化钠洗脱。收集主要的多糖馏分，浓缩，用蒸馏水透析(3000Da)48-72h。收集每个组分并在620nm处用蒽酮-硫酸法检测碳水化合物含量来确定离子纯化后多糖的含量和纯度。
如图2所示，粗多糖经阴离子柱洗脱出现两个洗脱峰，首先是由蒸馏水洗脱得到的第一个峰为中性多糖组分(BAP-1)，总糖含量为418mg。利用NaCl的不同浓度进行的梯度洗脱得到的峰为酸性多糖组分(BAP-2)，总糖含量为172mg。选择含量最高的中性组分(BAP-1)进行后续研究，其经透析后冷冻干燥称重233mg，经总糖测定结果，多糖纯度为77.2％。
2.3凝胶纯化
将离子纯化后的多糖(BAP-1)加载到AKTA exlorer系统(GE Healthcare)的Sephacryl S-400HR柱(26mm×1000mm)上，用蒸馏水洗脱，流速为1.0mL/min，收集每个组分并在620nm处用蒽酮-硫酸法检测碳水化合物含量来确定离子纯化后多糖的含量和纯度。
如图3所示，离子洗脱峰1(BAP-1)经浓缩、过滤后，过凝胶柱纯化得到单一洗脱峰，总糖含量298mg，冻干后得到多糖质量276mg，经总糖测定结果，多糖纯度：90.9％，说明分离纯化效果较好，可以用于进行后续试验。
3B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖(BAP-1)结构解析
3.1胞外多糖分子量测定
多糖样品分子量测定实验条件和参数为：色谱系统采用的是凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统，示差检测器为Optilab T-rEX，激光光散射检测器为DAWN HELEOSⅡ，根据化合物的性质，采用合适分子量范围的凝胶排阻色谱柱(Ohpak SB-805HQ(300×8mm)，Ohpak SB-804HQ(300×8mm)，Ohpak SB-803HQ(300×8mm))，使用模型柱加热器保持在45℃。进样量为100μL，流动相A(0.1mol/LNaNO3)，流速0.4mL/min，洗脱梯度：等度100min。
结果：BAP-1分子量为17.6kDa。通过图4a)BAP-1的绝对分子量分析图我们可以看到，红线为多角度激光光散射信号代表分子尺寸、蓝线为示差信号代表物质的量浓度、黑线是由两种信号拟合出的分子量，可知BAP-1组分中10kDa以上组分占大多数。
图4b)为BAP-1的分子构型图，其斜率可以作为分子构型的参考，根据斜率的大小不同可以推断多糖的分子构型为棒状、无规则线团或球形。从图中可以看出BAP-1分子构型图斜率接近1/3，所以其构型为球形，因球形的表面积最大官能团和外界接触面积也更多初步判断有利于功能活性的发挥。
3.2胞外多糖红外线扫描测定
称取(BAP-1)样品2mg用溴化钾研磨并压制成片置于Nicolet iZ-10傅里叶变换红外光谱仪扫描分析，检测400-4000cm-1扫描范围内的傅里叶变换红外光谱。
如图5所示，BAP-1的红外光谱测定结果。在3600-3200cm-1有明显的吸收带，其是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3408.97cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2936.46cm-1处的吸收峰归属于C-H伸缩振动。在1629.73cm-1吸收峰，归属于C＝O伸缩振动。在1062.57cm-1处有一个吸收峰，归属于C-O伸缩振动。在926.21cm-1处有一个吸收峰，归属于β-型糖苷键的特征信号。在1730cm-1处没有出现吸收峰，说明BAP-1中不存在糖醛酸，属于中性多糖。
3.3胞外多糖单糖组成分析
多糖样品的单糖组成分析方法如下：色谱系统采用的是Thermo ICS5000离子色谱系统(ICS5000，Thermo Fisher Scientific，USA)，利用电化学检测器对单糖组分进行分析检测。
采用DionexTMCarboPacTMPA20(150×3.0mm，10um)液相色谱柱；进样量为5μL。流动相A(0.1M NaOH)，流动相B(0.1M NaOH，0.2M NaAc)，流速0.5mL/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0min A相/B相(95：5V/V)，30min A相/B相(80：20V/V)，30.1min A相/B相(60：40V/V)，45min A相/B相(60：40V/V)，45.1min A相/B相(95：5V/V)，60min A相/B相(95：5V/V)。
如图6所示，利用高效液相色谱分别建立标准品和样品的色谱图，来测定BAP-1的单糖组成。如表3所示BAP-1由果糖和葡萄糖组成，含果糖99.15％，葡萄糖0.85％。对菌株B.amyloliquefaciens JM033进行全因组分析时，注释到了包含对葡萄糖和果糖转运的相关PTS基因，结果与单糖组成的结果一致。
