CN107760609A - 一种适宜在碱性条件下生产高分子、无色素普鲁兰多糖的菌株及其应用 - Google Patents

一种适宜在碱性条件下生产高分子、无色素普鲁兰多糖的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适宜在碱性条件下生产高分子、无色素普鲁兰多糖的菌株及其应用，属于菌株诱变技术领域。本发明所述菌株为产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)A4，保藏编号为CGMCC No.13177。本发明提供了一种该菌株在普鲁兰多糖生产中的应用。本发明提供的菌株适宜在碱性条件下发酵，可以生产高分子量的普鲁兰多糖，并且在发酵过程中没有色素的产生，并且产物浓度高，有助于有效降低发酵成本。发酵后的粗多糖具有较高的可塑性，有望实现普鲁兰多糖更为广泛的应用。

Description

一种适宜在碱性条件下生产高分子、无色素普鲁兰多糖的菌 株及其应用
技术领域
本发明涉及一种适宜在碱性条件下生产高分子、无色素普鲁兰多糖的菌株及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
普鲁兰多糖(pullulan)，也叫茁霉多糖、普聚多糖或茁霉糖，是无味无嗅的白色粉末。它是一种由出芽短梗霉利用生物糖但不局限于葡萄糖(还包括蔗糖，麦芽糖和果糖等)发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，这些生物糖的来源于淀粉，但不局限于淀粉，还包括秸秆、麦秆、稻草、玉米、米糠、麦麸等，该多糖化学结构是由α～1，4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α～1,6糖苷键聚合而成的直链状多糖，分子量4.8×104～2.2×106(商品普鲁兰多糖平均分子量2×105，大约由480个麦芽三糖组成)。由于上述的结构特点，普鲁兰多糖被赋予许多重要的理化特性，即结构上富有弹性，还具有成膜性、阻气性、可塑性、粘性均较强，并且具有易溶于水、无毒无害、无色无味等优良特性。2006年5月19日.国家卫生部发布了第8号公告，普鲁兰多糖为新增四种食品添加剂产品之一，可在糖果、巧克力包衣、膜片、复合调味科和果蔬汁饮料中用作被膜剂和增稠剂。因此在食物和食品方面、化学工业、医疗和药品、烟草、化妆品、环境保护、农产品保鲜等方面有着非常广的应用。
尽管普鲁兰多糖的生产已经工业化，但是受生产厂家少等因素的制约，市售价格偏高(23万/吨，进口价格30万/吨)，限制了普鲁兰多糖的应用。目前从事此研究的主要集中在菌株的筛选上，生物法合成普鲁兰多糖的菌株主要为普鲁兰酵母(茁芽短梗霉，Aureobiasidium pullulans)，其最适的发酵pH大多集中在酸性条件下，需要添加盐酸等酸性试剂调节至最适pH，此时培养基中会有盐分生成，进而影响酵母细胞的生长，最终影响普鲁兰多糖的产量；由于普鲁兰酵母菌株在产糖的同时，多数菌株会伴有黑色素的产生，黑色素会覆盖在菌丝细胞壁上，形成强有力的保护层，从而阻止一些酶进入细胞，从而导致胞外多糖产量的降低，并对下一步纯化带来一定的难度。因此获得适宜在碱性条件下生产无色素、高分子量的普鲁兰多糖生产菌株，对于提高普鲁兰多糖的产量，降低普鲁兰多糖的生产成本以及实现普鲁兰多糖广泛应用具有重要的意义。
发明内容
为解决目前生物法合成普鲁兰多糖的菌株大多最适发酵pH集中在酸性条件下，酸性条件会导致培养基中会有盐分生成，会影响酵母细胞的生长，进而影响普鲁兰多糖的产量，以及多数普鲁兰酵母菌株在产糖时会伴有黑色素产生，黑色素会导致胞外多糖产量降低，并纯化带来一定的难度等问题，本发明提供了一种适宜在碱性条件下生产高分子、无色素普鲁兰多糖的菌株及其应用，采用的技术方案如下：
本发明提供了一种适宜在碱性条件下生产高分子、无色素普鲁兰多糖的菌株，该菌株为产黑色素短梗霉A4(Aureobasidium melanogenum)，保藏编号为CGMCC No.13177。
本发明涉及的一种适宜在碱性条件下生产高分子量、无色素普鲁兰多糖的菌株是利用腐质土样溶于无菌水中筛选获得的，然后经ITS间隔序列分析和形态学对菌株进行鉴定，被命名为产黑色素短梗霉A4(A.melanogenum)，该菌株于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.13177。
