CN105821094A - 一种纳米级细菌纤维素膜的制备方法及应用 - Google Patents

一种纳米级细菌纤维素膜的制备方法及应用 Download PDF

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王纪明
张海波
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Abstract

本发明公开了一种纳米级细菌纤维素膜的制备方法及应用，属于发酵副产物综合利用技术领域。本发明所提供的方法是以经过预处理的废弃菌液或废弃菌体为发酵原料，调整发酵培养基中的营养成分含量后，接种5‑20％经过活化的木葡糖酸醋杆菌进行静态发酵获得纳米级细菌纤维素膜。本发明通过对获得的细菌纤维素膜进行适当处理，添加面膜营养液，低温封装，从而获得高附加值的美容面膜，该面膜服帖性、保湿性较普通的无纺布面膜效果更佳，同时，生产成本大幅度降低，可使面膜原料的制作成本降低99％以上，整个生产成本降低70％以上，具有强大的市场竞争力。

Description

一种纳米级细菌纤维素膜的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种纳米级细菌纤维素膜的制备方法及应用，属于发酵副产物综合利用技术领域。
背景技术
纤维素是地球上最为丰富的天然生物大分子物质，是由葡萄糖分子经过beta-1,4糖苷键连接而成的多聚物，其主要来源是树木、棉花等植物，是植物光合作用的主要产物。目前，树木、棉花来源的纤维素是造纸业、纺织业、建筑业以及化工领域中主要的原材料。地球上每年由植物合成的纤维素达亿万吨，但合成纤维素并不是植物所独有的功能，某些细菌，例如木醋杆菌、根瘤菌属、土壤杆菌属及假单胞菌属等能以异养方式更加高效地合成高纯度纳米级纤维素，又称细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)。
植物源纤维素通常被木质素、半纤维素等杂质包裹，这使得高纯度纤维素的提取、精制成为工业领域的一项重大技术难题。而细菌纤维素以纯纤维素的形式存在，并具有由超微纤维组成的纳米纤维网，纤维素直径在几纳米到几十纳米之间，比其他植物源纤维或人工合成纤维直径低1～2个数量级。细菌纤维素具有纯度高、结晶度高、机械强度及弹性模量高、吸水性及生物相容性好等特点，并且可以生物降解，使其具有许多独特的性质和功能，成为一种新型的生物材料，受到科学界的广泛关注，在食品工业、医疗美容、造纸、声学器材和石油开采等方面有广泛的应用潜力。
随着科技及经济水平的不断发展，近年来在美容产品上品类逐渐增多，而面膜作为一种清洁、护肤的大众消费品，在市场上的需求量极高，并且产品种类也非常之多，主要分为剥离型、粉末型、膏霜型、泡沫型、成型类面膜五种。成型类面膜较之其他几类使用方便，便于保存，与皮肤接触时清爽舒适，深受消费者的喜爱。传统成型类面膜的基材一般为无纺布，通过裁剪、浸泡灌装适量面膜营养液，密封而成。但由于无纺布持水能力差，容易造成面膜营养液的浪费，并且服帖性差，拉伸强度低，容易损坏。
目前，国内外已经有相关产品问世，但目前最大的问题在于产品售价昂贵，难以形成大众消费产品。产品售价之所以昂贵，主要有如下几个原因：
(1)发酵原料成本高
发酵原料中成本较高的成分主要是有机氮源、维生素及其他微量元素。有机氮源主要由酵母浸膏、蛋白胨等物质提供，按现在市场售价计算，酵母浸膏约为120,000/吨，蛋白胨约为200,000/吨，配制1吨发酵液所需的氮源成本就高达2000多元，再加上碳源、其他微量元素及设备损耗、燃油动力等费用，使纳米纤维素的合成成本居高不下。据调研发现，一片纳米纤维素凝胶面膜售价高达100元人民币，而用细菌纤维素凝胶膜生产的医用敷料则高达400元/片，如此高昂的产品售价让很多对此有需求的消费者望而却步。
(2)发酵周期长，机械化程度低
细菌纤维素凝胶膜的培养方式为静态培养，发酵周期较长，一般需要7～10才能形成较为结实的凝胶膜。静态培养方式的机械化程度较低，大部分都需要人工操作，无形中增加了产品的生产成本。
