CN105695347A - 一种产普鲁兰多糖菌种及其应用、普鲁兰多糖的生产方法 - Google Patents
一种产普鲁兰多糖菌种及其应用、普鲁兰多糖的生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物领域，公开了一种出芽短梗霉，其保藏编号为CGMCC No.11937。本发明所述保藏编号为CGMCC No.11937的出芽短梗霉以野生型出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580为出发菌株，经化学诱变后筛选获得，其发酵生成普鲁兰多糖的能力较出发菌株显著提高，普鲁兰多糖产量提高了80％，对糖转化率提高了68％。普鲁兰多糖成品颜色明显变浅。因此本发明所述保藏编号为CGMCC No.11937的出芽短梗霉能够广泛应用于普鲁兰多糖发酵中。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种产普鲁兰多糖菌种及其应用、普鲁兰多糖的生产方法。
背景技术
普鲁兰多糖又被叫做茁霉多糖、出芽短梗孢糖、普聚多糖或普鲁兰糖。它是出芽短梗霉产生的胞外多糖，以a-1，6-糖苷键结合麦芽三糖构成同型多糖为主，即葡萄糖按a-1，4-糖苷键结合成麦芽三糖，两端再以a-1，6-糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成高分子多糖。分子量4.8×1O4～2.2×106(商品普鲁兰多糖平均分子量2×105，大约由480个麦芽三糖组成)。
普鲁兰多糖是无色、无味的高分子物质，性质可表现在以下几个方面。安全性：动物实验表明，普鲁兰多糖不会引起任何生物学毒性和异常状态，可以安全可靠的用于食品及医药行业。耐热性：粉末状普鲁兰多糖对热反应与淀粉相同，与其它高分子材料不同，它的炭化不产生有毒气体。耐酸碱性：普鲁兰多糖是中性多糖，在常温pH3-10的条件下，其黏度和性质基本不发生变化。黏度：普鲁兰多糖是线状结构，黏度远低于其它多糖，它的黏度随相对分子质量及浓度的增加而增加，但比其它多糖增加的要小。可塑性：它的成型物不需添加增塑剂和稳定性物质，可以通过控制普鲁兰多糖溶液的浓度实现控制膜的厚度。因此普鲁兰多糖广泛应用于食品、保健、医药、化妆等领域。
在食品方面，普鲁兰多糖可作为低热量食品添加剂添加到糕点、饮料、口香糖、冰激凌等食品中，起到增加食品风味的作用，也可作为保健品食品添加剂添加到饮料或膳食中从而达到辅助性的治疗糖尿病的效果。同时也有研究发现，普鲁兰能够促进肠道内双歧杆菌的生长，从而可以维持肠道微生物菌群的平衡，有效的治疗便秘。在食品保鲜方面，在水果、鸡蛋表面涂抹普鲁兰多糖，可起到保鲜和抑菌作用，用普鲁兰多糖处理过的海鲜可以长期保持鲜味。在医药方面，可作为抗氧化包装材料、类毒素和疫苗保护剂，可制作眼内眼镜、作为X射线透视造影剂，可作为创口缝合线，可作为人工脏器和抗凝血性医疗材料，普鲁兰多糖可替代明胶制作植物空心胶囊。在化妆品行业，普鲁兰多糖可用于制造香粉、香波、化妆水、面膜、皮肤保护剂、头发定型剂等。
目前主要以糖质为原料经微生物发酵产生，然后采用“板框过滤”“超滤脱盐”加上“酒精沉淀”分离获得。普鲁兰多糖产量高低与所采用的微生物种类密不可分，出芽短梗霉是普鲁兰多糖发酵常用菌种之一，但其普鲁兰多糖产量低、对糖转化率不高，且色素含量过高，对后续提取及成品影响很大。因此提供一种无色素的高产普鲁兰多糖菌种，对于节约普鲁兰多糖生产成本至关重要。
尽管在前人研究的基础上，普鲁兰多糖的产量已有很大的提高，但出芽短梗霉发酵过程中仍存在产量低、对糖转化率低及分泌黑色素等问题。目前国内外很多科研机构很难同时解决以上两个问题，因此使得工业化进展缓慢。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种出芽短梗霉及其应用，使得所述出芽短梗霉可以提高普鲁兰多糖产量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种出芽短梗霉，其保藏编号为CGMCCNO.11937。
本发明以出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580(购自于中国微生物菌株保藏委员会普通微生物中心)为出发菌株，以N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍(以下简称NTG)为诱变剂对其进行化学诱变，然后将经诱变后的出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580的悬浮液涂布在含有PDA培养基上，挑取菌落形态正常，颜色偏浅，菌落直径最大的单菌落，命名为MHZ-2101。
本发明将上述筛选出的菌株MHZ-2101经ITS序列检测分析，菌株MHZ-2101与出发菌株出芽短梗霉同源性高达99％，确定为出芽短梗霉。
本发明所述出芽短梗霉MHZ-2101已于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.11937。
本发明所述出芽短梗霉MHZ-2101与野生型出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580的发酵对比试验显示出发菌株普鲁兰多糖产量50g/L，诱变菌株MHZ-2101普鲁兰多糖含量90g/L，提高80％；出发菌株对糖转化率40％，诱变菌株MHZ-2101对糖转化率67％，提高68％；出发菌株普鲁兰多糖成品颜色暗黄色，诱变菌株普鲁兰多糖成本颜色浅黄色，成品质量显著提高。因此，本发明所述出芽短梗霉MHZ-2101能够应用于生产普鲁兰多糖中。
本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉在生产普鲁兰多糖中的应用。