优选地，所述碱性条件为pH为8。
本发明所述的产黑色素短梗霉A4(Aureobasidium melanogenum)的筛选方法为：
将1g土样样品溶于10mL无菌水中，并放于30℃，180转/分钟摇床中过夜培养，将过夜培养的土样原液放于30℃恒温箱中静置一段时间，然后将菌悬液吸取100μl菌悬液(单位菌体浓度103～104)涂布到YPD(含有0.03～0.07％的曲利苯蓝)固体筛选培养基上，30℃恒温培养2-3天，以菌落颜色深浅、表面质地为筛选指标，筛选出颜色深，菌落表面湿润，菌落直径与厚度比值较高的菌株，在普通YPD固体培养基进行划线培养，并对其进行编号，再接入含有制霉素培养基上培养，进行下一步的复筛和遗传稳定性验证，并确定胞外多糖的产量；同时利用ITS间隔序列分析对所筛选的菌株进行鉴定，最后将获得种属的菌株放在-80℃保存。
上述YPD培养基含有如下质量百分比的成分：0.6～1.4％(w/v)的酵母膏，1.5～2.5％(w/v)的蛋白胨，1.5～2.5％(w/v)的葡萄糖，若制固体培养基，加入1.5～2.0％(w/v)的琼脂粉。灭菌条件为115℃灭菌25～35分钟。
上述复筛方法：取种子平板，接种到含有3ml的YPD培养基的试管中，培养24～36小时；取上述种子接种到含有50mL的YPD培养基中的摇瓶中，培养24小时添加5mL70％的灭菌后的葡萄糖，培养48小时，再取5mL发酵液，煮沸5～10分钟，10000转/分钟离心10～20分钟，利用4倍体积的乙醇沉淀，4～10摄氏度静置过夜，10000转/分钟离心10～20分钟后取沉淀干燥，测定胞外多糖的产量，其中乙醇沉淀时浮到顶部的为高分子多糖。
本发明所述菌株适宜在碱性条件下利用发酵培养基生产高分子、无色素普鲁兰多糖。
本发明还提供了一种产黑色素短梗霉A4(Aureobasidium melanogenum)在普鲁兰多糖生产中的应用。
本发明还提供了一种产黑色素短梗霉A4(Aureobasidium melanogenum)在生产高分子普鲁兰多糖中的应用。
本发明还提供了一种产黑色素短梗霉A4(Aureobasidium melanogenum)在生产无色素普鲁兰多糖中的应用。
本发明还提供了一种产黑色素短梗霉A4(Aureobasidium melanogenum)在生产高分子、无色素普鲁兰多糖中的应用。
进一步地，本发明所述应用包括如下步骤：
步骤一：取权利要求1所述黑色素短梗霉A4(Aureobasidium melanogenum)的种子接种到YPD培养基中培养获得一级种子，将获得的一级种子接种到YPD培养基中培养，添加灭菌后的生物质糖继续培养，获得培养种子；
步骤二：取步骤一获得的培养种子接种到发酵培养基中，调节pH值，并在发酵24h后向培养基中持续补加另一种碳源，继续发酵待发酵结束后测定多糖的浓度。
步骤二所述的发酵培养基包含如下质量百分比的成分：6％～10％生物质糖，1％～3％酵母膏和2％～5％蛋白胨，0.3％～0.7％K2HPO4，0.04％～0.08％(NH4)2SO4·7H2O，0.02％～0.04％CaCl2，pH值为8。
优选地，骤二所述的取步骤一获得的培养种子接种到发酵培养基中是按照6％-8％的接种量进行的。
优选地，骤二所述的调节pH值是用氨水进行调节的。
优选地，骤二所述的生物质糖为麦芽糖或葡萄糖。优选地，葡萄糖或麦芽糖的质量含量为70％。
优选地，所述应用具体步骤如下：取种子平板，接种到2mL～3mL的YPD培养基中，培养24h～36h；取上述种子接种到50ml的YPD培养基中，24h后添加5mL70％的灭菌后的葡萄糖，培养36h～48h；取上述培养种子接种到含6％～10％葡萄糖，1％～3％酵母膏和2％～5％蛋白胨，0.3％～0.7％K2HPO4，0.04％～0.08％(NH4)2SO4·7H2O，0.02％～0.04％CaCl2的发酵培养基中，pH8，将种子液接种到上述发酵培养基中，接种量为6％～8％，利用氨水调节pH，并在发酵24h向摇瓶中补加质量含量为70％的麦芽糖，继续发酵24h后，测定多糖的浓度。
本发明有益效果：
1、本发明提供的菌株适宜在碱性条件下发酵普鲁兰多糖，解决了目前生物法合成普鲁兰多糖的菌株大多最适发酵pH集中在酸性条件下，酸性条件会导致培养基中会有盐分生成，会影响酵母细胞的生长，进而影响普鲁兰多糖产量的问题。