为了解决细菌纤维素凝胶膜生产成本高的问题，本发明专利提出了利用发酵废水和废弃微生物细胞裂解液作为一种低成本原料合成细菌纤维素凝胶膜的方法，从而降低其原料成本；并且本发明还将获得的细菌纤维素凝胶膜制作成美容面膜，从而生产出低成本的纳米纤维素凝胶面膜。通过与市场上的现有细菌纤维素面膜产品做对比，其在微观结构、拉伸强度、保水特性等方面没有显著差异，但纳米纤维素凝胶膜的生产成本大幅降低，从而使终端产品的售价能够极大降低，满足大众消费的要求。
发酵工业中会产生大量的废弃菌体，如酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌等，以啤酒发酵工业为例，中国每生产1吨啤酒可附带产生1～1.5kg废弃酵母菌体。2015年中国啤酒产量约为506.15亿升，约产生50吨酵母菌体，并且啤酒产量还以每年约3.25％的趋势增长，这说明废弃酵母的量也会越来越多，其他工业上常用的微生物废弃菌体的产量同样也在逐年递增。废弃菌体富含蛋白质、氨基酸、脂类、维生素及其他微量元素，营养成分非常丰富，通过对这些废弃菌体进行适当处理，使其中的营养成分溶出，接种具有合成细菌纤维素能力的微生物，能够获得具有高附加值的细菌纤维素凝胶薄膜，在医用敷料、美容面膜、保健食品等领域具有巨大的市场需求，经济效益明显。在本发明中所述的低成本原料是工业上的发酵废水或微生物废弃菌体，几乎为零成本，用这些废弃物来代替细菌纤维素发酵培养基，能够大幅度降低细菌纤维素凝胶膜的生产成本，从而开发出一系列经济实惠、性价比高的细菌纤维素基产品。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种纳米级细菌纤维素膜的制备方法，所采取的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种纳米级细菌纤维素膜的制备方法，是以经过预处理的废弃菌液或废弃菌体为发酵原料，调整发酵培养基中的营养成分含量后，接种5-20％经过活化的木葡糖酸醋杆菌进行静态发酵获得纳米级细菌纤维素膜。
优选地，所述经过预处理的废弃菌体，为经过发酵的细菌或真菌菌体。
优选地，所述细菌为大肠杆菌；所述真菌菌体，为出芽短梗霉。
所述的制备方法的步骤如下：
1)制备种子液并活化培养木糖酸醋杆菌；
2)对废弃菌液或废弃菌体进行预处理，获得预处理菌液或预处理菌体；
3)以步骤2)所得的预处理菌液或预处理菌体为发酵原料，调整碳源、氮源、微生物、脂类和矿物质的含量和pH至4～7，高压灭菌后获得发酵培养基；
4)向步骤3)所得的发酵培养基中接种5-20％步骤1)所得的木葡糖酸醋杆菌在28～30℃下进行静态发酵培养7～15天，发酵培养后获得细菌纤维素膜。
优选地，步骤2)所述预处理菌液，步骤如下：
1)收集发酵废液，加入乙醇沉淀后，获得乙醇发酵液混合物；
2)5000rpm条件下离心步骤1)乙醇发酵液混合物10min，去除菌体细胞，获得上清液，再于30～50℃下旋转蒸发乙醇，获得无醇发酵液后补充蒸馏水，获得预处理菌液。
优选地，步骤2)所述预处理菌体，步骤如下：
1)将废弃菌液经过离心或沉淀后，利用蒸馏水混匀所得菌泥，调成10～20％(W/V)浓度的细胞悬浮液，再通过高压均质、超声破碎或冻融处理对细胞进行破碎处理，处理后将菌体裂解液加热到55～75℃，匀速搅拌，保温10-15h后获得细胞碎片溶液；
2)调整步骤2)所得细胞碎片溶液的温度后加入0.01～5％的蛋白酶，混合均匀后，水解10-15h，离心取上清液，获得预处理菌体。
优选地，所述高压均质，条件为：均质压力50～100MPa，循环均质3～5次；所述超声破碎，条件为：超声功率200～600W，超声时间30～90s，循环次数10～30次；所述冻融处理，条件为：将菌液煮沸5～10min，迅速置于冰浴中，并不断搅拌5～10min，反复循环5～20次。
所述任一制备方法在制备面膜中的应用也在本发明的保护范围之内。
所述应用的步骤如下：
1)根据权利要求1所述制备方法发酵培养纳米细菌纤维素凝胶膜至2～5mm厚；
2)将步骤1)所得的纳米细菌纤维素凝胶膜从培养基中取出，用蒸馏水冲洗后，置于1～4％(w/v)的氢氧化钠碱液中，煮沸30-60min，去除包裹在纤维素凝胶膜表面的菌体及培养基后，水洗去除碱液后根据模具将纤维素凝胶膜裁剪成型后与面膜营养液一同灌装于密封袋中，控制灌装温度为0～4℃，获得纳米级细菌纤维素面膜。
