CN104195077A - 一株低聚果糖合成菌及其发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株低聚果糖合成菌及其发酵培养方法。该低聚果糖合成菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NK-18，CGMCCNo.9505。利用本发明提供的低聚果糖合成菌株能够合成分子量为5-7KD的果聚糖，且分子量分布窄，d＝1.06-1.07。发酵液低聚果糖含量高，大于30g/L；发酵产物纯度高，大于98％。该菌株产低聚果糖的营养要求简单，传代稳定，且培养方式简单易行，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物法制备低聚果糖的生产，具体的涉及一株低聚果糖的合成菌株及其发酵培养方法。
背景技术
果聚糖(Fructan，也叫果糖聚合物)是自然界普遍存在的，主要由果糖基连接而成的生物大分子聚合物。分子量通常在几千到几百万之间。根据果糖基连接位置的不同，果聚糖主要分为以下三类：(1)Levan果聚糖：主要以β(2→6)糖苷键连接；(2)菊糖：主要以β(2→1)糖苷键连接；(3)混合果聚糖：一种混合型果聚糖，它由β(2→1)糖苷键和β(2→6)糖苷键连接。细菌产果聚糖主要是以β(2→6)糖苷键连接Levan果聚糖。
Levan果聚糖除了具有天然多糖的共性外，还具有其他特性。食品方面：它可作为功能性食品的重要组成部分、乳化剂及成膜剂等。医药方面：levan果聚糖具有抗肿瘤、免疫调控、抗感染等作用，还可以作为血浆的替代品。化妆品方面：由于它具有与透明质酸相类似的保湿效果以及对人体角质细胞和成纤维细胞增殖作用，可作为化妆品添加剂。因此，Levan果聚糖的生产具有巨大的市场前景。Levan果聚糖在植物中含量低，天然提取及分离成本很高，不适宜工业化生产。因此利用微生物发酵法合成Levan果聚糖具有很好的应用开发前景。
低聚果糖是聚合度较低的果糖聚合物。低聚果糖为白色粉末状，甜味柔和清爽、清香，无异味。除具有一般功能性低聚糖的物理化学性质外，还具有其独特的生理特性。它是肠内双歧杆菌的活化增殖因子，可减少和抑制肠内腐败物质的产生，抑制有害细菌的生长，调节肠道内平衡，改善肠道内微生物种群比例；能促进微量元素铁、钙的吸收与利用，以防止骨质疏松症；可减少肝脏毒素，能在肠中生成抗癌的有机酸，有显著的防癌功能；且口味纯正香甜可口，具有类似脂肪的香味和爽口的滑腻感。由于其显著的保健功能使得它在保健品生产方面具有很好的市场前景。
发明内容
一、要解决的技术问题
本发明的目的之一是提供一株低聚果糖的合成菌，另一目的是提供该菌株的发酵培养方法。
二、技术方案
本发明从食品中筛选得到一株低聚果糖合成菌，形态学特征为：在固体LB平板上表现为菌落呈圆形，边缘整齐，较粘稠，半透明状。通过16SrDNA鉴定，确定为解淀粉芽孢杆菌菌属(Bacillus amyloliquefaciens)菌株，命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NK-18。该菌株已于2014年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；菌种保藏号为：CGMCCNo.9505。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NK-18，CGMCC No.9505的分离方法为：用灭过菌的小铲采用无菌操作将发酵食品接入无菌生理盐水中，-4℃条件下，在磁力搅拌器上搅拌30分钟，然后转入100℃处理15分钟；再进行梯度稀释，选择合适梯度的菌悬液涂布在筛选平板上，挑取单菌落若干株传代纯化。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NK-18，CGMCC No.9505的发酵特征为：在利用碳水化合物进行发酵过程中会产酸；而且发酵液较粘稠。
本发明的第二个目的是提供解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NK-18，CGMCC No.9505用于生产低聚果糖的发酵培养方法。为实现这一目的，本发明采取以下技术方案和操作步骤：
(1)菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NK-18，CGMCC No.9505至LB固体培养基，在30-40℃恒温培养24小时；
(2)种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL种子培养基中，30-40℃，150-200rpm振荡培养16-24小时；
(3)摇瓶发酵：以1％至2％的接种量将种子液接入发酵培养基中，30-40℃，150-200rpm振荡培养24-48小时；
(4)将发酵液8000rpm，4℃离心20min，取上清用4倍体积无水乙醇沉淀，收集沉淀，用蒸馏水溶解，透析处理48小时，然后冷冻干燥得到发酵产物低聚果糖；
其中所用到的培养基的组成为：
(1)培养皿固体培养基：蛋白胨8.0-12.0g/L，酵母粉3.0-8.0g/L，NaCl9.0-11.0g/L，琼脂15.0-25.0g/L，pH6.5-7.2；
(2)种子培养基为：蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-10g/L，NaCl5-10g/L；
(3)蔗糖150-250g/L，尿素1.5-4.5g/L，K2HPO45g/L，KH2PO43g/L， MgSO40.6-0.9g/L，微量元素(FeSO4、CaCl2，MgSO4，ZnCl2)2mL/L。
本发明与现有技术相比，突出优点在于：本发明提供的低聚果糖合成菌株分离自发酵食品，具有安全性，对人体没有毒副作用；又该菌株发酵培养能够合成分子量为5-7KD的果聚糖，且分子量分布窄，d＝1.06-1.07。发酵液低聚果糖含量高，大于30g/L；发酵产物纯度高，大于98％。该菌株产低聚果糖的营养要求简单，传代稳定，且培养方式简单易行，具有良好的应用前景。
