CN102994395A

CN102994395A - 一株出芽短梗霉及其应用

Info

Publication number: CN102994395A
Application number: CN2012103894416A
Authority: CN
Inventors: 卫功元; 余小六; 王大慧
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2012-10-15
Filing date: 2012-10-15
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2032-10-15
Also published as: CN102994395B

Abstract

本发明公开了一株出芽短梗霉及其应用，所述出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans菌株SZU1001，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M 2012259。应用上述出芽短梗霉菌株生产普鲁兰的方法，包括：以出芽短梗霉菌株作为出发菌株，经斜面种子活化和种子培养后，发酵培养至少48小时，用有机溶剂提取获得普鲁兰，其特征在于：每1升发酵培养基含：葡萄糖40～60克，酵母粉0.8～3.5克，硫酸铵0.2～1.0克，磷酸氢二钾1.0～3.0克，硫酸镁0.1～0.3克，氯化钠0～1.0克，pH是6.5～6.8。本发明得到了能够在胞内合成谷胱甘肽的出芽短梗霉突变株，实现了不产色素且分子量高的普鲁兰的合成，满足了医药、环境等应用领域对高分子量普鲁兰的需求。

Description

一株出芽短梗霉及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一株不产色素且具有谷胱甘肽合成能力的出芽短梗霉及其在高分子量普鲁兰合成中的应用。

背景技术

普鲁兰（Pullulan）亦称茁霉多糖，是出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）产生的胞外多糖，是以α-1,6-糖苷键结合麦芽三糖构成的高分子多糖。普鲁兰分子为无分支链的线型结构，其分子量一般在4.8×10⁴−2.2×10⁶之间（商品普鲁兰多糖平均分子量为2×10⁵，大约由480个麦芽三糖组成），聚合度100-5000，在10 g/L的浓度下其旋光度为192°。

普鲁兰多糖是无色、无味、无臭的高分子物质，具有无毒、安全、耐热、耐盐、耐酸碱、黏度低、可塑性强、成膜性好等特点。因而具有广泛的应用，如：

1、普鲁兰在食品工业中的应用：普鲁兰无毒无害，具有良好的可食性和被膜性，在食品工业中可用作食品配料与添加剂、粘着剂、抗氧化剂、包装材料和被膜剂，其中高分子量的普鲁兰具有较好的保水作用。

2、普鲁兰在医药工业中的应用：普鲁兰在医药工业领域除了用于制备胶囊，微胶囊和药物包装袋和中药浸出用包装材料外，还可用于药物锭剂、稳定剂、止血剂、类毒素和疫苗等的制备。由于普鲁兰不为人体消化酶消化，其具有的食物纤维的生理功能对各种常见老年疾病有辅助治疗作用。作为生物可降解材料，高分子量普鲁兰在经过化学修饰后可以用作骨科疾病治疗的原料。

3、普鲁兰在化学工业中的应用：以普鲁兰作粘胶剂时，可在生产中控制分子量以增加粘性，如制成干性胶或文具胶等。普鲁兰经酯化作用后，制成的非水溶性薄膜可用来制作内用夹板、层压板或用作建筑表面处理的覆膜材料，其表面特性与三聚氰胺松脂板相仿。适当聚合度的高浓度普鲁兰溶液可加工成纤维。此纤维光泽度好，与人造丝相似，抗张强度不低于尼龙丝。

4、普鲁兰在环境工程中的应用：普鲁兰特殊的吸附性能及电化学特性使其在有助凝剂的作用下进行分子架桥、吸附、絮凝与收缩沉淀。此特点使其可用作饮用水及生活、工业污水的净化剂，去除水中的悬浮物并脱色。研究表明，普鲁兰分子量越大，其絮凝活性越高。

可见，提高普鲁兰的分子量对于其应用具有重大意义。

目前，普鲁兰多糖主要通过出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）发酵法进行生产。然而，生产菌株出芽短梗霉在发酵过程中通常会产生多种色素，这些色素的存在非常不利于普鲁兰多糖的提取纯化，进而影响其质量。