表3BAP-1单糖组成结果表
3.4胞外多糖甲基化测定
将干燥的(BAP-1)多糖(20mg)和NaOH(200mg)粉末溶于7.5mL DMSO中，然后在55℃搅拌6小时，在冰浴中加入5mL碘甲烷，在室温下超声处理30分钟至浅黄色，加入5mL去离子水终止反应。然后，将样品透析48h，透析液冷冻干燥后再次用7.5mLDMSO溶解，重复上述操作两次，以确保多糖被完全甲基化。
最终样品在室温下用10mL NaBD4溶液(10mg/mL)在10-12的pH值下还原24h之后，用4mol/L乙酸中和溶液，在65℃的真空旋转蒸发器中干燥，产品用甲醇洗三次以除去乙酸。在沸水浴中与1mL吡啶和1mL醋酐溶液反应30分钟，使产品衍生化。衍生化的产物被干燥，然后用2mL CH2Cl2重新溶解后使用Agilent气象色谱系统和四极杆质谱检测系统对样品进行检测和分析。
通过甲基化分析能够得到EPS中单糖残基之间的连接方式和位置。BAP-1经过甲基化处理后检测分析，BAP-1的甲基化分析结果如表4所示，组分中有6种糖残基，较多的有三种：t-Fru(f)、2,1-Fru(f)、1,2,6-Fru(f)，其中以2,1-Fru(f)为主要糖残基形式，占80.771％。
表4BAP-1的甲基化分析
注：*相对摩尔量＝峰面积/分子量；
*相对摩尔比(％)＝相对摩尔量/各组分相对摩尔量总和。
如图7所示，为EPS总离子流图。
3.5胞外多糖核磁共振测定
样品被溶解在0.5mL D2O中，最终浓度为40mg/mL。一维核磁共振和二维核磁共振(1H-NMR，13C-NMR，COSY，NOESY，HMBC和HSQC)在25℃下使用Bruker AVANCE NEO 500M光谱仪系统在500MHz下操作记录。
一维氢谱主要解决多糖结构中糖苷键的构型问题。多糖在1H NMR中的信号集中于3～6ppm。对于醛糖，通常β-糖苷键构型的异头氢信号主要分布在δ4.4～4.8ppm，α-糖苷键构型的异头氢信号主要分布在δ4.8～5.8ppm。由于果糖属于酮糖，因此没有异头氢信号。此样品在δ4.8～5.8ppm没有明显吸收峰(δ4.7ppm为HOD溶剂峰)，与果糖信号一致，表明该样品为果聚糖。此样品氢谱信号主要集中在δ3.2～5.4ppm之间，如图8a)1H NMR谱，非异头氢信号均集中在δ3.2～4.2ppm区域，个别信号由于重叠严重，还需要结合COSY和HSQC谱分别对糖残基的化学位移进行归属。
与1H NMR相比，多糖在如图8b)13C NMR中的化学位移信号分布较宽。多糖在13C NMR中的异头碳信号集中于95-110ppm，共识别到2个偶合信号峰，化学位移分别为δ107.10ppm和δ106.49ppm，部分残基的异头碳信号可能在这里发生了重叠。结合1H NMR、HSQC和13C NMR谱，分别对各残基进行归属，从而确定了糖残基的异头碳信号。结合样品键合结构(甲基化)信息、异头信号以及文献综合报道，确定了残基A为→1)-β-D-Fruf-(2→，残基B为β-D-Fruf-(2→，残基C为→1,6)-β-D-Fruf-(2→，并对其1H和13C化学位移进行归属，详细结果见表5。
本研究中使用的二维NMR谱包括：氢-氢相关谱(COSY)、NOESY谱、HSQC谱和HMBC谱。COSY谱和HSQC谱。
表5糖残基的1H和13C化学位移
据样品中各糖残基13C和1H的化学位移，结合HMBC谱图分析该多糖中存在结构和的连接方式：糖残基A的C2(107.1ppm)与残基A的H1(3.64ppm，3.61ppm)以及残基C的H1(3.51ppm)均有偶合信号。糖残基B的C2(106.5ppm)与残基C的H6(3.75ppm)存在偶合信号。糖残基C的C2(107.06ppm)与残基A的H1(3.64ppm，3.61ppm)以及残基C的H1(3.51ppm)均存在偶合信号。
综合一维核磁和二维核磁信息分析，推断出该多糖主要是由→1)-β-D-Fruf-(2→与→1,6)-β-D-Fruf-(2→形成主链，支链由β-D-Fruf-(2→作为端糖连接在残基C的6位构成，因此推测该多糖可能的结构为：
3.6胞外多糖BAP-1扫描电镜
多糖样品过100目筛，取5.0mg样品于载物台上，均匀的粘贴于云母片表面，固定后喷金，置于扫描电子显微镜下观察。SEM图像是通过扫描电子显微镜在500x、1000x、2000x、5000x、和10,000x放大倍数下获得。
如图9所示，BAP-1属于片层多孔网状，孔多且大，平均孔径在100-200微米左右。较多较大的孔状结构有利于在人体内与肠道表皮细胞上受体接触发挥相应活性作用。
4.B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖体外免疫调节能力的研究