2、本发明提供的菌株在发酵过程中没有色素的产生，在利用预冷无水乙醇沉淀可得到白色多糖，避免了现有多数普鲁兰酵母菌株在产糖时会伴有黑色素产生，黑色素会导致胞外多糖产量降低，并纯化带来一定的难度等问题，无须纯化有效降低了发酵成本。
3、本发明获得的菌株可以生产高分子量的普鲁兰多糖，通过凝胶渗透色谱(GPC)对多糖的分子量进行测定，本发明获得的普鲁兰多糖的分子量为81.41万道尔顿，大于20万道尔顿(商品普鲁兰多糖平均分子量)。本发明菌株生产高分子量的普鲁兰多糖产量高，产量最高可达40.4g/L。
4、利用本发明获得的菌株发酵生产普鲁兰多糖，产物的浓度高，有效提高普鲁兰多糖的产量，发酵后的粗多糖具有较高的可塑性，有望实现普鲁兰多糖更为广泛的应用。
5、本发明提供的菌株生产的普鲁兰多糖的生产方法条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点。
附图说明
图1为普鲁兰酶解普鲁兰多糖和发酵产品的薄板层析图；
(1，酶解标准样品；2，标准样品；3，麦芽三糖；4，酶解产品；5，产品)。
图2为发酵产品和普鲁兰多糖标品的红外光谱图；
(Sample，发酵产品；Control，普鲁兰多糖标品)。
图3为发酵产品和普鲁兰多糖标品的核磁共振光谱图；
(A:1H-NMR：其中Standard为普鲁兰多糖标品；Sample为发酵产品；B:13C-NMR:其中
Standard为普鲁兰多糖标品；Sample为发酵产品)。
图4为在碱性条件下发酵液中黑色素的吸光度值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例一：生产普鲁兰多糖菌株的筛选
将1g腐质土样样品溶于10mL无菌水中，并放于30℃，180转/分钟摇床中过夜培养，将过夜培养的土样原液放于30℃恒温箱中静置一段时间，然后将菌悬液吸取100μL菌悬液(单位菌体浓度103～104)涂布到YPD(含有0.03～0.07％的曲利苯蓝)固体筛选培养基上，30℃恒温培养2-3天，以菌落颜色深浅、表面质地为筛选指标，筛选出颜色深，菌落表面湿润，菌落直径与厚度比值较高的菌株，在普通YPD固体培养基进行划线培养，并对其进行编号；同时利用ITS间隔序列分析对所筛选的菌株进行鉴定，最后将获得种属的菌株放在-80℃保存。
取筛选到的能够生产胞外多糖的菌株，接种到5mL的YPD培养基中，培养48小时后，取100μL接种到5mL新鲜的YPD培养基中，如此反复重复10次以上，后进行上述复筛验证，产量稳定的用于后期发酵试验。
所述YPD筛选培养基，以YPD固体培养基为筛选培养基，含有如下质量百分比的成分：0.6～1.4％(w/v)的酵母膏，1.5～2.5％(w/v)的蛋白胨，1.5～2.5％(w/v)的葡萄糖，若制固体培养基，加入1.5～2.0％(w/v)的琼脂粉。灭菌条件为115℃灭菌25～35分钟。
上述复筛方法：取种子平板，接种到3/15mL的YPD液体培养基中，培养24～36小时；取上述种子接种到50mL的YPD液体培养基中，培养24小时添加5mL70％的灭菌后的葡萄糖，培养48小时，再取5mL发酵液，煮沸5～10分钟，10000转/分钟离心10～20分钟，利用4倍体积的乙醇沉淀，4～10摄氏度静置过夜，10000转/分钟离心10～20分钟后取沉淀干燥。
通过上述筛选方法获得的菌株，经鉴定被命名为产黑色素短梗霉A4(A.melanogenum)，该菌株于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.13177。
实施例二：普鲁兰多糖的鉴定
发酵产物和普鲁兰多糖均按照1g/10mL的比例溶解到去离子水中，得到样品溶液和普鲁兰多糖标准溶液；麦芽三糖，葡萄糖，按照10mg/mL的比例溶解于去离子水；展层体系：乙腈和蒸馏水按照体积比正丁醇：乙酸：蒸馏水＝8:3:2的比例混合均匀，置于具塞玻璃瓶中备用。显色剂：浓硫酸和无水乙醇按照V浓硫酸：V无水乙醇＝1:6的比例混合均匀，装到喷壶中备用。
将普鲁兰多糖标准溶液、普鲁兰多糖水解液、样品溶液、样品酶解液分别稀释100倍，按照普鲁兰多糖标准溶液、普鲁兰多糖水解液、麦芽三糖、样品酶解液、样品溶液、葡萄糖的顺序在硅胶层析板上点样，在展层液中层析，待液体层析到硅胶板顶部后取出吹干，重复层析2-3次。将显色剂喷到层析后的硅胶板上，吹干后在酒精灯上加热显色，观察实验现象。结果表明获得产品为普鲁兰多糖(图1)。
将少许发酵产物和普鲁兰多糖分别用溴化钾研磨并压成圆形片状备用，然后放在红外光谱仪上观察。结果表明获得产品为普鲁兰多糖(图2).