此外，本发明还提供了一种普鲁兰多糖的生产方法，将保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵。
本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括如下步骤：
步骤1：取如权利要求1所述的出芽短梗霉接种到固体PDA培养基培养；
步骤2：挑取一接种环步骤1获得的菌落接种到种子培养基培养；
步骤3：按照1：10的比例将步骤2获得的菌悬液转接到发酵培养基培养。
在本发明的一些具体实施中，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法中，所述PDA培养基配方包括：200g土豆去皮，切丁，沸水中煮15min，八层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，蒸馏水定容至1L，三角瓶分装，121℃，20min湿热灭菌。加2％的琼脂粉为PDA固体培养基。
在本发明的一些具体实施中，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法中，所述种子培养基的配方包括40g/L葡萄糖、2.8g/L酵母粉、6.5g/L磷酸二氢钾、0.3g/L硫酸镁。
在本发明的一些具体实施中，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法中，所述发酵培养基的配方包括：120g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、130g/L磷酸二氢钾、10g/L硫酸镁、15g/L硫酸铵，氢氧化钠调节pH值至6.5。
在本发明的一些具体实施中，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法中，步骤1所述培养的温度为28℃，步骤1所述培养的时间为3d。
在本发明的一些具体实施中，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法中，步骤2所述培养具体为于28℃、150rpm往复摇床震荡培养20h。
在本发明的一些具体实施中，本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法中，步骤3所述培养具体为于28℃、180rpm往复摇床震荡培养72h。
通过离心收集上清，加入两倍体积95％乙醇，提取发酵液普鲁兰多糖并检测发酵液普鲁兰多糖含量。
对于扩繁用的种子培养基以及发酵用的发酵培养基为本领域公知，本领域技术人员均可采用合适的培养基进行普鲁兰多糖的发酵。作为优选，种子培养基：40g/L葡萄糖、2.8g/L酵母粉、6.5g/L磷酸二氢钾、0.3g/L硫酸镁。发酵培养基：120g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、130g/L磷酸二氢钾、10g/L硫酸镁、15g/L硫酸铵，氢氧化钠调节pH值至6.5。
本发明还提供了保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：以出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580为出发菌株，获得其孢子悬浮液；
步骤2：取所述孢子悬浮液稀释至106个孢子/mL，与终浓度为0.5mol/L的NTG混合2h，洗涤后，培养。
步骤1具体为将出发菌株出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580接种到固体PDA培养基，28℃培养3d，加入0.9％无菌生理盐水，充分震荡，获得孢子悬浮液；步骤2具体为通过生理盐水将所述孢子悬浮液稀释至106个孢子/mL，经终浓度0.5mol/LNTG处理2hr，生理盐水洗涤3次，最后用生理盐水稀释至105个/mL，取100μL涂布到PDA平板上，28℃避光培养7天，挑取形态正常，颜色发白的菌落。
NTG诱变是亚硝基胍，分子式:CH4N4O。NTG诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。在自然条件下NTG容易分解，而在酸性(pH5.5)条件下会产生HNO2。虽然HNO2本身就是诱变剂，但在NTG有活性时(pH6～9),它却无诱变效果.在碱性条件下，NTG会形成重氮甲烷(CH2N2)，它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH2N2对DNA的烷化作用引起的。
由以上技术方案可知，本发明所述保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉MHZ-2101以野生型出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580为出发菌株，经化学诱变后获得，其发酵生成普鲁兰多糖的能力较野生型出芽短梗霉显著提高，普鲁兰产量提高了80％，对糖转化率提高了68％，产品质量也有明显提高。因此，本发明所述保藏编号为CGMCCNO.11937的出芽短梗霉能够广泛应用于普鲁兰多糖发酵中。
生物保藏说明
生物材料MHZ-2101，分类命名：出芽短梗霉，Aureobasidiumpullulans于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11937。
具体实施方式
本发明公开了一种产普鲁兰多糖菌种及其应用、普鲁兰多糖的生产方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了产普鲁兰多糖菌种及其应用、普鲁兰多糖的生产方法中所用菌株、原料、试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明所属出芽短梗霉MHZ-2101的筛选