4.1B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7的细胞毒性测定
小鼠巨噬细胞RAW264.7在DMEM高糖培养基中在37℃含5％CO2的环境中培养。将培养好的细胞以1×105个/孔的密度接种于96孔板中，在原环境中继续培养24h。然后，以LPS(脂多糖)溶液(1μg/mL)作为阳性对照，试验孔中添加不同浓度的溶于DMEM高糖培养基(即DMEM高糖培养液，购自北京索莱宝科技有限公司)中的BAP-1溶液，具体参考SHEN的方法(Shen C-Y,Yang L,Jiang J-G,et al.Immune enhancement effects and extractionoptimization of polysaccharides from Citrus aurantium L.var.amara Engl[J].Food&Function,2017,8(2):796-807.)测定BAP-1对RAW264.7细胞的毒性。
如图10所示，结果受试浓度下均没有使细胞活性显著性下降，细胞存活率在EPS浓度为600μg/mL时达到最高为100.19％。以上结果证明所研究的胞外多糖对细胞无毒。
4.2B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖体外的中性红吞噬作用测定
取对数生长期RAW264.7细胞，以1×105个/孔的密度接种于96孔板中培养24h。去除前一种培养基后，用PBS洗涤2次。再加入不同浓度(100、200、400、800、1000μg/mL)的多糖溶液(100μL)继续培养24h。阳性对照和空白对照分别为100μL LPS(脂多糖)和100μL空白培养基。孵育结束后，用PBS洗涤2次，加入150μL中性红色试剂孵育1h后，去除上清液，加入150μL裂解液(冰醋酸：无水乙醇，1：1(v/v))再孵育2h，用平板检测仪在550nm处测定吸光度。
如图10所示，中性红是一种大分子，可以被巨噬细胞通过内吞作用摄取到细胞中，因此可以用来测试巨噬细胞的吞噬能力。BAP-1能显著促进巨噬细胞的吞噬能力，其中800μg/mLBAP-1对免疫细胞的吞噬能力有最大促进作用。
4.3B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖作用下巨噬细胞RAW264.7中NO、IL-6和TNF-α的分泌量测定
将RAW264.7细胞以1×105个/孔的密度接种于96孔板中，培养24h后，去除之前的培养基，用PBS溶液洗涤2次。随后在96孔板中分别加入100μL严重浓度(100、200、400、800、1000μg/mL)的BAP-1多糖溶液、阳性对照和空白对照。采用一氧化氮检测试剂盒、TNF-α免疫反应试剂盒、IL-6免疫反应试剂盒说明书检测NO、IL-6、TNF-α分泌量。
结果表明，BAP-1各剂量组均能促进NO的分泌(P<0.01)。通过ELISA分析，各实验组对IL-6的分泌均有显著影响(P<0.01)。800μg/mL的BAP-1对免疫细胞分泌IL-6的作用最强。此外，BAP-1对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌有显著影响(如图10e)所示)。800μg/mL的BAP-1对TNF-α的分泌作用最强。
综上所述，与Control组相比，100-1000μg/mL的BAP-1在一定程度上可以显著提升RAW264.7细胞中NO、IL-6和TNF-α的分泌。BAP-1的免疫活性仅在一定浓度范围内呈剂量依赖关系，这可能与高浓度多糖处理的巨噬细胞的细胞凋亡或免疫调节有关。与脂多糖组相比，BAP-1对RAW264.7细胞吞噬中性红和分泌IL-6的作用优于对NO和TNF-α的分泌。
由此可见，多糖主要通过控制免疫细胞分泌白介素来发挥免疫活性。
5B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖体内对免疫抑制小鼠免疫能力调节的研究
5.1小鼠试验方案
选取6-8周龄C57BL/6J小鼠96只，分5批次进行试验。分为NC组(33只)，Model组(33只)和EPS组(33只)。0-6天适应性喂养后，7-9天Model组和EPS组每天腹腔注射环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)80mg/kg，每只200μL，NC组注射同等量PBS。模型建立后分别宰杀NC组和Model组小鼠测体重，眼球取血取全血抗凝管冻存，取脾、胸腺称重计算脏器指数，判断建模是否成功。建模成功后EPS组小鼠每日灌胃150mg/kgBAP-1续灌胃胞外多糖20天，每日200μL，另外两组灌胃同样体积PBS(小鼠分组及处理见表6)。三组小鼠在饲养结束时6只一组再分5小组，进行后续试验。NC-1组、Model-1组和EPS-1组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；NC-2组、Model-2组和EPS-2组进行小鼠抗体生成细胞检测和血清溶血素测定；NC-3组、Model-3组和EPS-3组进行小鼠迟发型变态反应实验；NC-4组、Model-4组和EPS-4组进行小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定；NC-5组、Model-5组和EPS-5组进行碳廓清试验。
