CN103756935B

CN103756935B - 一种双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基及发酵方法

Info

Publication number: CN103756935B
Application number: CN201410001755.3A
Authority: CN
Inventors: 符雷; 郗洪生; 严涛
Original assignee: JIANGSU HENGFENGQIANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: JIANGSU HENGFENGQIANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-01-02
Filing date: 2014-01-02
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2034-01-02
Also published as: CN103756935A

Abstract

本发明公开了一种双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基，其配方包括：水溶性鱼粉，0.5-2g/L；水溶性大豆粉，1-5g/L；高氮玉米浆干粉，2-8g/L；高氮糖蜜酵母粉，30-50g/L；葡萄糖，10-20g/L；乳糖，1-2g/L；乙酸钠，0.1-0.3g/L；吐温-80，2-4g/L；柠檬酸铁铵，5-20mg/L；硫酸锰，5-15mg/L；氯化铁，30-50mg/L。用该培养基混合上罐培养双歧杆菌和乳酸杆菌，活菌数能达0.6-2.0×10¹⁰cfu/ml。该培养基成本低廉，制作过程简单。本发明混合发酵方法采用优化的培养基和优化的补料培养基成分、比例，充分发挥两种菌间的协同作用，降低生产成本，提高设备利用率。

Description

一种双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基及发酵方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基及其发酵方法。

背景技术

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。

乳酸杆菌和双歧杆菌在大量培养生产的情况下，培养基费用占生产成本比重大，而且生产成本难以降低。所以在生产制备菌体过程中，廉价经济的培养基显的格外重要。不同属的微生物培养所需的营养物质不尽相同，同时培养时容易产生拈抗作用。国内外也有少量文献报道双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵方法，但是都有其不足，例如成本太高、或活菌数太低等。因此，亟需一种低成本培养基混合发酵出高活菌数的方法。

发明内容

针对现有生产工艺的不足，本发明提供了一种乳酸杆菌和双歧杆菌的混合发酵培养基，及利用该培养基在优化条件下的混合发酵方法。

本发明提供了一种双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基，其原料及含量为：水溶性鱼粉，0.5-2g/L；水溶性大豆粉，1-5g/L；高氮玉米浆干粉，2-8g/L；高氮糖蜜酵母粉，30-50g/L；葡萄糖，10-20g/L；乳糖，1-2g/L；乙酸钠，0.1-0.3g/L；吐温-80，2-4g/L；柠檬酸铁铵，5-20mg/L；硫酸锰，5-15mg/L；氯化铁，30-50mg/L。

本发明所述乳酸杆菌和双歧杆菌混合发酵的方法，包括步骤：

(1)分别取乳酸杆菌、双歧杆菌在培养基中活化培养。其包括：乳酸杆菌的活化，取用试管保存的菌种一支，用2ml无菌水冲洗下菌体，吸取1ml菌液注入250ml容量瓶中的100ml活化培养基(即，本发明的双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基)中，37℃静置培养12h；双歧杆菌的活化，取用试管保存的菌种一支，用2ml无菌水冲洗下菌体，吸取1ml菌液注入250ml容量瓶中的100ml活化培养基(即，本发明的双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基)中，37℃静置培养16h；

(2)取步骤1的双歧杆菌接种到培养基上，接种量为1％，37℃培养14-22h；取步骤1的乳酸杆菌接种到培养基上，接种量为1％，37℃培养12-22h；

(3)将步骤2制备的双歧杆菌和乳酸杆菌按体积比1-3％∶1-5％的混合比例接种上罐，37℃，pH6.5，采用流加补料培养基，补料培养基中葡萄糖为上罐总用葡萄糖的2倍，发酵14-22h放罐。

优选的，本发明双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵方法中采用培养基配方如下：

115℃灭菌20min，待用。

上述双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵方法中，补料培养基中成分比为水溶性鱼粉∶水溶性大豆粉∶高氮玉米浆干粉∶高氮糖蜜酵母粉∶葡萄糖∶乳糖∶乙酸钠＝1∶1∶2∶15∶7∶1∶0.05，其中葡萄糖为上罐总用葡萄糖的2倍，其他成分按此比例基准换算。其中，上罐总用葡萄糖是指除补料外进罐的葡萄糖，如上罐发酵10L，总葡萄糖为140g，补料为其2倍，即280g。

