CN107586742A - 一株高产果聚糖的解淀粉芽胞杆菌及其应用 - Google Patents

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本发明提供一株高产果聚糖的解淀粉芽胞杆菌及其应用，其B.amyloliquefaciens 66在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.14363。该菌株作为饲用益生菌剂产生功能性果聚糖作为良好的免疫激活剂，能有效提高饲喂生物干扰素和巨噬细胞的活性，通过产生非特异性免疫调节因子激发生物机体免疫功能，增强其机体免疫力和抗病性。菌株在生长过程中还可产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶等消化酶类，加强宿主体内的营养代谢。同时，B.amyloliquefaciens 66发酵生产胞外果聚糖的产量高达100g/L。因此，本发明公开的菌株amyloliquefaciens 66不仅在饲料添加剂领域具有很好的应用潜力，在生物医药和功能食品等领域也显示了巨大的开发潜能和市场价值。

Description

一株高产果聚糖的解淀粉芽胞杆菌及其应用
技术领域
本发明属于饲料添加剂及生物技术领域，涉及一株高产果聚糖的解淀粉芽胞杆菌及其应用。
背景技术
芽胞杆菌菌剂是目前畜牧养殖业中应用较为广泛的益生菌制剂。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)属于革兰氏阳性、好氧型杆状细菌，是公认安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)菌株。该菌种在自然界中分布广泛，其产生的次生代谢产物种类多，抑菌活性强、抑菌谱广，同时具有激活免疫、促生长等功能特性，显示了很好的饲用益生菌的应用潜力。然而，目前市场上大部分益生菌剂标注的功能虽全，但对有效成为的说明并不清晰，至今只是以活菌数定义产品质量，导致各类益生菌的作用效果参差不齐，并没有统一质量标准。本发明开发的益生菌株B.amyloliquefaciens 66不但证明具有很好的益生菌功效，同时对其主要功能代谢产物-果聚糖进行了鉴定，通过稳定的发酵控制，可达到理想的益生菌效果。
微生物来源的胞外多糖具有抗肿瘤、抗糖尿病、降血脂、提高免疫力等多种生物学功能，然而目前产率成为制约其应用的主要因素。如来源于冬麦的解淀粉芽孢杆菌的胞外多糖能够抑制胃癌细胞MC-4和SGC-7901生长活性；来源于解淀粉芽孢杆菌LPL061的多糖具有免疫调节作用，但其发酵产率仅为4.46g/L；Cellulomonas sp.GJT07发酵优化后果聚糖产量为15g/L。而本发明的菌株B.amyloliquefaciens 66发酵产果聚糖产量可达100g/L。因此，本发明的菌株B.amyloliquefaciens 66不仅在饲料添加剂领域具有很好的应用潜力，在生物医药和功能食品等领域也显示了巨大的开发潜能和市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株高产果聚糖的解淀粉芽胞杆菌及其应用。
本发明目的之一是提供一株解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens66)，保藏编号为CGMCC No.14363。本发明目的之二是提供一种菌剂的生产方法，其特征在于，培养权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens 66)CGMCCNo.14363，其培养基成分为蔗糖300-500g/L，可溶性淀粉25-30g/L，酵母浸粉5-10g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，氯化钠5-10g/L，氯化钙0.1-0.3g/L，硫酸锌0.01-0.03g/L，硫酸亚铁0.01-0.03g/L，硫酸锰0.05-0.1g/L和硫酸镁0.3-1g/L；其培养条件为，温度为30-37℃，pH为6.0-7.0，通气800-1000L/m，发酵罐转速150-350rpm，溶氧20-40％，培养24-28h。
在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，其培养基成分为发酵培养基成分为500g/L蔗糖、25g/L可溶性淀粉、5g/L酵母浸粉、磷酸氢二钾1g/L、氯化钠5g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸锌0.03g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.05g/L和硫酸镁0.3g/L；其培养条件为，温度为37℃，pH为7.0，通气800-1000L/m，发酵罐转速150-350rpm，溶氧30％，培养24h。
本发明目的之三是提供一种菌剂，其特征在于包含本发明目的之一所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens 66)或本发明目的之二所述方法制备的菌剂。
在优选的实施方式中，所述的菌剂为液态或固态。
在更优选的实施方式中，所述的菌剂，其特征在于所述菌剂的活菌数不低于1*1010CFU/ml。
在优选的实施方式中，所述的菌剂，其特征在于所述菌剂的活菌数不低于1*1010CFU/ml。
本发明目的之四是提供一种果聚糖的生产方法，收集本发明目的之二所述的方法得到的菌剂中的果聚糖。
在优选的实施方式中，所述的生产方法，其特征在于，所述菌剂中果聚糖含量不低于100g/L。