优选地，步骤2)所述面膜营养液，含有如下成分：
透明质酸钠、乙醇、吐温-80、红没药醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆异黄酮、维生素B、维生素C和对羟基苯甲酸钠。
本发明获得的有益效果：
本发明将发酵原料替换成为发酵工业生产中大量排出的发酵废水或废弃微生物菌体，通过对发酵废水及废弃菌体进行简单的预处理，形成良好的细菌纤维素发酵培养基，供具有纤维素合成能力的微生物生长繁殖所用。
本发明通过对获得的细菌纤维素膜进行适当处理，添加面膜营养液，低温封装，从而获得高附加值的美容面膜，该面膜服帖性、保湿性较普通的无纺布面膜效果更佳，并且生产成本大幅度降低，具有强大的市场竞争力。
附图说明
图1细菌纤维素凝胶膜的扫描电镜图。
图2为细菌纤维素凝胶膜的红外扫描图。
图3为细菌纤维素凝胶膜的X衍射图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所使用的试剂、材料、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规试剂、材料、仪器和方法，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
种子液的制备：
a、种子培养所需的营养成分配方如下：
以质量比(w/v)表示，葡萄糖5～20％，蛋白胨0.5～2％，酵母膏0.5～2％，柠檬酸0.01～0.1％，Na2HPO4 0.2～0.5％，KH2PO4 0.1～0.2％，MgSO4 0.025～0.05％，pH 4.8～6.8，121℃灭菌20min。
b、种子活化方法如下：
挑取平板上的一个单菌落接种于新鲜培养基中，并添加0.01％的纤维素酶，30℃，180rpm摇床培养48h。5000rpm离心10min得到菌体沉淀，无菌生理盐水水洗3次，去除体系内的纤维素酶，并最后用相同体积的无菌水溶解经过清洗的菌体，待用。
实施例1：以普鲁兰多糖发酵废水为原料合成细菌纤维素
1)收集普鲁兰发酵液，加入2倍体积的乙醇以使发酵液中的多糖沉淀析出，5000rpm离心处理10min得到发酵液与乙醇的混合物。将上述混合物转移至旋转蒸发仪上进行脱出乙醇的操作，旋蒸仪水浴温度为40℃，在旋蒸得到的无醇发酵液中添加适量蒸馏水，以补足因旋蒸而损失的水分。
2)利用生物传感器分析仪检测上述发酵培养基中的糖含量，调整发酵液的糖含量为2％。如果低于2％(w/v)，则需要添加适量蔗糖，以保证菌体的正常生长；若高于2％，则需要稀释处理，以降低高渗透压对菌体的影响。
3)调整发酵培养基的pH为5.5。
4)准确量取100mL上述发酵培养基于500mL三角瓶中，以8层纱布覆盖瓶口，置于高压灭菌锅中，121℃下灭菌15min。冷却至室温，接种10％新鲜木葡糖酸醋杆菌种子液，28～30℃，静态培养9天，得到细菌纤维素凝胶膜。
5)将获得的细菌纤维素凝胶膜上的培养基用蒸馏水冲洗干净，置于1～4％(w/v)氢氧化钠溶液中，煮沸1h，以去除菌体、蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基；之后，用蒸馏水反复冲洗数次，至凝胶膜表面pH为中性。将处理之后的凝胶膜置于面膜模具上，裁剪成型。将其与面膜营养液一同灌装于密封袋中，控制灌装温度为0～4℃，得到细菌纤维素美容面膜。
其中，面膜营养液，含有如下成分：
透明质酸钠、乙醇、吐温-80、红没药醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆异黄酮、维生素B、维生素C和对羟基苯甲酸钠。
实施例2：以普鲁兰多糖发酵废弃菌体为原料合成细菌纤维素
普鲁兰多糖是由出芽短梗霉经过发酵获得的一种多糖，出芽短梗霉又名普鲁兰酵母，自身有细胞壁，需要对细胞进行充分的破壁才能将其中的营养物质溶出，本实例采用超声破碎的方法进行破壁处理。