本发明双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基(简称HFQ培养基)由以下成分组成：水溶性鱼粉，0.5-2g/L；水溶性大豆粉，1-5g/L；高氮玉米浆干粉，2-8g/L；高氮糖蜜酵母粉，30-50g/L；葡萄糖，10-20g/L；乳糖，1-2g/L；乙酸钠，0.1-0.3g/L；吐温-80，2-4g/L；柠檬酸铁铵，5-20mg/L；硫酸锰，5-15mg/L；氯化铁，30-50mg/L，初始pH6.0-7.5。利用本发明培养基对双歧杆菌和乳酸杆菌混合上罐培养，双歧杆菌和乳酸杆菌活菌数能达0.6-2.0×10¹⁰cfu/ml。本发明培养基成本低廉，制作过程简单，提高设备利用率，适合双歧杆菌和乳酸杆菌的工业化规模生产。

本发明所提供的双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵方法，特别适合双歧杆菌和乳酸杆菌相关微生态制剂的液体发酵生产，本发明方法的显著优点是：将双歧杆菌和乳酸杆菌进行混合上罐发酵，采用优化的培养基和优化的补料培养基成分、比例，充分发挥两种菌间的协同作用，降低生产成本，提高设备利用率。

附图说明

图1表示乳酸杆菌和双歧杆菌一级种子生长曲线；

图2表示乳酸杆菌和双歧杆菌二级种子生长曲线；

图3表示双歧杆菌和乳酸杆菌混合及单独上罐发酵生长曲线(HFQ培养基)。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

一、实验步骤

本实施例中，乳酸杆菌为短乳酸杆菌，双歧杆菌为动物双歧杆菌乳亚种，均由内蒙古畜牧科学院提供，水溶性鱼粉、水溶性大豆粉、高氮玉米浆干粉和高氮糖蜜酵母粉，均采购与山东新隆亚工贸有限公司，葡萄糖和乳糖均为工业级，采购于上海丽臣商贸有限公司，柠檬酸铁铵、硫酸锰和氯化铁，采购于国药集团化学试剂有限公司。

1.对本发明双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基(HFQ培养基)的主要碳源和氮源进行正交试验设计，如表1和表2所示，配制编号为1-9的培养基，每个500ml锥形瓶中装400ml，同时测量其OD₆₀₀(600nm吸光度)，1-9号培养基中其它成分为：水溶性鱼粉，1g/L；乳糖，1g/L；乙酸钠，0.1g/L；吐温-80，2g/L；柠檬酸铁铵，10mg/L；硫酸锰，10mg/L；氯化铁，40mg/L。

2.乳酸杆菌的活化，取一支4度保存的斜面菌种，吸取2ml无菌水冲洗，吸取1ml菌悬液接入活化MRS培养基中(250ml锥形瓶装液量为100ml，下同)，37℃静置培养。

其中，活化MRS培养基配方为(每升)：酪蛋白胨10.0g，牛肉浸取物10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温-801.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，碳酸钙20.0g，高氮玉米浆干粉1.0，水溶性大豆粉1.0g，水溶性鱼粉0.5g，高氮糖蜜酵母粉10g，乳糖1.0g。

3.双歧杆菌的活化，取一支4度保存的斜面菌种，吸取2ml无菌水冲洗，吸取1ml菌悬液接入活化MRS培养基中，37℃静置培养。

4.取上述一级种子液接入到1-9号培养基中，每个瓶中双歧杆菌接入12ml(接种量3％)，乳酸杆菌接入8ml(接种量2％)，37℃静置培养12小时，测量OD₆₀₀。

表1正交试验水平(单位g/L)

因素名称	水溶性大豆粉	高氮玉米粉	高氮糖蜜酵母粉	葡萄糖
					水平1	1	2	30	10
水平2	2.5	5	40	15
					水平3	5	8	50	20

表2正交试验表设计(单位g/L)

所在列	1	2	3	4
					因素名称	水溶性大豆粉	高氮玉米粉	高氮糖蜜酵母粉	葡萄糖
1号	1	2	30	10
					2号	1	5	40	15
3号	1	8	50	20
					4号	2.5	2	40	20
5号	2.5	5	50	10
					6号	2.5	8	30	15
7号	5	2	50	15
					8号	5	5	30	20
9号	5	8	40	10

二、实验结果

因为不同OD₆₀₀的活菌数不同，且OD₆₀₀的活菌数成正比关系，即OD₆₀₀越高，其中的活菌数也就越高，编号1-9号培养基的试验结果如表3，可以看出最佳水平为6号，OD₆₀₀差值为29，其配方为水溶性大豆粉2.5g/L，高氮玉米粉8g/L，高氮糖蜜酵母粉30g/L，葡萄糖15g/L，水溶性鱼粉，1g/L，乳糖，1g/L，乙酸钠，0.1g/L，吐温-80，2g/L，柠檬酸铁铵，10mg/L，硫酸锰，10mg/L，氯化铁，40mg/L。其中水溶性大豆粉、高氮玉米粉和葡萄糖所选3个水平中存在最优点，而随着高氮糖蜜酵母粉含量提高OD₆₀₀还有上升的趋势，所用对其进行进行单因素优化，之后得到最优为40g/L。最后对HFQ培养基其它成分进行单因素优化分析，得到了HFQ培养基各组分的大致应用范围，水溶性鱼粉，0.5-2g/L；水溶性大豆粉，1-5g/L；高氮玉米浆干粉，2-8g/L；高氮糖蜜酵母粉，30-50g/L；葡萄糖，10-20g/L；乳糖，1-2g/L；乙酸钠，0.1-0.3g/L；吐温-80，2-4g/L；柠檬酸铁铵，5-20mg/L；硫酸锰，5-15mg/L；氯化铁，30-50mg/L。