表6小鼠实验分组及处理
5.2B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠体重、胸腺和脾脏指数的影响
记录各小鼠初始体重，且试验期间每7天测定一次小鼠体重。小鼠宰杀后称重小鼠胸腺和脾脏重量。胸腺和脾脏指数为胸腺和脾脏的重量与小鼠重量的比值。
图11a)，b)显示了各组小鼠的体重变化趋势和试验始末体重增重情况，可以看出NC组体重按一定的速度平稳增加。在第7-9天给NC组外的小鼠连续三天注射CTX，可以看出Model组和EPS组小鼠在CTX的作用下体重下降。BAP-1的摄入使得EPS组小鼠体重开始回升并与Model组相比又较快的增长。Model组小鼠虽在CTX造成的体重下降后有回升，但体重增加速度较NC组小鼠慢。体重增量结果得知，NC组和Model组体重增量间具有显著性差异(P<0.05)。BAP-1的摄入在一定程度上增加了免疫抑制小鼠的体重增量，但是并未产生显著的提高。
图11c)，d)所示为各组受试小鼠的脾脏指数和胸腺指数情况，CTX的作用使得Model组小鼠的脾脏指数(P<0.01)和胸腺指数(P<0.05)都显著低于NC组。BAP-1的摄入使得小鼠脾脏指数极显著(P<0.05)升高，而胸腺指数虽然也有增高但无显著性差异。还观察到NC组的脾脏指数和胸腺指数与EPS组间均无显著性差异，可以说明BAP-1的摄入使得免疫抑制小鼠的胸腺指数和脾脏指数都升高至正常水平范围。
5.3B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响
(1)B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖免疫抑制小鼠脾淋巴细胞转化实验(ConA诱导的小鼠淋巴脾细胞转化实验)
1)用完全培养基将细胞浓度调整成3×106个/mL；
2)将每一份脾细胞悬液分成两孔加入到24孔板中，每孔1mL，一孔加入75μL ConA液(相当于7.5μg/mL)，另一个孔作为对照，置于37℃、含5％CO2孵箱中培养72h；
3)培养结束前4h，吸取细胞液，离心后，每孔轻轻吸去上清液，留存0.3mL，再加入0.3mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，每个孔作3个平行孔，分装到96孔板中，同时加入MTT溶液10μL/孔，继续培养4h；
4)培养结束后，轻轻吸取上清液，离心后取上清(完全不要沉淀)，加入200μL溶解液(DMSO)，吹打混匀，溶解板底形成的紫色结晶；
5)用酶标仪，以490nm波长测定光密度值(OD值)。
图12a)中所示为受试小鼠的脾淋巴细胞转化试验结果，所示数值为ConA诱导脾淋巴细胞增值OD差值。NC组和EPS组的脾淋巴细胞增值能力显著高于Model组(P<0.01)。
(2)B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠迟发型变态反应实验(绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH(足跖增厚法))
致敏：小鼠用2％(v/v)SRBC腹腔或静脉免疫，每只鼠注射0.2mL(约1×108个SRBC)。
DTH的产生与测定：免疫后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC，每只鼠20μL(约1×108个SRBC)，注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。
图12b)中所示为受试小鼠的迟发型变态反应试验结果，图中显示的是SRBC攻击前后的足跖肿胀程度。NC组的肿胀程度显著高于Model组(P<0.01)和EPS组(P<0.05)。Model组和EPS组之间不存在显著性差异。
5.4B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠体液免疫功能的影响
(1)B.amyloliquefaciensJM033胞外多糖对免疫抑制小鼠抗体生成细胞检测
1)用完全培养基将细胞浓度调整成5×108个/mL；
2)取新的6孔板，每孔加入1mL底层琼脂：1.4％琼脂加热融化(用含有酚红的Hank’s液)；