将些许发酵产物和普鲁兰多糖分别用重水交换3次备用，然后放在核磁管中进行核磁共振光谱的观察。结果表明获得产品为普鲁兰多糖(图3)。
实施例三：在碱性条件下利用生物基葡萄糖生产普鲁兰多糖
本发明发酵生产方法具体如下：取黑色素短梗霉A4种子平板，接种到2mL～3mL的YPD液体培养基中，培养24h～36h；取上述种子接种到含有50mL的YPD液体培养基中摇瓶中，24h后添加5mL70％的灭菌后的葡萄糖，培养36h～48h；取上述培养种子接种到所述摇瓶发酵培养基，含6％～10％(w/v)葡萄糖，1％～3％(w/v)酵母膏和2％～5％(w/v)蛋白胨，0.3％～0.7％(w/v)K2HPO4，0.04％～0.08％(w/v)(NH4)2SO4·7H2O，0.02％～0.04％(w/v)CaCl2的摇瓶发酵培养基中，所述碱性条件，制备50mL摇瓶发酵培养基，并将培养基pH分别调至7、8、9，灭菌条件为115℃灭菌25～35分钟。将种子液接种到上述发酵培养基中，接种量为6％～8％，利用氨水调节pH，并在发酵24h向摇瓶中补加灭菌后的葡萄糖(质量百分含量70％)，继续发酵24h，醇沉胞外多糖。
发酵48h结束后，分别取5ml发酵液，煮沸5～10分钟，10000转/分钟离心10～20分钟，利用4倍体积的乙醇沉淀，4～10摄氏度静置过夜，10000转/分钟离心10～20分钟后取沉淀干燥。
实施例四：在碱性条件下利用生物基葡萄糖生产无色素普鲁兰多糖
取黑色素短梗霉A4种子平板，接种到2mL～3mL的YPD液体培养基中，培养24h～36h；取上述种子接种到含有50mL的YPD液体培养基中摇瓶中，24h后添加5mL70％的灭菌后的葡萄糖，培养36h～48h；取上述培养种子接种到所述摇瓶发酵培养基，含6％～10％(w/v)葡萄糖，1％～3％(w/v)酵母膏和2％～5％(w/v)蛋白胨，0.3％～0.7％(w/v)K2HPO4，0.04％～0.08％(w/v)(NH4)2SO4·7H2O，0.02％～0.04％(w/v)CaCl2的摇瓶发酵培养基中，所述碱性条件，制备50mL摇瓶发酵培养基，并将培养基pH调至8，灭菌条件为115℃灭菌25～35分钟。将种子液接种到上述发酵培养基中，接种量为6％～8％，利用氨水调节pH，并在发酵24h向摇瓶中补加灭菌后的葡萄糖(质量百分含量70％)，继续发酵24h，醇沉胞外多糖。
在发酵过程中，每隔4小时取2mL发酵液，8000转/分钟离心4～6分钟，菌体用NaOH在121℃热处理20分钟，冷却至室温并8000转/分钟离心4～6分钟，再用3mL的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)重悬，最后在540nm处测定其吸光度值(图4)。根据吸光度值可知，在发酵过程中没有黑色素的产生，并且醇沉时得到无色的胞外多糖。
实施例五：高分子普鲁兰多糖的测定
精密称取0.05g在碱性条件下生产的普鲁兰多糖样品加流动相溶解制成5mg/mL溶液，离心取上清溶液，进样20μL，GPC软件根据出峰时间，计算出样品的分子量。所获得的普鲁兰多糖分子量为81.41万道尔顿，大于市售产品分子量—20万道尔顿。
实施例六：利用生物基葡萄糖生产高分子、无色素的普鲁兰多糖
YPD液体培养基，含有如下质量百分比的成分：0.6～1.4％(w/v)的酵母膏，1.5～2.5％(w/v)的蛋白胨，1.5～2.5％(w/v)的葡萄糖，上述培养基接种黑色素短梗霉A4，生长24～36小时后作为一级种子，取上述种子接种到50mL的YPD培养基中，24h后添加5mL70％的灭菌后的葡萄糖，培养36h～48h；再接种到(100mL)的摇瓶培养。500mL摇瓶发酵含有以下成本，6～10％(w/v)葡萄糖，1～3％(w/v)酵母膏，2～5％(w/v)蛋白胨，0.3～0.7％(w/v)K2HPO4，0.04～0.08％(w/v)(NH4)2SO4·7H2O，0.02～0.04％(w/v)CaCl2，初始pH 8，8磅(115℃)灭菌30min。70％葡萄糖需单独灭菌，利用氨水调节pH值。发酵24h后，向摇瓶中补加灭菌后的葡萄糖(质量百分含量70％)，，继续发酵24h，测定胞外多糖产量。