1)收集发酵废弃菌液，离心得菌体沉淀。添加适量蒸馏水，混匀，调制成10～20％的菌悬液，至于超声破碎仪上，对细胞进行物理破碎，破碎功率为400w，破碎时间30s，间隔5s，反复20个循环，如果出现大量泡沫，需添加适量消泡剂以提高破碎效果。将超声破碎之后得到的菌悬液置于50℃水浴锅中，添加0.01％蛋白酶以水解细胞内的蛋白质，形成不同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解处理时间为10h。酶解结束后，5000rpm离心处理10min，得到的上清液即为发酵培养基。
2)利用生物传感器分析仪检测上述发酵培养基中的糖含量，如果低于5％(w/v)，则需要添加适量果糖，以保证菌体的正常生长；若高于5％，则需要稀释处理，以降低高渗透压对菌体的影响。
3)调整发酵培养基的pH为5.5。
4)准确量取100mL上述发酵培养基于500mL三角瓶中，以8层纱布覆盖瓶口，置于高压灭菌锅中，121℃下灭菌15min。冷却至室温，接种5％新鲜木葡糖酸醋杆菌种子液，29℃，静态培养7天，得到细菌纤维素凝胶膜。
5)将获得的细菌纤维素凝胶膜上的培养基用蒸馏水冲洗干净，置于1～4％(w/v)氢氧化钠溶液中，煮沸1h，以去除菌体、蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基；之后，用蒸馏水反复冲洗数次，至凝胶膜表面pH为中性。将处理之后的凝胶膜置于面膜模具上，裁剪成型。将其与面膜营养液一同灌装于密封袋中，控制灌装温度为0～4℃，得到细菌纤维素美容面膜。
其中，面膜营养液，含有如下成分：
透明质酸钠、乙醇、吐温-80、红没药醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆异黄酮、维生素B、维生素C和对羟基苯甲酸钠。
实施例3：以出芽短梗霉废弃菌体为原料合成细菌纤维素
1)收集发酵废弃菌液，离心得菌体沉淀。添加适量蒸馏水，混匀，调制成15％的菌悬液，置于高压均质机上，对细胞进行物理破碎，高压均质机的压力为100MPa，处理时间10min，处理次数3次。将高压均质机处理之后得到的菌悬液置于50℃水浴锅中，添加0.01％蛋白酶以水解细胞内的蛋白质，形成不同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解处理时间为15h。酶解结束后，5000rpm离心处理10min，得到的上清液即为发酵培养基。
2)利用生物传感器分析仪检测上述发酵培养基中的糖含量，如果低于5％(w/v)，则需要添加适量葡萄糖以补充足够的碳源，保证菌体的正常生长；若高于5％，则需要稀释处理，以降低高渗透压对菌体的影响。
3)调整发酵培养基的pH为6。
4)准确量取100mL上述发酵培养基于500mL三角瓶中，以8层纱布覆盖瓶口，置于高压灭菌锅中，121℃下灭菌15min。冷却至室温，接种20％新鲜木葡糖酸醋杆菌种子液，28～30℃，静态培养10天，得到细菌纤维素凝胶膜。
5)将获得的细菌纤维素凝胶膜上的培养基用蒸馏水冲洗干净，置于1～4％(w/v)氢氧化钠溶液中，煮沸1h，以去除菌体、蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基；之后，用蒸馏水反复冲洗数次，至凝胶膜表面pH为中性。将处理之后的凝胶膜置于面膜模具上，裁剪成型。将其与面膜营养液一同灌装于密封袋中，控制灌装温度为0～4℃，得到细菌纤维素美容面膜。
其中，面膜营养液，含有如下成分：
透明质酸钠、乙醇、吐温-80、红没药醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆异黄酮、维生素B、维生素C和对羟基苯甲酸钠。
实施例4：以出芽短梗霉废弃菌体为原料合成细菌纤维素
1)收集发酵废弃菌液，离心得菌体沉淀。添加适量蒸馏水，混匀，调制成15％的菌悬液，煮沸10min，迅速置于干冰冰浴中，处理时间10min；反复冻融处理次数10次。将冻融处理之后得到的菌悬液置于50℃水浴锅中，添加0.01％蛋白酶以水解细胞内的蛋白质，形成不同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解处理时间为12h。酶解结束后，5000rpm离心处理10min，得到的上清液即为发酵培养基。