根据以上实验结果表明，本发明中优选的培养基组成为高氮玉米浆干粉8.0g/L，水溶性大豆粉2.5g/L，水溶性鱼粉0.5g/L，高氮糖蜜酵母粉40g/L，葡萄糖15g/L，乳糖1.0g/L，乙酸钠0.1g/L，吐温3.0g/L，柠檬酸铁铵10mg/L，硫酸锰11mg/L，氯化铁47mg/L。

表3 1-9号培养基OD₆₀₀差值

培养基	1号	2号	3号	4号	5号	6号	7号	8号	9号
										OD₆₀₀差值	21	27	25	27	22	29	26	25	23

实施例2

一、实验步骤

1、乳酸杆菌的活化，取一支4度保存的斜面菌种，吸取2ml无菌水冲洗，吸取1ml菌悬液接入HFQ培养基和MRS培养基中(250ml锥形瓶装液量为100ml，下同)，37℃静置培养。其中，HFQ培养基配方为：

本实验采用现有MRS培养基作为对照组，其配方为(每升)：酪蛋白胨10.0g，牛肉浸取物10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温-801.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，碳酸钙20.0g。

2、双歧杆菌的活化，取一支4度保存的斜面菌种，吸取2ml无菌水冲洗，吸取1ml菌悬液接入HFQ液体培养基和MRS培养基中，37℃静置培养。

3、活化后的一级种子接种二级种子：吸取上述制备的一级种子液各12ml，接入到HFQ培养基和MRS培养基中(500ml锥形瓶装液量为400ml)，37℃静置培养。

4、配制8LHFQ培养基，上罐115℃30min，灭菌3h后用6MNaOH调节pH到6.5，同时用补料瓶配制好补料培养基，连接好管道，在高压锅中115℃20min，待用，待二级种子发酵9h时，接入罐体中(接种量说明，HFQ培养基混合发酵时，双歧杆菌接入400ml，乳酸杆菌接入150ml，双歧杆菌和乳酸杆菌单独发酵时接种量都为5％，即400ml)，发酵8h后进行补料，每小时250ml，13小时后进行放罐，菌液进行活菌计数。其中，补料培养基配方为：水溶性鱼粉32g，水溶性大豆粉32g，高氮玉米浆干粉64g，高氮糖蜜酵母粉480g，葡萄糖224g，乳糖32g，乙酸钠1.6g，补料定容培养基为3L。本发明中，适用的补料培养基成分比为水溶性鱼粉∶水溶性大豆粉∶高氮玉米浆干粉∶高氮糖蜜酵母粉∶葡萄糖∶乳糖∶乙酸钠＝1-3∶1-3∶1-5∶10-20∶7-10∶1-2∶0.05-0.2，在该成分比例中均能得到理想的培养效果。补料培养基中，葡萄糖为上罐总用葡萄糖的2倍，其他成分按此比例基准换算。

5、配制8LMRS培养基，上罐115℃30min，灭菌3h后用6MNaOH调节pH到6.5，同时用补料瓶配制好补料培养基，连接好管道，在高压锅中115℃20min，待用，待二级种子发酵9h时，接入罐体中(双歧杆菌和乳酸杆菌单独发酵时接种量都为5％，即400ml)，发酵8h后进行补料，每小时250ml，13小时后进行放罐，菌液进行活菌计数。其中，补料培养基配方为：酪蛋白胨80g，牛肉浸取物80g，酵母粉40g，葡萄糖150g，补料定容培养基为3L。

6、采用MRS固体培养基(MRS液体培养基中每升加20g琼脂)进行稀释涂布平板计数法。

二、实验结果

1、一级种子生长曲线的测定结果如图1所示，可以看到双歧杆菌和乳酸杆菌(分别以HFQ培养基发酵)在18-20小时到达最大值。因此，一级种子的培养时间可以优选设定为19h。

2、二级种子生长曲线的测定结果如图2所示，可以看到双歧杆菌和乳酸杆菌(分别以HFQ培养基发酵)在8-10小时到达对数生长期中期。因此，二级种子的培养时间可以优选设定为9h。