3)表层培养基：每个孔加1mL 0.7％琼脂加热融化(用含有酚红的Hank’s液)40-45℃，100μL 20％SRBC，100μL小牛血清(56℃，灭活30min)，100μL脾细胞悬液，100μL DEAD-右旋糖酐，100μL抗-Ig血清，迅速混匀，平铺在孔上，待琼脂凝固后，放入二氧化碳培养箱中孵育1～1.5h；
4)然后加入1mLSA缓冲液稀释的补体(1：5)加入到孔内，继续温育1～1.5h后，计数溶血空斑数。
采用Jerne改良玻片法对受试小鼠进行了抗体生成细胞检测，图13a)中显示的为各组受试小鼠测得的溶血空斑数。Model组的溶血空斑数均极显著低于NC组(P<0.01)和EPS组(P<0.01)。NC组和EPS组溶血空斑数之间没有显著性差异(P>0.05)。
(2)B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠血清溶血素测定
1)SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。
2)免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。
3)凝集反应用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入100μL0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。
采用血凝法对受试小鼠进行血清溶血素的测定，图13b)所示为各组受试小鼠的抗体水平。Model组的抗体水平均极显著低于NC组(P<0.01)和EPS组(P<0.01)。NC组和EPS组抗体水平之间没有显著性差异(P>0.05)。
5.5B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞功能的影响
(1)B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠的碳廓清实验
给受试小鼠注射印度墨汁(10mg/kg)，在0min和10min分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL 0.1％Na2CO3溶液中，用分光光度计在600nm处测得吸光度(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。
以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。OD1为0min取血测得的吸光度，OD2为10min取血测得的吸光度，t1为0min，t2为10min。按下式计算吞噬指数a。
将印度墨汁经尾静脉注射进入小鼠体内，于不同时间点采集静脉血，以判断碳颗粒在小鼠体内被清除的速率。由于肝、脾重量会影响清除速率，以校正吞噬指数表示。图14a)显示，Model组的抗体水平均极显著低于NC组(P<0.01)和EPS组(P<0.01)。虽然BAP-1的摄入一定程度上提高了吞噬指数，但仍极显著低于NC组(P<0.01)。
(2)B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
小鼠巨噬细胞的激活：实验前4天给每只小鼠腹腔注射2％压积羊血红细胞0.2mL。用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液4mL/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2mL于试管内(或用注射器)。用1mL加样器吸取腹腔洗液0.5mL加入盛有0.5mL 1％鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器(装大针头)吸取0.5mL混合液，加入玻片的琼脂圈内。放置孵箱内37℃孵育15-20min。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1分钟，Giemsa液染色15min。用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40×显微镜计数吞噬率和吞噬指数。吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。
采用滴片法检测受试小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力，图14b),c)显示Model组的吞噬率和吞噬指数水平均极显著低于NC组(P<0.01)和EPS组(P<0.01)。图14d),e)显示EPS组中更多的巨噬细胞吞噬了鸡红细胞且平均每个巨噬细胞可以吞噬更多的鸡红细胞。虽然BAP-1的摄入一定程度上提高了吞噬率(P<0.01)和吞噬指数(P<0.05)，但仍显著低于NC组。