2)利用生物传感器分析仪检测上述发酵培养基中的糖含量，如果低于2％(w/v)，则需要添加适量葡萄糖，以保证菌体的正常生长；若高于2％，则需要稀释处理，以降低高渗透压对菌体的影响。
3)调整发酵培养基的pH为7。
4)准确量取100mL上述发酵培养基于500mL三角瓶中，以8层纱布覆盖瓶口，置于高压灭菌锅中，121℃下灭菌15min。冷却至室温，接种10％新鲜木葡糖酸醋杆菌种子液，28～30℃，静态培养8天，得到细菌纤维素凝胶膜。
5)将获得的细菌纤维素凝胶膜上的培养基用蒸馏水冲洗干净，置于1～4％(w/v)氢氧化钠溶液中，煮沸1h，以去除菌体、蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基；之后，用蒸馏水反复冲洗数次，至凝胶膜表面pH为中性。将处理之后的凝胶膜置于面膜模具上，裁剪成型。将其与面膜营养液一同灌装于密封袋中，控制灌装温度为0～4℃，得到细菌纤维素美容面膜。
其中，面膜营养液，含有如下成分：
透明质酸钠、乙醇、吐温-80、红没药醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆异黄酮、维生素B、维生素C和对羟基苯甲酸钠。
实施例5：以大肠杆菌废弃菌体为原料合成细菌纤维素
大肠杆菌是重要的发酵工业用菌，主要用来合成氨基酸、多肽、酶等重要的工业化合物，每年会产生大量废弃菌体。本实施例将采用大肠杆菌废弃菌体为原料，通过接种木葡糖酸醋杆菌合成细菌纤维素凝胶膜，并将其制作成美容面膜。具体操作步骤如下：
1)收集发酵废弃菌液，离心得菌体沉淀。添加适量蒸馏水，混匀，调制成30％的菌悬液，煮沸5min，迅速置于干冰冰浴中，处理时间5min；反复冻融处理次数5次。将冻融处理之后得到的菌悬液置于55℃水浴锅中，添加0.01％蛋白酶以水解细胞内的蛋白质，形成不同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解处理时间为14h。酶解结束后，5000rpm离心处理10min，得到的上清液即为发酵培养基。
2)利用生物传感器分析仪检测上述发酵培养基中的糖含量，如果低于2％(w/v)，则需要添加适量果糖，以保证菌体的正常生长；若高于2％，则需要稀释处理，以降低高渗透压对菌体的影响。
3)调整发酵培养基的pH为6.5。
4)准确量取50mL上述发酵培养基于500mL三角瓶中，以8层纱布覆盖瓶口，置于高压灭菌锅中，121℃下灭菌15min。冷却至室温，接种15％新鲜木葡糖酸醋杆菌种子液，28～30℃，静态培养7天，得到细菌纤维素凝胶膜。
5)将获得的细菌纤维素凝胶膜上的培养基用蒸馏水冲洗干净，置于1～4％(w/v)氢氧化钠溶液中，煮沸1h，以去除菌体、蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基；之后，用蒸馏水反复冲洗数次，至凝胶膜表面pH为中性。将处理之后的凝胶膜置于面膜模具上，裁剪成型。将其与面膜营养液一同灌装于密封袋中，控制灌装温度为0～4℃，得到细菌纤维素美容面膜。
其中，面膜营养液，含有如下成分：
透明质酸钠、乙醇、吐温-80、红没药醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆异黄酮、维生素B、维生素C和对羟基苯甲酸钠。
实施例6：以大肠杆菌废弃菌体为原料合成细菌纤维素
1)收集发酵废弃菌液，离心得菌体沉淀。添加适量蒸馏水，混匀，调制成40％的菌悬液，置于高压均质机上，对细胞进行物理破碎，高压均质机的压力为50MPa，处理时间20min，处理次数5次。将高压均质机处理之后得到的菌悬液置于50℃水浴锅中，添加0.03％蛋白酶以水解细胞内的蛋白质，形成不同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解处理时间为11h。酶解结束后，5000rpm离心处理10min，得到的上清液即为发酵培养基。
2)利用生物传感器分析仪检测上述发酵培养基中的糖含量，如果低于5％(w/v)，则需要添加适量蔗糖，以保证菌体的正常生长；若高于5％，则需要稀释处理，以降低高渗透压对菌体的影响。