本发明目的之五是本发明目的之一所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens 66)或本发明目的之三所述的菌剂在生产果聚糖或生产饲料添加剂中的应用。
本发明采用以下技术方案：
(1)本发明提供的具有益生菌功能的解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens66)，已于2017年06月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌株保藏，并证明了存活，其保藏登记号为CGMCCNo.14363。保存地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
(2)B.amyloliquefaciens 66发酵培养条件如下：
发酵培养基成分为300-500g/L蔗糖、25-30g/L可溶性淀粉、5-10g/L酵母浸粉、磷酸氢二钾1-5g/L、氯化钠5-10g/L、氯化钙0.1-0.3g/L、硫酸锌0.01-0.03g/L、硫酸亚铁0.01-0.03g/L、硫酸锰0.05-0.1g/L和硫酸镁0.3-1g/L。
培养条件：37℃、pH7.0，初始通气800L/m(最大为1500L/m)，初始转速150rpm(最大转速为350rpm)。设定转速串联溶氧(30％)。
(3)本发明的菌株B.amyloliquefaciens 66的发酵代谢主要功能产物为功能性多糖，在功能性多糖中以果聚糖含量最高，致使该菌株的发酵产品具有免疫激活剂作用，激发生物机体免疫功能，增强其机体免疫力和抗病性。以此为基础开发成饲用益生菌剂，具有很好的益生效果；同时由于B.amyloliquefaciens 66发酵产果聚糖的胞外产量高达100g/L，可以作为果聚糖的生产菌株，进一步应用于生物医药和功能食品领域。
本发明开发的一株高产果聚糖的解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens 66)，其优点主要体现在：(1)发酵培养条件简单，发酵周期短、成本低；(2)该菌株发酵活菌数高(≥1*1010CFU/ml)，同时高产功能性多糖，其中果聚糖含量达到100g/L；(3)应用范围广，不仅可作为益生菌应用于饲料添加剂，还可作为果聚糖生产菌株，应用于生物医药和功能食品领域。
因此，本发明开发的菌株B.amyloliquefaciens 66极具应用潜力和市场开发前景。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1 B.amyloliquefaciens 66液体发酵(1T发酵罐)
1、一级种子液制备：取甘油管中保存的菌液按照2‰的接种量接种于20mL LB培养基中，37℃、220rpm震荡培养10～12h。
2、二级种子液制备：将一级种子液按照2％的接种量接种于200mL LB培养基中，37℃、200rmp震荡培养10～12h。
3、三级种子液制备：将二级种子液接种至5L发酵培养基中37℃、pH7.0培养至DO上升。
4、100L种子液制备：将三级种子液接种至100L发酵培养基中37℃、pH7.0培养。罐压0.05MPa，通气150～300L/m，初始转速150rpm。设定转速串联溶氧(40％)，最高转速450rpm。培养至溶氧开始上升，pH偏碱时，进行移种。
5、1000L罐发酵：配制300L(灭菌后400L)发酵培养基115℃灭菌。将100L种子液移种至1000L发酵罐中，恒温37℃、pH7.0，初始通气800L/m(最大为1500L/m)，初始转速150rpm(最大转速为350rpm)。设定转速串联溶氧(30％)。
6.计数与检测：在发酵过程中每隔6h取一份菌液样品，检测OD600数值，以10为梯度分别稀释至一定倍数后进行平板涂布，放入37℃温箱培养9h后计数。一份直接涂布，另一份80℃水浴10min以后再涂布。
发酵培养基成分为500g/L蔗糖、25g/L可溶性淀粉、5g/L酵母浸粉、磷酸氢二钾1g/L、氯化钠5g/L、氯化钙0.3g/L、硫酸锌0.03g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.05g/L和硫酸镁0.3g/L。
发酵24h后活菌数达到1＊1010-1＊1011CFU/ml；发酵液中功能多糖(果聚糖)含量≥100g/L。
实施例2菌株B.amyloliquefaciens 66应用特性检测
表1 B.amyloliquefaciens 66性能及其与市售商品的指标对比
注：★对应相对酶活，★越多表示酶活越高。
可见，与现售商品益生菌剂相比，B.amyloliquefaciens 66菌株具有活菌数高，菌种性能强，生产成本低等诸多优势。
实施例3 B.amyloliquefaciens 66液体菌剂对母猪繁殖及育仔性能的影响
选择胎次接近、健康状况良好的长白哺乳母猪48头，平均分成两组，每组24头，实验从产仔前30天至哺乳仔猪22日龄断奶结束，对照组为基础日粮，益生组每日添加1ml益生菌剂。结果见下表：
表2 B.amyloliquefaciens 66液体菌剂对母猪繁殖及育仔性能的影响
由以上结果可见，与对照组相比，饲喂B.amyloliquefaciens 66液体菌剂的母猪生产平均健仔数相对高，弱仔及死胎率相对低，平均窝重提高了28.8％，说明该益生菌剂对母猪生产具有显著的有益效果；同时，平均断奶窝重也较对照组提高了18％，通过观察，饲喂益B.amyloliquefaciens 66液体菌剂的仔猪精神头相对特别足，显著缓解仔猪腹泻，可见本菌剂具有显著提高母猪及仔猪免疫力的功效。