5.6B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠的NK细胞活性测定
收集YAC-1细胞，将细胞浓度调整至4×105个/mL。无菌取脾，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×107个/mL。以效应细胞：靶细胞＝50：1的比例将这两种细胞加入U型96孔培养板中，以加靶细胞加培养液各100μL的孔作为靶细胞自然释放孔，以加靶细胞加入1％NP40各100μL的孔作为靶细胞最大释放孔，按照文献方法在490nm波长下测定各孔吸光度A值，并计算NK细胞活性(％)。
A0为对照孔吸光度，A1为试验孔吸光度，A2为最大释放孔吸光度。
将靶细胞(YAC-1细胞)和效应细胞(小鼠脾细胞)共孵育，通过检测培养基中LDH活性，观察小鼠脾细胞产生的NK细胞的杀伤活性。图15显示Model组的NK细胞杀伤活性均极显著低于NC组(P<0.01)和EPS组(P<0.05)。NC组和EPS组NK细胞杀伤活性之间没有显著性差异(P>0.05)。
6B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖对免疫抑制小鼠肠道菌群的影响研究
6.1肠道菌群分析
收集完成的各组小鼠盲肠内容物，按照粪便DNA提取试剂盒说明书进行总DNA提取，使用Quick Drop对DNA的浓度和纯度进行检测，使用16S rDNA的V3、V4区作为目标序列进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否合格，并用Illumina MiSeq测序仪进行上机测序，与Greengenes数据库进行对比，分析各组小鼠盲肠内容物样品的主要菌群组成和比例。
结果：BAP-1的摄入可以缓解免疫抑制小鼠的肠道菌群紊乱，使菌群组成向正常组转变。BAP-1的摄入可在门水平上显著提升有益菌如Verrucomicrobia的菌群丰度，同时降低潜在致病菌如Actinobacteria和Proteobacteria的菌群丰度。属水平上BAP-1的摄入可以显著提高免疫抑制小鼠肠道菌群中Akkermansia、Lachnospiraceae和Oscillospiracea等可以产生短链脂肪酸的下一代益生菌的菌群丰度。
6.2短链脂肪酸测定
称取盲肠内容物0.50±0.01g，加1mL纯水，涡旋10s。经粪便处理仪处理，配制成浓度为10％的悬浊液。取0.5mL悬浊液和100μL巴豆酸偏磷酸溶液于1.5mL无菌离心管中，-30℃冻结24h。解冻后于4℃，离心取上清(8000r/min，3min)，再用0.22μm水系滤膜过滤后采用气相色谱仪上机测定。进样量为1μL，色谱柱HP-FFAP(30m×250μm×0.25μm)。
结果：BAP-1的摄入还可以刺激免疫抑制小鼠的肠道中乙酸、丙酸和丁酸含量的显著升高。BAP-1具有潜在的通过调节肠道菌群进而影响宿主免疫的作用。具体地，图16中显示这各组受试小鼠肠道中短链脂肪酸含量的测定结果。与NC组相比可以观察到Model组小鼠乙酸、丙酸和丁酸含量在统计学上并无显著性差异。而摄入BAP-1的EPS组小鼠肠道中的乙酸、丙酸和丁酸含量与Model组相比显著升高(P<0.01，P<0.01，P<0.05)且含量比NC组更高。说明BAP-1的摄入对肠道中短链脂肪酸的产生具有较强的促进作用。
本实施例对B.amyloliquefaciens JM033胞外多糖产量的发酵条件优化：本研究中选定发酵时间、发酵温度和初始pH值三个指标首先进行单因素试验选定每个发酵条件的取值区间，后采用响应面优化设计。根据响应面优化设计结果，我们得知对于B.amyloliquefaciens JM033的EPS产量的影响力大小排序为：初始pH>发酵时间>发酵温度，并建立了关于EPS产量的预测拟合模型。根据预测结果结合实验验证得到最优发酵条件为50h为发酵时间、37℃为发酵温度、7.0为初始发酵pH，在此优化的发酵条件下，B.amyloliquefaciens JM033的EPS产量从0.75mg/mL提高到5.34mg/mL，增加了612％。
BAP-1的构效关系：本研究通过阴离子柱分离出两个组分的多糖(BAP-1和BAP-2)，选取B.amyloliquefaciens JM033所产EPS中含量60％以上且更易被肠道中菌群所利用的中性多糖组分(BAP-1)进行后续分析，分子量为17.6kDa。多糖中的单糖组成与其功能特性有很大关系，通过HPLC对其进行单糖组成分析，发现BAP-1主要由果糖(99.15％)和葡萄糖(0.85％)组成。BAP-1是一种中性的果聚糖。果聚糖在植物和微生物中是一类重要的多糖类物质，其存在形式和生物学功能都不同。β-2，1菊粉类型的果聚糖是众所周知的益生元并具有广泛的免疫调节特性，通常只含有β-2，1连接的果糖残基，最多含60个单体单位。另一种类型的果聚糖含有β-2，6-连接的果糖残基，由微生物产生的被命名为Levan，在植物中被称为β-2，6果聚糖。