将出发菌株出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580接种到固体PDA培养基，28℃培养3天，加入0.9％无菌生理盐水，充分震荡，获得菌悬液，通过血球计数板计算孢子悬浮液浓度，通过生理盐水稀释至106个/mL，终浓度0.5mol/LNTG处理2hr，生理盐水洗涤3次，最后用生理盐水稀释至105个/mL，取100μL涂布到PDA平板上，28℃避光培养7天，挑取菌落形态正常，颜色发白，菌落直径最大的单菌落，命名为MHZ-2101。
PDA培养基配方如下：200g土豆去皮，切丁，沸水中煮15min，八层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，蒸馏水定容至1L，三角瓶分装，121℃，20min湿热灭菌。加2％的琼脂粉为PDA固体培养基。
上述筛选出的菌株MHZ-2101经ITS序列检测分析，菌株MHZ-2101与出发菌株出芽短梗霉同源性高达99％，确定为出芽短梗霉。菌株MHZ-2101于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11937。
实施例2：本发明所述普鲁兰多糖生产方法及普鲁兰多糖发酵对比实验
1、发酵方法
将出芽短梗霉MHZ-2101接种到固体PDA培养基，28℃培养3天，用接种环挑取一大环接种到种子培养基，28℃，150rpm往复摇床震荡培养20hr，1:10转接到发酵培养基，28℃，180rpm往复摇床震荡培养72hr，测葡萄糖和普鲁兰含量。
种子培养基：40g/L葡萄糖、2.8g/L酵母粉、6.5g/L磷酸二氢钾、0.3g/L硫酸镁。
发酵培养基：120g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、130g/L磷酸二氢钾、10g/L硫酸镁、15g/L硫酸铵，氢氧化钠调节pH值至6.5。
葡萄糖含量检测：将发酵液稀释50倍，生物传感仪检测葡萄糖含量。
普鲁兰多糖检测方法：取发酵液10mL，蒸馏水稀释一倍，8000r/min离心10min，取上清，加入两倍体积95％乙醇沉淀，沉淀65℃干燥至恒重。
2、普鲁兰多糖发酵对比试验
将本发明所述出芽短梗霉MHZ-2101和出发菌株出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580按照上述生产方法同时进行发酵，两种菌株的发酵环境、接种量均相同，停止发酵后测葡萄糖和普鲁兰含量。结果见表1。
表1发酵结果
出发菌株普鲁兰糖产量50g/L，诱变菌株MHZ-2101普鲁兰多糖含量90g/L，提高80％；出发菌株对糖转化率产量40％，诱变菌株MHZ-0201对糖转化率67％，提高68％；出发菌株普鲁兰多糖成品颜色暗黄色，诱变菌株MHZ-2101普鲁兰多糖成本颜色浅黄色，成品质量显著提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种出芽短梗霉，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO.11937。
2.根据权利要求1所述的出芽短梗霉在生产普鲁兰多糖中的应用。
3.根据权利要求1所述的出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取如权利要求1所述的出芽短梗霉接种到固体PDA培养基培养；
步骤2：挑取步骤1获得的菌落接种到种子培养基培养；
步骤3：将步骤2获得的菌悬液转接到发酵培养基培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PDA培养基配方包括：200g土豆去皮，切丁，沸水中煮15min，八层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖，蒸馏水定容至1L，三角瓶分装，121℃，20min湿热灭菌，加2％的琼脂粉为PDA固体培养基。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的配方包括40g/L葡萄糖、2.8g/L酵母粉、6.5g/L磷酸二氢钾、0.3g/L硫酸镁。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方包括：120g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、130g/L磷酸二氢钾、10g/L硫酸镁、15g/L硫酸铵，氢氧化钠调节pH值至6.5。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1所述培养的温度为28℃，步骤1所述培养的时间为3d。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2所述培养具体为于28℃、150rpm往复摇床震荡培养20h。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3所述培养具体为于28℃、180rpm往复摇床震荡培养72h。
10.根据权利要求1所述的出芽短梗霉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：以出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580为出发菌株，获得其孢子悬浮液；
步骤2：取所述孢子悬浮液稀释至106个孢子/mL，与终浓度为0.5mol/L的NTG混合2h，洗涤后，培养。
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