另一方面，在出芽短梗霉发酵生产普鲁兰过程中，生产菌株在液体培养条件下可向胞外分泌酸性物质，使pH下降，进而形成酸胁迫环境。酸胁迫会导致细胞生长受抑制，普鲁兰合成酶活性降低，从而影响普鲁兰的产量和分子量。为此，提高出发菌株抵抗酸胁迫的能力将有利于降低细胞对pH下降的敏感性，同时也可以促进普鲁兰分子量的提高。

发明内容

本发明的目的是提供一株不产色素且具有谷胱甘肽合成能力的出芽短梗霉菌株；本发明的另一个目的是提供上述菌株合成高分子量的普鲁兰的方法。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

一株出芽短梗霉Aureobasidium pullulans菌株SZU 1001，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏日期是2012年6月29日，保藏号为CCTCC M 2012259。

上述出芽短梗霉Aureobasidium pullulans菌株SZU 1001的诱变筛选方法，包括以下步骤：以出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans ATCC 201253）为出发菌株，采用紫外线和γ-射线复合诱变的方法对出发菌株进行处理，在含有乙硫氨酸的平板中筛选出不产色素且具有谷胱甘肽合成能力的出芽短梗霉突变株。

其中，采用种子培养基：PDA培养基（马铃薯浸取液1 L，葡萄糖20 g，自然pH）；

筛选培养基：向种子培养基中加入0.1 g/L乙硫氨酸。

具体操作为：

（1）紫外诱变：

在飞利浦ZWSSJD-30型紫外灯下进行照射，其辐照功率和波长分别为30W、253.7 nm，照射距离为30 cm。具体操作步骤为：吸取经培养20 h后的种子培养液1 mL，10000 rpm下离心2 min，弃上清，加入灭菌的生理盐水洗涤离心三次，以1 mL生理盐水重新悬浮，倒入盛有9 mL无菌生理盐水的培养皿（直径9 cm）中混匀，并依次稀释，得到稀释10⁶倍的菌液，将该梯度培养皿先暂时放入恒温箱中备用。将磁力搅拌器（包括转子）放入无菌操作台，调整高度使位于最佳辐照距离处，随后打开紫外灯20 min，使其稳定。将培养箱中存放的培养皿迅速放至磁力搅拌器上，搅拌并开始计时，依次按照时间梯度取出平板，避光保存。

关闭紫外灯，吸取200 μL诱变后菌液涂布于含有筛选培养基的选择性平板上，后于30℃恒温箱中倒置培养。约72 h，挑取平板上的无色透明的菌落进行摇瓶复筛，根据检测结果，确定普鲁兰分子量最高的菌株，作为γ-射线诱变的出发菌株。

（2）γ-射线诱变

以紫外诱变得到的突变株作为出发菌株，培养20 h后的菌液经稀释倍后，于苏州大学辐照中心进行⁶⁰Co γ-射线诱变，在相同剂量率80 Gy/min下，采用的γ-射线总辐照剂量为160～800Gy。γ-射线诱变后菌株的筛选过程与紫外诱变相同。

由于乙硫氨酸是谷胱甘肽的结构类似物，在低浓度时能促进谷胱甘肽的合成但是在高浓度时就会抵制谷胱甘肽的合成，因而筛选抗乙硫氨酸的突变株，可以选育出具有合成谷胱甘肽能力的出芽短梗霉。同时，通过挑取平板上的无色透明的菌落进行摇瓶复筛，可以获得不产色素的出芽短梗霉。由此，本发明获得了不产色素且具有谷胱甘肽合成能力的出芽短梗霉突变株。

在微生物细胞中过量表达谷胱甘肽合成基因，提高胞内谷胱甘肽含量将有利于细胞抵抗酸胁迫的能力。由此，本发明通过获得具有谷胱甘肽合成能力的出芽短梗霉突变株，减轻了出芽短梗霉在发酵生产普鲁兰过程中，生产菌株在液体培养条件下向胞外分泌酸性物质，使pH下降，进而形成酸胁迫环境所造成的影响，配合特定的发酵培养基，可提高普鲁兰的产量和分子量。