BAP-1重复单元主链是13个(2→1)链接的β-D-呋喃果糖，支链是(2→6)链接的β-D-呋喃果糖。所以BAP-1是一种新的混合型果聚糖，主链是菊糖型，侧链是左聚糖型。三维结构与Levan近似。Levan是一种罕见的非结构多糖，存在于几种微生物和少数几种植物中。这种多糖中果糖分子几乎完全由通过β-2，6碳连接的果糖残基组成，被包装成纳米尺寸的球形形式，使其具有非常低的特性粘度，并且比线性同类分子更稳定。BAP-1三维结构也近似球形，性质上也较稳定，表观观察BAP-1属于片层多孔网状，孔多且大，可能更有利于与受体接触发挥生物学活性。
BAP-1体外免疫调节能力分析：研究结果显示，与空白组相比，100-1000μg/mL的多糖对巨噬细胞免疫活性物质的分泌有一定的促进作用。BAP-1的免疫活性仅在一定浓度范围内呈剂量依赖关系，这可能与高浓度多糖处理的巨噬细胞的细胞凋亡或免疫调节有关。与脂多糖组相比，多糖对RAW264.7细胞吞噬中性红和分泌IL-6的作用优于对NO和TNF-α的分泌。
BAP-1体内对免疫抑制小鼠免疫能力调节的作用机制：CTX是一种可以导致DNA交联的烷化剂类抗肿瘤药物，因为是细胞毒性免疫抑制剂。因为来源广泛且成本较低，CTX是临床应用上使用最广泛的化疗药物之一。CTX本身没有烷化和细胞毒化作用，其经机体吸收之后在肝脏中进行代谢产生多种产物后发挥相关作用。在代谢产物中存在氮芥和丙烯醛这两种毒性代谢产物，氮芥是一种活泼的烷化剂具有很强的细胞毒性，丙烯醛能够使细胞色素p450发生变性，这也是在大剂量给药CTX向病人后产生心、肺毒性的原因，严重还可导致出血性膀胱炎和肾损伤。代谢产生的磷酰胺氮芥能够与细胞内的DNA交联并破坏DNA，从而非特异性的破坏免疫母细胞。因而，在免疫药理学上通过连续过量给小鼠注射CTX来杀死健康的免疫细胞，并阻止巨噬细胞、B和T淋巴细胞的增殖和分化进而抑制小鼠的细胞免疫和体液免疫等能力，这种方法被广泛用于诱导免疫抑制模型。我们连续3天注射过量的CTX给小鼠建立免疫抑制模型，从体重、脾脏系数和胸腺系数这三个指标上与NC组相比，在Model组我们都观察到了显著的下降(P<0.5，P<0.01，P<0.5)。胸腺和脾脏是宿主体内最重要的外周免疫器官，脾脏主要是通过其中成熟的T、B淋巴细胞发挥免疫应答作用，胸腺又是T淋巴细胞的分化主要场所，所以免疫器官指数的测定是反应机体免疫调节活性能力强弱的重要指标之一。体重在建模初期Model组和EPS组小鼠体重产生了明显的下降，而NC组小鼠体重正常增加。随着实验的进行Model组和EPS组小鼠体重开始回升，但Model组小鼠体重上升速率仍然较慢，EPS组小鼠体重上升速度较Model组更快。试验结束后NC组小鼠增重显著高于(P<0.05)Model组，喂食BAP-1后的小鼠增重较Model有一定程度的增加，且NC组和EPS组小鼠增重值间不具有显著性差异(P>0.05)。顾婷通过CTX诱导建立免疫抑制小鼠模型，显著降低了小鼠的胸腺和脾脏指数，后喂食美洲大蠊糖蛋白，不同程度的提高了小鼠的脾脏和胸腺指数。综上可以初步得出喂食BAP-1可以在一定程度上增加免疫抑制小鼠的体重、胸腺指数和脾脏指数，进而提高小鼠的免疫能力。
BAP-1对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响：本研究中通过脾淋巴细胞转化实验和迟发型变态反应实验分析BAP-1对免疫抑制小鼠细胞免疫应答的影响。因为脾中既含有B淋巴细胞又含有T淋巴细胞，所以脾淋巴细胞增殖一直作为鉴定动物机体细胞免疫反应状况的直接方法。绵羊红细胞(SRBC)诱导小鼠DTH(足跖增厚法)是SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4天后，当再以SRBC攻击时，攻击部位出现肿胀，其肿胀程度可反映小鼠细胞免疫应答能力。在本研究中免疫抑制小鼠的脾淋巴细胞增殖能力足跖肿胀度与NC组相比均显著下降(P<0.01)。虽然BAP-1的摄入在数值上能观察到在一定程度上提高了两个指标对应的数值，但与Model组相比EPS组相应指标的提升均不存在统计学上的显著性差异(P>0.05)。综上BAP-1的摄入对免疫抑制小鼠的细胞免疫应答能力不存在显著性提升。