实施例4 B.amyloliquefaciens 66液体发酵产果聚糖
分别以400g/L的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、果糖为发酵培养基中的部分碳源成分，其他成分不变。以2％的接种量于37℃、200r/min条件下培养24h，以果聚糖产量为衡量指标，结果如下：
表3不同小分子糖对B.amyloliquefaciens 66发酵产果聚糖的影响
由以上结果可见，B.amyloliquefaciens 66发酵高效生产果聚糖需以蔗糖为主要的培养基底物成分，所产解淀粉芽胞杆菌果聚糖产量可达108.8g/L。
实施例5解淀粉芽胞杆菌果聚糖部分生物活性检测
本发明采用常见的DPPH自由基清除，ABTS自由基清除与铁还原能力评价化解淀粉芽孢杆菌果聚糖抗氧化性。
(1)ABTS自由基清除能力测试：100μL样品溶液与3000μL由磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH7.4)稀释的ABTS自由基溶液(其在734nm处吸光值为0.70±0.02)快速混匀后，避光反应6min，测定反应液在734nm处的吸光度。按照公式(1)计算ABTS自由基清除率：
ABTS自由基清除率(％)＝(Ablank-Asample)/Ablank×100 式(1)
式中：Ablank为空白样品吸光度；Asample为测试样品吸光度。
解淀粉芽胞杆菌果聚糖测试浓度为25mg/mL。
(2)DPPH自由基清除能力测试：1mL样品溶液、1mL由无水乙醇配制0.2mmol/L的DPPH溶液和1mL二次水快速混匀后，避光反应30min，测定反应液在517nm处的吸光值。按照公式(2)计算DPPH自由基清除率：
DPPH自由基清除率(％)＝(Ablank-Asample)/Ablank×100 式(2)
式中：Ablank为空白样品吸光度；Asample为测试样品吸光度。
解淀粉芽胞杆菌果聚糖测试浓度为10mg/mL。
(3)铁还原能力测试：取100μL样品溶液与3mL铁还原(FRAP)试剂混匀后于37℃水浴中反应5min，测定593nm处吸光值。同时取浓度0～1.0mmol/L的FeSO4溶液各100μL代替样品反应，以593nm处吸光值为纵坐标，FeSO4浓度为横坐标，制作标准曲线。通过标准曲线计算样品对应的FeSO4浓度，表示铁还原能力。
(4)抗肿瘤活性测试：采用MTT法测试多糖对体外培养的宫颈癌细胞Hela的抑制活性。用取3mg/mL解淀粉芽胞杆菌果聚糖作为实验样品，取对数生长期的Hela细胞，以5×104个/mL的密度接种于96孔板内，每孔100μL，于37℃、5％CO2培养箱中孵育24h使细胞完全贴壁。移除培养基，加入果聚糖样品100μL，实验设3个平行孔。继续培养24h，然后每孔加入10μL的MTT溶液，其终浓度为0.5mg/mL，继续孵4h后，4500r/min离心10min，弃去上清，加入150μL DMSO，溶解活细胞与MTT生成的甲瓒，37℃震荡10min，利用酶标仪测定其在490nm的吸光值。按照式(3)计算细胞抑制率：
抑制率(％)＝(A0-A)/A0×100 式(3)
式中：A0为阴性对照组吸光度；A为测试样品组吸光度。
测试结果如下：
表4解淀粉芽胞杆菌果聚糖抗氧化能力及抗肿瘤活性
由以上结果可见，本发明菌株B.amyloliquefaciens 66生产的果聚糖具有很好的抗氧化和抗肿瘤活性，显示了良好的应用前景。
以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，对于本领域普通技术人员来说，在不脱离所附权利要求限定的精神和范围情况下，可做成许多修改、变化或等效，但都将落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一株解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens 66)，保藏编号为CGMCCNo.14363。
2.一种菌剂的生产方法，其特征在于，培养权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens 66)CGMCC No.14363，其培养基成分为蔗糖300-500g/L，可溶性淀粉25-30g/L，酵母浸粉5-10g/L，磷酸氢二钾1-5g/L，氯化钠5-10g/L，氯化钙0.1-0.3g/L，硫酸锌0.01-0.03g/L，硫酸亚铁0.01-0.03g/L，硫酸锰0.05-0.1g/L和硫酸镁0.3-1g/L；其培养条件为，温度为30-37℃，pH为6.0-7.0，通气800-1000L/m，发酵罐转速150-350rpm，溶氧20-40％，培养24-28h。
3.一种菌剂，其特征在于包含权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens 66)或权利要求2所述方法制备的菌剂。
4.权利要求3所述的菌剂，其特征在于所述菌剂为液态或固态。
5.权利要求3或权利要求4所述的菌剂，其特征在于所述菌剂的活菌数不低于1*1010CFU/ml。
6.一种果聚糖的生产方法，收集权利要求2所述的方法得到的菌剂中的果聚糖。
7.权利要求6所述的果聚糖的生产方法，其特征在于，所述菌剂中果聚糖含量不低于100g/L。
8.权利要求1所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens 66)或权利要求3-5任一所述的菌剂在生产果聚糖或生产饲料添加剂中的应用。
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