3)调整发酵培养基的pH为7。
4)准确量取100mL上述发酵培养基于500mL三角瓶中，以8层纱布覆盖瓶口，置于高压灭菌锅中，121℃下灭菌15min。冷却至室温，接种10％新鲜木葡糖酸醋杆菌种子液，28～30℃，静态培养10天，得到细菌纤维素凝胶膜。
5)将获得的细菌纤维素凝胶膜上的培养基用蒸馏水冲洗干净，置于1～4％(w/v)氢氧化钠溶液中，煮沸1h，以去除菌体、蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基；之后，用蒸馏水反复冲洗数次，至凝胶膜表面pH为中性。将处理之后的凝胶膜置于面膜模具上，裁剪成型。将其与面膜营养液一同灌装于密封袋中，控制灌装温度为0～4℃，得到细菌纤维素美容面膜。
其中，面膜营养液，含有如下成分：
透明质酸钠、乙醇、吐温-80、红没药醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆异黄酮、维生素B、维生素C和对羟基苯甲酸钠。
实施例7：以大肠杆菌废弃菌体为原料合成细菌纤维素
1)收集发酵废弃菌液，离心得菌体沉淀。添加适量蒸馏水，混匀，调制成30％的菌悬液，至于超声破碎仪上，对细胞进行物理破碎，破碎功率为400w，破碎时间50s，间隔5s，反复20个循环，如果出现大量泡沫，需添加适量消泡剂以提高破碎效果。将超声破碎之后得到的菌悬液置于50℃水浴锅中，添加0.01％蛋白酶以水解细胞内的蛋白质，形成不同分子量大小的多肽或氨基酸，酶解处理时间为10h。酶解结束后，5000rpm离心处理10min，得到的上清液即为发酵培养基。
2)利用生物传感器分析仪检测上述发酵培养基中的糖含量，如果低于2％(w/v)，则需要添加适量蔗糖，以保证菌体的正常生长；若高于2％，则需要稀释处理，以降低高渗透压对菌体的影响。
3)调整发酵培养基的pH为5。
4)准确量取100mL上述发酵培养基于500mL三角瓶中，以8层纱布覆盖瓶口，置于高压灭菌锅中，121℃下灭菌15min。冷却至室温，接种20％新鲜木葡糖酸醋杆菌种子液，28～30℃，静态培养7天，得到细菌纤维素凝胶膜。
5)将获得的细菌纤维素凝胶膜上的培养基用蒸馏水冲洗干净，置于1～4％(w/v)氢氧化钠溶液中，煮沸1h，以去除菌体、蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基；之后，用蒸馏水反复冲洗数次，至凝胶膜表面pH为中性。将处理之后的凝胶膜置于面膜模具上，裁剪成型。将其与面膜营养液一同灌装于密封袋中，控制灌装温度为0～4℃，得到细菌纤维素美容面膜。
其中，面膜营养液，含有如下成分：
透明质酸钠、乙醇、吐温-80、红没药醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆异黄酮、维生素B、维生素C和对羟基苯甲酸钠。
实施例8
市场上目前所售的细菌纤维素面膜生产原料大部分是由葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、维生素及其他微量元素等营养物质组成的微生物培养基获得，配制1L微生物发酵液大约需要20g葡萄糖，10g酵母浸粉、20g蛋白胨及少量维生素和微量元素，成本大约10-11元人民币，而采用废弃发酵液或废弃微生物菌体为原料，所需成本约为0.1-0.5元，因此可大大降低细菌纤维素的原料成本。面膜质量最关键的技术指标是拉伸强度，如果拉伸强度低，则很容易损坏。本实施例对前面实施例1-7所得的细菌纤维素面膜的机械强度、微观结构进行了检测，结果如表1和图1-3所示。
表1细菌纤维素凝胶膜的机械强度
从表1可知，与市场上某品牌面膜相比，采用本发明所述的低成本原料所得到的面膜，在弹性模量、断裂伸长率、拉伸断裂应力、拉伸强度及拉伸屈服应力几个指标上没有明显的差别。尤其是实施例3所得到的细菌纤维素膜，其弹性模量最大，达到3917.9MPa，这说明其机械强度大，不易损坏，能够降低产品的废品率。