BAP-1对免疫抑制小鼠体液免疫功能的影响：本研究通过抗体生成细胞检测和血清溶血素测定分析BAP-1对免疫抑制小鼠体液免疫应答的影响。因为SRBC是一种可以刺激B淋巴细胞产生抗体的抗原，所以可以通过注射RBC攻击动物来评价CTX和BAP-1对动物机体长生抗体能力的影响。本研究中，CTX的处理使得Model组小鼠与NC组相比抗体产生能力均显著下降(P<0.01)，失去产生SRBC抗体的潜力，并表现出极低的血凝效价。然而BAP-1的摄入使得EPS组小鼠的抗体细胞生成数显著高于Model组(P<0.01)。有研究表明，龙须菜的黄酮成分可以显著增强免疫抑制大鼠的体液免疫反应，其主要表现为提高血凝效价。血清溶血素的测定是对药物增强机体体液免疫能力的定量测定方法，当体液免疫增强时可以通过初级补体途径来增强对SRBC的溶血能力。在本研究中，免疫抑制小鼠的脾细胞对SRBC的溶血作用显著降低(P<0.01)，而BAP-1的摄入显著增强了免疫抑制小鼠的脾细胞对SRBC的溶血作用(P<0.01)。这项研究的结果与天然酚类化合物3，4-二羟基肉桂酸在100mg/kg剂量下增强免疫抑制小鼠的溶血活性，并刺激小鼠的体液免疫反应的结论相一致。综上说明BAP-1的摄入可以显著提高免疫抑制小鼠的体液免疫应答能力。
BAP-1对免疫抑制小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响：本研究通过碳廓清实验和腹腔巨噬细胞吞噬及红细胞实验分析BAP-1对单核-巨噬细胞功能的影响。单核-巨噬细胞能力属于非特异性免疫，碳的清除率值与巨噬细胞的吞噬反应成正比。本研究中CTX的处理显著降低了小鼠的单核-巨噬细胞吞噬功能(P<0.01)，而BAP-1的摄入显著提升了免疫抑制小鼠的碳廓清除速率与巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数(P<0.01)。研究表明儿茶素的使用可以显著增强免疫抑制大鼠的巨噬细胞吞噬作用。综上说明BAP-1的摄入可以显著增强免疫抑制小鼠的单核-巨噬细胞功能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）JM033，其特征在于，保藏于广东省微生物菌种保藏中心保藏，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCC NO：62989。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JM033产胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01，解淀粉芽孢杆菌JM033胞外粗多糖的制备：以蔗糖作为碳源，在37℃，pH为7.0的条件下发酵50h，接种量为2%、摇床转速为180 rpm/min进行发酵的发酵液，经20000g离心15min；取上清液加入3倍体积提前预冷却至4℃的无水乙醇，于4℃静置沉淀48h；经12000 g离心15 min后取沉淀；将沉淀溶解于适量去离子水中，去离子水的加入量相当于沉淀的10倍体积，获得混悬液，加入相当于混悬液1/4体积的Sevage试剂，混匀后以180 rpm震荡2 h，离心，取水相并重复将沉淀溶解于适量去离子水中，去离子水的加入量相当于沉淀的10倍体积，获得混悬液，加入相当于混悬液1/4体积的Sevage试剂，混匀后以180 rpm震荡2 h，离心操作，直至水相与有机相的交界处没有蛋白存在，将水相置于透析袋中，透析袋截留分子量为8000-13000 Da，透析3 d，每8 h换水，透析液进行真空冷冻干燥，最后获得粗多糖样品；
S02，离子交换纯化：粗多糖样品被应用于DEAE-纤维素柱，粗多糖样品用蒸馏水溶解后上样，以4mL/min的速度依次用蒸馏水洗脱，然后用0.1 mol/L、0.2mol/L和0.3mol/L氯化钠洗脱；收集蒸馏水洗脱的馏分，浓缩，用蒸馏水透析48-72h，透析袋截留分子量为3000 Da，获得BAP-1粗品；
S03，凝胶纯化：将BAP-1粗品加载到Sephacryl S-400 HR柱上，BAP-1粗品用蒸馏水溶解后上样，用蒸馏水洗脱60个柱体积，流速为1.0 mL/min，收集每个柱体积获得的溶液并检测多糖的含量和纯度，合并多糖纯度≥90%的组分，冻干，获得BAP-1。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，DEAE-纤维素柱为26mm×400mm；每15mL接一管，蒸馏水洗脱液接26管，0.1mol/L氯化钠洗脱液接13管，0.2mol/L氯化钠洗脱液接10管，0.3mol/L氯化钠洗脱液接10管。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，Sephacryl S-400 HR柱为26 mm×1000 mm。
5.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JM033在制备免疫调节药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JM033在制备缓解免疫抑制肠道菌群紊乱药物中的应用。
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