应用上述出芽短梗霉Aureobasidium pullulans菌株SZU 1001生产普鲁兰的方法，包括以下步骤：以出芽短梗霉Aureobasidium pullulans菌株SZU 1001作为出发菌株，经过斜面种子活化和种子培养后，发酵培养至少48小时，用有机溶剂提取获得普鲁兰，每1升发酵培养基含有：葡萄糖40～60克，酵母粉0.8～3.5克，硫酸铵0.2～1.0克，磷酸氢二钾1.0～3.0克，硫酸镁0.1～0.3克，氯化钠0～1.0克，所述发酵培养基的pH是6.5～6.8。

优选的技术方案，每1升发酵培养基含有：葡萄糖50克，酵母粉1.0克，硫酸铵0.3克，磷酸氢二钾1.0克，硫酸镁0.2克，所述发酵培养基的pH是6.8。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、本发明采用了紫外线和γ-射线复合诱变的方法，在选择性培养基上得到了能够在胞内合成谷胱甘肽的出芽短梗霉突变株。在优化培养基的基础上，利用该突变株实现了高分子量普鲁兰的合成，满足了医药、环境等应用领域对高分子量普鲁兰的需求，因此将产生良好的社会经济效益。

2、由于本发明获得的出芽短梗霉突变株不产色素且生产普鲁兰的发酵时间短，因此具有良好的工业化应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：复合诱变处理筛选出芽短梗霉突变株及性能比较

（1）菌株

出发菌株为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans ATCC 201253），经复合诱变后的突变株为Aureobasidiumpullulans SZU 1001。该突变株于2012年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M 2012259。

（2）培养基

种子培养基：PDA培养基（马铃薯浸取液1 L，葡萄糖20 g，自然pH）；

筛选培养基：向种子培养基中加入0.1 g/L乙硫氨酸；

优化前发酵培养基：50 g/L葡萄糖，2.5 g/L 酵母粉，5 g/L K₂HPO₄，0.6 g/L (NH₄)₂SO₄，0.2 g/L MgSO₄·7H₂O，1 g/L NaCl，pH 6.8。

（3）紫外诱变

在飞利浦ZWSSJD-30型紫外灯下进行照射，其辐照功率和波长分别为30W、253.7 nm，照射距离为30 cm。具体操作步骤为：吸取经培养20 h后的种子培养液1 mL，10000 rpm下离心2 min，弃上清，加入灭菌的生理盐水洗涤离心三次，以1 mL生理盐水重新悬浮，倒入盛有9 mL无菌生理盐水的培养皿（直径9 cm）中混匀，并依次稀释，得到稀释10⁶倍的菌液，将该梯度培养皿先暂时放入恒温箱中备用。将磁力搅拌器（包括转子）放入无菌操作台，调整高度使位于最佳辐照距离处，随后打开紫外灯20 min，使其稳定。将培养箱中存放的培养皿迅速放至磁力搅拌器上，搅拌并开始计时，依次按照时间梯度取出平板，避光保存。关闭紫外灯，吸取200 μL诱变后菌液涂布于选择性平板，后于30℃恒温箱中倒置培养。约72 h，挑取平板上的无色透明的菌落进行摇瓶复筛，根据检测结果，确定普鲁兰分子量最高的菌株，作为γ-射线诱变的出发菌株。

（4）γ-射线诱变

以紫外诱变得到的突变株作为出发菌株，培养20 h后的菌液经稀释倍后，于苏州大学辐照中心进行⁶⁰Co γ-射线诱变，在相同剂量率80 Gy/min下，采用的γ-射线总辐照剂量为160~800Gy。γ-射线诱变后菌株的筛选过程与紫外诱变相同。由此获得突变株。

（5）种子培养

斜面种子活化4小时后接入装有50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中进行振荡培养，培养温度30℃，摇床转速200 rpm，培养时间20小时。

（6）发酵培养

按10%的接种量将种子接入装有50 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，在摇床中进行发酵培养。培养温度30℃，摇床转速200 rpm，培养时间72小时。

（7）细胞干重的测定

取20 mL发酵液，于12000 rpm下离心20 min，蒸馏水洗涤3次，得到细胞在70 ℃下烘48 h至恒重。

（8）普鲁兰的分离提取

取10 mL上清液，加入2倍体积无水乙醇，4℃静置12小时，于12000 rpm离心10 min，得到多糖沉淀，用乙醇等有机溶剂洗涤3次，在70℃下烘48 h至恒重。