发酵48小时结束后，取5mL发酵液，煮沸5～10分钟，10000转/分钟离心10～20分钟，利用4倍体积的乙醇沉淀，4～10摄氏度静置过夜，10000转/分钟离心10～20分钟后取沉淀干燥，测定多糖的产量。可得到23.4g/L的无色素多糖。
实施例七：利用生物基麦芽糖高效生产无色素的普鲁兰多糖
YPD液体培养基，含有如下质量百分比的成分：0.6～1.4％(w/v)的酵母膏，1.5～2.5％(w/v)的蛋白胨，1.5～2.5％(w/v)的葡萄糖，上述培养基接种黑色素短梗霉A4，生长24～36小时后作为一级种子，取上述种子接种到50mL的YPD培养基中，24h后添加5mL70％的灭菌后的葡萄糖，培养36h～48h；再接种到(100mL)的摇瓶培养。500mL摇瓶发酵含有以下成本，6～10％(w/v)葡萄糖，1～3％(w/v)酵母膏，2～5％(w/v)蛋白胨，0.3～0.7％(w/v)K2HPO4，0.04～0.08％(w/v)(NH4)2SO4·7H2O，0.02～0.04％(w/v)CaCl2，初始pH 8，8磅(115℃)灭菌30min。70％麦芽糖需单独灭菌，利用氨水调节pH值。发酵24h后，向摇瓶中补加灭菌后的麦芽糖(质量百分含量70％)，，继续发酵24h，测定胞外多糖产量。
发酵48小时结束后，取5mL发酵液，煮沸5～10分钟，10000转/分钟离心10～20分钟，利用4倍体积的乙醇沉淀，4～10摄氏度静置过夜，10000转/分钟离心10～20分钟后取沉淀干燥，测定多糖的产量。可得到40.4g/L的无色素多糖。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种适宜在碱性条件下生产高分子、无色素普鲁兰多糖的产黑色素短梗霉A4(Aureobasidium melanogenum)，菌种保藏编号为CGMCC No.13177。
2.权利要求1所述的菌株在普鲁兰多糖生产中的应用。
3.权利要求1所述的菌株在生产高分子普鲁兰多糖中的应用。
4.权利要求1所述的菌株在生产无色素普鲁兰多糖中的应用。
5.权利要求1所述的菌株在生产高分子、无色素普鲁兰多糖中的应用。
6.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：取权利要求1所述黑色素短梗霉A4(Aureobasidium melanogenum)的种子接种到YPD培养基中培养获得一级种子，将获得的一级种子接种到YPD培养基中培养，添加灭菌后的生物质糖继续培养，获得培养种子；
步骤二：取步骤一获得的培养种子接种到发酵培养基中，调节pH值，并在发酵24h后向培养基中持续补加生物质糖，继续发酵待发酵结束后测定多糖的浓度。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤二所述的发酵培养基包含如下质量百分比的成分：6％～10％生物质糖，1％～3％酵母膏和2％～5％蛋白胨，0.3％～0.7％K2HPO4，0.04％～0.08％(NH4)2SO4·7H2O，0.02％～0.04％CaCl2，pH值为8。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，骤二所述的取步骤一获得的培养种子接种到发酵培养基中是按照6％-8％的接种量进行的。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，骤二所述的调节pH值是用氨水进行调节的。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤二所述的生物质糖为葡萄糖或麦芽糖。
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