附图说明
附图1为所合成的低聚果糖的13C核磁共振波谱；
附图2为所合成的低聚果糖的1H核磁共振波谱；
附图3为所合成的低聚果糖的结构式。
下面结合具体实例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：低聚果糖合成菌的分离筛选：用灭过菌的小铲采用无菌操作将发酵食品接入无菌生理盐水中，-4℃条件下，在磁力搅拌器上搅拌30分钟，然后转入100℃处理15分钟；再进行梯度稀释，选择合适梯度的菌悬液涂布在筛选平板上，挑取菌落若干株传代纯化。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB固体培养基，在37℃恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL种子培养基中，37℃，180rpm振荡培养24小时；③摇瓶发酵：以1％的接种量将种子液接入发酵培养基中，37℃，180rpm振荡培养48小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解果聚糖测果糖单体含量。
实施例3：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB固体培养基，在37℃恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL种子培养基中，37℃，180rpm振荡培养16小时；③摇瓶发酵：以2％的接种量将种子液接入发酵培养基中，37℃，180rpm振荡培养48小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解果聚糖测果糖单体含量。⑤检测结果：产量为30g/L；纯度98％；分子量为：5000-7000Da；分子量分布：1.06。
实施例4：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB固体培养基，在30℃恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL种子培养基中，30℃， 150rpm振荡培养16小时；③摇瓶发酵：以1％的接种量将种子液接入发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养48小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解果聚糖测果糖单体含量。⑤检测结果：产量为40g/L；纯度99％；分子量为：5000-6000Da；分子量分布：1.06。
实施例5：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB固体培养基，在40℃恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL种子培养基中，40℃，200rpm振荡培养16小时；③摇瓶发酵：以5％的接种量将种子液接入发酵培养基中，40℃，200rpm振荡培养24小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解果聚糖测果糖单体含量。⑤检测结果：产量为50g/L；纯度98％；分子量为：6000-7000Da；分子量分布：1.07。
实施例6：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciensNK-18)的培养及低聚果糖的检测：①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NK-18至LB固体培养基，在30℃恒温培养24小时；②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL种子培养基中，30℃，180rpm振荡培养16小时；③摇瓶发酵：以3％的接种量将种子液接入发酵培养基中，30℃，180rpm振荡培养24小时；④低聚果糖的检测：核磁共振检测；水解果聚糖测果糖单体含量。⑤检测结果：产量为35g/L；纯度99％；分子量为：5500-6500Da；分子量分布：1.07。
Claims (2)
1.一株低聚果糖合成菌——解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NK-18，CGMCCNo.9505。
2.利用权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NK-18，CGMCC No.9505发酵合成低聚果糖的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
①菌种活化：接种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)NK-18，CGMCC No.9505至LB固体培养基，在30-40℃恒温培养24小时；
②种子培养：将固体培养基活化的菌种接种至50mL种子培养基中，30-40℃，150-200rpm振荡培养16-24小时；
③摇瓶发酵：以1-5％的接种量将种子液接入发酵培养基中，30-40℃，150-200rpm振荡培养24-48小时；
④将发酵液8000rpm，4℃离心20min，取上清用4倍体积无水乙醇沉淀，收集沉淀，用蒸馏水溶解，透析处理48小时，然后冷冻干燥得到发酵产物低聚果糖；
其中，种子培养基为：蛋白胨5-10g/L，酵母粉5-10g/L，NaCl5-10g/L；发酵培养基为：蔗糖150-250g/L，尿素1.5-4.5g/L，K2HPO45g/L，KH2PO43g/L，MgSO40.6-0.9g/L，微量元素(FeSO4，CaCl2，MgSO4，ZnCl2)2mL/L。
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