（9）葡萄糖质量浓度的测定

3, 5-二硝基水杨酸法。

（10）普鲁兰分子量的测定

粘度法。

（11）胞内谷胱甘肽的提取

发酵培养得到的新鲜细胞用蒸馏水洗涤3次后，在40%乙醇中30℃下处理2小时，离心取上清液进行谷胱甘肽测定。

（12）谷胱甘肽的测定

采用DTNB [5，5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)]-谷胱甘肽还原酶循环法。

出发菌株与本实施例获得的突变株性能比较如下表１所示。

表1 出发菌株和突变株性能比较

菌株	A. pullulans ATCC 201253	A. pullulans SZU 1001
			色素	深(+)	无(-)
细胞干重（g/L）	9.17±0.25	11.04±0.12
			普鲁兰（g/L）	18.07±0.87	18.93±0.55
分子量（×10⁶）	1.14±0.14	2.05±0.15
			谷胱甘肽（mg/L）	0	4.4±0.3

实施例二：确定高分子量普鲁兰发酵高产的最佳培养基

按照实施例一进行操作，不同在于：以优化前的发酵培养基为基准，采用正交设计试验对发酵培养基进行优化，确定最佳的培养基成分及浓度。

根据正交设计试验结果，影响普鲁兰产量的最主要营养物依次是硫酸铵、酵母粉、氯化钠和磷酸氢二钾，其最佳浓度分别为：硫酸铵0.8 g/L，酵母粉3 g/L，氯化钠1 g/L，磷酸氢二钾3 g/L。

根据正交设计试验结果，影响普鲁兰分子量的最主要营养物依次是氯化钠、酵母粉、磷酸氢二钾和硫酸铵，其最佳浓度分别为：氯化钠0 g/L，酵母粉1 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，硫酸铵0.3 g/L。

实施例三：采用优化后的培养基（一）进行突变株的普鲁兰发酵培养。

每1升发酵培养基（一）含有：葡萄糖50克，酵母粉3.0克，硫酸铵0.8克，磷酸氢二钾3.0克，硫酸镁0.2克，氯化钠1克，所述发酵培养基的pH是6.8。

同实施例一进行种子培养和发酵培养，结果如下：

细胞干重9.9 g/L；普鲁兰产量22.3 g/L；普鲁兰分子量1.69×10⁶。

实施例四：采用优化后的培养基（二）进行突变株的普鲁兰发酵培养。

每1升发酵培养基（二）含有：葡萄糖50克，酵母粉1.0克，硫酸铵0.3克，磷酸氢二钾1.0克，硫酸镁0.2克，所述发酵培养基的pH是6.8。

同实施例一进行种子培养和发酵培养，结果如下：

细胞干重9.3 g/L；普鲁兰产量23.7 g/L；普鲁兰分子量2.55×10⁶。

对比实施例三和实施例四可以发现，采用优化后的培养基（二），普鲁兰的产量和分子量有进一步的提高。

Claims

1.一株出芽短梗霉Aureobasidium pullulans菌株SZU 1001，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏日期是2012年6月29日，保藏号为CCTCC M 2012259。

2.应用权利要求1所述出芽短梗霉Aureobasidium pullulans菌株SZU 1001生产普鲁兰的方法，包括以下步骤：以出芽短梗霉Aureobasidium pullulans菌株SZU 1001作为出发菌株，经过斜面种子活化和种子培养后，发酵培养至少48小时，用有机溶剂提取获得普鲁兰，其特征在于：每1升发酵培养基含有：葡萄糖40～60克，酵母粉0.8～3.5克，硫酸铵0.2～1.0克，磷酸氢二钾1.0～3.0克，硫酸镁0.1～0.3克，氯化钠0～1.0克，所述发酵培养基的pH是6.5～6.8。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：每1升发酵培养基含有：葡萄糖50克，酵母粉1.0克，硫酸铵0.3克，磷酸氢二钾1.0克，硫酸镁0.2克，所述发酵培养基的pH是6.8。