3、双歧杆菌和乳酸杆菌的混合培养与分别单独培养(HFQ培养基)结果如图3，从图中可以看出，两种菌混合发酵比两种菌分别单独发酵生长迅速，混合发酵能在14h到达最大值，并在14-25h发酵时间中保持高水平发酵；而双歧杆菌和乳酸杆菌单独发酵都需20h以上才能达到最大值。再从OD₆₀₀差值来看，混合发酵的OD₆₀₀差为30，乳酸杆菌单独发酵OD₆₀₀差为18，乳酸杆菌单独发酵OD₆₀₀差为14，混合发酵的OD₆₀₀差为30与两种菌单独发酵的OD₆₀₀差和值近似持平，这能从侧面反映出混合发酵效果近似等于两种菌单独发酵效果。

4、不同发酵条件的活菌数如表4所示。从以上实验结果结合表4可见，采用HFQ培养基混合发酵双歧杆菌和乳酸杆菌比采用HFQ培养基单独对双歧杆菌、乳酸杆菌发酵的活菌数高，而且发酵时间缩短；采用HFQ培养基单独对双歧杆菌、乳酸杆菌发酵比MRS单独对双歧杆菌、乳酸杆菌发酵效果好，节省大量资源，表明本发明培养基亦适合只需生产一种菌的生产需要。

表4不同发酵条件的活菌数

	乳酸杆菌(cfu/ml)	双歧杆菌(cfu/ml)
			现有MRS培养基(单独培养)	7.8×10⁹	4×10⁹
本发明HFQ培养基(单独培养)	10.2×10⁹	8.3×10⁹
			本发明HFQ培养基(混合培养)	12×10⁹	8.9×10⁹

综上所述，应用本发明培养基混合发酵双歧杆菌和乳酸杆菌效果比单独发酵效果好，本发明培养基在发酵乳酸杆菌和双歧杆菌时比传统的MRS便宜、效果好，本发明培养基具有广阔工业应用前景。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims

1.一种双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基，其特征在于，其原料及含量为：水溶性鱼粉，0.5‐2g/L；水溶性大豆粉，1‐5g/L；高氮玉米浆干粉，2‐8g/L；高氮糖蜜酵母粉，30‐50g/L；葡萄糖，10‐20g/L；乳糖，1‐2g/L；乙酸钠，0.1‐0.3g/L；吐温‐80，2‐4g/L；柠檬酸铁铵，5‐20mg/L；硫酸锰，5‐15mg/L；氯化铁，30‐50mg/L。

2.如权利要求1所述的双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵培养基，其特征在于，其原料及含量为：

。

3.一种双歧杆菌和乳酸杆菌混合发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别取乳酸杆菌、双歧杆菌在如权利要求1所述的发酵培养基中活化培养；

(2)取指数生长后期的双歧杆菌接种到如权利要求1所述的发酵培养基上，接种量为1％，37℃培养14‐22h；

取指数生长后期的乳酸杆菌接种到如权利要求1所述的发酵培养基上，接种量为1％，37℃培养14‐22h；

(3)将步骤2制备的双歧杆菌和乳酸杆菌按体积比1‐3％:1‐5％的混合比例接种上罐，37℃，pH6.5，采用流加补料培养基，补料培养基中葡萄糖为上罐总用葡萄糖用量的2倍，发酵14‐22h放罐；

其中，所述发酵培养基成分为：水溶性鱼粉，0.5‐2g/L；水溶性大豆粉，1‐5g/L；高氮玉米浆干粉，2‐8g/L；高氮糖蜜酵母粉，30‐50g/L；葡萄糖，10‐20g/L；乳糖，1‐2g/L；乙酸钠，0.1‐0.3g/L；吐温‐80，2‐4g/L；柠檬酸铁铵，5‐20mg/L；硫酸锰，5‐15mg/L；氯化铁，30‐50mg/L。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述补料培养基成分比为水溶性鱼粉：水溶性大豆粉：高氮玉米浆干粉：高氮糖蜜酵母粉：葡萄糖：乳糖：乙酸钠＝1‐3：1‐3：1‐5：10‐20： 7‐10：1‐2：0.05‐0.2；

其中，葡萄糖为上罐总用葡萄糖用量的2倍；

其中，其他成分按此比例基准换算，即，参照所述葡萄糖用量，按照所述水溶性鱼粉：水溶性大豆粉：高氮玉米浆干粉：高氮糖蜜酵母粉：葡萄糖：乳糖：乙酸钠＝1‐3：1‐3：1‐5：10‐20：7‐10：1‐2：0.05‐0.2的比例基准，经换算，得出其他成分包括水溶性鱼粉、水溶性大豆粉、高氮玉米浆干粉、高氮糖蜜酵母粉、乳糖、乙酸钠的用量。