图1-3是对细菌纤维素微观结构的观察，通过图1可以看出采用本发明所述的方法得到的细菌纤维素纤维直径约为0.05μm，并且纤维丝互相交错，形成了坚固紧密的三围纳米网状结构，能够很好的锁住水分及其他营养因子，使面膜中的营养成分很好的保留其中。图2是本发明所得细菌纤维素与标准纤维素分子的红外扫描图谱对比，从图中可以看出纤维素的特征官能团，从而从分子水平确定了产品结构。图3是细菌纤维素的x衍射图谱，从图中的两个特征峰也能证明所得的产品为纤维素分子。
由此可知，本发明所提供的制备方法在保证面膜质量效果的情况下，大幅降低了原料成本，可使纳米纤维素面膜的原料成本降低99％以上。生产成本降低70％以上。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种纳米级细菌纤维素膜的制备方法，其特征在于，以经过预处理的废弃菌液或废弃菌体为发酵原料，调整发酵培养基中的营养成分含量后，接种5-20％经过活化的木葡糖酸醋杆菌进行静态发酵获得纳米级细菌纤维素膜。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述经过预处理的废弃菌体，为经过发酵的细菌或真菌菌体。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌；所述真菌菌体，为出芽短梗霉。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)制备种子液并活化培养木糖酸醋杆菌；
2)对废弃菌液或废弃菌体进行预处理，获得预处理菌液或预处理菌体；
3)以步骤2)所得的预处理菌液或预处理菌体为发酵原料，调整碳源、氮源、微生物、脂类和矿物质的含量和pH至4～7，高压灭菌后获得发酵培养基；
4)向步骤3)所得的发酵培养基中接种5-20％步骤1)所得的木葡糖酸醋杆菌在28～30℃下进行静态发酵培养7～15天，发酵培养后获得细菌纤维素膜。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述预处理菌液，步骤如下：
1)收集发酵废液，加入乙醇沉淀后，获得乙醇发酵液混合物；
2)5000rpm条件下离心步骤1)乙醇发酵液混合物10min，去除菌体细胞，获得上清液，再于30～50℃下旋转蒸发乙醇，获得无醇发酵液后补充蒸馏水，获得预处理菌液。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述预处理菌体，步骤如下：
1)将废弃菌液经过离心或沉淀后，利用蒸馏水混匀所得菌泥，调成10～20％(W/V)浓度的细胞悬浮液，再通过高压均质、超声破碎或冻融处理对细胞进行破碎处理，获得细胞碎片溶液；
2)调整步骤2)所得细胞碎片溶液的温度后加入0.01％的蛋白酶，混合均匀后，水解10-15h，离心取上清液，获得预处理菌体。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述高压均质，条件为：均质压力50～100MPa，循环均质3～5次；所述超声破碎，条件为：超声功率200～600W，超声时间30～90s，循环次数10～30次；所述冻融处理，条件为：将菌液煮沸5～10min，迅速置于冰浴中，并不断搅拌5～10min，反复循环5～20次。
8.权利要求1-7所述任一制备方法在制备面膜中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于，步骤如下：
1)根据权利要求1所述制备方法发酵培养纳米细菌纤维素凝胶膜至2～5mm厚；
2)将步骤1)所得的纳米细菌纤维素凝胶膜从培养基中取出，用蒸馏水冲洗后，置于1～4％(w/v)的氢氧化钠碱液中，煮沸30-60min，去除包裹在纤维素凝胶膜表面的菌体及培养基后，水洗去除碱液后根据模具将纤维素凝胶膜裁剪成型后与面膜营养液一同灌装于密封袋中，控制灌装温度为0～4℃，获得纳米级细菌纤维素面膜。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，步骤2)所述面膜营养液，含有如下成分：透明质酸钠、乙醇、吐温-80、红没药醇、香精、甘油、丁二醇、玻尿酸、大豆异黄酮、维生素B、维生素C和对羟基苯甲酸钠。
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